Summary
Här föreslår vi en metod för att effektivt få enstaka muskelfibrer i tidiga postnatala utvecklingsstadier från homozygous mutant Lamin Δ8-11 mus modell, en mycket svår modell för Emery-Dreifuss muskeldystrofi (EDMD).
Abstract
Autosomal dominerande Emery-Dreifuss muskeldystrofi (EDMD) orsakas av mutationer i LMNA genen, som kodar A-typ kärn-laminer, mellanliggande glödtråd proteiner som upprätthåller kärnhöljet och komponenterna i nukleoplasma. Vi rapporterade nyligen att muskelförtjning i EDMD kan hänföras till inneboende epigenetiska dysfunktioner som påverkar muskel (satellit) stamceller regenerativ kapacitet. Isolering och kultur av enda myofibers är en av de mest fysiologiska ex-vivo metoder för att övervaka satellitceller beteende inom sin nisch, eftersom de förblir mellan basala lamina kring fibern och sarcolemma. Därför är det ett ovärderligt experimentellt paradigm för att studera satellitceller från en mängd olika murine modeller. Här beskriver vi en omanpassad metod för att isolera intakta och livskraftiga enstaka myofibers från postnatala hindlimb muskler (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius och Soleus). Efter detta protokoll kunde vi studera satellitceller från Lamin Δ8-11 -/- möss, en allvarlig EDMD murine modell, på bara 19 dagar efter födseln.
Vi beskriver isoleringsförfarandet, liksom kulturförhållandena för att få en bra mängd myofibers och deras tillhörande satellit-celler-härledda avkomma. När odlas i tillväxt-faktorer rikt medium, satellitceller som härrör från vilda typ möss aktivera, föröka sig, och så småningom skilja eller genomgå självförnyelse. Hos homozygous Lamin Δ8-11 -/- mutantmöss är dessa förmågor allvarligt nedsatta.
Denna teknik, om strikt följs, gör det möjligt att studera alla processer kopplade till myofiber-associerade satellitcell även i tidiga postnatala utvecklingsstadier och i bräckliga muskler.
Introduction
Skelettmuskeln är en differentierad vävnad med en av de mest utökade förmåga att regenerera efter träning eller trauma1. Denna egenskap beror främst på närvaron av stamceller, så kallade satellitceller på grund av deras perifera position mellan den basala lamina och plasmalemma av myofiber2. Under postnatal utveckling, satellitceller föröka sig och gradvis skilja, vilket bidrar till skelettmuskulaturen tillväxt. Väl i vuxen ålder, satellitceller in i en reversibel quiescent tillstånd, och på fysiologiska eller patologiska trauma, de aktiverar, föröka sig och differentiera för att reparera de skadade musklerna3. Defekter i kapaciteten hos satellitceller att korrekt transitering genom dessa olika regenerativa faser och att genomgå självförnyelse har varit starkt kopplade till muskelförtvining, antingen under fysiologiska åldrande4,,5,,6 eller i muskeldegenerativa sjukdomar, såsom muskeldystrofier7,8,9,10.
Det finns två huvudsakliga kulturmetoder för att studera satellitceller ex-vivo: primära myogena kulturer från monokärnor, mekaniskt och kemiskt separerade från hela muskeln11,12; eller kultur av isolerade myofibers13,,14,15,16,17,18,19,20. I det första fallet innebär processen för isolering av satellitceller trituration av hela muskler som extraherats från musen, en kemisk matsmältning, filtrering och fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS)21. Detta förfarande, även om det är effektivt för att isolera satellitceller från en mängd olika modeller, innebär flera variabler som utsätter satellitceller för stress och stör deras fysiologiska nisch22,23. Däremot innebär myofiber isolering en mildare matsmältning av muskelvävnad med matris förnedrande enzymer och en mekanisk fragmentering som orsakar minskad trauma för stamceller20. Denna andra metod möjliggör en mycket effektivare hämtning av livskraftiga satellitceller, som förblir fysiskt knutna till sin myofiber mellan basala lamina och sarcolemma, vilket möjliggör analys inom deras fysiologiska nisch19,20.
