Summary
هنا، نقترح طريقة للحصول بكفاءة على ألياف العضلات واحدة في المراحل التنموية المبكرة بعد الولادة من homozygous متحولة لامين Δ 8-11 نموذج الماوس، وهو نموذج شديد جدا لالتد وضمور العضلات Emery-Dreifuss (EDMD).
Abstract
يحدث ضمور العضلات Emery-Dreifuss المهيمن على الأوتوموم (EDMD) بسبب الطفرات في جين LMNA ، الذي يشفر اللامينات النووية من نوع A ، بروتينات الشعيرة الوسيطة التي تحافظ على المغلف النووي ومكونات النوكللوبلازم. أبلغنا مؤخرا أن هدر العضلات في EDMD يمكن أن يعزى إلى الاختلالات اللاجينية الجوهرية التي تؤثر على العضلات (الأقمار الصناعية) الخلايا الجذعية القدرة التجديدية. العزلة والثقافة من myofibers واحد هو واحد من أكثر الفسيولوجية السابقين vivo النهج لرصد سلوك الخلايا الفضائية داخل مكانتها، لأنها لا تزال بين الصفيحة القاعدية المحيطة الألياف وساركليما. ولذلك، فإنه يمثل نموذجاً تجريبياً لا يقدر بثمن لدراسة الخلايا الساتلية من مجموعة متنوعة من نماذج المورين. هنا، ونحن وصف طريقة إعادة تكييفها لعزل myofibers واحد سليمة وقابلة للحياة من عضلات hindlimb بعد الولادة(تيبياليس أنديرالي، اكستتوروم لونجوس، Gastrocnemius وسوليوس). بعد هذا البروتوكول، تمكنا من دراسة الخلايا الفضائية من لامين Δ 11-11 -/- الفئران، وهو نموذج EDMD مورين شديد، في 19 يوما فقط بعد الولادة.
نحن نفصّل إجراءات العزلة، وكذلك شروط الثقافة للحصول على كمية لا بأس بها من myofibers وذريتها المشتقة من الخلايا الساتلية المرتبطة بها. عندما تُزرع في عوامل النمو المتوسطة الغنية، تنشط الخلايا الساتلية المستمدة من فئران من النوع البري، وتتكاثر، وتفرق في نهاية المطاف أو تخضع للتجديد الذاتي. في homozygous Lamin Δ8-11 -/- فئران متحولة هذه القدرات تضعف بشدة.
هذه التقنية، إذا اتبعت بدقة، يسمح لدراسة جميع العمليات المرتبطة الخلية الساتلية المرتبطة myofiber حتى في المراحل المبكرة من النمو بعد الولادة والعضلات الهشة.
Introduction
الهيكل العظمي هو نسيج متمايز مع واحدة من أكثر قدرة ممتدة على تجديد بعد ممارسة الرياضة أو الصدمة1. ويرجع هذا السمة أساسا إلى وجود الخلايا الجذعية، ودعا الخلايا الفضائية بسبب موقعها المحيطي بين الصفيحة القاعدية والبلازما من myofiber2. خلال مرحلة ما بعد الولادة، تتكاثر الخلايا الساتلية وتتمايز تدريجياً، مما يساهم في نمو العضلات الهيكلية. مرة واحدة في مرحلة البلوغ، تدخل الخلايا الفضائية حالة هادئة قابلة للعكس، وعلى الصدمة الفسيولوجية أو المرضية، فإنها تنشط، تتكاثر وتفريق من أجل إصلاح العضلات التالفة3. وقد تم ربط عيوب في قدرة الخلايا الأقمار الصناعية للمرور بشكل صحيح من خلال هذه المراحل التجديدية المختلفة والخضوع للتجديد الذاتي بإهدار العضلات ، إما خلال الشيخوخة الفسيولوجية4،5،6 أو في الأمراض التنكسية العضلية ، مثل dystrophies العضلات7،8،9،10.
اثنين من الأساليب الثقافة الرئيسية موجودة لدراسة الخلايا الأقمار الصناعية السابق vivo: الثقافات ميوجيني الأولية من الخلايا أحادية النوى, ميكانيكيا وكيميائيا فصلت من العضلات كله11,12; أو ثقافة معزولة myofibers13،14،15،16،17،18،19،20. في الحالة الأولى، عملية عزل الخلايا الأقمار الصناعية ينطوي على التثاب من العضلات كلها المستخرجة من الماوس، والهضم الكيميائي، والترشيح وفرز الخلايا الفلورية المنشطة (FACS)21. هذا الإجراء، على الرغم من فعاليته في عزل الخلايا الفضائية من مجموعة متنوعة من النماذج، ينطوي على العديد من المتغيرات التي تعرض الخلايا الفضائية للإجهاد وتعطل مكانتها الفسيولوجية22،23. على النقيض من ذلك ، تتضمن عزل myofiber هضمًا ألطف للأنسجة العضلية مع الإنزيمات المهينة المصفوفية والتمزيق الميكانيكي الذي يسبب انخفاض الصدمة للخلايا الجذعية20. هذا النهج الثاني يسمح لاسترجاع أكثر كفاءة من الخلايا الفضائية قابلة للحياة، التي لا تزال تعلق جسديا إلى myofiber بهم بين لامينا القاعدية وساركليما، مما يسمح التحليل داخل المتخصصة الفسيولوجية الخاصة بهم19،20.
