Summary
Her foreslår vi en metode for effektivt å få enkeltmuskelfibre på tidlige postnatal utviklingsstadier fra homozygot mutant Lamin Δ8-11 mus modell, en svært alvorlig modell for Emery-Dreifuss muskeldystrofi (EDMD).
Abstract
Autosomal dominant Emery-Dreifuss muskeldystrofi (EDMD) er forårsaket av mutasjoner i LMNA genet, som koder A-type kjernefysiske lamins, mellomliggende filament proteiner som opprettholder atomkonvolutten og komponentene i nukleoplasma. Vi har nylig rapportert at muskel svekk i EDMD kan tilskrives iboende epigenetiske dysfunksjoner påvirker muskel (satellitt) stamceller regenerativ kapasitet. Isolasjon og kultur av single myofibers er en av de mest fysiologiske ex-vivo tilnærminger for å overvåke satellittceller atferd i sin nisje, som de forblir mellom basal lamina rundt fiber og sarcolemma. Derfor representerer det et uvurderlig eksperimentelt paradigme for å studere satellittceller fra en rekke murine modeller. Her beskriver vi en re-tilpasset metode for å isolere intakte og levedyktige enkelt myofibers fra postnatal hindlimb muskler (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius og Soleus). Etter denne protokollen kunne vi studere satellittceller fra Lamin Δ8-11 -/- mus, en alvorlig EDMD-murinmodell, bare 19 dager etter fødselen.
Vi beskriver isolasjonsprosedyren, samt kulturforholdene for å oppnå en god del myofibers og deres tilhørende satellittceller-avledet avkom. Når dyrket i vekstfaktorer rik medium, satellittceller avledet fra vill type mus aktivere, spre, og til slutt differensiere eller gjennomgå selvfornyelse. I homozygots Lamin Δ8-11 -/- muterte mus er disse evnene alvorlig svekket.
Denne teknikken, hvis strengt fulgt, gjør det mulig å studere alle prosesser knyttet til myofiber-assosiert satellittcelle selv i tidlige postnatal utviklingsstadier og i skjøre muskler.
Introduction
Skjelettmuskulatur er et differensiert vev med en av de mest utvidede evnen til å regenerere etter trening eller traumer1. Denne egenskapen skyldes hovedsakelig tilstedeværelsen av stamceller, kalt satellittceller på grunn av deres perifere posisjon mellom basal lamina og plasmalemma av myofiber2. Under postnatal utvikling, satellittceller spre seg og gradvis differensiere, og dermed bidra til skjelettmuskulatur vekst. En gang i voksen alder, satellittceller inn en reversibel quiescent tilstand, og på fysiologiske eller patologiske traumer, de aktiverer, spre og differensiere for å reparere de skadede musklene3. Defekter i kapasiteten til satellittceller å riktig transitt gjennom disse forskjellige regenerative faser og å gjennomgå selvfornyelse har vært fast knyttet til muskel svinning, enten under fysiologisk aldring4,,5,6 eller i muskel degenerative sykdommer, som muskel dystrofies7,8,9,10.
To viktigste kultur tilnærminger eksisterer for å studere satellittceller ex-vivo: primære myogene kulturer fra mononucleated celler, mekanisk og kjemisk dissosiert fra hele muskel11,12; eller kultur av isolerte myofibers13,14,15,16,17,18,19,20. I det første tilfellet innebærer prosessen med satellittceller isolasjon triturasjon av hele muskler hentet fra musen, en kjemisk fordøyelse, filtrering og fluorescerende aktivert cellesortering (FACS)21. Denne prosedyren, selv om den er effektiv i å isolere satellittceller fra en rekke modeller, innebærer flere variabler som utsetter satellittceller for stress og forstyrrer deres fysiologiske nisje22,23. Derimot innebærer myofiber isolasjon en mildere fordøyelse av muskelvev med matriseforringelsesenzymer og en mekanisk makulering som forårsaker redusert traumer til stamceller20. Denne andre tilnærmingen tillater en mye mer effektiv gjenfinning av levedyktige satellittceller, som forblir fysisk festet til deres myofiber mellom basal lamina og sarcolemma, og dermed tillater analyse i deres fysiologiske nisje19,20.