Många olika protokoll har föreslagits under de senaste åren för att korrekt och effektivt isolera enstaka myofibers från skelettmuskulaturen. Redan 1986 föreslog Bischoff ett protokoll för att isolera fibrer från Flexor Digitorum Brevis13 och senare, 1995, ändrade Rosenblatt et al. protokollet för att få en effektivare separation av myofibers14. Sedan dess har många andra författare föreslagit justerade förfaranden på andra muskler, såsom Extensor Digitorum Longus (EDL) och Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, som är längre, även om mer bräckliga, muskler14. Isolerade myofibers kan sedan odlas både i vidhäftning, för att möjliggöra expansion av satellitceller-härledda myoblaster, eller under flytande förhållanden, upp till 96 timmar, att följa avkomman som härrör från enstaka satellitceller19 (figur 1). Variabla koncentrationer av serum inom odlingsmediet används för att utlösa aktivering, spridning och/eller differentiering av satellitceller, för att studera deras förmåga att korrekt passera genom dessa olika faser1.
Vi beskrev nyligen den epigenetiska mekanismen bakom utmattningen av satellitstamcellspoolen i musmodellen av EDMD, Lamin Δ8-11 -/- mus7. Eftersom dessa möss dör vanligtvis mellan 4-8 veckors ålder24, på grund av svår muskelförlust, gjordes ett försök att fånga de molekylära defekter som ligger bakom sjukdomens tidiga debut genom att fokusera vår analys på postnatal muskelutveckling. Flytande enda myofibers isolerades och odlade från vild typ och Lamin Δ8-11 -/- mutant7 19 dagar gamla möss. I detta skede är muskeldefekter redan uppenbara, men möss är fortfarande livskraftiga. Men eftersom alla ovan nämnda protokoll för enstaka myofibers utvinning var optimerade för skelettmuskulaturen hos vuxna möss, behövde vi anpassa dem till våra syften: mycket små möss i tid av ålder och storlek, och mycket bräckliga myofibers. Således beskriver vi här vår omanpassning av det protokoll som föreslagits av Rudnicki laboratoriet19 för att få ett betydande antal enda livskraftiga myofibers från möss under postnatal utveckling och från allvarliga dystrofa muskler, såsom de som härrör från Lamin Δ8-11 -/- möss24. Det slutliga målet med detta tillvägagångssätt är att tillhandahålla ett standardiserat förfarande för studier av myofibers-associerade muskel stamceller i någon annan mus modell när de tidiga stadierna av postnatala utveckling är av intresse, eller när det gäller mus modeller som bär någon specifik sjukdom som gör myofibers mer mottagliga för mekanisk stress.
Protocol
Alla försöksprocedurer utfördes under etiskt godkännande av det italienska hälsoministeriet och kommittén för institutionsvård och användning av djur (tillstånd nr 83/2019-PR). Djuren förvarades i en auktoriserad anläggning vid San Raffaele Hospital, Milano, Italien (tillstånd n. N. N. 127/2012-A).
1. Muskeldissekering och myofiber kultur
- Utrustning förberedelse.
- Innan du börjar ska du förbereda alla nödvändiga lösningar enligt beskrivningen i tabell 1. Dessa lösningar måste beredas på nytt.
- Rengör alla ytor och verktyg som kommer att användas under proceduren med 70% etanol.
- Innan du börjar med möss offer, utföra beläggning av 100 mm och 35 mm petriskålar med hästserum (HS). Täck alla rätter för att förhindra myofibers från att fästa på plasten. Överväg att använda en 100 mm maträtt och fyra 35 mm rätter per mus.
- Efter att ha tagit bort överskottet av HS, förvara belagda rätter i en inkubator vid 37 °C i 30 min. Fyll den sedan med tvättlösning eller odlingsmedium (två 35 mm rätter per mus).
