Summary
Her foreslår vi en metode til effektivt at opnå enkelte muskelfibre i de tidlige postnatale udviklingsstadier fra homozygot mutant Lamin Δ8-11 musemodel, en meget alvorlig model for Emery-Dreifuss muskelsvind (EDMD).
Abstract
Autosomal dominerende Emery-Dreifuss muskelsvind (EDMD) er forårsaget af mutationer i LMNA genet, som koder A-type nukleare lamins, mellemliggende filament proteiner, der opretholder den nukleare kuvert og komponenterne i nukleoplasma. Vi har for nylig rapporteret, at muskelsvældning i EDMD kan tilskrives iboende epigenetiske dysfunktioner, der påvirker muskel (satellit) stamceller regenerativ kapacitet. Isolation og kultur af enkelt myofibers er en af de mest fysiologiske ex-vivo tilgange til at overvåge satellitceller adfærd inden for deres niche, da de forbliver mellem den basale lamina omkring fiber og sarcolemma. Derfor repræsenterer det et uvurderligt eksperimentelt paradigme at studere satellitceller fra en række murine modeller. Her beskriver vi en re-tilpasset metode til at isolere intakt og levedygtige enkelt myofibers fra post-natal hindlimb muskler (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius og Soleus). Efter denne protokol, vi var i stand til at studere satellitceller fra Lamin Δ8-11 -/- mus, en alvorlig EDMD murine model, på kun 19 dage efter fødslen.
Vi beskriver isolationsproceduren, samt de kulturbetingelser for at opnå en god mængde myofibere og deres tilhørende satellit-celler-afledtafkom. Når dyrket i vækst-faktorer rige medium, satellitceller stammer fra vilde type mus aktivere, formere sig, og i sidste ende differentiere eller undergå selvfornyelse. I homozygot Lamin Δ8-11 -/- mutant mus er disse evner alvorligt svækket.
Denne teknik, hvis strengt fulgt, gør det muligt at studere alle processer i forbindelse med myofiber-associerede satellitcelle selv i tidlige post-natal udviklingsstader og i skrøbelige muskler.
Introduction
Skeletmuskulatur er et differentieret væv med en af de mest udvidede evne til at regenerere efter træning eller traume1. Denne egenskab skyldes hovedsagelig tilstedeværelsen af stamceller, kaldet satellitceller på grund af deres perifere position mellem basal lamina og plasmalemma af myofiber2. Under postnatal udvikling, satellitceller formere sig og gradvist differentiere, hvilket bidrager til skeletmuskulatur vækst. Når i voksenalderen, satellitceller indtaste en reversibel quiescent tilstand, og efter fysiologiske eller patologiske traumer, de aktiverer, formere sig og differentiere for at reparere de beskadigede muskler3. Fejl i satellitcellers evne til korrekt transit gennem disse forskellige regenerative faser og til at gennemgå selvfornyelse har været fast forbundet med muskelsvind , enten under fysiologiskaldring 4,5,6 eller i muskeldegenerative sygdomme, såsom muskeldystrotrohies7,8,9,10.
Der findes to hovedkulturtilgange til at studere satellitceller ex-vivo: primære myogene kulturer fra mononukleerede celler, mekanisk og kemisk adskilt fra hele muskler11,12; eller kultur af isolerede myofibere13,14,15,16,17,,18,19,20. I det første tilfælde indebærer processen med isolation af satellitceller trituration af hele muskler udvundet fra musen, en kemisk fordøjelse, filtrering og fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS)21. Selv om denne procedure er effektiv til at isolere satellitceller fra en række forskellige modeller, indebærer den flere variabler , der udsætter satellitceller for stress og forstyrrer deres fysiologiske niche22,23. Derimod, myofiber isolation indebærer en blidere fordøjelse af muskelvæv med matrix nedbrydende enzymer og en mekanisk makulering, der forårsager reduceret traumer til stamceller20. Denne anden tilgang giver mulighed for en langt mere effektiv hentning af levedygtige satellitceller, der forbliver fysisk knyttet til deres myofiber mellem basal lamina og sarcolemma, således at analysen inden for deres fysiologiske niche19,20.