وقد اقترح العديد من البروتوكولات المختلفة خلال السنوات الماضية لعزل بشكل صحيح وفعال myofibers واحد من عضلات الهيكل العظمي. بالفعل في عام 1986 اقترح بيشوف بروتوكولا لعزل الألياف من Flexor Digitorum Brevis13 وفيما بعد، في عام 1995، روزنبلات وآخرون تعديل البروتوكول للحصول على فصل أكثر كفاءة من myofibers14. ومنذ ذلك الحين، اقترح العديد من الكتاب الآخرين إجراءات معدلة على العضلات الأخرى، مثل Extensor Digitorum لونجوس (EDL) وتيبياليس أنديرالي (TA)15،16،17،18،19،20، التي هي أطول ، حتى لو كانت أكثر هشاشة ، والعضلات14. ويمكن بعد ذلك myofibers معزولة تزرع على حد سواء في الالتصاق ، للسماح لتوسيع الخلايا الأقمار الصناعية المستمدة myoblasts ، أو في ظروف عائمة ، تصل إلى 96 ساعة ، لمتابعة ذرية المستمدة من الخلايا الأقمار الصناعية واحدة19 (الشكل 1). وتستخدم تركيزات متغيرة من المصل داخل الوسط ثقافة لتحريك تنشيط الخلايا الأقمار الصناعية، والانتشار و / أو التمايز، لدراسة قدرتها على العبور بشكل صحيح خلال هذه المراحل المختلفة1.
وصفنا مؤخرا آلية اللاجينية وراء استنفاد الأقمار الصناعية تجمع الخلايا الجذعية في نموذج الماوس من EDMD، و لامين Δ8-11 -/- الماوس7. منذ هذه الفئران عادة ما يموت بين 4-8 أسابيع من العمر24, بسبب فقدان العضلات الشديد, بذلت محاولة لالتقاط العيوب الجزيئية الكامنة في بداية مبكرة من المرض من خلال تركيز تحليلنا على تنمية العضلات بعد الولادة. تم عزل myofibers واحد العائمة واستزراع من نوع البرية ولامين Δ8-11 -/- متحولة7 19 يوما الفئران. في هذه المرحلة ، عيوب العضلات واضحة بالفعل ، ولكن الفئران لا تزال قابلة للحياة. ومع ذلك ، منذ جميع البروتوكولات المذكورة أعلاه لاستخراج myofibers واحد تم تحسينها لعضلات الهيكل العظمي للفئران الكبار ، كنا بحاجة إلى تكييفها لأغراضنا : الفئران الصغيرة جدا في فترة العمر والحجم ، وseofibers هشة جدا. وهكذا، فإننا نصف هنا إعادة التكيف من البروتوكول المقترح من قبل مختبر Rudnicki19 للحصول على عدد كبير من myofibers واحد قابلة للحياة من الفئران أثناء التنمية بعد الولادة ومن العضلات dystrophic شديدة، مثل تلك المستمدة من لامين Δ8-11 -/- الفئران24. الهدف النهائي من هذا النهج هو توفير إجراء موحد لدراسة الخلايا الجذعية المرتبطة بالعضلات المرتبطة بالميوفيبير في أي نموذج فأر آخر عندما تكون المراحل المبكرة من تطور ما بعد الولادة ذات أهمية ، أو في حالة نماذج الماوس التي تحمل أي مرض معين يجعل myofibers أكثر عرضة للإجهاد الميكانيكي.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية بموجب موافقة أخلاقية من وزارة الصحة الإيطالية واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (تفويض رقم 83/2019-PR). وقد تمت صيانة الحيوانات في منشأة مرخصة في مستشفى سان رافايل، ميلانو، إيطاليا (تفويض N. 127/2012-A).
1. تشريح العضلات وثقافة myofiber
- إعداد المعدات.
- قبل البدء، قم بإعداد جميع الحلول الضرورية كما هو موضح في الجدول 1. وينبغي إعداد هذه الحلول من جديد.
- تنظيف جميع الأسطح والأدوات التي سيتم استخدامها خلال الإجراء مع الإيثانول 70٪.
- قبل البدء بالتضحية بالفئران، قم بأداء طلاء 100 مم و35 مم من أطباق بيتري باستخدام مصل الحصان (HS). معطف جميع الأطباق لمنع myofibers من إرفاق البلاستيك. النظر في استخدام طبق واحد 100 مم وأربعة أطباق 35 ملم لكل فأرة.
- بعد إزالة الفائض من HS، قم بتخزين الأطباق المغلفة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم املأه بمحلول الغسيل أو الثقافة المتوسطة (طبقان من عيار 35 مم لكل فأرة).