OBS: Alternativt kan en lösning på 10% HS i Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) användas för att belägga rätter. Använd alltid belagda rätter. Det är möjligt att använda kulturrätter av olika storlek, men små dimensioner Petrirätter rekommenderas. - För isolering av fibrer, förbered sterila Pasteur-pipetter enligt figur 2. För varje mus förbereda ett stort hål borrpipette för muskelhantering och mekanisk uppdelning (figur 2A) och ett litet hål pipett för fiberval (figur 2B). Skär varje glaspipett, eventuellt med en diamantpenna, till önskad längd och släta pipettens kanter på en låga.
- Täck varje pipett genom att kort vätna den med HS före användning.
- Musoffer och muskeldissektion
- Värm upp matsmältningslösningen i rumstemperatur i 10 minuter innan dissekeringsproceduren påbörjas. Polypropylen FACS rundbottnade rör är de mest lämpliga behållarna för ändamålet.
- Omedelbart före början av muskelhämtning, offra musen enligt korrekt nationell IACUC rekommendation.
- Blöt underkroppen med 70% etanol innan du klipper huden för att göra avlägsnandet av håret lättare.
- Sätt musen i en benägen position på ett stöd av polystyren täckt med aluminiumpapper och skär huden från mitten av ryggen längsgående och i riktning mot benen.
- Ta försiktigt bort huden utan att vidröra muskler och senor. Det är möjligt att slita av all hud.
- Skär musens två ben och fortsätt snabbt med dissekeringen.
OBS: Om det är bekvämare, är det möjligt att fortsätta dissekering på hela musen men arbetar på benet ger mer rörlighet och precision i de senare snitten. - Fixa benet på stödet på nivån för foten med hjälp av en stift och börja isolera skelettmuskulaturen av intresse i denna ordning: TA, EDL, Gastrocnemius och Soleus.
- Lyft den nedre senan av TA med en skarp pincett på ankelhöjd och skär den, skär den sedan med fin sax runt TA-muskeln till den andra senan i höjd med patella (Figur 3A). Överför till matsmältningslösningen.
- Lyft den nedre senan på EDL och separera den från andra muskler genom att försiktigt dra den uppåt upp till den andra senan. Skär och placera den i matsmältningslösningen.
OBS: Eftersom EDL kan vara extremt litet för att skäras separat från TA, kan de dissekeras tillsammans (figur 3B). Sedan, om hela muskeln är för stor, skär den i 2-3 stycken från senan och efter fibrerna i en longitudinell riktning (Figur 3C). - Rotera benet som visar ryggmusklerna och fixa foten med hjälp av stiftet. Lyft hälsenan, Gastrocnemius kommer automatiskt att separera från andra muskler. Den övre senan är uppe på baksidan av patella. Skär den och tillsätt muskeln till matsmältningen.
- Lyft benets yttre sena (med avseende på kroppen) och få Soleus. Separera försiktigt den från de andra musklerna genom att rulla under med pincetten.
- Gör samma sak för det andra benet (steg från 1.2.7. till 1.2.11.).
- Muskelnedsmältning
- Inkubera rötningslösningen som innehåller alla muskler i ett vattenbad vid 37 °C i ca 45-50 min. Under matsmältningstiden, kontrollera regelbundet muskeln för att undvika övernedering. Var 10:e minut invertera rötningsrören 10x med en energisk rörelse (undvik att virvla).
- Stoppa matsmältningen när musklerna börjar lossna och myofibers är synliga.
- I slutet av matsmältningstiden skaka proverna.
- För att stoppa matsmältningen, överför försiktigt rötningsfjädringen till en förvärmd 100 mm petriskål med 10 ml tvättlösning.
OBS: Undvik muskelöverstmning eftersom detta oundvikligen kommer att resultera i isolering av hyper-kontrakterade myofibers. Vanligtvis med detta protokoll, muskler homozygous muterade möss tar 45 min att smälta, medan muskler av vild typ möss ta 50-55 min. Matsmältningstiden måste experimentellt valideras.
- Single myofibers isolering
- Först isolera fibrerna som redan separerats under ett dissekerande mikroskop genom att plocka dem individuellt med en belagd P200 pipett eller litet hål Pasteur och överföra dem från 100 mm Petri till en ny 35 mm petriskål med 5 ml förvärmd tvättlösning.