Mange forskellige protokoller er blevet foreslået i løbet af de seneste år til korrekt og effektivt at isolere enlige myofibere fra skeletmuskulatur. Allerede i 1986 Foreslog Bischoff en protokol om at isolere fibre fra Flexor Digitorum Brevis13 og senere, i 1995, Rosenblatt et al. ændret protokollen for at opnå en mere effektiv adskillelse af myofibers14. Siden da har mange andre forfattere foreslået justerede procedurer på andre muskler, såsom Extensor Digitorum Longus (EDL) og Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, der er længere, selv om mere skrøbelige, muskler14. Isolerede myofibere kan derefter dyrkes både i vedhæftning, for at give mulighed for udvidelse af satellitceller-afledte myoblaster, eller i flydende forhold, op til 96 timer, at følge afkommet stammer fra enkelt satellitceller19 (Figur 1). Variable serumkoncentrationer i kulturmediet anvendes til at udløse aktivering, spredning og/eller differentiering af satellitceller for at undersøge deres evne til at passere korrekt gennem disse forskelligefaser 1.
Vi har for nylig beskrevet den epigenetiske mekanisme bag udmattelse af satellit stamceller pool i musemodellen af EDMD, Lamin Δ8-11 -/- mus7. Da disse mus normalt dør mellem 4-8 ugeraf alder 24,på grund af alvorlige muskeltab, et forsøg blev gjort for at fange de molekylære defekter, der ligger til grund for den tidlige debut af sygdommen ved at fokusere vores analyse på post-natal muskeludvikling. Flydende enkelt myofibers blev isoleret og dyrket af vildtype og Lamin Δ8-11 -/- mutant7 19 dage gamle mus. På dette stadium, muskeldefekter er allerede indlysende, men mus er stadig levedygtige. Men da alle de ovennævnte protokoller for enkelt myofibers ekstraktion blev optimeret til skeletmuskulatur af voksne mus, vi havde brug for at tilpasse dem til vores formål: meget små mus i form af alder og størrelse, og meget skrøbelige myofibers. Således beskriver vi her vores re-tilpasning af protokollen foreslået af Rudnicki laboratorium19 for at opnå et betydeligt antal enkelt levedygtige myofibers fra mus under postnatal udvikling og fra svær dystrofiske muskler, såsom dem, der stammer fra Lamin Δ8-11 -/- mus24. Det endelige mål med denne tilgang er at give en standardiseret procedure for undersøgelse af myofibers-associerede muskel stamceller i enhver anden musemodel, når de tidlige stadier af postnatal udvikling er af interesse, eller i tilfælde af musemodeller, der transporterer en specifik sygdom, der gør myofibere mere modtagelige for mekanisk stress.
Protocol
Alle forsøgsprocedurerne blev udført under etisk godkendelse fra det italienske sundhedsministerium og udvalget for institutionelle dyrepleje og -anvendelse (tilladelse n. 83/2019-PR). Dyrene blev opbevaret på et autoriseret anlæg på San Raffaele Hospital, Milano, Italien (tilladelse n. N. 127/2012-A).
1. Muskel dissektion og myofiber kultur
- Forberedelse af udstyr.
- Før du starter, forberedes alle de nødvendige løsninger som beskrevet i tabel 1. Disse løsninger skal være frisklavede.
- Rengør alle overflader og værktøjer, der vil blive brugt under proceduren med 70% ethanol.
- Før du starter med mus offer, udføre belægning på 100 mm og 35 mm petriskåle ved hjælp af Horse Serum (HS). Coat alle retter for at forhindre myofibers fra at binde sig til plast. Overvej at bruge en 100 mm skål og fire 35 mm retter pr. mus.
- Efter fjernelse af overskydende HS opbevares coatede fade i en kuvøse ved 37 °C i 30 min. Fyld den derefter med vaskeopløsning eller kulturmedium (to 35 mm retter pr. mus).
