Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Hel djuravbildning av Drosophila melanogaster med mikrodatortomografi

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61515

Summary

Ett protokoll presenteras som möjliggör visualisering av intakt Drosophila melanogaster i alla utvecklingsstadier med hjälp av mikrodatortomografi.

Abstract

Biomedicinska bildverktyg möjliggör undersökning av molekylära mekanismer över rumsliga skalor, från gener till organismer. Drosophila melanogaster, en väl karakteriserad modellorganism, har dragit nytta av användningen av ljus- och elektronmikroskopi för att förstå genfunktionen på cell- och vävnadsnivå. Tillämpningen av bildplattformar som möjliggör förståelse för genfunktionen på nivån för hela den intakta organismen skulle ytterligare förbättra vår kunskap om genetiska mekanismer. Här presenteras en hel djuravbildningsmetod som beskriver de steg som behövs för att visualisera Drosophila i alla utvecklingsstadier med hjälp av mikrodatortomografi (μ-CT). Fördelarna med μ-CT inkluderar kommersiellt tillgänglig instrumentering och minimal praktisk tid för att producera korrekt 3D-information vid mikronnivåupplösning utan behov av vävnadsdissekerings- eller clearingmetoder. I kombination med programvara som påskyndar bildanalys och 3D-rendering kan detaljerad morfometrisk analys av alla vävnads- eller organsystem utföras för att bättre förstå mekanismer för utveckling, fysiologi och anatomi för både beskrivande och hypotestestningsstudier. Genom att använda ett avbildningsarbetsflöde som innehåller användning av elektronmikroskopi, ljusmikroskopi och μ-CT kan en grundlig utvärdering av genfunktionen utföras, vilket ökar nyttan av denna kraftfulla modellorganism.

Introduction

Bildframställningsmetoder som möjliggör detaljerad undersökning av inre strukturer av ett objekt utan att förstöra dess övergripande 3D-arkitektur har visat sig vara allmänt fördelaktiga för ett antal olika discipliner, inklusive fysik, teknik, materialvetenskap, arkeologi, paleontologi, geologi ochbiologi 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Bland dessa icke-förstörande avbildningsmetoder är röntgenbaserade plattformar särskilt användbara på grund av förmågan hos högenergiröntgenstrålar att tränga in i många olika provtyper och material med minimal spridning jämfört med synliga ljusvågor. Datortomografi (CT), mikrodatortomografi (μ-CT), nanodatortomografi (Nano-CT) och synkrotronmikrotomografi har därför framträtt som den primära tekniken för röntgenbaserad avbildning av prover som sträcker sig från meter till mikron, med millimeter till submikronupplösningskapacitet10,11,12,13,14.

Medan dessa plattformar skiljer sig åt i sin design, röntgengeometri och komponenter för att balansera provstorlek och upplösning, förlitar de sig alla på samma grundläggande princip för bildinspelning: en källa till röntgenstrålar som färdas genom objektet och fångas av en detektor. Differentiell dämpning av röntgenstrålen när den passerar genom olika densiteter i objektet genererar bildkontrast. 3D-data erhålls genom att antingen provet eller detektorn roteras och en serie 2D-projektionsbilder samlas in som sedan rekonstrueras med hjälp av algoritmer till tomogram som innehåller 3D-information vars upplösning är isotropisk i x,y,z15. För många bänkskivor μ-CT-skannrar som använder en konstråleröntgengeometri för att projicera röntgenstrålar vid objektet som avbildas används Feldkamp-algoritmen för att exakt rekonstruera objektet med minimala fel16.

Upplösningen på en viss plattform bestäms främst av systemparametrar som storleken på röntgenstrålen (dekorstorlek), skannergeometri (avstånd från objekt till röntgenkälla), pixelstorleken på detektorn och den rekonstruktionsalgoritm som används. Ytterligare faktorer, såsom skannervibrationer, röntgenstrålningsfluktuationer, provrörelser och materialtyp eller kemisk fläck som används för att visualisera objektet, kan också avsevärt påverka rumslig upplösning under verkliga avbildningsförberutningar15.

För biomedicinska tillämpningar har CT och μ-CT spelat en nyckelroll för att främja vår förståelse av anatomi, fysiologi, utveckling och sjukdomsmekanismer, som fungerar som ett verktyg för både mänskliga patientdiagnoser och som en preklinisk bildplattform för modellorganismer17,18. Till exempel använder Mouse International Phenotyping Consortium, vars mål är att identifiera funktionen hos varje gen i musgenomet, μ-CT som en del av deras fenotypningspipeline19. Deras resultat har varit avgörande för att förstå gener som är involverade i utvecklings- och sjukdomsprocesser, samtidigt som de fungerar som en atlas för musanatomi och utveckling20. Andra modellorganismer, såsom zebrafisk och råttor, har också helt omfamnat användningen av μ-CT för att utföra heldjurs fenotypning av ett antal genmutanter17,21,22,23.