- För att frigöra ytterligare myofibers, pipett muskeln upp och ner med hjälp av ett stort hål borr glas pipett med varmt medium, tills fibrerna är mekaniskt frigörs. Var inte alltför långlivade eftersom detta kommer att resultera i skadliga fibrer.
- Fortsätt släppa myofibers från muskeln tills skålen innehåller en önskvärd mängd. Om petriskålen hålls i rumstemperatur i mer än 8 minuter, stanna och utför minst 5 minuters inkubation vid 37 °C, 5 % CO2 för att åter jämvikta mediet.
- Innan du överför den enda myofibers till odlingsmediet, lämna dem på 37 °C, 5% CO2 i tvättskålen i minst 1 h. Detta hjälper myofibers att anpassa sig till in vitro-tillståndet.
OBS: Adult myofibers är mindre känsliga för stress och kan tvättas ~ 2-3x. Men i detta tillstånd (vid 19 dagar postnatal ålder) är det bättre att utföra endast ett tvättsteg för att förhindra myofiber skador. Därför alltid uppmärksamma att hålla utvalda myofibers tillräckligt ren genom att inte bära skräp eller hyperkontrakterade fibrer.
- Enda myofiber kultur
- Överför enskilda myofibers till en ny förvärmd maträtt med lämpligt odlingsmedium (högt serummedium för att tillåta aktivering av satellitceller, se figur 1).
- Ändra mediet till isolerade myofibers, genom att överföra dem till en ny belagd maträtt med nytt kulturmedium, först efter 48-72 h av kultur för att undvika stress som kommer att leda till myofibers hypercontraction och störningar.
2. Nedströms applikationer: Myofibers tvärbindning och immunofluorescens
OBS: Myofibers-associerade satellitceller kan visualiseras genom immunofluorescens (IF) vid tidpunkten för intresse. Eftersom de flesta av de publicerade protokollen är optimerade för att utföra IF på vuxna myofibers, här presenteras ett detaljerat protokoll för att få tillförlitliga resultat även på myofibers isolerade från postnatala muskler.
- Myofiber crosslinking
- Innan du börjar ska du förbereda alla nödvändiga lösningar enligt beskrivningen i tabell 2.
- Förlack med HS så många 1,5 ml mikrocentrifugrör som antalet prover. Var noga med att ta bort alla HS innan du fortsätter. Eftersom tvärlänkade fibrer är tuffare än de levande och svårare att pipett, se till att tvärbinda ca 200-300 fibrer separat per rör.
- Under ett dissekerande mikroskop, samla alla fibrer som kan anses friska, överföra dem till mikrocentrifugröret och lämna röret vertikalt i 5 min inuti inkubatorn så att fibrerna att bosätta sig.
- Ta bort supernatanten mycket långsamt från röret.
- Tvärlänksfibrer genom att lägga till 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) vid RT till röret. Gör det försiktigt för att undvika fibrer nöd.
- För att förhindra att fibrer vävs samman under tvärbindningen, håll röret i mycket mild agitation i 10 min.
- Håll röret i vertikalt läge i 5 min vid RT så att fibrerna kan bosätta sig och kassera sedan supernatanten för att ta bort majoriteten av PFA-volymen.
- Tillsätt 1 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och håll rören vertikala i 5 min vid RT för att låta fibrerna sediment.
- Ta bort supernatanten och upprepa tvättproceduren (steg 2.1.8.) två gånger.
- Håll tvärbundna prover vid 4 °C.
OBS: Det är möjligt att hålla tvärbundna myofibers vid 4 °C i en vecka. Om fibrerna förblir mer än en vecka i detta tillstånd, kommer detta oundvikligen resultera i myofibers sammanflätning.
- Immunfluorescens
- Håll rören som innehåller fibrerna stående på RT i minst 5 min för att möjliggöra fibersedimentation.
- Ta bort supernatant, lämnar bara en liten volym för att vara säker på att inte ta bort någon fiber.
- Tillsätt 1 ml 0,5% Triton X-100 i PBS och inkubera i 5 min med mild omrörning.