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام حل من 10٪ HS في متوسطة النسر Dulbecco المعدلة (DMEM) لأطباق معطف. استخدم الأطباق المغلفة دائماً. من الممكن استخدام أطباق الثقافة ذات الحجم المختلف، ولكن ينصح بأطباق بتري الصغيرة. - لعزل الألياف، وإعداد الماصات باستور العقيمة كما هو مبين في الشكل 2. لكل فأر إعداد واحد ثقب كبير الماصات مناولة العضلات والميكانيكية تصنيف(الشكل 2A)واحد ماصات ثقب صغير لاختيار الألياف (الشكل 2B). قطع كل ماصة الزجاج، وربما باستخدام قلم الماس، إلى الطول المطلوب وحافات الماصات على نحو سلس على اللهب.
- معطف كل ماصة عن طريق التبول لفترة وجيزة مع HS قبل الاستخدام.
- الماوس التضحية وتشريح العضلات
- قبل الدفء حل الهضم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة قبل البدء في إجراء تشريح. أنابيب البولي بروبلين FACS المستديرة القاع هي أنسب الحاويات لهذا الغرض.
- مباشرة قبل بداية استعادة العضلات، تضحية الماوس وفقا للتوصية IACUC الوطنية المناسبة.
- الرطب في الجزء السفلي من الجسم مع 70٪ الإيثانول قبل قطع الجلد لجعل إزالة الشعر أسهل.
- وضع الماوس في موقف عرضة على دعم من البوليسترين مغطاة ورق الألومنيوم وقطع الجلد بدءا من منتصف الظهر طوليا وفي اتجاه الساقين.
- إزالة بعناية الجلد دون لمس العضلات والأوتار. فمن الممكن لتمزيق كل الجلد.
- قطع الساقين من الفأر والمضي قدما بسرعة مع تشريح.
ملاحظة: إذا كان أكثر راحة، فمن الممكن أن تستمر تشريح على الماوس بأكمله ولكن العمل على الساق يسمح المزيد من التنقل والدقة في التخفيضات في وقت لاحق. - إصلاح الساق على الدعم على مستوى القدم باستخدام دبوس والبدء في عزل عضلات الهيكل العظمي من الفائدة في هذا النظام: TA، EDL، Gastrocnemius و Soleus.
- رفع الوتر السفلي من TA مع ملاقط حاد في ارتفاع الكاحل وقطع عليه، ثم قطع مع مقص غرامة في جميع أنحاء العضلات TA إلى وتر آخر على مستوى الرضفة (الشكل 3A). نقل إلى حل الهضم.
- ارفع الوتر السفلي من EDL وافصله عن العضلات الأخرى عن طريق سحبه بلطف إلى أعلى إلى الوتر الآخر. قطع وضعه في حل الهضم.
ملاحظة: منذ EDL قد تكون صغيرة للغاية ليتم قطعها بشكل منفصل عن TA، يمكن تشريحها معا(الشكل 3B). ثم، إذا كانت العضلات كلها كبيرة جدا، وقطع في 2-3 قطعة بدءا من وتر واتباع الألياف في اتجاه طولي(الشكل 3C). - تدوير الساق تظهر عضلات الظهر وإصلاح القدم باستخدام دبوس. رفع وتر أخيل، سوف Gastrocnemius فصل تلقائيا من العضلات الأخرى. الوتر العلوي في الجزء الخلفي من الرضفة. قطعه وإضافة العضلات إلى الهضم.
- رفع وتر خارجي من الساق (فيما يتعلق بالجسم) والحصول على سولوس. فصل بلطف من العضلات الأخرى عن طريق التمرير تحت مع الملقط.
- تفعل الشيء نفسه بالنسبة للساق الأخرى (الخطوات من 1.2.7. إلى 1.2.11.).
- هضم العضلات
- احتضان حل الهضم الذي يحتوي على جميع العضلات في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 45-50 دقيقة. أثناء فترة الهضم، تحقق بانتظام من العضلات لتجنب الإفراط في الهضم. كل 10 دقائق عكس أنابيب الهضم 10x مع حركة نشطة (تجنب دوامة).
- وقف الهضم عندما تبدأ العضلات في تخفيف و myofibers مرئية.
- في نهاية الوقت الهضم يهز العينات.
- لوقف الهضم، نقل بعناية تعليق الهضم إلى طبق بيتري 100 مم مسخ مسبقا مع 10 مل من محلول الغسيل.
ملاحظة: تجنب الإفراط في الهضم العضلات لأن هذا سيؤدي حتما في عزلة من myofibers مفرط التعاقد. عادة مع هذا البروتوكول ، وعضلات الفئران المتحولة homozygous تأخذ 45 دقيقة ليتم هضمها ، في حين أن عضلات الفئران من النوع البرية تأخذ 50-55 دقيقة. يحتاج وقت الهضم إلى التحقق من صحة تجريبية.