Fördelen med att kombinera heldjursavbildning med modellorganismer är att en mekanistisk förståelse av genfunktionen för en given biologisk process kan utforskas fullt ut. Detta är möjligt på grund av de väl karakteriserade genomen och många genetiska verktyg som finns tillgängliga i modellorganismer som möjliggör exakt manipulering av genfunktionen vid distinkta utvecklingsmässiga tidspunkter, specifika vävnader, enskilda celler och till och med subcellulära organeller. Dessa inkluderar binära uttryckssystem som UAS / GAL4-systemet (och dess många derivat), CRISPR / Cas9 och RNAi24,25,26. När dessa genetiska verktyg används tillsammans med en kraftfull bildbehandlingspipeline bestående av elektronmikroskopi, ljusmikroskopi (fluorescerande och icke-fluorescerande) och hel djuravbildning som μ-CT, kan en grundlig utvärdering av molekyler, celler, vävnader, organ och hela organismen uppnås, vilket möjliggör en mycket djupare förståelse för genfunktionen.

Detta protokoll fokuserar på användningen av μ-CT i den icke-däggdjursmodellorganism Drosophila melanogaster, vars otaliga genetiska verktyg har hjälpt till att belysa många molekyläramekanismer 26,27. Det antogs från tidigare protokoll i icke-modell insekter1,28,29,30,31,32, och bygger av tidigare μ-CT studier i Drosophila för att upprätta ett standardiserat protokoll för dess användning i detta djur33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Stegen för lyckad provberedning, bildbehandling och analys av μ-CT-datamängder med kommersiellt tillgängliga skannrar beskrivs. Med detta protokoll kan alla utvecklingsstadier i flugan visualiseras med hög upplösning för både beskrivande och hypotestestande studier, inklusive taxonomi, anatomi, utveckling, fysiologi och sjukdom27. Detta protokoll kommer också att vara användbart för avbildning av praktiskt taget alla insekter och till och med icke-levande material som kräver kemisk färgning för bildkontrast för att förbättra visualiseringen μ-CT.

Protocol

1. Urval av prov och nagelbandsberedning

  1. Välj lämplig utvecklingstidpunkt (embryo, larva, poppa eller vuxen) för avbildning.
    1. För embryonala stadier, burkvinnor på druvjuice agar tallrikar utsmetade med jästpasta och samla ägg var 30-60 min. Låt dessa embryon utvecklas vid 25 °C tills rätt steg har uppnåtts.
    2. För larvstadier, samla första och andra instars från tidsindlade embryosamlingsexperiment. Välj direkt vandrande 3rd instars från sidan av matflaskan under icke-trängselförhållanden.
    3. För poppig timing, samla vita pre-pupae (inverterade spiracles) och notera den tid då nagelbandet börjar bruna. Djur kommer att gå igenom 15 stadier av poppal utveckling vid definierade tidpunkter efter nagelbandsbrunning och kan samlas in i enlighet därmed42.
    4. Samla vuxna som oskulder efter eclosion och låt åldras i en matflaska under en önskad tid (t.ex. 5 dagar för fullständig tarmutveckling).
  2. Överför 5-50 djur till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör på 1 ml 0,5 % Triton X-100 i 1x fosfatbuffrad saltlösning (0,5 % PBST). Medan du knackar röret regelbundet på bänkskivan, inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur (RT) för att hjälpa till att avlägsna den hydrofobiska beläggningen och låta djur bli helt nedsänkta.
    1. För embryonala, larv- och pupalsteg, stoppa vidareutveckling genom att placera röret i ett värmeblock inställt på 100 °C i 20 s följt av kylning vid RT i 5 minuter.
      OBS: Djur kan också blixtfrysas i flytande kväve37.