- Sätt rören i vertikalt läge i 5 min, ta sedan bort supernatant.
- Tillsätt 1,5 ml PBS och inkubera med mild omrörning i 5 min.
- Håll rören i vertikalt läge i 5 min och ta sedan bort supernatanten.
- Tillsätt 1 ml blockerande lösning och inkubera i 1 h vid RT med mild omrörning.
- Håll rören 5 min i vertikalt läge och ta sedan bort supernatanten.
- Späd primära antikroppar i blockeringslösningen, tillsätt dem i rören och inkubera över natten vid 4 °C i mild omrörning (för föreslagna koncentrationer se Tabell över material).
OBS: Alternativt kan den primära antikroppen inkuberas i 3 timmar vid RT. Men natten inkubation gav optimal färgning. Inkubationsvolymen för både primära och sekundära antikroppar bör vara 300 μL när sedimenterade fibrer når 100 μL-skåran på 1,5 ml mikrocentrifugröret. När fibrerna är mindre rikliga rekommenderas en volym på 100-200 μL. - Låt rören vara i vertikalt läge i 5 min och ta sedan bort supernatanten.
- Utför 3 tvättar i 1 ml 0,25% Tween-20 i PBS, inkubera i 5 min i mild omrörning och sedan lämnar rören stående i 5 min varje gång.
OBS: Från och med nu, utför alla steg i mörkret, för att undvika fluorochromer blekning. - Späd sekundära antikroppar i blockeringslösningen, tillsätt dem i rören och inkubera i 1 h vid RT med mild omrörning (för koncentrationer se Tabell över material).
- Tvätta två gånger i 1 ml 0,1% Tween-20 i PBS, inkubera i 5 min med mild omrörning och sedan lämna rören i stående läge i 5 min.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 1 ml DAPI-lösning och inkubera i 5 min med mild omrörning.
- Låt rören stå vertikalt i ett rack i 5 min, ta sedan bort supernatanten.
- Tvätta med 1 ml PBS, inkubera i 5 min med mild omrörning och sedan lämna rören stå i ett rack i 5 min.
- Ta bort supernatanten och lämna en volym på ca 50 μL.
- Montering av fluorescerande märkta myofibers på mikroskop diabilder
- Kapa en P200 pipettspets och täck den med blockerande lösning
OBS: För att belägga spetsen, pipett lösningen upp och ner flera gånger innan plocka fibrerna, kommer detta att undvika fibrer att hålla sig till spetsen väggen. - Samla fibrerna från röret och sprida dem på ett mikroskop glasskiva.
- Under ett dissekerande mikroskop, med endast det naturliga ljuset som reflekteras av spegeln, använd en ny (ej skuren) P200 pipettspets för att sprida fibrerna och ta bort överflödig vätskelösning.
- Låt rutschbanorna lufttorka i mörker i ca 10-15 min, tills mycket låg mängd lösning återstår.
- Tillsätt monteringsmediet på bilden (rätt mängd monteringsmedium ska kalibreras på måttet på täcket: för ett 24 x 40 mm täckglas räcker det med 20 μL) och lägg sedan långsamt ett täckglas på det område som innehåller fibrerna. Var noga med att inte skapa bubblor mellan glasögonen.
- Tryck på täcket så att fibrerna kommer att ligga på en enda horisontell plan.
- Fixa täcket med nagellack.
- Förvara proverna vid 4 °C i upp till 4 veckor.
- Skaffa önskade bilder av fluorescerande märkta myofibers med ett konfokalmikroskop.
- Kapa en P200 pipettspets och täck den med blockerande lösning
Representative Results
Vi brukar smälta fyra olika muskler (TA, EDL, Soleus och Gastrocnemius)för att hämta en bra mängd långa och livskraftiga fibrer som kan överleva 96 h i tillväxtfaktorer rikt medium (Figur 4A, B). Endast de mest intakta fibrerna bör överföras i odlingsmedium, eftersom de kommer att överleva; alla andra, som är lätta att diskriminera och välja, måste kasseras.