BEMÆRK: Alternativt kan en opløsning på 10% HS i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) bruges til at belægge fade. Brug altid belagte retter. Det er muligt at bruge kulturretter af forskellig størrelse, men små dimension petriskåle anbefales. - For fiberisolation tilberedes sterile Pasteurpipetter som vist i figur 2. For hver mus forberede en stor hul boring pipette til muskel håndtering og mekanisk disaggregation (Figur 2A) og et lille hul pipette for fibre udvælgelse (Figur 2B). Skær hver glaspipette, eventuelt ved hjælp af en diamantpen, til den ønskede længde og glat pipette kanter på en flamme.
- Coat hver pipette ved kort befugtning det med HS før brug.
- Mus offer og muskel dissektion
- Fordøjelsesopløsningen skal forvars dig ved stuetemperatur i 10 minutter, før dissektionsproceduren påbegyndes. Polypropylen FACS rundbundsrør er de bedst egnede beholdere til formålet.
- Umiddelbart før begyndelsen af muskel hentning, ofre musen i henhold til rette nationale IACUC anbefaling.
- Våd dens underkrop med 70% ethanol, før du skærer huden for at gøre fjernelsen af håret lettere.
- Sæt musen i en udsat position på en støtte af polystyren dækket med aluminiumpapir og skære huden fra midten af ryggen i længderetningen og i retning af benene.
- Fjern forsigtigt huden uden at røre muskler og sener. Det er muligt at flå al huden af.
- Skær de to ben af musen og hurtigt gå videre med dissektion.
BEMÆRK: Hvis det er mere behageligt, er det muligt at fortsætte dissektion på hele musen, men arbejder på benet giver mere mobilitet og præcision i de senere nedskæringer. - Fastgør benet på støtte på niveau med foden ved hjælp af en pin og begynde at isolere skeletmuskulatur af interesse i denne rækkefølge: TA, EDL, Gastrocnemius og Soleus.
- Løft den nederste sene af TA med en skarp pincet i ankelhøjde og skær det, derefter skæres med fin saks hele vejen rundt om TA musklen til den anden sene på niveau med patella (Figur 3A). Overføres til fordøjelsesopløsningen.
- Løft den nederste sene af EDL og adskille det fra andre muskler ved forsigtigt at trække det opad til den anden sene. Skær og læg det i fordøjelsesopløsningen.
BEMÆRK: Da EDL kan være meget lille, der skal skæres adskilt fra TA, kan de dissekeres sammen (Figur 3B). Derefter, hvis hele musklen er for stor, skær det i 2-3 stykker startende fra senen og efter fibrene i længderetningen (Figur 3C). - Drej benet viser rygmusklerne og fastgør foden ved hjælp af stiften. Løft Achilles sene, Gastrocnemius vil automatisk adskille sig fra andre muskler. Den øverste sene er oppe på bagsiden af patella. Skær det og tilføje musklen til fordøjelsen.
- Løft den udvendige sene af benet (med hensyn til kroppen) og få Soleus. Forsigtigt adskille det fra de andre muskler ved at rulle under med pincet.
- Gør det samme for det andet ben (trin fra 1.2.7. til 1.2.11.).
- Muskel fordøjelse
- Udfaktion af fordøjelsesopløsningen, der indeholder alle musklerne i et vandbad ved 37 °C i ca. 45-50 min. Under fordøjelsen tid, regelmæssigt kontrollere musklen for at undgå over-fordøjelse. Hver 10 min vende fordøjelsen rør 10x med en energisk bevægelse (undgå vortexing).
- Stop fordøjelsen, når musklerne begynder at løsne op og myofibers er synlige.
- I slutningen af fordøjelsen tid ryste prøverne.
- For at stoppe fordøjelsen overføres fordøjelsessuspensionen forsigtigt til en forvart 100 mm petriskål med 10 ml vaskeopløsning.
BEMÆRK: Undgå muskel over-fordøjelse, da dette uundgåeligt vil resultere i isolering af hyper-kontrakt myofibers. Normalt med denne protokol, muskler af homozygot mutant mus tage 45 min at blive fordøjet, mens muskler af vilde type mus tage 50-55 min. Fordøjelse tid skal eksperimentelt valideret.