2. Fixering och färgning

  1. Ta bort 0,5 % PBST och tillsätt 1 ml Bouins lösning. Kranrör för att säkerställa att djuren är helt nedsänkta.
    VARNING: Bouins lösning innehåller formaldehyd. Det kan orsaka akut toxicitet för hud och ögon om det spills och kan vara dödligt om det sväljs. Använd handskar, skyddsglasögon och labbrock vid hantering.
    OBS: Ytterligare fixeringstekniker kan också användas, till exempel användning av etanol. Fördelarna med andra fixativ beskrivs i detalj i ref.1,30.
    1. För embryo- och vuxenprover, inkubera på bänkskivan i 16-20 h på RT.
    2. För larv- och pupalprover, fixera djur i 2 timmar på RT. Kassera Bouins lösning och tvätta med 1x PBS i 5 min tre gånger. Överför till en multi-well dissekeringsform som innehåller 1x PBS och använd en liten minutienstift fäst vid en hållare för att peta ett hål i den främre och bakre nagelbanden var noga med att inte störa någon underliggande mjukvävnad.
    3. Överför larv- och poppalprover tillbaka till ett mikrofugerör och tillsätt 1 ml färsk Bouins lösning. Inkubera på bänkskivan i 24 timmar på RT.
  2. Ta bort Bouins lösning och tvätta provet i 30 min med 1 ml μ-CT tvättbuffert (0,1 M Na2HPO4,1,8% sackaros) eller 1x PBS tre gånger.
  3. Tillsätt 1 ml av lämplig färglösning och inkubera på bänkskivan i 2-7 dagar.
    OBS: Fläckvalet beror på många faktorer, men är i allmänhet en balans mellan penetration, inkubationstid och upplösning. I allmänhet ger fosfotungstisk syra (PTA) överlägsen kontrast och upplösning av mjukvävnad men kräver mekanisk störning av nagelband och längre inkubationstider. Fördelarna med olika fläcktyper beskrivs i detalj i ref.1.
    1. För jodfärgning, använd 1 ml 0,1 N I2KI (Lugol Solution). Inkubera i 2 dagar. Inga ytterligare störningar av den vuxna nagelband är nödvändigt.
    2. För fosfotungstisk syrafärgning (PTA) använd 1 ml av en 0,5% (w/v) lösning utspädd i vatten. Stör den vuxna nagelbanden, antingen genom att ta bort mundelarna eller peta hål i bröstkorgen eller buken nagelband med en liten minutien stift fäst vid en hållare. Inkubera i 5-7 dagar, eller längre om vävnadsfärgning verkar icke-homogen.
  4. Tvätta med 1 ml ultrapurvatten eller 1x PBS i 30 min. Upprepa tvättsteget. Förvara djur på RT i ultrapure vatten eller 1x PBS i upp till en månad.
  5. Om djur ska skannas medan de hydratiseras, fortsätt direkt till avsnitt 4. Om längre bevarande av provet behövs, fortsätt till avsnitt 3 i protokollet.

3. Torkning av kritiska poäng (tillval)

  1. Utför en etanol (EtOH) uttorkningsserie på provet: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Tillsätt 1 ml EtOH-lösning och inkubera på bänkskivan i 1 timme för varje koncentration i den angivna ordningen.
  2. Efter den sista 100% EtOH blötläggning, ersätt med färska 100% EtOH och låt prov inkubera på bänkskivan över natten.
  3. Utför kritisk punkttorkning av prover enligt tillverkarens instruktioner.
    OBS: Elektronmikroskopianläggningar har i allmänhet en kritisk punkttorkningsmaskin (se materialförteckning)som kommer att utföra torkningen av provet efter EtOH-uttorkning.

4. Provmontering

  1. För kritiskt punkttorkade prover, varma limprover till en insektsstift eller annan hållare som är utformad för att passa in i chucken på det roterande stadiet eller placera den i ett plast- eller glaskapillaryrör (~ 1,0-1,25 mm innerdiameter).
  2. För hydratiserade prover, fyll en P10-pipettspets med vatten och säkra den smala änden genom antingen värmetätning eller paraffinfilm för att förhindra läckage.
    VARNING: Var noga med att linda alla anslutningar tätt så att vatten inte läcker in i skannern och orsakar skador.
    1. Överför ett enda prov till pipettspetsen med tång. Använd ett långt, smalt föremål, till exempel en matt 20 G-nål eller en annan pipettspets, tryck försiktigt ner provet i spetsen tills det bara kommer i kontakt med rörspetsens vägg för att hålla den på plats.
    2. Täck pipettspetsens öppning med paraffinfilm för att förhindra avdunstning av vatten under långa skanningar.
    3. Montera P10-pipetten med en hållare som är utformad för att passa in i chucken på det roterande stadiet(figur 1A-C).