- عزل myofibers واحد
- عزل أولا الألياف التي تم فصلها بالفعل تحت مجهر تشريح عن طريق اختيار لهم بشكل فردي مع ماصة P200 المغلفة أو ثقب صغير باستور ونقلها من بيتري 100 ملم في طبق بيتري جديد 35 ملم مع 5 مل من محلول الغسيل قبل الدافئة.
- لإطلاق سراح المزيد من myofibers، ماصة العضلات صعودا وهبوطا باستخدام ماصة زجاجية حفرة كبيرة تحمل مع المتوسطة الدافئة، حتى يتم تحريرها ميكانيكيا الألياف. لا تكون مستمرة جدا لأن هذا سيؤدي إلى ألياف ضارة.
- مواصلة الإفراج myofibers من العضلات حتى الطبق يحتوي على كمية مرغوب فيه. إذا تم الاحتفاظ بطبق Petri في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 8 دقائق، قم بإيقاف وتنفيذ ما لا يقل عن 5 دقائق حضانة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لإعادة توازن الوسط.
- قبل نقل myofibers واحد إلى المتوسطة الثقافة، وترك لهم في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في طبق الغسيل لمدة 1 ساعة على الأقل. وهذا يساعد myofibers على التكيف مع حالة في المختبر.
ملاحظة: myofibers الكبار هي أقل عرضة للإجهاد ويمكن غسلها ~ 2-3x. ومع ذلك ، في هذه الحالة (في 19 يوما بعد سن الولادة) فمن الأفضل أن تؤدي خطوة واحدة فقط الغسيل لمنع تلف myofiber. لذلك، دائماً إيلاء الاهتمام للحفاظ على myofibers مختارة نظيفة بما فيه الكفاية من خلال عدم حمل الحطام أو الألياف hypercontracted.
- ثقافة myofiber واحدة
- نقل myofibers الفردية إلى طبق جديد قبل الدفء مع ثقافة المتوسطة المناسبة (متوسطة مصل عالية للسماح تنشيط الخلايا الأقمار الصناعية، انظر الشكل 1).
- تغيير المتوسطة إلى myofibers معزولة، عن طريق نقلها إلى طبق مغلفة جديدة مع ثقافة جديدة المتوسطة، فقط بعد 48-72 ساعة من الثقافة لتجنب أي الإجهاد التي من شأنها أن تؤدي إلى الإفراط في myofibers وتعطيل.
2. تطبيقات المصب: Myofibers crosslinking و المناعةfluorescence
ملاحظة: يمكن تصور خلايا القمر الصناعي المرتبطة بـ myofibers بواسطة الفلوروس المناعي (IF) في وقت الاهتمام. منذ يتم تحسين معظم البروتوكولات المنشورة لأداء IF على myofibers الكبار، وهنا يتم تقديم بروتوكول مفصل للحصول على نتائج موثوقة أيضا على myofibers معزولة عن العضلات بعد الولادة.
- الربط المتقاطع بين Myofiber
- قبل البدء، إعداد جميع الحلول اللازمة على النحو المبين في الجدول 2.
- معطف مسبق مع HS العديد من أنابيب microcentuge 1.5 مل مثل عدد العينات. تأكد من إزالة كافة HS قبل المتابعة. منذ الألياف crosslinked هي أكثر صرامة من تلك الحية وأكثر صعوبة في ماصة، تأكد من crosslink حول 200-300 الألياف بشكل منفصل لكل أنبوب.
- تحت المجهر تشريح، وجمع جميع الألياف التي يمكن اعتبار صحية، ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge وترك أنبوب عمودي لمدة 5 دقائق داخل الحاضنة للسماح للألياف لتسوية.
- إزالة ناظر ببطء شديد من الأنبوب.
- ألياف عبر الوصلات بإضافة 1 مل من 4٪ شبهفورمالدهيد (PFA) في RT إلى الأنبوب. تفعل ذلك بلطف لتجنب الضائقة الألياف.
- لمنع الألياف تتشابك أثناء الربط، والحفاظ على أنبوب في التحريض لطيف جدا لمدة 10 دقيقة.
- إبقاء الأنبوب في وضع عمودي لمدة 5 دقائق في RT للسماح للألياف لتسوية، ثم تجاهل فائق ضمان إزالة غالبية حجم PFA.
- إضافة 1 مل من الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) والحفاظ على أنابيب عمودي لمدة 5 دقائق في RT للسماح للألياف إلى الرواسب.
- قم بإزالة المُنَاط واكرر إجراء الغسيل (الخطوة 2.1.8. ) مرتين مرة أخرى.
- الاحتفاظ عينات عبر في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: من الممكن الحفاظ على myofibers عبر الوصلات في 4 درجة مئوية لمدة أسبوع. إذا ظلت الألياف أكثر من أسبوع في هذه الحالة ، فإن هذا سيؤدي حتما إلى تداخل myofibers.