- Enkelt myofibers isolation
- Først isolere fibrene allerede dissocieret under en dissekere mikroskop ved at plukke dem individuelt med en belagt P200 pipette eller lille hul Pasteur og overføre dem fra 100 mm Petri i en ny 35 mm petriskål med 5 ml forvarmt vaskeopløsning.
- At frigive yderligere myofibers, pipette musklen op og ned ved hjælp af et stort hul boring glas pipette med varmt medium, indtil fibrene er mekanisk frigivet. Må ikke være for vedholdende, da dette vil resultere i skadelige fibre.
- Fortsæt med at frigive myofibers fra musklen, indtil skålen indeholder en ønskelig mængde. Hvis petriskålen opbevares ved stuetemperatur i mere end 8 min.2
- Før du overfører de enkelte myofibere til kulturmediet, skal de efterlades ved 37 °C, 5% CO2 i vaskeskål i mindst 1 time. Dette hjælper myofibers at tilpasse sig in vitro tilstand.
BEMÆRK: Voksne myofibers er mindre modtagelige for stress og kan vaskes ~ 2-3x. Men i denne tilstand (ved 19 dage efter fødslen alder) er det bedre at udføre kun én vask skridt for at forhindre myofiber skader. Derfor altid være opmærksom på at holde udvalgte myofibers tilstrækkeligt ren ved ikke at bære snavs eller hypercontracted fibre.
- Single myofiber kultur
- Overfør individuelle myofibere til en ny forvart skål med passende kulturmedium (højt serummedium for at tillade aktivering af satellitceller, se figur 1).
- Skift mediet til de isolerede myofibers, ved at overføre dem til en ny belagt skål med nyt kulturmedium, først efter 48-72 h af kultur for at undgå enhver stress, der vil føre til myofibere hypercontraction og forstyrrelser.
2. Downstream applikationer: Myofibers crosslinking og immunofluorescens
BEMÆRK: De myofibers-associerede satellitceller kan visualiseres ved immunfluorescens (IF) på tidspunktet for interesse. Da de fleste af de offentliggjorte protokoller er optimeret til at udføre IF på voksne myofibers, her en detaljeret protokol præsenteres for at opnå pålidelige resultater også på myofibers isoleret fra post-natal muskler.
- Myofiber krydslinker
- Før du starter, forberedes alle de nødvendige løsninger som beskrevet i tabel 2.
- Precoat med HS så mange 1,5 ml mikrocentrifuge rør som antallet af prøver. Sørg for at fjerne alle HS, før du fortsætter. Da crosslinked fibre er hårdere end de levende og vanskeligere at pipette, skal du sørge for at crosslink omkring 200-300 fibre separat pr rør.
- Under en dissekere mikroskop, indsamle alle de fibre, der kan betragtes som sunde, overføre dem til mikrocentrifuge røret og lad røret lodret i 5 minutter inde i kuvøse at tillade fibre at bosætte sig.
- Fjern supernatant meget langsomt fra røret.
- Crosslink fibre ved at tilføje 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) ved RT til røret. Gør det forsigtigt for at undgå fibre nød.
- For at undgå, at fibrene flettes sammen under krydsningen, skal røret opbevares i meget skånsom omrøring i 10 min.
- Hold røret i lodret position i 5 min ved RT for at tillade fibre at bundfælde sig, og kassér derefter supernatanten for at fjerne størstedelen af PFA-volumen.
- Tilsæt 1 ml fosfat buffered saltvand (PBS) og hold rørene lodret i 5 min ved RT for at lade fibrene til sediment.
- Fjern supernatanten, og gentag vaskeproceduren (trin 2.1.8.) to gange igen.
- Der opbevares krydsforbundne prøver ved 4 °C.
BEMÆRK: Det er muligt at holde crosslinked myofibers ved 4 °C i en uge. Hvis fibrene forbliver mere end en uge i denne tilstand, vil dette uundgåeligt resultere i myofibers sammenbne.
- Immunofluorescens
- Hold rørene, der indeholder fibrene stående på RT i mindst 5 min for at give mulighed for fiber sedimentering.
- Fjern supernatant, efterlader bare en lille volumen for at være sikker på ikke at fjerne nogen fiber.
- Der tilsættes 1 ml 0,5% Triton X-100 i PBS og inkuberes i 5 min med let omrøring.