När myofibers hålls i en tillväxt-faktorer rika medelstora satellitceller som härrör från vilda möss börjar aktivera och föröka sig, se figur 1. Vid 48 h av kultur, i hälsosamt tillstånd (Lamin Δ8-11 +/+), satellitceller upregulate MyoD och genomgå sin första division. Aktiverade Pax7 +/MyoD + satellitceller förökar sig sedan och med 72 h i kultur, genererar de cellaggregat bundna till myofiber, som är ännu mer synliga vid 96 h (Figur 5). Under dessa divisioner, några av dem kan undertrycka MyoD uttryck, genomgår självförnyelse för att återbefolka stamceller poolen, medan de som upprätthåller MyoD blir engagerade i differentiering genom att downregulating Pax7 uttryck. Efter 96 timmar innehåller satellitcellskluster tydligt synliga MyoG+ engagerade celler, som kan skiljas till nya myofibers (figur 1 och figur 6). Särskilt med detta experiment beskrev vi en fördröjd dynamik av satellitcell differentiering i homozygous mutant Lamin Δ8-11 möss (-/-) jämfört med deras vilda typ motsvarigheter (+/+), se figur 6.
Det slutliga resultatet av varje enskilt experiment låt oss tro att det protokoll som utvecklats för enda myofibers isolering och kultur från denna modell av svår muskeldystrofi säkerställer god kvalitet myofibers för alla ytterligare tillämpningar.
Figur 1: Grafisk representation av satellitcellernas regenerativa faser modellerade i flytande myofibers. Vid 48 h kultur i tillväxtfaktorer rikt medium, Pax7 + celler få aktiveras och genomgår den första divisionen, vilket ger upphov till en dubblering av Pax7 + /MyoD + celler. MyoD positiva celler sedan föröka sig och expandera, vilket ger upphov, i 72 h av kultur, till ett kluster av flera celler som är avkomman av en enda satellitcell. På 96 h av kultur Pax7 +/MyoD + celler blir särskilja Pax7-/MyoG + celler. Under expansionsfasen, en delmängd av Pax7 +/MyoD + celler downregulate MyoD uttryck genomgår självförnyelse i quiescence. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Beredning av borrpipaspipitter. (A) Longitudinell och frontal bild av hur det stora hålet borrpispett måste visas. (B)Longitudinell och frontal bild av hur det lilla hålet borrpispetten äntligen måste visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa bilder av en muskeldissekering. (A)Isolering av TA muskeln. Undvika avlägsnande av det tunna lagret som täcker muskeln skyddar myofibers inuti. B)TA- och EDL-muskler som isolerats tillsammans är fortfarande fästa vid den övre senan i patella-nivån. C)Delning av TA och EDL efter isolering genom att skära dem längs den längsgående axeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel på friska och livskraftiga myofibers. Representativa faskontrastbilder av livskraftiga myofibers i suspension. (A)Den röda pilen anger en myofiber med synlig sarcomere organisation och en satellitcell på sin sida; de orange pilarna visar några bitar av trasiga myofibers, och några skräp som finns i den första skålen innan det slutliga valet för kultur. Skala bar 100 μm.(B)Mer fullständig bild av andra myofibers under en mindre förstoring. Skala bar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Skillnad i dimensionen av stamceller i wt och muterade möss. Immunofluorescensfärgning av myofibers utvinns ur 19 dagar Lamin Δ8-11 möss (+/+ och -/-) efter 96 h av kultur. Pax7+ satellitceller visas. Dimensionen av cellklustret i de flesta fall var betydligt större i Lamin Δ8-11 +/+ än i Lamin Δ8-11 -/- när det gäller antal celler. Skala bar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Representativt immunofluorescensexperiment. Immunofluorescens experiment utförs, efter 96 h av kultur, på myofibers utvinns från 19 dagar Lamin Δ8-11 möss (+/+ och -/-). Pax7 +/MyoG- (röd) och Pax7-/MyoG + (grön) celler observerades. Bilder erhållna med ett konfokalmikroskop. Skala bar 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösningens namn i texten | Komponent | Procent | förslag på slutlig volym/prov | Anteckningar | |
| tvättlösning | DMEM hög glukos | 90% | 4 ml | Håll steril, förvara i 4°C tills användning | |
| Hästserum (HS) | 10% | ||||
| matsmältningslösning | DMEM hög glukos | 9.80% | 20 ml | Extremt skadligt pulver. Filterlösning med 0,22 μm filter och sedan hålla steril. Förvaras vid 4°C tills användning | |
| Collagenase Jag | 0.20% | ||||
| kultur medium | DMEM hög glukos | 78% | 10 ml | Håll steril, förvara i 4°C tills användning | |
| Fetala bovin serum (FBS) | 20% | ||||
| Extrakt från kycklingembryo (CEE) | 1% | ||||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | ||||
Tabell 1: Recept på lösningar som används i avsnitt 1.