Mange forskjellige protokoller har blitt foreslått i løpet av de siste årene for å isolere enkelt myofibere fra skjelettmuskler. Allerede i 1986 foreslo Bischoff en protokoll for å isolere fibre fra Flexor Digitorum Brevis13 og senere, i 1995, endret Rosenblatt et al. protokollen for å oppnå en mer effektiv separasjon av myofibers14. Siden da har mange andre forfattere foreslått justerte prosedyrer på andre muskler, for eksempel Extensor Digitorum Longus (EDL) og Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, som er lengre, selv om mer skjøre, muskler14. Isolerte myofibers kan deretter dyrkes både i vedheft, for å tillate utvidelse av satellittceller-avledede myoblasts, eller i flytende forhold, opptil 96 timer, for å følge avkom avkom fra enkeltsatellittceller19 (Figur 1). Variable konsentrasjoner av serum innenfor kulturmediet brukes til å utløse satellittceller aktivering, spredning og / eller differensiering, for å studere deres evne til å riktig transitt gjennom disse forskjellige faser1.
Vi har nylig beskrevet epigenetic mekanismen bak utmattelse av satellitt stamcelle bassenget i musemodellen av EDMD, Lamin Δ8-11 -/- mus7. Siden disse musene vanligvis dør mellom 4-8 uker i alderen24, på grunn av alvorlig muskeltap, ble det gjort et forsøk på å fange molekylære defekter som ligger til grunn for tidlig sykdom ved å fokusere vår analyse på postnatal muskelutvikling. Flytende single myofibers ble isolert og dyrket fra vill type og Lamin Δ8-11 -/- mutant7 19 dager gamle mus. På dette stadiet er muskelfeil allerede tydelige, men mus er fortsatt levedyktige. Men siden alle ovennevnte protokoller for enkelt myofibers utvinning ble optimalisert for skjelettmus av voksne mus, måtte vi tilpasse dem til våre formål: svært små mus i alder og størrelse, og svært skjøre myofibers. Dermed beskriver vi her vår re-tilpasning av protokollen foreslått av Rudnicki-laboratoriet19 for å få et betydelig antall enkelt levedyktige myofibers fra mus under postnatal utvikling og fra alvorlige dystrofiske muskler, slik som de avledet fra Lamin Δ8-11 -/- mus24. Det endelige målet med denne tilnærmingen er å gi en standardisert prosedyre for studiet av myofibers-tilknyttede muskelstamceller i en hvilken som helst annen musemodell når de tidlige stadiene av postnatal utvikling er av interesse, eller i tilfelle av musemodeller som bærer noen spesifikk sykdom som gjør myofibers mer utsatt for mekanisk stress.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført under etisk godkjenning av det italienske helsedepartementet og Institutional Animal Care and Use Committee (autorisasjon n. 83/2019-PR). Dyrene ble vedlikeholdt i et autorisert anlegg ved San Raffaele Hospital, Milano, Italia (autorisasjon n. N. 127/2012-A).
1. Muskeldisseksjon og myofiberkultur
- Utstyr forberedelse.
- Før du begynner, klargjør alle nødvendige løsninger som beskrevet i tabell 1. Disse løsningene må være nyforberedt.
- Rengjør alle overflater og verktøy som skal brukes under prosedyren med 70% etanol.
- Før du starter med musoffer, utfør belegg på 100 mm og 35 mm Petri-retter ved hjelp av Horse Serum (HS). Coat alle retter for å hindre myofibers fra å feste til plast. Vurder å bruke en 100 mm tallerken og fire 35 mm retter per mus.
- Etter at HS har fjernet overskuddet, oppbevarer du belagte retter i en inkubator ved 37 °C i 30 min. Fyll den deretter med vaskeløsning eller kulturmedium (to 35 mm retter per mus).