5. Skanning

  1. Utför nödvändiga kalibreringar av maskinen före avbildning för dagen.
    OBS: Dessa varierar beroende på tillverkare och det rekommenderas att rådgöra med en applikationsspecialist för att bestämma rätt steg. Se materialförteckningen för specifik information om den installation och programvara som används i det här protokollet. Kalibreringar, t.ex. en scenaxeljustering för att ta bort alla "wobble" som är associerade med att chucken är utanför axeln i förhållande till det roterande stadiet och utför plattfältskorrigeringar för att säkerställa enhetliga bakgrundspixelintensiteter på kameran ger optimala bildförhållanden för bästa upplösning och datamängder som är jämförbara över flera skanningar.
  2. Öppna skannerdörren för att få tillgång till den roterande scenchucken genom att klicka på ikonen "Öppnadörr " i det övre vänstra hörnet av programvaran. Fäst provet genom att dra åt kragen runt provhållarens botten.
    OBS: Använd försiktigt tryck när du fäster provet på den roterande chucken för att bibehålla skannerns inriktning.
  3. Ställ in skanningsparametrar i programvaran som styr skannern för optimal upplösning och kontrast.
    OBS: Dessa måste bestämmas empiriskt eftersom röntgenkällan, kameran / detektorn och geometrin för varje skanner kommer att variera beroende på tillverkare. Ytterligare information för att välja de bästa parametrarna finns ocksåhär 43, liksom från tillverkarens applikationsspecialist.
    1. Öppna strömkontrollen för röntgenkällan (Alternativ | Röntgenkälla). Använd skjutreglaget för att ställa in röntgenspänningen på 30-40 kV och ström till 100-110 μA för att producera en röntgenstråle med 3-4 W effekt och en liten dekorstorlek för förbättrad upplösning.
    2. Använd dialogrutan Anskaffningslägen (Alternativ | Förvärvslägen) för att ställa in kamerans exponeringstid till 500-800 ms.
    3. Använd skjutreglaget bredvid förstoringsglasikonen längst ner i programvaran för att ställa in önskad bildpixelstorlek (~ 700 nm till 4 μm), beroende på kamerans inställningar och position. Detta avgör antalet projektionsbilder som förvärvas under skanningen, med fler projektioner som leder till förbättrad upplösning men längre skanningstider (se Representativa resultat).
    4. Klicka och dra skjutreglaget bredvid den roterande pilen längst ned i programvaran för att flytta exemplet längs dess 360° rotationsbana. Se till att exemplet håller sig inom synfältet.
  4. Klicka på ikonen" Startaförvärv " (blå cirkelpilsikonen) högst upp i programvaran. En dialogruta visas som gör att ytterligare skanningsparametrar kan ställas in och att fil- och utdatamappen där genomsökningen sparas kan namnges.
    1. Ställ in den slumpmässiga rörelsen på 10 och genomsnittliga 4-6 bildrutor. Rotationssteget beräknas automatiskt beroende på vilka kamerainställningar som används.
  5. Börja skanna genom att klickapå OKi dialogrutan Förvärv. En andra dialogruta i förloppsindikatorn visas som visar genomsökningstiden. Skannern kommer nu att få en serie projektionsbilder (figur 1D) av provet längs rotationsvägen och behöver inte övervakas.

6. Återuppbyggnad

  1. För att generera tomogrammen utför du bildrekonstruktion med projektionsbilderna.
    OBS: Medan nästan all rekonstruktion av bilder från konstrålegeometriskannrar förlitar sig påFeldkamp-algoritmen 16, kommer enskilda parametrar att variera beroende på programvaruimplementeringen och bör bestämmas empiriskt. Följande inställningar, som är specifika för en kommersiellt tillgänglig programvara (se Materialförteckning)kan användas som vägledning. Parametrar som feljusteringskompensation, minskning av ringartefakter och bomhärdningskorrigering (0% för de flesta flugprover) utförs på ett iterativt sätt för att välja de bästa värdena för den slutliga rekonstruktionen. För avancerade användare som vill ha mer kontroll över rekonstruktionsprocessen, se MATLAB-gränssnittet här44.
  2. Utför en inledande bildjustering genom att använda en skiftkorrigeringsalgoritm baserad på referensskanningar45 (Åtgärder | X/Y-justering med en referenssökning).
  3. Finjustera varje rekonstruktionsparameter( Start | Finjustering). Då aktiveras dialogrutan "Finjustering av parameter".
    1. Finjustera justeringen genom att klicka' Nästa ' till 'Efterjustering'. Ange antalet iterationer till fem och parametersteget till 1,0. Klicka på Start för att generera en serie förhandsgranskningar. Markera den bild som är korrekt justerad.
      OBS: En korrekt justerad bild kommer inte att vara suddig eller visa "klippning" artefakter där en annars kontinuerlig struktur (till exempel nagelband) verkar delad.
    2. Finjustera minskningen av ringartefakten genom att klicka bredvid den. Ange antalet iterationer till fem och parametersteget till 1,0. Klicka på Start för att generera en serie förhandsgranskningar. Välj den bild som innehåller minst antal ringar.
  4. När ovanstående parametrar har optimerats för att ge bästa bild, se till att de valda värdena är korrekt representerade på fliken Inställningar (Inställningar).
  5. Justera eventuella slutliga ljusstyrk- och kontrastvärden med histogrammet, filparametrar som bitdjup och typ och använd ett intresseområde (ROI) som endast omfattar de strukturer som är av intresse (t.ex. endast helfluga eller huvud) för att minska beräkningstiden (Utdata).
  6. Påbörja rekonstruktionen (Start | Börja). Om flera rekonstruktioner krävs lägger du till den aktuella avbildningen i batchhanteraren (Start | Lägg till i batch) och upprepa steg 6.2-6.5 för de återstående bilderna.