- الفلور المناعي
- الحفاظ على الأنابيب التي تحتوي على الألياف التي تقف في RT لمدة 5 دقائق على الأقل للسماح لترسب الألياف.
- إزالة supernatant، وترك مجرد حجم صغير للتأكد من عدم إزالة أي الألياف.
- إضافة 1 مل من 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 5 دقائق مع التحريض لطيف.
- وضع أنابيب في وضع عمودي لمدة 5 دقائق، ثم إزالة ناظر.
- إضافة 1.5 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان مع التحريض لطيف لمدة 5 دقائق.
- إبقاء الأنابيب في وضع عمودي لمدة 5 دقائق، ثم إزالة ناظر.
- إضافة 1 مل من حل حظر واحتضان لمدة 1 ساعة في RT مع التحريض لطيف.
- إبقاء أنابيب 5 دقيقة في وضع عمودي، ثم إزالة ناظر.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية في حل الحجب، إضافة إلى أنابيب واحتضان أكثر من ليلة في 4 درجة مئوية في التحريض لطيف (لتركيزات المقترحة انظر جدول المواد).
ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن احتضان الجسم المضاد الأساسي لمدة 3 ساعات في RT. ومع ذلك، أعطى حضانة بين عشية وضحاها تلطيخ الأمثل. يجب أن يكون حجم الحضانة لكل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية 300 ميكرولتر عندما تصل الألياف الرسوبية إلى درجة 100 ميكرولتر من أنبوب microcentuge 1.5 مل. عندما تكون الألياف أقل وفرة ، يوصى بحجم 100-200 ميكرولتر. - ترك الأنابيب في وضع عمودي لمدة 5 دقائق ثم إزالة ناظر.
- أداء 3 يغسل في 1 مل من 0.25٪ توين-20 في برنامج تلفزيوني، والاحتضان لمدة 5 دقائق في التحريض لطيف ثم ترك أنابيب يقف لمدة 5 دقائق في كل مرة.
ملاحظة: من الآن فصاعدا، تنفيذ جميع الخطوات في الظلام، لتجنب التبييض الفلوروكرومات. - تمييع الأجسام المضادة الثانوية في منع الحل، إضافتها إلى الأنابيب واحتضان لمدة 1 ساعة في RT مع التحريض لطيف (لتركيزات انظر جدول المواد).
- غسل مرتين في 1 مل من 0.1٪ توين-20 في برنامج تلفزيوني، والاحتضان لمدة 5 دقائق مع التحريض لطيف ثم ترك الأنابيب في وضع الوقوف لمدة 5 دقائق.
- إزالة supernatant، إضافة 1 مل من حل DAPI واحتضان لمدة 5 دقائق مع التحريض لطيف.
- اترك الأنابيب تقف عمودياً في رف لمدة 5 دقائق، ثم اخلع المابير.
- غسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، احتضان لمدة 5 دقائق مع الانفعالات لطيف ثم ترك أنابيب الوقوف في رف لمدة 5 دقائق.
- إزالة ناظر، وترك حجم حوالي 50 ميكرولتر.
- تركيب من الفلورسنت المسمى myofibers على شرائح المجهر
- قطع تلميح P200 ماصة ومعطف عليه مع حل حظر
ملاحظة: لمعطف طرف، ماصة الحل صعودا وهبوطا عدة مرات قبل التقاط الألياف، وهذا سوف تجنب الألياف إلى التمسك الجدار تلميح. - جمع الألياف من أنبوب ونشرها على شريحة زجاجية المجهر.
- تحت المجهر تشريح، وذلك باستخدام الضوء الطبيعي فقط ينعكس من قبل المرآة، واستخدام جديد (لا قطع) P200 ماصة تلميح لنشر الألياف وإزالة حل السائل الزائد.
- ترك الشرائح إلى الهواء الجاف في الظلام لمدة 10-15 دقيقة، حتى كمية منخفضة جدا من الحل لا يزال.
- إضافة المتوسطة تصاعد على الشريحة (ينبغي معايرة الكمية المناسبة من المتوسطة تصاعد على البعد من الغطاء: ل24 × 40 مم يغطي، 20 ميكرولتر يكفي) ومن ثم وضع ببطء غطاء الزجاج على المنطقة التي تحتوي على الألياف. يجب الحرص على عدم خلق فقاعات بين النظارات.
- اضغط على الغطاء بحيث الألياف سوف تقع على خطة أفقية واحدة.
- إصلاح الغطاء باستخدام طلاء الأظافر.
- تخزين العينات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
- الحصول على الصور المطلوبة من الفلورسنت المسمى myofibers مع المجهر confocal.
- قطع تلميح P200 ماصة ومعطف عليه مع حل حظر
Representative Results
نحن هضم عادة أربعة عضلات مختلفة (TA، EDL، Soleus و Gastrocnemius) لاسترداد كمية لا بأس بها من الألياف الطويلة والقابلة للحياة التي يمكن أن البقاء على قيد الحياة 96 ح في عوامل النمو المتوسطة الغنية(الشكل 4A، B). وينبغي نقل الألياف الأكثر سليمة فقط في الوسط ثقافة, كما أنها سوف البقاء على قيد الحياة; كل الآخرين، التي من السهل التمييز واختيار، تحتاج إلى التخلص منها.