MERK: Alternativt kan en løsning på 10% HS i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) brukes til å belegge retter. Bruk alltid belagte retter. Det er mulig å bruke kulturretter av forskjellig størrelse, men små dimensjon Petri retter anbefales. - For fiberisolasjon, forberede sterile Pasteur pipetter som vist i figur 2. For hver mus forberede en stor hull bore pipette for muskelhåndtering og mekanisk disaggregation (Figur 2A) og en liten hull pipette for fibre utvalg (Figur 2B). Klipp hver glasspipette, muligens ved hjelp av en diamantpenn, til ønsket lengde og glatte pipettekanter på en flamme.
- Coat hver pipette ved å kort fukte den med HS før bruk.
- Museoffer og muskeldisseksjon
- Forvarm fordøyelsesoppløsningen ved romtemperatur i 10 min før disseksjonsprosedyren startes. Polypropylen FACS runde bunnrør er de mest egnede beholderne for formålet.
- Umiddelbart før begynnelsen av muskelhenting, ofre musen i henhold til riktig nasjonal IACUC anbefaling.
- Våt underkroppen med 70% etanol før du kutter huden for å gjøre fjerning av håret enklere.
- Sett musen i en utsatt posisjon på en støtte av polystyren dekket med aluminiumpapir og kutt huden fra midten av ryggen langsgående og i retning av bena.
- Fjern forsiktig huden uten å berøre muskler og sener. Det er mulig å rive av hele huden.
- Klipp de to beina på musen og fortsett raskt med disseksjon.
MERK: Hvis det er mer behagelig, er det mulig å fortsette disseksjonen på hele musen, men å jobbe på beinet gir mer mobilitet og presisjon i de senere kuttene. - Fest benet på støtten på fotens nivå ved hjelp av en pinne og begynn å isolere skjelettmuskler av interesse i denne rekkefølgen: TA, EDL, Gastrocnemius og Soleus.
- Løft den nedre senen av TA med en skarp pinsett i ankelhøyde og kutt den, og kutt deretter med fin saks rundt TA-muskelen til den andre senen på nivået av patella (Figur 3A). Overfør til fordøyelsesløsningen.
- Løft den nedre senen av EDL og skill den fra andre muskler ved å forsiktig trekke den oppover opp til den andre senen. Klipp og plasser den i fordøyelsesløsningen.
MERK: Siden EDL kan være ekstremt liten å kutte separat fra TA, kan de dissekeres sammen (figur 3B). Deretter, hvis hele muskelen er for stor, kutt den i 2-3 stykker fra senen og følg fibrene i en langsgående retning (Figur 3C). - Roter beinet som viser ryggmuskulaturen og fest foten ved hjelp av pinnen. Løft Akilles sene, Gastrocnemius vil automatisk skille seg fra andre muskler. Den øvre senen er oppe på baksiden av patella. Klipp den og legg til muskelen til fordøyelsen.
- Løft den ytre senen av benet (med hensyn til kroppen) og få Soleus. Lukk den forsiktig fra de andre musklene ved å rulle under med pinsett.
- Gjør det samme for det andre benet (trinn fra 1.2.7. til 1.2.11.).
- Muskel fordøyelse
- Inkuber fordøyelsesoppløsningen som inneholder alle musklene i et vannbad ved 37 °C i ca. 45-50 min. Under fordøyelsestiden, kontroller regelmessig muskelen for å unngå overdøyelse. Hver 10 min inverter fordøyelsesrørene 10x med en energisk bevegelse (unngå virvlende).
- Stopp fordøyelsen når musklene begynner å løsne opp og myofibers er synlige.
- På slutten av fordøyelsestiden riste prøvene.
- For å stoppe fordøyelsen, overfør forsiktig fordøyelsesfjæringen til en forvarmet 100 mm petriskål med 10 ml vaskemiddel.
MERK: Unngå muskeloverdøyelse, da dette uunngåelig vil resultere i isolering av hyper-kontraherte myofibers. Vanligvis med denne protokollen tar muskler av homozygoterte muterte mus 45 minutter for å bli fordøyd, mens muskler av villtypemus tar 50-55 min. Fordøyelsestiden må være eksperimentelt validert.
- Enkelt myofibers isolasjon
- Først isolere fibrene allerede dissosiert under et disseksjonsmikroskop ved å plukke dem individuelt med en belagt P200 pipette eller lite hull Pasteur og overføre dem fra 100 mm Petri til en ny 35 mm Petri parabolen med 5 ml forvarmet vaskemiddel.