- Sæt rørene i lodret position i 5 min, derefter fjerne supernatant.
- Der tilsættes 1,5 ml PBS og inkuber med let omrøring i 5 min.
- Hold rørene i lodret position i 5 min.
- Der tilsættes 1 ml blokeringsopløsning og inkuberes i 1 time ved RT med let omrøring.
- Hold rørene 5 min i lodret position, og fjern derefter supernatanten.
- De primære antistoffer fortyndes i den blokerende opløsning, de tilsættes til rørene, og de inkuber over natten ved 4 °C i forsigtig omrøring (for foreslåede koncentrationer se materialetabel).
BEMÆRK: Alternativt kan det primære antistof inkuberes i 3 timer ved RT. Men natten inkubation gav optimal farvning. Inkubationsvolumenet for både primære og sekundære antistoffer skal være på 300 μL, når sedimenterede fibre når 100 μL hak af 1,5 ml mikrocentrifugerøret. Når fibrene er mindre rigelige, anbefales et volumen på 100-200 μL. - Lad rørene være i lodret position i 5 min. og fjern derefter supernatanten.
- 3 vaske i 1 ml af 0,25% Tween-20 i PBS, inkubering i 5 min i blid omrøring og derefter forlader rørene stående i 5 min hver gang.
BEMÆRK: Fra nu af, udføre alle de skridt i mørke, for at undgå fluorokromes blegning. - Sekundære antistoffer fortyndes i blokerende opløsning, de tilsættes til rørene og inkuberes i 1 time ved RT med forsigtig omrøring (for koncentrationer se Materialetabel).
- Der vaskes to gange i 1 ml 0,1% Tween-20 i PBS, inkuberes i 5 min med let omrøring og lad derefter rørene stå i 5 min.
- Supernatanten fjernes, der tilsættes 1 ml DAPI-opløsning, og inkuber i 5 min. med let omrøring.
- Lad rørene stå lodret i en rack i 5 min, derefter fjerne supernatant.
- Vask med 1 ml PBS, inkubering i 5 min med blid omrøring og derefter forlader rørene stå i en rack i 5 min.
- Supernatanten fjernes, så der efterlades et volumen på ca. 50 μL.
- Montering af fluorescerende mærket myofibers på mikroskop dias
- Skær en P200 pipette spids og pels det med blokering løsning
BEMÆRK: For at belægge spidsen, pipette opløsningen op og ned flere gange, før du vælger fibrene, vil dette undgå fibre til at holde sig til spidsen væggen. - Indsamle fibre fra røret og sprede dem på et mikroskop glas dias.
- Under en dissekere mikroskop, ved hjælp af kun det naturlige lys reflekteres af spejlet, bruge en ny (ikke skåret) P200 pipette spids til at sprede fibrene og til at fjerne den overskydende væskeopløsning.
- Lad objektglassene lufttørre i mørke i ca. 10-15 min. indtil der er meget lav opløsning tilbage.
- Tilsæt monteringsmediet på diaset (den korrekte mængde monteringsmedium skal kalibreres på betræksslipsens dimension: for en 24 x 40 mm overtrækslip, 20 μL er nok) og læg derefter langsomt et dækglas på det område, der indeholder fibrene. Pas på ikke at skabe bobler mellem brillerne.
- Tryk på coverslip, således at fibrene vil lægge på en enkelt vandret plan.
- Fastgør coversklippen ved hjælp af neglelak.
- Prøverne opbevares ved 4 °C i op til 4 uger.
- Erhverve de ønskede billeder af fluorescerende mærket myofibers med en konfokal mikroskop.
- Skær en P200 pipette spids og pels det med blokering løsning
Representative Results
Vi typisk fordøje fire forskellige muskler (TA, EDL, Soleus og Gastrocnemius) for at hente en god mængde af lange og levedygtige fibre, der kunne overleve 96 h i vækst-faktorer rige medium (Figur 4A, B). Kun de mest intakte fibre bør overføres i kulturmediet, da de vil overleve; alle de andre, der er lette at diskriminere og vælge, skal kasseres.