7. Bildanalys

  1. Visualisera tomogram i två och tre dimensioner och utför ytterligare morfometrisk analys med freeware eller kommersiell programvara.
    Obs: Information om programvaran som används i detta protokoll finns i materialförteckningen. Andra programvarupaket som kan utvärdera μ-CT-datamängder inkluderar freeware-alternativ som FIJI46,Seg3D (www.seg3D.org)47och ITK-SNAP48, plus kommersiell programvara (t.ex. AMIRA). Andra program som använder maskininlärningsbaserade algoritmer för att halvautomatisera segmenteringsprocessen kan hjälpa till att påskynda arbetsflöden och minska mänsklig partiskhet (t.ex. Biomedisa49).
  2. Importera tomogramfilen till programvaran (Fil | Importera bildfiler). Metadata som är associerade med filen ska automatiskt läsas in i fönstret men kan också ställas in manuellt för att matcha bildegenskaperna.
  3. Om du vill segmentera en intressestruktur klickar du på fliken Segment till vänster på skärmen. Skapa en ny intresseregion (ROI)(Grundläggande | Ny), ge den ett namn och välj en lämplig färg.
  4. Definiera det tröskelvärde som omfattar intressestrukturen ( Intervall| Definiera område) med skjutreglaget.
  5. Välj ett lämpligt verktygsläge för 2D- eller 3D ROI-målare (ROI Painter | Penselalternativ).
  6. Så här målar du ett område som definieras av tröskelvärdet. Tryck och håll ned Ctrl medan du håller ned vänster musknapp. Om du vill ta bort ett område håller du ned Skift-tangenten medan du håller ned vänster musknapp.
    OBS: Om du vill ändra storleken på cirkulär eller fyrkantig pensel bläddrar du bara i mushjulet medan du håller ned Ctrl- eller Skift-tangenterna.
  7. Fortsätt att måla intressestrukturen under hela Z-volymen.
  8. Konvertera AVKASTNINGEN till ett nät(export | Till en mesh | Normalt).
  9. Markera nätöverlägget genom att klicka på det på panelen Dataegenskaper och inställningar i det övre högra hörnet.
  10. Jämna ut nätet med ett lämpligt antal iterationer (Smooth Mesh | Iterationer).
    OBS: Använd samma nätutjämnings iterationsvärde för alla bilder som ska jämföras.
  11. Se till att mätningarna av mesh ROI(Surface Area, Volume och Feret Diameter)visas på informationspanelen till höger på skärmen för grundläggande morfometrisk analys. Ytterligare analys kan utföras med hjälp av objektanalysmodulen.
  12. Återge nätobjektet och hela tomogrambilden och visualisera i 3D. Använd den inbyggda Movie Maker för att generera en video av objektet (Högerklicka | Visa Movie Maker) med hjälp av enskilda bildrutor från visningsvisaren(Lägg till nyckel).
    OBS: Flera visuella förbättringar kan också tillämpas på filmen med hjälp av fliken visuella effekter på höger panel för att markera vissa funktioner etc.
  13. Exportera videon för visning med knappen Exportera animering i Movie Maker.

Representative Results

Figur 2 visar bilder av ett embryo, 3rd instar larver, puppar på fafat vuxenstadiet (P7) och en vuxen kvinna som flyger fläckad med jod och avbildas hydratiserad i vatten med hjälp av en kommersiell bänkskanner. Utmärkt bevarande och även färgning av känsliga vävnad är uppenbara, så att alla större organ lätt kan identifieras och användas för morfometrisk analys och 3D-visualisering.

Vanligtvis ger skanningar som får färre projektionsbilder av provet lägre upplösning än skanningar som förvärvar fler projektionsbilder, där kompromissen är tidss spenderad skanning. Även om skanningstiderna varierar beroende på instrument och andra skanningsparametrar, tar skanningar som förvärvar några hundra projektioner (~ 3 μm bildpixelstorlek) ungefär 30 min per prov, medan skanningar bestående av tusentals projektionsbilder (700 nm-1,25 μm bildpixelstorlek) kan ta 8-16 h. En jämförelse av samma vuxna flughuvudkropp som tagits i både "långsamt" (tusentals projektioner) och "snabbt" (hundratals projektioner) skanningsläge visas i figur 3. Det är viktigt att morfometriska analyser inte skiljer sig mellan "långsamma" och "snabba" skanningar(figur 3C)40. Vår bildbehandlingspipeline använder därför snabba skanningar för att generera en tillräckligt stor provstorlek för morfometrisk analys och långsamma skanningar för att visualisera morfologiska eller anatomiska defekter med högre upplösning. Med hjälp av programvaran (steg 7) kan alla vävnads- eller organsystem av intresse segmenteras och användas för morfometrisk analys och visualiseras i 3D med hjälp av filmskaparen (Film 1).

Figur 4 visar ett exempel på flug buken fläckad med PTA och avbildad hydratiserad (vatten) eller efter kritisk punkttorkning (CPD) på ett röntgenmikroskop (Materialförteckning). Detaljerna i en kombination av PTA och kapaciteten hos denna plattform är lätt uppenbara i dessa bilder, så att enskilda epitelceller i midgut- och spermiebuntarna i testikelerna lätt löses. Medan CPD-bilden visar marginellt ökad upplösning jämfört med det hydratiserade provet, uppnås bättre bevarande av ultrastrukturen hos känsliga vävnader (såsom fettcellerna nära nagelbandet) med hydratiserade prover (Film 2).