- For å frigjøre ytterligere myofibers, pipette muskelen opp og ned ved hjelp av et stort hull bore glass pipette med varmt medium, til fibrene er mekanisk frigjort. Ikke vær for vedvarende, da dette vil føre til skadelige fibre.
- Fortsett å slippe myofibers fra muskelen til parabolen inneholder en ønskelig mengde. Hvis Petri parabolen holdes ved romtemperatur i mer enn 8 min, stopp og utfør minst 5 min inkubasjon ved 37 °C, 5 % CO2 for å re-likevekte mediet.
- Før du overfører de enkle myofibers til kulturmediet, la dem være på 37 °C, 5 % CO2 i vaskefat i minst 1 t. Dette hjelper myofibers å tilpasse seg in vitro tilstand.
MERK: Voksne myofibers er mindre utsatt for stress og kan vaskes ~ 2-3x. Men i denne tilstanden (ved 19 dager postnatal alder) er det bedre å utføre bare ett vasketrinn for å forhindre myofiber skade. Vær derfor alltid oppmerksom på å holde utvalgte myofibers tilstrekkelig rene ved ikke å bære rusk eller hyperkontrahertfibre.
- Enkel myofiberkultur
- Overfør individuelle myofibers til en ny forhåndsoppvarmet tallerken med riktig kultur medium (høyt serum medium for å tillate satellittceller aktivering, se figur 1).
- Endre mediet til de isolerte myofibers, ved å overføre dem til en ny belagt tallerken med nytt kulturmedium, bare etter 48-72 h kultur for å unngå stress som vil føre til myofibers hyperkontraksjon og avbrudd.
2. Nedstrøms applikasjoner: Myofibers krysskobling og immunofluorescens
MERK: Myofibers-tilknyttede satellittceller kan visualiseres ved immunofluorescens (IF) på tidspunktet for interesse. Siden de fleste av de publiserte protokollene er optimalisert for å utføre IF på voksne myofibers, her presenteres en detaljert protokoll for å oppnå pålitelige resultater også på myofibers isolert fra postnatal muskler.
- Myofiber krysskobling
- Før du begynner, klargjør alle nødvendige løsninger som beskrevet i tabell 2.
- Precoat med HS så mange 1,5 ml mikrosym mikroclyrifuge rør som antall prøver. Pass på å fjerne alle HS før du fortsetter. Siden krysskoblede fibre er tøffere enn de levende og vanskeligere å pipette, sørg for å kryssbinde ca 200-300 fibre separat per rør.
- Under et disseksjonsmikroskop samler du alle fibrene som kan betraktes som sunne, overfører dem til mikrosytrifusrøret og lar røret stå vertikalt i 5 min inne i inkubatoren for å tillate fibre å bosette seg.
- Fjern supernatanten veldig sakte fra røret.
- Crosslink fibre ved å legge til 1 ml av 4% paraformaldehyd (PFA) ved RT til røret. Gjør det forsiktig for å unngå fibre nød.
- For å forhindre at fibrene vever seg sammen under krysskoblingen, hold røret i svært mild agitasjon i 10 min.
- Hold røret i vertikal stilling i 5 min ved RT for å tillate fibre å bosette seg, og kast deretter supernatanten for å fjerne mesteparten av PFA-volumet.
- Tilsett 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og hold rørene vertikale i 5 min ved RT for å la fibrene til sediment.
- Fjern supernatanten og gjenta vaskeprosedyren (trinn 2.1.8.) to ganger igjen.
- Hold krysskoblede prøver ved 4 °C.
MERK: Det er mulig å holde krysskoblede myofibers ved 4 °C i en uke. Hvis fibrene forblir mer enn en uke i denne tilstanden, vil dette uunngåelig resultere i myofibers sammenflettet.
- Immunofluorescens
- Hold rørene som inneholder fibrene som står ved RT i minst 5 min for å tillate fibersedimentering.
- Fjern supernatanten, og la bare et lite volum være sikker på ikke å fjerne fiber.
- Tilsett 1 ml 0,5% Triton X-100 i PBS og inkuber i 5 min med mild agitasjon.