Når myofibers opretholdes i en vækst-faktorer rige medium satellitceller stammer fra vilde type mus begynder at aktivere og formere sig, se figur 1. Efter 48 h af kultur, i sund stand (Lamin Δ8-11 +/+), satellitceller upregulate MyoD og gennemgå deres første division. Aktiveret Pax7 +/MyoD + satellitceller derefter formere sig og med 72 h i kultur, de genererer celle aggregater bundet til myofiber, der er endnu mere synlige på 96 h (Figur 5). Under disse divisioner, kan nogle af dem undertrykke MyoD udtryk, undergår selvfornyelse at genbefolke stamceller pulje, mens dem, der fastholder MyoD bliver forpligtet til differentiering ved at nedregulere Pax7 udtryk. Efter 96 timer, satellitceller klynger indeholder klart synlige MyoG + engagerede celler, der kan differentiere i nye myofibers(Figur 1 og Figur 6). Især, med dette eksperiment, vi beskrev en forsinket dynamik i satellit celle differentiering i homozygot mutant Lamin Δ8-11 mus (-/-) i forhold til deres vilde type kolleger (+/+), se figur 6.
Det endelige resultat af hvert enkelt eksperiment lad os tro, at protokollen udviklet til enkelt myofibers isolation og kultur fra denne model af svær muskel dystrofi sikrer god kvalitet myofibers for alle yderligere anvendelser.
Figur 1: Grafisk repræsentation af satellitcellers regenerative faser modelleret i flydende myofibere. Efter 48 timer af kultur i vækst-faktorer rige medium, Pax7 + celler bliver aktiveret og gennemgår den første division, hvilket giver anledning til en doublet af Pax7 + / MyoD + celler. MyoD positive celler derefter formere sig og udvide, hvilket giver anledning, i 72 h af kultur, til en klynge af flere celler, som er afkom af en enkelt satellit celle. Efter 96 timer af kultur Pax7 + / MyoD + celler bliver differentiere Pax7-/MyoG + celler. I ekspansionsfasen nedregulerer et undersæt af Pax7+/MyoD+-celler MyoD-udtryk, der gennemgår selvfornyelse til quiescence. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Klargøring af borepatossetter. (A) Langsgående og frontale visning af, hvordan det store hul boring pipette skal vises. (B) Langsgående og frontale visning af, hvordan det lille hul boring pipette endelig skal vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative billeder af enkeltmuskeldissektion. (A) Isolering af TA-musklen. Undgå fjernelse af det tynde lag, der dækker musklen beskytter myofibers indeni. (B) TA og EDL muskler isoleret sammen stadig knyttet til deres øvre senen på niveau med patella. CC) Opdeling af TA og EDL efter isolering ved at skære dem langs længdeaksen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempler på sunde og levedygtige myofibere. Repræsentativ fase kontrast billeder af levedygtige myofibers i suspension. (A) Den røde pil angiver en myofiber med synlig sarcomere organisation og en satellit celle på sin side; de orange pile angiver nogle stykker af brudte myofibere, og nogle vragrester til stede i den første skål før den endelige udvælgelse til kultur. Skala bar 100 μm. (B) Mere komplet visning af andre myofibers under en mindre forstørrelse. Skala bar 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Forskel i dimensionen af stamcelleklynger i wt og mutant mus. Immunofluorescens farvning af myofibere udvundet fra 19 dage Lamin Δ8-11 mus (+/+ og -/-) efter 96 timer af kultur. Pax7+ satellitceller vises. Dimensionen af celleklyngen var i de fleste tilfælde betydeligt større i Lamin Δ8-11 +/+ end i Lamin Δ8-11 -/- med hensyn til antal celler. Skala bar 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentativt immunfluorescenseksperiment. Immunofluorescenseksperiment udført efter 96 timer af kultur på myofibere udvundet fra 19 dage Lamin Δ8-11 mus (+/+ og -/-). Pax7+/MyoG- (rød) og Pax7-/MyoG+ (grøn) celler blev observeret. Billeder fremstillet med et konforosset mikroskop. Skalabjælke 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navnet på løsningen i teksten | Komponent | Procentdel | foreslået endelig volumen/prøve | Noter | |
| vaskeopløsning | DMEM høj glukose | 90% | 4 ml | Hold den steril, hold ved 4°C, indtil brug | |
| Hesteserum (HS) | 10% | ||||
| fordøjelsesopløsning | DMEM høj glukose | 9.80% | 20 ml | Ekstremt skadeligt pulver. Filteropløsning med 0,22 μm filter og hold derefter steril. Hold ved 4°C indtil brug | |
| Kollagen I | 0.20% | ||||
| kulturmedium | DMEM høj glukose | 78% | 10 ml | Hold den steril, hold ved 4°C, indtil brug | |
| Føtalt kvægserum (FBS) | 20% | ||||
| Kyllingembryefødningsekstrakt (CEE) | 1% | ||||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | ||||
Tabel 1: Opskrifter på opløsninger, der anvendes i afsnit 1.