Figure 1
Bild 1: Översikt över skannerdesign och provmontering μ-CT. A)En kommersiell bänkskiva μ CT-skannern. B)Visa inuti skannern. Röntgenkällan (till höger) avger röntgenstrålar som passerar genom provet på ett roterande stadium (gul pil). Dämpning av dessa röntgenstrålar genererar bildkontrast när de passerar genom provet och på detektorn, som består av en scintillationsskärm som omvandlar röntgenstrålar till fotoner och en vanlig CCD-kamera (vänster). C)Montering av en vuxen fruktfluga för hydratiserad avbildning i vatten. Anslutningspunkterna mellan pipettspetsen och mässingshållaren är inlindade i paraffinfilm för att förhindra läckage och eventuella skador på skannern. Scenchucken är också markerad. Observera att pipettspetsen var placerad något utanför axeln, vilket ledde till en längre skanningstid och minskad upplösning i den slutliga rekonstruktionen. D)En enda 2D-projektionsbild av en vuxen kvinnlig fluga. hundratals till tusentals av dessa projektioner förvärvas under en skanning längs rotationsaxeln och används för återuppbyggnad för att generera tomogram som innehåller isotropisk upplösning och korrekt 3D-information. Skalstänger (C) = 2 mm. P, Bakre; V, Ventral. Denna siffra har ändrats från Schoborg et al.40. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Alla Drosophila melanogaster livscykelstadier, avbildade av μ-CT. Prover färgade med jod och avbildade hydratiserade i vatten. Visas är en enda 2D-skiva. A)Ett embryo som har slutfört de tidiga stadierna av gastrulation (asterisk). B)En tredje instar larva. (C) En P7-facit vuxen under metamorfos. (D)En vuxen kvinna. Olika organ markeras: BWM, kroppsväggsmuskler; Br, hjärna; Cd, cardia; Cr, gröda; DLMs, dorsala längsgående muskler; DVM, dorsala ventrala muskler; E-AD, ögonantennskiva; Em, embryo; FB, feta kroppar; FBC, fettkroppsceller; H, hjärta; Hg, hindgut; La, lamina; L, ben; Mg, midgut; OL, hjärnoptisk lob; Ov, ovipositor; PC, pupal nagelband; SG, salivkörtlar; VNC, ventral nerv sladd; W, vinge; WD, vingskiva. Skalstänger (A) = 100 μm; B)-D= 500 μm. D, Dorsal. A, Främre; L, vänster. Skanningsparametrar: Källa till provavstånd (mm): (A, D) 36.5, B) 48.8, (C) 40.3. Källa till kameraavstånd (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Kamerans pixelstorlek (μm): (A-D) 11,6. Bildpixelstorlek (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Skanningsparametrar och bildupplösning ändrar inte morfometriska analyser. Ett vuxenhuvud skannat med både(A, A') "snabba" skannerinställningar (hundratals projektioner) och (B, B') "långsamma" skannerinställningar (tusentals projektioner). Hjärnan är skisserad i gult. (C) Hjärnvolymmätningar från långsamma och snabba skanningar. Markerade strukturer: AL; antennlob; CB, central hjärna; FB, fläktformad kropp; FCs, fettceller; La, lamina; Lo, lobula; LoP, lobulaplatta; Jag, medulla; Näthinna. n = 5, Welchs t-test. ns = inte signifikant. Skalstänger = 100 μm. Skanningsparametrar: Källa till provavstånd (mm): (A) 44.4, B) 36.5. Källa till kameraavstånd (mm): (A) 348 (B) 350. Kamerans pixelstorlek (μm): (A-B) 11,6. Bildpixelstorlek (μm): (A) 2,95, (B) 1,2. Denna siffra har ändrats från Schoborg et al.40. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Bild 4: Drosophila melanogaster buken avbildas av röntgenmikroskopi. Buken var fläckade med 0,5% PTA och avbildas hydratiserade (vatten) eller efter kritisk punkttorkning (CPD). (A) Kritisk punkt Torkad buk, visas ur YZ-perspektivet och (A') XZ-perspektivet. B)Hydratiserad buk, visad ur YZ-perspektivet och (B') XZ-perspektivet. Olika organ markeras: FC, fettceller; Hg, hindgut; Mg, Midgut; SP, Sperm Pump; Te, testiklar. Skalstänger (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Främre; L, vänster. Skanningsparametrar: Källa till provavstånd (mm): (A) 6.7, (B) 7. Källa till kameraavstånd (mm): (A) 28 (B) 29,5. Syfte: (A-B) 4X. BildPixelstorlek (μm): (A-B) 0,65. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Film 1: En tredje instar larva, renderad i 3D med Movie Maker i Dragonfly. Markerade organ inkluderar hjärnan (gul), ögonantenn imaginala skivor (röd), fettkropp (blå) och kroppsväggsmusklerna (gröna). Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film 2: Jämförelse av prover avbildade i vatten eller följ kritisk punkttorkning. Buken färgas med 0,5% PTA visas. Båda buken skannades med identiska bildpixelstorleksinställningar (0,65 μm). En serie 2D-skivor visas i ett "Z-stack" -format (YZ) som börjar vid dorsala ytan och slutar vid bukens ventrala yta. Markerade organ: FC, fettceller; Mg, Midgut; SP, Sperm Pump; Te, testiklar. Skanningsparametrar: Källa till provavstånd (mm): (A) 6.7, (B) 7. Källa till kameraavstånd (mm): (A) 28 (B) 29,5. Syfte: (A-B) 4X. BildPixelstorlek (μm): (A-B) 0,65. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Discussion