- Sett rørene i vertikal stilling i 5 min, og fjern deretter supernatant.
- Tilsett 1,5 ml PBS og inkuber med mild agitasjon i 5 min.
- Hold rørene i vertikal stilling i 5 min, og fjern deretter supernatanten.
- Tilsett 1 ml blokkeringsløsning og inkuber i 1 timer ved RT med mild agitasjon.
- Hold rørene 5 minutter i vertikal stilling, og fjern deretter supernatanten.
- Fortynn primære antistoffer i blokkeringsløsning, legg dem til rørene og inkuber over natten ved 4 °C i mild agitasjon (for foreslåtte konsentrasjoner se Tabell over materialer).
MERK: Alternativt kan det primære antistoffet inkuberes i 3 timer ved RT. Men over natten inkubasjon ga optimal farging. Inkubasjonsvolumet for både primære og sekundære antistoffer bør være på 300 μL når sedimenterte fibre når 100 μL hakk av 1,5 ml mikrocentrifugerør. Når fibrene er mindre rikelig, anbefales et volum på 100-200 μL. - La rørene stå i vertikal stilling i 5 min og fjern deretter supernatanten.
- Utfør 3 vasker i 1 ml 0,25% Tween-20 i PBS, inkubering i 5 min i mild agitasjon og la rørene stå i 5 min hver gang.
MERK: Herfra utfører du alle trinnene i mørket, for å unngå at fluorokromer bleking. - Fortynn sekundære antistoffer i blokkeringsløsning, legg dem til rørene og inkuber i 1 timer ved RT med mild agitasjon (for konsentrasjoner se Tabell over materialer).
- Vask to ganger i 1 ml 0,1% Tween-20 i PBS, rug i 5 min med mild agitasjon og deretter la rørene stå i stående stilling i 5 min.
- Fjern supernatanten, tilsett 1 ml DAPI-oppløsning og inkuber i 5 min med mild agitasjon.
- La rørene stå vertikalt i et stativ i 5 min, og fjern deretter supernatanten.
- Vask med 1 ml PBS, rug i 5 min med mild agitasjon og la rørene stå i et stativ i 5 min.
- Fjern supernatanten, og la et volum på ca. 50 μL.
- Montering av fluorescerende merket myofibers på mikroskoplysbilder
- Klipp en P200 pipettespiss og belegge den med blokkeringsløsning
MERK: For å belegge spissen, pipette løsningen opp og ned flere ganger før du plukker fibrene, vil dette unngå fibre å holde seg til tuppveggen. - Samle fibrene fra røret og spre dem på et mikroskopglasslysbilde.
- Under et disseksjonsmikroskop, ved hjelp av bare det naturlige lyset som reflekteres av speilet, bruk en ny (ikke kuttet) P200 pipettespiss for å spre fibrene og for å fjerne overflødig væskeløsning.
- La lysbildene lufttørke i mørket i ca 10-15 min, til svært lav mengde oppløsning gjenstår.
- Tilsett monteringsmediet på lysbildet (riktig mengde monteringsmedium skal kalibreres på dimensjonen på dekkslipmen: for en 24 x 40 mm dekkslips er 20 μL nok) og legg deretter sakte et dekkglass på området som inneholder fibrene. Vær forsiktig så du ikke lager bobler mellom brillene.
- Trykk på dekkslippen slik at fibrene vil ligge på en enkelt horisontal plan.
- Fest dekkslippen ved hjelp av neglelakk.
- Oppbevar prøvene ved 4 °C i opptil 4 uker.
- Få de ønskede bildene av fluorescerende merket myofibers med et konsernkal mikroskop.
- Klipp en P200 pipettespiss og belegge den med blokkeringsløsning
Representative Results
Vi fordøyer vanligvis fire forskjellige muskler (TA, EDL, Soleus og Gastrocnemius)for å hente en god mengde lange og levedyktige fibre som kan overleve 96 timer i vekstfaktorer rikt medium (Figur 4A,B). Bare de mest intakte fibrene bør overføres i kulturmedium, da de vil overleve; alle de andre, som er enkle å diskriminere og velge, må kastes.