| Lösningens namn i texten | Komponent | Procent | förslag på slutlig volym/prov | Anteckningar | |
| 4% PFA | Paraformaldehyd (PFA) | 4% | 2-3 ml | Pulver och sedan lösning är extremt skadliga | |
| Pbs | 96% | ||||
| 0.5% Triton X-100 | Triton X-100 | 0.50% | 2-3 ml | Triton X-100 är extremt trögflytande, företrädesvis skär spetsen på pipetten till aliquot det | |
| Pbs | 99.50% | ||||
| 0.25% Tween-20 | Tween-20 | 0.25% | 10 ml | Tween-20 är extremt trögflytande, företrädesvis skär spetsen på pipetten till aliquot det | |
| Pbs | 99.75% | ||||
| 0,1% Tween-20 | Tween-20 | 0.10% | 10 ml | Tween-20 är extremt trögflytande, företrädesvis skär spetsen på pipetten till aliquot det | |
| Pbs | 99.90% | ||||
| blockera lösning | Fetala bovin serum (FBS) | 10% | 10 ml | Förbered ny lösning och förvara den vid 4°C i högst 3 veckor (kontrollera alltid klarheten före användning) | |
| Pbs | 90% | ||||
| DAPI (på andra sätt) | DAPI (på andra sätt) | 0.10% | 2-3 ml | Förvaras i mörker | |
| Pbs | 99.90% | ||||
Tabell 2: Recept på lösningar som används i avsnitt 2.
Discussion
Isolering av intakta enstaka myofibers är en viktig metod inom myogenesområdet när huvudsyftet är att karakterisera cellautonoma regenerativa kapacitet hos muskelstamceller inom sin nisch, under friska och patologiska tillstånd. Men när biokemiska eller genomiska studier är av intresse, FACS-isolerade satellitceller kan vara det bästa alternativet.
Single myofibers isolering gör det möjligt att följa ex-vivo, men på det mest fysiologiska sättet, dynamiken i alla steg enda satellitceller genomgår under muskelförnyelse, det vill säga: aktivering, celldelning (asymmetrisk och symmetrisk), differentiering och återgå till quiescence genom självförnyelse. När myofibers odlas under flytande förhållanden, de enda satellitceller aktivera och expandera bildar ett kluster av celler, alla härrör från samma satellitcell. Immunofluorescensanalys för spridning, differentiering, aktivering eller stamhet markörer är då optimalt att kvantifiera andelen mellan cellen stadier.
Det viktigaste steget i vårt protokoll för att få livskraftiga och intakta myofibers kan anses vara den snabba men milda muskel dissekering, genom sena-till-sena isolering, för att undvika muskelskador. Vårt råd är att endast använda vass sax och små vassa pincett och att begränsa hela muskeldissektionsproceduren till tio minuter. När det är svårt att isolera mycket små muskler (dvs. EDL och TA), är det möjligt att skära ihop dem och senare dela dem genom att använda fin sax skära längs den längsgående planen efter fibrerna. Denna strategi kommer så småningom att ge mindre intakta myofibers, men lönsamheten kommer inte att äventyras. Detsamma måste utföras på stora muskler som Gastrocnemius för att underlätta matsmältningen. Optimering av matsmältningstiden, som måste valideras empiriskt, och minimal manipulering av isolerade fibrer är också två avgörande aspekter för det positiva resultatet av efterföljande analys.