عندما يتم الحفاظ على myofibers في عوامل النمو الغنية الخلايا الأقمار الصناعية المتوسطة المستمدة من الفئران نوع البرية تبدأ في تنشيط وتكاثر، انظر الشكل 1. على 48 ساعة من الثقافة، في حالة صحية(لامين Δ Δ 11 +/+)، الخلايا الأقمار الصناعية upregulate ميو دي والخضوع للقسم الأول. تنشيط Pax7 + / ميود + الخلايا الأقمار الصناعية ثم تتكاثر و 72 ساعة في الثقافة ، فإنها تولد مجاميع الخلية ملزمة myofiber ، التي هي أكثر وضوحا في 96 ح(الشكل 5). خلال هذه الانقسامات، وبعضها يمكن قمع التعبير ميود، ويخضع للتجديد الذاتي لإعادة إسكان تجمع الخلايا الجذعية، في حين أن تلك التي تحافظ على ميو دي تصبح ملتزمة بالتمايز عن طريق downregulating التعبير Pax7. بعد 96 ح، تحتوي مجموعات الخلايا الأقمار الصناعية مرئية بوضوح MyoG + الخلايا الملتزمة، التي يمكن أن تفرق إلى myofibers جديدة(الشكل 1 والشكل 6). وتجدر الإشارة إلى أنه مع هذه التجربة، وصفنا ديناميات تأخر تمايز الخلايا الساتلية في homozygous متحولة افئ لامين Δ8-11 (-/-) بالمقارنة مع نظرائهم من نوع البرية (+/+)، انظر الشكل 6.
النتيجة النهائية لكل تجربة واحدة دعونا نفكر في أن البروتوكول وضعت لعزلة myofibers واحد والثقافة من هذا النموذج من ضمور العضلات الشديد يضمن نوعية جيدة myofibers لجميع التطبيقات الأخرى.
الشكل 1: التمثيل الرسومي للمراحل التجديدية للخلايا الساتلية على غرار myofibers العائمة. على 48 ح من الثقافة في عوامل النمو المتوسطة الغنية، يتم تنشيط خلايا Pax7 + والخضوع للقسم الأول، مما يؤدي إلى مضاعفة من خلايا Pax7 +/MyoD+ . الخلايا الإيجابية ميود ثم تتكاثر وتتوسع، مما يؤدي، في 72 ساعة من الثقافة، إلى مجموعة من عدة خلايا التي هي ذرية خلية الأقمار الصناعية واحدة. عند 96 ساعة من ثقافة Pax7 + / MyoD الخلايا تصبح التفريق Pax7 - / MyoG الخلايا . أثناء مرحلة التوسيع، مجموعة فرعية من خلايا Pax7+/MyoD+ أسفل تنظيم تعبير ميو دي يخضع للتجديد الذاتي إلى حالة من عدم التطابق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد ماصات باستور المُضِيّة. (أ) عرض طولي و أمامي لكيفية ثقب كبير الماصات يجب أن تظهر. (B) عرض طولي و أمامي لكيفية ثقب صغير الماصات يجب أن تظهر أخيرا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية لتشريح العضلات الواحدة. (أ) عزل عضلة TA. تجنب إزالة طبقة رقيقة تغطي العضلات يحمي myofibers داخل. (B) TA وعضلات EDL معزولة معا لا تزال تعلق على وتر العليا على مستوى الرضفة. (ج)شعبة TA وEDL بعد العزل عن طريق قطع لهم على طول المحور الطولي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أمثلة على myofibers صحية وقابلة للحياة. صور النقيض من المرحلة التمثيلية لـ myofibers القابلة للتطبيق في التعليق. (أ) يشير السهم الأحمر إلى myofiber مع تنظيم ساركومير مرئي وخلية قمر صناعي على جانبه؛ يشير السهم برتقاليّ بعض قطعة من كسر myofibers, وبعض حطام حاضرة في الطبق أولى قبل ال إنتقاء نهائيّة للثقافة. شريط مقياس 100 μm. (ب) أكثر اكتمالا عرض myofibers الأخرى تحت أصغر التكبير. مقياس شريط 500 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الاختلاف في أبعاد مجموعات الخلايا الجذعية في wt و الفئران المتحولة. مناعية تلطّخ من [موفبيرسّسّدّة 19 يوم لامين Δ 11 فئران (+++ و-/-) بعد 96 [هسّس]. تظهر خلايا الأقمار الصناعية Pax7+ . وكان بعد خلية التجمع في معظم الحالات أكبر بكثير في لامين Δ 8-11 +/+ مما كان عليه في لامين Δ8-11 -/- من حيث عدد الخلايا. مقياس شريط 10 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تجربة الفلورة المناعية التمثيلية. إجراء تجربة immunofluorescence، بعد 96 ساعة من الثقافة، على myofibers المستخرجة من 19 يوما لامين Δ 8-11 الفئران (+/+ و-/-). لوحظت خلايا Pax7+/MyoG -(الحمراء) و باكس7-/ميوغ+ (الخضراء). الصور التي تم الحصول عليها مع المجهر confocal. شريط مقياس 25 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم الحل في النص | مكون | النسبه المئويه | المقترحة الحجم النهائي / عينة | تلاحظ | |
| غسل الحل | DMEM عالية الجلوكوز | 90% | 4 مل | حافظ على تعقيمك، حافظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام | |
| مصل الحصان (HS) | 10% | ||||
| حل الهضم | DMEM عالية الجلوكوز | 9.80% | 20 مل | مسحوق ضار للغاية. حل التصفية مع مرشح 0.22μm ومن ثم الحفاظ على العقيمة. حافظ على درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام | |
| كولاجيناز 1 | 0.20% | ||||
| ثقافة متوسطة | DMEM عالية الجلوكوز | 78% | 10 مل | حافظ على تعقيمك، حافظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | 20% | ||||
| استخراج جنين الدجاج (CEE) | 1% | ||||
| بنسيلين-ستريبتوميسين (P/S) | 1% | ||||
الجدول 1: وصفات للحلول المستخدمة في الفرع 1.