Når myofibers opprettholdes i en vekstfaktor rik middels satellittceller avledet fra vill type mus begynner å aktivere og spre seg, se Figur 1. Ved 48 t av kultur, i sunn tilstand (Lamin Δ8-11 +/+), satellittceller oppregulere MyoD og gjennomgå sin første divisjon. Aktivert Pax7 + / MyoD + satellittceller deretter spre seg og ved 72 h i kultur, de genererer celleaggregater bundet til myofiber, som er enda mer synlig på 96 h (Figur 5). Under disse divisjonene kan noen av dem undertrykke MyoD-uttrykket, gjennomgår selvfornyelse for å befolke stamcellebassenget, mens de som opprettholder MyoD blir forpliktet til differensiering ved å nedregulere Pax7-uttrykket. Etter 96 timer inneholder satellittceller klynger godt synlige MyoG + engasjerte celler, som kan skille seg inn i nye myofibers (Figur 1 og figur 6). Spesielt, med dette eksperimentet, beskrev vi en forsinket dynamikk av satellittcelledifferensiering i homozygot mutant Lamin Δ8-11 mus (-/-) sammenlignet med deres ville type kolleger (+/+), se figur 6.
Det endelige resultatet av hvert enkelt eksperiment la oss tro at protokollen utviklet for enkelt myofibers isolasjon og kultur fra denne modellen av alvorlig muskeldystrofi sikrer god kvalitet myofibers for alle videre applikasjoner.
Figur 1: Grafisk representasjon av satellittcellers regenerative faser modellert i flytende myofibers. På 48 t av kultur i vekstfaktorer rik medium, Pax7 + celler blir aktivert og gjennomgår første divisjon, noe som gir opphav til en dobbel av Pax7 + / MyoD + celler. MyoD positive celler deretter spre seg og utvide, noe som gir økning, i 72 h kultur, til en klynge av flere celler som er avkom av en enkelt satellittcelle. Ved 96 t av kultur Pax7 + / MyoD + celler blir differensiering Pax7-/ MyoG + celler. Under ekspansjonsfasen nedregulerer et delsett av Pax7+/MyoD+-celler MyoD-uttrykket som gjennomgår selvfornyelse til quiescence. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tilberedning av borede Pasteur pipetter. (A)Langsgående og frontal visning av hvordan det store hullet bar pipette må vises. (B)Langsgående og frontal visning av hvordan den lille hullboret pipetten må endelig vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative bilder av enkelt muskeldisseksjon. (A)Isolering av TA-muskelen. Unngå fjerning av det tynne laget som dekker muskelen beskytter myofibers inne. (B)TA og EDL muskler isolert sammen fortsatt festet til deres øvre sene på nivået av patella. (C) Division of TA and EDL after isolation by cutting them along the longitudinal axis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Eksempler på sunne og levedyktige myofibers. Representative fase kontrastbilder av levedyktige myofibers i suspensjon. DenArøde pilen indikerer en myofiber med synlig sarcomere organisasjon og en satellittcelle på sin side; de oransje pilene indikerer noen biter av ødelagte myofibers, og noen rusk til stede i første parabolen før det endelige valget for kultur. Vektlinje 100 μm. (B) Mer fullstendig visning av andre myofibers under en mindre forstørrelse. Skala bar 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Forskjell i dimensjonen av stamcelleklynger i wt og muterte mus. Immunofluorescensfarging av myofibers ekstrahert fra 19 dager Lamin Δ8-11 mus (+/+ og -/-) etter 96 h kultur. Pax7+ satellittceller vises. Dimensjonen av celleklyngen i de fleste tilfellene var betydelig større i Lamin Δ8-11 +/+ enn i Lamin Δ8-11 -/- når det gjelder antall celler. Skalerbar 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Representativt immunfluorescenseksperiment. Immunofluorescenseksperiment utført, etter 96 t kultur, på myofibers ekstrahert fra 19 dager Lamin Δ8-11 mus (+/+ og -/-). Pax7+/MyoG- (rød) og Pax7-/MyoG+ (grønne) celler ble observert. Bilder innhentet med et konfusisk mikroskop. Skala bar 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navnet på løsningen i teksten | Komponent | Prosent | foreslått endelig volum/prøve | Notater | |
| vaskeløsning | DMEM høy glukose | 90% | 4 ml | Hold sterilt, hold den ved 4 °C til bruk | |
| Hest serum (HS) | 10% | ||||
| fordøyelsesløsning | DMEM høy glukose | 9.80% | 20 ml | Ekstremt skadelig pulver. Filteroppløsning med 0,22 μm filter og hold deretter sterilt. Oppbevars ved 4 °C til bruk | |
| Kollagenasje I | 0.20% | ||||
| kultur medium | DMEM høy glukose | 78% | 10 ml | Hold sterilt, hold den ved 4 °C til bruk | |
| Fetal storfe serum (FBS) | 20% | ||||
| Kylling embryo ekstrakt (CEE) | 1% | ||||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | ||||
Tabell 1: Oppskrifter for løsninger som brukes i avsnitt 1.