Visualisering intakt Drosophila melanogaster i alla utvecklingsstadier har förblivit en utmaning, främst på grund av inkompatibiliteten hos ljusmikroskopi med den tjocka, pigmenterade nagelband som finns i detta djur. Medan andra hela djurtomografimetoder, såsom Magnetic Resonance Imaging (MRI), Optical Coherence Tomography (OCT) och ultramikroskopi i kombination med vävnadsrensning har använts med framgång iflugor 50,51,52,53,54, μ-CT presenterar ett antal fördelar som gör det idealiskt för hela djuravbildning av denna organism13,15,30 . Röntgenstrålar tränger lätt in i den pigmenterade nagelbanden och deras lilla våglängd möjliggör submikronavbildning. Märkning kräver minimala investeringar i allmänt tillgängliga kemikalier och inga specialiserade bänkfärdigheter13. μ-CT-skannrar är också kommersiellt tillgängliga, och kostnaderna är jämförbara med lätta mikroskopiplattformar, samtidigt som de är mer attraktiva för ett bredare spektrum av discipliner (geologi, paleontologi, teknik etc.) som också kan dra nytta av dess tillgänglighet vid en institution. Synkrotronröntgenkällor kan också användas för högupplöst μ-CT-avbildning av fasta och levande insekter31,55,56, men är mindre tillgängliga än kommersiella bänkskannrar.

Detta protokoll ger ett effektivt sätt att μ av flyg-vuxna, poppa, larva och cellulära embryon. Observera att för många av stegen som beskrivs ovan kan alternativa metoder också tillämpas för att förbereda prover för avbildning. Andra studier har gett en detaljerad jämförelse av olika fixerings-, märknings- och torksteg för användning i insekter och de som är intresserade av att anta denna teknik uppmuntras att utvärdera fördelarna med varjetillvägagångssätt 1,4,13,29,30,57. Även om detta protokoll är relativt enkelt, presenteras några användbara förslag.

För det första bör försiktighet vidtas när nagelband av intakta exemplar störs så att underliggande mjuka vävnader inte störs avsevärt. Det är viktigt att låta larv och tidiga pupalsteg genomgå fixering i 2 timmar i Bouins lösning innan du petar. Detta kommer att stelna vävnaden och begränsa mängden hemolymf som kommer att ooze ut ur nagelbandshålen, vilket kan förändra organarkitekturen. Enskilda kroppssegment (huvud, bröstkorg och buk) hos den vuxna kan separeras om strukturen eller strukturerna av intresse finns där. Det rekommenderas att använda en skalpell för att rent skära igenom dessa segment snarare än att dra isär dem med tång, vilket kan störa tarmens eller centrala nervsystemets 3D-arkitektur, till exempel. När det gäller timing behöver vuxna i allmänhet bara 16 timmar. för fullständig fixering, medan larv- och pupalsteg behöver 24 timmar. Om jod- eller PTA-färgning verkar ojämn kan provet också placeras tillbaka i lösning för att inkubera längre tills jämn färgning uppnås. Slutligen bör hydratiserade prover inte placeras vid 4 °C, eftersom detta verkar inducera bildandet av luftbubblor i kroppshålan efter uppvärmning till rumstemperatur.

För det andra varierar provmonteringen beroende på instrument, scentyp och om provet behöver förbli hydratiserat eller har torkats. Om det är hydratiserat, se till att provet inte läcker och eventuellt förstör skannern. När du monterar provet inuti en pipettspets, var noga med att trycka försiktigt med ett dämpat föremål tills proverna stöter på lite motstånd och inte kan röra sig. Att trycka för hårt kan leda till nagelbandsdeformation och underliggande strukturella defekter. Se också till att provet är justerat i hållaren så nära rotationsaxeln som möjligt. Eventuell wobble kommer att öka skanningstiderna på grund av det större synfältet och minska upplösningen av det slutliga tomogrammet efter återuppbyggnaden.

För det tredje varierar skannerinställningarna för att hämta projektionsbilder också beroende på instrument. För att maximera skannerns upplösningskapacitet bör röntgenstrålens dekorstorlek vara så liten som möjligt (5-10 μm). Detta kan uppnås genom att balansera röntgenspänning och ströminställningar så att den totala strömmen är 3-4 W. Med dessa inställningar och lämplig exponeringstid på kameran kan korrekt röntgenstråledämpning av provet och optimal bildkontrast uppnås. Användningen av aluminium- eller kopparfilter mellan objektet och röntgenkällan kan användas för att finjustera de optimala röntgenenergiinställningarna för bästa bildkontrast eller dämpa strålen tillräckligt för att högre drivna källor ska kunna användas. När det gäller bildupplösning beror detta på många olika variabler, inklusive fläcktyp, antal projektionsbilder, bildpixelstorlek, kameraposition, provrörelse, skannervibrationer och rekonstruktionsparametrar. En stapelmönsterfantom (QRM GmbH) som innehåller markörer för kända storlekar kan hjälpa till att utvärdera rumslig upplösning för en viss skanner och kamerainställning.