| اسم الحل في النص | مكون | النسبه المئويه | المقترحة الحجم النهائي / عينة | تلاحظ | |
| 4% PFA | ما قبل الفورمالدهيدي (PFA) | 4% | 2-3 مل | مسحوق ومن ثم حل هي ضارة للغاية | |
| برنامج تلفزيوني | 96% | ||||
| 0.5% تريتون X-100 | تريتون X-100 | 0.50% | 2-3 مل | تريتون X-100 هو لزج للغاية، وقطع بشكل تفضيلي غيض من ماصة ل aliquot ذلك | |
| برنامج تلفزيوني | 99.50% | ||||
| 0.25 في المائة توين-20 | توين-20 | 0.25% | 10 مل | توين-20 هو لزج للغاية، وقطع بشكل تفضيلي غيض من ماصة ل aliquot ذلك | |
| برنامج تلفزيوني | 99.75% | ||||
| 0.1 في المائة توين-20 | توين-20 | 0.10% | 10 مل | توين-20 هو لزج للغاية، وقطع بشكل تفضيلي غيض من ماصة ل aliquot ذلك | |
| برنامج تلفزيوني | 99.90% | ||||
| حظر الحل | مصل الأبقار الجنينية (FBS) | 10% | 10 مل | إعداد حل جديد وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 3 أسابيع (دائما التحقق من وضوح قبل الاستخدام) | |
| برنامج تلفزيوني | 90% | ||||
| DAPI | DAPI | 0.10% | 2-3 مل | أبقِ في الظلام | |
| برنامج تلفزيوني | 99.90% | ||||
الجدول 2: وصفات للحلول المستخدمة في الفرع 2.
Discussion
عزل myofibers واحد سليمة هو وسيلة أساسية في مجال myogenesis عندما يكون الهدف الرئيسي هو لتوصيف الخلايا المستقلة قدرات تجديد الخلايا الجذعية داخل مكانة بهم، في ظروف صحية والمرضية. ومع ذلك، عندما تكون الدراسات الكيميائية الحيوية أو الجينومية ذات أهمية، قد تكون الخلايا الساتلية المعزولة في نظام مراقبة الأصول الأجنبية هي الخيار الأفضل.
عزلة myofibers واحدة تسمح لمتابعة السابقين vivo، ولكن في الطريقة الأكثر فسيولوجية، وديناميات جميع الخطوات الخلايا الساتلية واحدة تمر خلال تجديد العضلات، والتي هي: التنشيط، انقسام الخلايا (غير المتماثلة والمتناظرة)، والتمايز والعودة إلى حالة التجدد الذاتي. مرة واحدة يتم زراعة myofibers في ظروف عائمة، والخلايا القمر الصناعي واحد تنشيط وتوسيع تشكيل مجموعة من الخلايا، وكلها مستمدة من نفس الخلية الأقمار الصناعية. تحليل الفلورس المناعي لعلامات الانتشار أو التمايز أو التفعيل أو الجزع هو الأمثل لتحديد النسبة بين مراحل الخلية.