| Navnet på løsningen i teksten | Komponent | Prosent | foreslått endelig volum/prøve | Notater | |
| 4% PFA | Paraformaldehyd (PFA) | 4% | 2-3 ml | Pulver og deretter løsning er ekstremt skadelig | |
| Pbs | 96% | ||||
| 0,5% Triton X-100 | Triton X-100 | 0.50% | 2-3 ml | Triton X-100 er ekstremt viskøs, fortrinnsvis kutte spissen av pipetten for å aliquot det | |
| Pbs | 99.50% | ||||
| 0,25% Tween-20 | Tween-20 (andre) | 0.25% | 10 ml | Tween-20 er ekstremt viskøs, fortrinnsvis kutte spissen av pipetten for å aliquot det | |
| Pbs | 99.75% | ||||
| 0,1% Tween-20 | Tween-20 (andre) | 0.10% | 10 ml | Tween-20 er ekstremt viskøs, fortrinnsvis kutte spissen av pipetten for å aliquot det | |
| Pbs | 99.90% | ||||
| blokkeringsløsning | Fetal storfe serum (FBS) | 10% | 10 ml | Forbered frisk oppløsning og oppbevar ved 4 °C i ikke lenger enn 3 uker (kontroller alltid tydeligheten før bruk) | |
| Pbs | 90% | ||||
| Dapi (andre) | Dapi (andre) | 0.10% | 2-3 ml | Hold deg i mørket | |
| Pbs | 99.90% | ||||
Tabell 2: Oppskrifter for løsninger som brukes i avsnitt 2.
Discussion
Isolering av intakte enkelt myofibers er en viktig metode innen myogenese når hovedmålet er å karakterisere celle-autonome regenerative kapasiteter av muskel stamceller i deres nisje, i sunne og patologiske forhold. Men når biokjemiske eller genomiske studier er av interesse, FACS-isolerte satellittceller kan være det beste alternativet.
Single myofibers isolasjon gjør det mulig å følge ex-vivo, men på den mest fysiologiske måten, dynamikken i alle trinnene enkelt satellittceller gjennomgå under muskel regenerering, det vil si: aktivering, celledeling (asymmetrisk og symmetrisk), differensiering og gå tilbake til quiescence av selvfornyelse. Når myofibers er dyrket i flytende forhold, de enkelte satellittceller aktivere og utvide danner en klynge av celler, alle stammer fra samme satellittcelle. Immunofluorescensanalyse for spredning, differensiering, aktivering eller stemness markører er deretter optimal for å kvantifisere andelen mellom cellestadier.
Det viktigste trinnet i vår protokoll for å oppnå levedyktig og intakt myofibers kan betraktes som den raske, men milde muskeldisseksjonen, ved sene-til-sene isolasjon, for å unngå muskelskader. Vårt råd er å bruke bare skarp saks og små skarpe pinsett og å begrense hele muskeldisseksjonsprosedyren til ti minutter. When it is difficult to isolate very small muscles (i.e., EDL and TA), it is possible to cut them together and to later divide them by using fine scissors cutting along the longitudinal plan following the fibers. Denne strategien vil til slutt gi mindre intakte myofibers, men levedyktighet vil ikke bli kompromittert. Det samme må utføres på store muskler som Gastrocnemius for å lette fordøyelsen. Optimalisering av fordøyelsestiden, som må empirisk valideres, og minimal manipulering av isolerte fibre er også to avgjørende aspekter for det positive resultatet av påfølgende analyse.