| Navnet på løsningen i teksten | Komponent | Procentdel | foreslået endelig volumen/prøve | Noter | |
| 4% PFA | Paraformaldehyd (PFA) | 4% | 2-3 ml | Pulver og derefter opløsning er ekstremt skadelige | |
| Pbs | 96% | ||||
| 0,5% Triton X-100 | Triton X-100 | 0.50% | 2-3 ml | Triton X-100 er ekstremt tyktflydende, fortrinsvis skære spidsen af pipetten til aliquot det | |
| Pbs | 99.50% | ||||
| 0,25% Tween-20 | Tween-20 | 0.25% | 10 ml | Tween-20 er ekstremt tyktflydende, fortrinsvis skære spidsen af pipetten til aliquot det | |
| Pbs | 99.75% | ||||
| 0,1% Tween-20 | Tween-20 | 0.10% | 10 ml | Tween-20 er ekstremt tyktflydende, fortrinsvis skære spidsen af pipetten til aliquot det | |
| Pbs | 99.90% | ||||
| blokere løsning | Føtalt kvægserum (FBS) | 10% | 10 ml | Forbered frisk opløsning og opbevares ved 4 °C i højst 3 uger (kontroller altid klarhed før brug) | |
| Pbs | 90% | ||||
| DAPI | DAPI | 0.10% | 2-3 ml | Hold dig i mørke | |
| Pbs | 99.90% | ||||
Tabel 2: Opskrifter på opløsninger, der anvendes i afsnit 2.
Discussion
Isolering af intakte enkelt myofibere er en vigtig metode inden for myogenese, når hovedformålet er at karakterisere celle-autonome regenerative kapaciteter af muskelstamceller inden for deres niche, i sunde og patologiske forhold. Men når biokemiske eller genomiske undersøgelser er af interesse, kan FACS-isolerede satellitceller være den bedste løsning.
Single myofibers isolation gør det muligt at følge ex-vivo, men i den mest fysiologiske måde, dynamikken i alle de trin, enkelt satellitceller gennemgå under muskel regenerering, der er: aktivering, celledeling (asymmetrisk og symmetrisk), differentiering og vende tilbage til quiescence ved selvfornyelse. Når myofibers dyrkes i flydende forhold, aktiveres og udvides de enkelte satellitceller, der danner en klynge af celler, der alle stammer fra den samme satellitcelle. Immunofluorescensanalyse for sprednings-, differentierings-, aktiverings- eller stængelmarkører er derefter optimal til at kvantificere forholdet mellem cellestadierne.
Det vigtigste skridt i vores protokol for at opnå levedygtige og intakte myofibers kan betragtes som den hurtige, men blide muskel dissektion, ved senen-til-senen isolation, for at undgå muskelskader. Vores råd er kun at bruge skarpe saks og små skarpe pincet og begrænse hele muskel dissektion procedure til ti minutter. Når det er vanskeligt at isolere meget små muskler (dvs. EDL og TA), er det muligt at skære dem sammen og senere opdele dem ved hjælp af fine saks skære langs langsgående plan efter fibrene. Denne strategi vil i sidste ende give mindre intakt myofibers, men levedygtigheden vil ikke blive kompromitteret. Det samme skal udføres på store muskler som Gastrocnemius at lette fordøjelsen. Optimering af fordøjelsestiden, som skal empirisk valideres, og minimal manipulation af isolerede fibre er også to afgørende aspekter for det positive resultat af efterfølgende analyse.