Fördelen med det protokoll som rapporteras här är att det kan tillämpas på mycket små möss (i ålder och dimension), även när deras muskler är extremt bräckliga. Även om inte nämns ovan, är det möjligt att följa detta protokoll av dissekering till då kultur livskraftiga myofibers under längre period med hjälp av källaren membran-belagda rätter18,19. Det är viktigt att tänka på att denna situation är helt annorlunda än flytande tillstånd, där vidhäftning stimuli och närhet stimuli är frånvarande.
Disclosures
Inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Andrea Bianchi, det italienska nätverket av laminopathies och medlemmarna i laboratoriet för stödet och alla konstruktiva kommentarer. Vi är tacksamma mot Chiara Cordiglieri för den dyrbara hjälpen vid konfokalmikroskop. Författarna tackar Dr Beatrice Biferali för hennes hjälp med att ta bilder för siffror. Arbetet som presenteras här stöddes av My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, Italiens hälsominister n. GR-2013-02355413 och Cariplo 2017-0649 till C.L. C.M. stöds av My First AIRC grant n.18993 och AFM-Telethon n. 22489.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
| Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
| Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
| Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
| Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
| Lab equipment | Manufacturer | ||
| Bunsen burner | |||
| Confocal microscope | Leica | ||
| Diamond pen | bio-optica | ||
| Dissection pins | |||
| FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
| Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
| Glass coverslips | Thermofisher | ||
| Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
| Glass slides | Thermofisher | ||
| Micro dissecting scissors | |||
| Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
| Micropipette tips | Corning | ||
| Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
| Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
| Rubber pipette bulbs | VWR | ||
| Sharp tweezers | |||
| Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
| Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
| Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
| Water bath at 37°C | VWR |
References
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127 (21), 4543-4548 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 19 (6), 628-633 (2007).
- Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The Skeletal Muscle Satellite Cell: The Stem Cell That Came in From the Cold. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1177-1191 (2006).
- Franco, I., et al. Somatic mutagenesis in satellite cells associates with human skeletal muscle aging. Nature Communications. 9 (1), 800 (2018).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nature Medicine. 20 (3), 255-264 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in aged skeletal muscle. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Bianchi, A., et al. Dysfunctional polycomb transcriptional repression contributes to lamin A/C-dependent muscular dystrophy. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 2408-2421 (2020).
- Blau, H. M., Webster, C., Pavlath, G. K. Defective myoblasts identified in Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 80 (15), 4856-4860 (1983).
- Jiang, C., et al. Notch signaling deficiency underlies age-dependent depletion of satellite cells in muscular dystrophy. Disease Models & Mechanisms. 7 (8), 997-1004 (2014).
- Vallejo, D., et al. PITX2 Enhances the Regenerative Potential of Dystrophic Skeletal Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (4), 1398-1411 (2018).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal Muscle Satellite Cells: Background and Methods for Isolation and Analysis in a Primary Culture System. Methods in Molecular Biology. (798), 21-52 (2012).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Developmental Biology. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. (290), 281-304 (2005).
- Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single Muscle-Fiber Isolation and Culture for Cellular, Molecular, Pharmacological, and Evolutionary Studies. Methods in Molecular Biology. 798, 85-102 (2012).
- Verma, M., Asakura, A. Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following β-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 60-67 (2011).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. 946 (206), 431-468 (2013).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Gallot, Y., Hindi, S., Mann, A., Kumar, A. Isolation, Culture, and Staining of Single Myofibers. Bio-Protocol. 6 (19), 1942 (2016).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Machado, L., et al. In Situ Fixation Redefines Quiescence and Early Activation of Skeletal Muscle Stem Cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Lucini, F., Bianchi, A., Lanzuolo, C. Formaldehyde-mediated snapshot of nuclear architecture. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Sullivan, T., et al. Loss of a-Type Lamin Expression Compromises Nuclear Envelope Integrity Leading to Muscular Dystrophy. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 913-920 (1999).