الخطوة الرئيسية في بروتوكول لدينا للحصول على myofibers قابلة للحياة وسليمة يمكن اعتبار تشريح العضلات السريع ولكن لطيف، عن طريق عزل الأوتار إلى وتر، لتجنب أي تلف العضلات. نصيحتنا هي استخدام مقص حاد فقط وملاقط حادة صغيرة والحد من إجراء تشريح العضلات بأكملها إلى عشر دقائق. عندما يكون من الصعب عزل العضلات الصغيرة جدا (أي EDL وTA)، فمن الممكن قطع لهم معا وتقسيمها في وقت لاحق باستخدام مقص غرامة قطع على طول الخطة الطولية التالية الألياف. هذه الاستراتيجية في نهاية المطاف تعطي myofibers أقل سليمة ، ولكن لن تكون قابلة للحياة للخطر. يجب أن يتم تنفيذ الشيء نفسه على عضلات كبيرة مثل Gastrocnemius لتسهيل عملية الهضم. تحسين وقت الهضم ، الذي يحتاج إلى التحقق التجريبي ، والحد الأدنى من التلاعب بالألياف المعزولة هما أيضا جانبان حاسمان للنتائج الإيجابية للتحليل اللاحق.
ميزة البروتوكول ذكرت هنا هو أنه يمكن تطبيقه على الفئران الصغيرة جدا (في العمر والبعد)، حتى عندما تكون عضلاتهم هشة للغاية. حتى لو لم يذكر أعلاه، فمن الممكن أن تتبع هذا البروتوكول من تشريح إلى ثم الثقافة قابلة للحياة myofibers لفترة أطول باستخدام الأطباق المغلفة بالغشاء الطابق السفلي18،19. من المهم أن نعتبر أن هذا الوضع يختلف تمامًا عن الحالة العائمة ، حيث تغيب محفزات الالتصاق ومحفزات القرب.
Disclosures
لا توجد مصالح متنافسة.
Acknowledgments
ونشكر أندريا بيانكي، والشبكة الإيطالية لللامينووباي وأعضاء المختبر على الدعم وجميع التعليقات البناءة. ونحن ممتنون لكيارا كورديغيليرلي للمساعدة الثمينة في المجهر confocal. يشكر المؤلفان الدكتورة بياتريس بيفرالي على مساعدتها في التقاط الصور للشخصيات. وقد تم دعم العمل المقدم هنا من قبل بلدي أول AIRC منحة ن. 18535، AFM-Telethon n. 21030، وزير الصحة الإيطالي n. GR-2013-02355413 وكاريبلو 2017-0649 إلى C.L. C.M. مدعوم بمنحة MY AIRC الأولى n.18993 و AFM-Telethon n. 22489.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
| Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
| Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
| Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
| Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
| Lab equipment | Manufacturer | ||
| Bunsen burner | |||
| Confocal microscope | Leica | ||
| Diamond pen | bio-optica | ||
| Dissection pins | |||
| FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
| Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
| Glass coverslips | Thermofisher | ||
| Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
| Glass slides | Thermofisher | ||
| Micro dissecting scissors | |||
| Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
| Micropipette tips | Corning | ||
| Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
| Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
| Rubber pipette bulbs | VWR | ||
| Sharp tweezers | |||
| Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
| Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
| Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
| Water bath at 37°C | VWR |
References
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127 (21), 4543-4548 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 19 (6), 628-633 (2007).
- Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The Skeletal Muscle Satellite Cell: The Stem Cell That Came in From the Cold. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1177-1191 (2006).
- Franco, I., et al. Somatic mutagenesis in satellite cells associates with human skeletal muscle aging. Nature Communications. 9 (1), 800 (2018).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nature Medicine. 20 (3), 255-264 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in aged skeletal muscle. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Bianchi, A., et al. Dysfunctional polycomb transcriptional repression contributes to lamin A/C-dependent muscular dystrophy. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 2408-2421 (2020).
- Blau, H. M., Webster, C., Pavlath, G. K. Defective myoblasts identified in Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 80 (15), 4856-4860 (1983).
- Jiang, C., et al. Notch signaling deficiency underlies age-dependent depletion of satellite cells in muscular dystrophy. Disease Models & Mechanisms. 7 (8), 997-1004 (2014).
- Vallejo, D., et al. PITX2 Enhances the Regenerative Potential of Dystrophic Skeletal Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (4), 1398-1411 (2018).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal Muscle Satellite Cells: Background and Methods for Isolation and Analysis in a Primary Culture System. Methods in Molecular Biology. (798), 21-52 (2012).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Developmental Biology. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. (290), 281-304 (2005).
- Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single Muscle-Fiber Isolation and Culture for Cellular, Molecular, Pharmacological, and Evolutionary Studies. Methods in Molecular Biology. 798, 85-102 (2012).
- Verma, M., Asakura, A. Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following β-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 60-67 (2011).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. 946 (206), 431-468 (2013).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Gallot, Y., Hindi, S., Mann, A., Kumar, A. Isolation, Culture, and Staining of Single Myofibers. Bio-Protocol. 6 (19), 1942 (2016).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Machado, L., et al. In Situ Fixation Redefines Quiescence and Early Activation of Skeletal Muscle Stem Cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Lucini, F., Bianchi, A., Lanzuolo, C. Formaldehyde-mediated snapshot of nuclear architecture. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Sullivan, T., et al. Loss of a-Type Lamin Expression Compromises Nuclear Envelope Integrity Leading to Muscular Dystrophy. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 913-920 (1999).