Fordelen med protokollen rapportert her er at den kan brukes på svært små mus (i alder og dimensjon), selv når musklene er ekstremt skjøre. Selv om det ikke er nevnt ovenfor, er det mulig å følge denne protokollen for disseksjon til da kultur levedyktige myofibers for lengre periode ved hjelp av kjellermembran-belagt retter18,19. Det er viktig å vurdere at denne situasjonen er helt forskjellig fra flytende tilstand, hvor vedheft stimuli og nærhet stimuli er fraværende.
Disclosures
Ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Andrea Bianchi, det italienske nettverket av laminopatier og medlemmene av laboratoriet for støtten og alle konstruktive kommentarer. Vi er takknemlige til Chiara Cordiglieri for den dyrebare hjelpen på konfusisk mikroskop. Forfatterne takker Dr. Beatrice Biferali for hennes hjelp til å ta bilder for figurer. Arbeidet som ble presentert her ble støttet av My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, den italienske helseministeren n. GR-2013-02355413 og Cariplo 2017-0649 til C.L. C.M. støttes av My First AIRC grant n.18993 og AFM-Telethon n. 22489.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
| Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
| Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
| Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
| Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
| Lab equipment | Manufacturer | ||
| Bunsen burner | |||
| Confocal microscope | Leica | ||
| Diamond pen | bio-optica | ||
| Dissection pins | |||
| FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
| Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
| Glass coverslips | Thermofisher | ||
| Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
| Glass slides | Thermofisher | ||
| Micro dissecting scissors | |||
| Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
| Micropipette tips | Corning | ||
| Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
| Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
| Rubber pipette bulbs | VWR | ||
| Sharp tweezers | |||
| Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
| Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
| Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
| Water bath at 37°C | VWR |
References
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127 (21), 4543-4548 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 19 (6), 628-633 (2007).
- Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The Skeletal Muscle Satellite Cell: The Stem Cell That Came in From the Cold. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1177-1191 (2006).
- Franco, I., et al. Somatic mutagenesis in satellite cells associates with human skeletal muscle aging. Nature Communications. 9 (1), 800 (2018).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nature Medicine. 20 (3), 255-264 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in aged skeletal muscle. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Bianchi, A., et al. Dysfunctional polycomb transcriptional repression contributes to lamin A/C-dependent muscular dystrophy. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 2408-2421 (2020).
- Blau, H. M., Webster, C., Pavlath, G. K. Defective myoblasts identified in Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 80 (15), 4856-4860 (1983).
- Jiang, C., et al. Notch signaling deficiency underlies age-dependent depletion of satellite cells in muscular dystrophy. Disease Models & Mechanisms. 7 (8), 997-1004 (2014).
- Vallejo, D., et al. PITX2 Enhances the Regenerative Potential of Dystrophic Skeletal Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (4), 1398-1411 (2018).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal Muscle Satellite Cells: Background and Methods for Isolation and Analysis in a Primary Culture System. Methods in Molecular Biology. (798), 21-52 (2012).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Developmental Biology. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. (290), 281-304 (2005).
- Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single Muscle-Fiber Isolation and Culture for Cellular, Molecular, Pharmacological, and Evolutionary Studies. Methods in Molecular Biology. 798, 85-102 (2012).
- Verma, M., Asakura, A. Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following β-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 60-67 (2011).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. 946 (206), 431-468 (2013).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Gallot, Y., Hindi, S., Mann, A., Kumar, A. Isolation, Culture, and Staining of Single Myofibers. Bio-Protocol. 6 (19), 1942 (2016).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Machado, L., et al. In Situ Fixation Redefines Quiescence and Early Activation of Skeletal Muscle Stem Cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Lucini, F., Bianchi, A., Lanzuolo, C. Formaldehyde-mediated snapshot of nuclear architecture. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Sullivan, T., et al. Loss of a-Type Lamin Expression Compromises Nuclear Envelope Integrity Leading to Muscular Dystrophy. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 913-920 (1999).