Fordelen ved protokollen rapporteret her er, at det kan anvendes på meget små mus (i alder og dimension), selv når deres muskler er ekstremt skrøbelige. Selv om ikke nævnt ovenfor, er det muligt at følge denne protokol af dissektion til derefter kultur levedygtige myofibers i længere tid ved hjælp af kælder membran-belagtretter 18,19. Det er vigtigt at overveje, at denne situation er helt forskellig fra flydende tilstand, hvor vedhæftning stimuli og nærhed stimuli er fraværende.
Disclosures
Ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Andrea Bianchi, det italienske netværk af Laminopathies og medlemmerne af laboratoriet for støtten og alle de konstruktive kommentarer. Vi er taknemmelige for Chiara Cordiglieri for den dyrebare hjælp på konforosset mikroskop. Forfatterne takker Dr. Beatrice Biferali for hendes hjælp til at tage billeder til tal. Det arbejde, der præsenteres her blev støttet af My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, den italienske sundhedsminister n. GR-2013-02355413 og Cariplo 2017-0649 til C.L. C.M. støttes af My First AIRC grant n.18993 og AFM-Telethon n. 22489.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
| Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
| Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
| Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
| Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
| Lab equipment | Manufacturer | ||
| Bunsen burner | |||
| Confocal microscope | Leica | ||
| Diamond pen | bio-optica | ||
| Dissection pins | |||
| FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
| Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
| Glass coverslips | Thermofisher | ||
| Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
| Glass slides | Thermofisher | ||
| Micro dissecting scissors | |||
| Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
| Micropipette tips | Corning | ||
| Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
| Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
| Rubber pipette bulbs | VWR | ||
| Sharp tweezers | |||
| Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
| Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
| Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
| Water bath at 37°C | VWR |
References
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127 (21), 4543-4548 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 19 (6), 628-633 (2007).
- Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The Skeletal Muscle Satellite Cell: The Stem Cell That Came in From the Cold. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1177-1191 (2006).
- Franco, I., et al. Somatic mutagenesis in satellite cells associates with human skeletal muscle aging. Nature Communications. 9 (1), 800 (2018).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nature Medicine. 20 (3), 255-264 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in aged skeletal muscle. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Bianchi, A., et al. Dysfunctional polycomb transcriptional repression contributes to lamin A/C-dependent muscular dystrophy. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 2408-2421 (2020).
- Blau, H. M., Webster, C., Pavlath, G. K. Defective myoblasts identified in Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 80 (15), 4856-4860 (1983).
- Jiang, C., et al. Notch signaling deficiency underlies age-dependent depletion of satellite cells in muscular dystrophy. Disease Models & Mechanisms. 7 (8), 997-1004 (2014).
- Vallejo, D., et al. PITX2 Enhances the Regenerative Potential of Dystrophic Skeletal Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (4), 1398-1411 (2018).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal Muscle Satellite Cells: Background and Methods for Isolation and Analysis in a Primary Culture System. Methods in Molecular Biology. (798), 21-52 (2012).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Developmental Biology. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. (290), 281-304 (2005).
- Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single Muscle-Fiber Isolation and Culture for Cellular, Molecular, Pharmacological, and Evolutionary Studies. Methods in Molecular Biology. 798, 85-102 (2012).
- Verma, M., Asakura, A. Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following β-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 60-67 (2011).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. 946 (206), 431-468 (2013).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Gallot, Y., Hindi, S., Mann, A., Kumar, A. Isolation, Culture, and Staining of Single Myofibers. Bio-Protocol. 6 (19), 1942 (2016).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Machado, L., et al. In Situ Fixation Redefines Quiescence and Early Activation of Skeletal Muscle Stem Cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Lucini, F., Bianchi, A., Lanzuolo, C. Formaldehyde-mediated snapshot of nuclear architecture. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Sullivan, T., et al. Loss of a-Type Lamin Expression Compromises Nuclear Envelope Integrity Leading to Muscular Dystrophy. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 913-920 (1999).