Det är också värt att utvärdera fördelarna med att avbilda kritiska punkttorkade eller hydratiserade prover. Sombke et al. gjorde en jämförande bedömning av de två metoderna och fann att kritisk punkttorkning var överlägsen för μ-CT-applikationer som omfattade leddjur30. Fördelarna med hydratiserade prover är dock att djur utsätts för mindre kemisk och mekanisk exponering som kan leda till både kvantitativa och morfologiska artefakter. Detta tenderar också att bevara känsliga vävnader bättre än CPD. Hydratiserade prover har dock en mycket kortare hållbarhetstid och bör avbildas senast en månad efter fixering eftersom vävnadsnedbrytning och minskad bildkvalitet blir uppenbar vid den tidpunkten. Upplösningen av hydratiserade prover kommer också att vara något mindre än ett kritiskt punkttorkat prov, eftersom röntgenstrålar också måste tränga igenom både en plastpipettspets och den omgivande vätskan (vatten eller buffert). Kritiska punkttorkade prover kan bevaras under mycket längre tidsperioder, särskilt när de hålls på drierit. De kan också placeras direkt i röntgenstrålens väg genom att helt enkelt limma vingarna eller benen till en insektsstift och placera den i scenchucken, vilket förenklar monteringsprocessen. Den omfattande etanoldehydrering av dessa prover kan dock leda till vävnad krympning och förlust av känsliga vävnad arkitektur, varför det är viktigt att utföra en rad ökande EtOH koncentrationer för att minimera dessa effekter. Det bör dock noteras att alla former av kemisk behandling, inklusive paraformaldehydfixering och till och med jodfärgning kan orsaka vävnadskrympning58,59. Även om ingen av metoderna kommer att ge mätningar av "faktisk organstorlek" i en levande fluga, är morfometriska mätningar fortfarande giltiga när man jämför mutanta och vilda djur så länge fixerings-, färgnings- och torkstegen utförs på samma sätt för båda provuppsättningarna – helst parallellt.

Sammanfattningsvis ger μ-CT ett användbart helt djuravbildningsverktyg för Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Många andra studier har visat kraften i denna teknik för att förstå olika aspekter av insekts taxonomi, ekologi, fysiologi, utveckling och anatomi som kan hjälpa till att informera framtidastudier i flugor 1,28,30,31,32,55,56,57 . I kombination med de genetiska och lätta mikroskopiverktyg som redan används i stor utsträckning i denna organism kan μ-CT positionera sig inom en experimentell pipeline som möjliggör en djupare förståelse mellan genotyp och fenotyp.

Disclosures

Författaren förklarar inga konkurrerande eller ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Inget av detta hade varit möjligt utan stöd från Nasser Rusan. Jag vill tacka H. Doug Morris, Danielle Donahue och Brenda Klaunberg från NIH Mouse Imaging Facility och Ben Ache från Micro Photonics för utbildning och hjälpsam diskussion. Jag tackar också Mansoureh Norouzi Rad från Zeiss för att ha skannat bukprover på Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith och Rachel Ng hjälpte också till med skanning. Mike Marsh från Object Research Systems tillhandahöll Dragonfly teknisk support. Jag är också tacksam för stöd från National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) och Start Up Funds från University of Wyoming. Jag tackar också de anonyma granskarna för deras hjälpsamma förslag och kommentarer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  2. Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
  3. Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
  4. Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
  5. Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
  6. Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
  7. Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
  8. Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
  9. Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
  10. Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
  11. Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
  12. Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
  13. Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
  14. Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
  15. Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , Springer. 2 (2019).
  16. Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
  17. Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
  18. Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
  19. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), International Mouse Knockout Consortium 9-13 (2007).
  20. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  21. Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
  22. Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
  23. Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
  24. Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
  25. Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
  26. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  27. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  28. Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
  29. Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
  30. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
  31. Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, Pt 1 51-71 (2007).
  32. Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
  33. Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
  34. Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
  35. Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
  36. Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
  37. Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
  38. Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
  39. Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, Pt 4 374-377 (2008).
  40. Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
  41. Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
  42. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  43. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
  44. Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
  45. Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. CIBC Seg3D: Volumetric Image Segmentation and Visualization. Scientific Computing and Imaging Institute (SCI). , Available from: http://www.seg3d.org (2016).
  48. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  49. Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
  50. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
  51. Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
  52. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
  53. Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
  54. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  55. Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
  56. Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
  57. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  58. Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
  59. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).

Tags

Utvecklingsbiologi Utgåva 163 Drosophila melanogaster mikrodatortomografi preklinisk avbildning bildanalys modellering av mänskliga sjukdomar fenotypning
Hel djuravbildning <em>av Drosophila melanogaster</em> med mikrodatortomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging More

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter