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एकल Myofiber अलगाव और संस्कृति एमरी के एक Murine मॉडल से-Dreifuss मस्कुलर डिस्ट्रॉफी जल्दी प्रसव के बाद विकास में

Published: July 1, 2020 doi: 10.3791/61516
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi", 2IRCCS Santa Lucia Foundation, 3Department of Biology and Biotechnology, "C. Darwin" Sapienza University, CNR - IBPM, 4CNR – Institute of Biomedical Technologies (ITB)

Summary

यहां, हम होमोज़िगस उत्परिवर्ती लेमिन ए8-11 माउस मॉडल से प्रसव के बाद के शुरुआती विकासात्मक चरणों में एकल मांसपेशियों के तंतुओं को कुशलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करते हैं, जो एमरी-ड्रेफस मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (ईडीएमडी) के लिए एक बहुत ही गंभीर मॉडल है।

Abstract

ऑटोसोमल प्रमुख एमरी-ड्रेफस मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (ईडीएमडी) एलएमएनए जीन में म्यूटेशन के कारण होता है, जो परमाणु लिफाफे और न्यूक्लियोप्लैम के घटकों को बनाए रखने वाले ए-टाइप न्यूक्लियर लैमिन्स, इंटरमीडिएट फिलामेंट प्रोटीन को एन्कोड करता है । हमने हाल ही में बताया है कि ईडीएमडी में मांसपेशियों को बर्बाद करने के लिए आंतरिक एपीजेनेटिक डिस्फंक्शन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो मांसपेशियों (उपग्रह) स्टेम कोशिकाओं को पुनर्योजी क्षमता को प्रभावित करते हैं। अलगाव और एकल myofibers की संस्कृति सबसे शारीरिक पूर्व वीवो दृष्टिकोण में से एक है अपने आला के भीतर उपग्रह कोशिकाओं के व्यवहार की निगरानी के लिए, के रूप में वे फाइबर और sarcolemma आसपास बेसल लैमिना के बीच रहते हैं । इसलिए, यह विभिन्न प्रकार के मुरीन मॉडलों से उपग्रह कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य प्रयोगात्मक प्रतिमान का प्रतिनिधित्व करता है। यहां, हम प्रसव के बाद की हिंडलिब मांसपेशियों(टिबिलिस एंटेर, एक्सटेंसर डिजोरम लंगस, गैस्ट्रोस्नेमियस और सोलियस)से अक्षुण्ण और व्यवहार्य एकल माइफबरर्स को अलग करने के लिए एक पुनः अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के बाद, हम जन्म के केवल 19 दिनों में Lamin 18-11-/-चूहों, एक गंभीर EDMD murine मॉडल से उपग्रह कोशिकाओं का अध्ययन करने में सक्षम थे ।

हम अलगाव प्रक्रिया का विस्तार करते हैं, साथ ही माइफिबर और उनके संबद्ध उपग्रह-कोशिकाओं-व्युत्पन्न संतान की एक अच्छी राशि प्राप्त करने के लिए संस्कृति की स्थिति का विस्तार करते हैं। जब विकास कारकों समृद्ध माध्यम में सुसंस्कृत, जंगली प्रकार चूहों से प्राप्त उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय, पैदा करना, और अंततः अंतर या आत्म नवीकरण से गुजरना । homozygous Lamin 18-11 में-/-उत्परिवर्ती चूहों इन क्षमताओं को गंभीर रूप से बिगड़ा हुआ है ।

यह तकनीक, यदि कड़ाई से पालन की जाती है, तो माइोफिबर से जुड़े उपग्रह कोशिका से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देती है, यहां तक कि प्रसव के बाद के विकास के चरणों में और नाजुक मांसपेशियों में भी।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी एक विभेदित ऊतक है जिसमें व्यायाम या आघात के बाद पुनर्जीवित करने की सबसे विस्तारित क्षमता में से एकहै 1। यह विशेषता मुख्य रूप से स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण होती है, जिसे बेसल लैमिना और मायोफिबर 2 के प्लाज्मलेम्मा के बीच उनकी परिधीय स्थिति के कारण उपग्रह कोशिकाएं कहाजाताहै। प्रसव के बाद के विकास के दौरान, उपग्रह कोशिकाएं पैदा होती हैं और उत्तरोत्तर अंतर करती हैं, इस प्रकार कंकाल मांसपेशियों के विकास में योगदान देती हैं। एक बार वयस्कता में, उपग्रह कोशिकाएं एक प्रतिवर्ती शांत अवस्था में प्रवेश करती हैं, और शारीरिक या रोग आघात पर, वे क्षतिग्रस्त मांसपेशियों की मरम्मत के लिए सक्रिय, प्रसार और अंतर करते हैं3। इन विभिन्न पुनर्योजी चरणों के माध्यम से ठीक से पारगमन करने और आत्म-नवीकरण से गुजरने के लिए उपग्रह कोशिकाओं की क्षमता में दोषों को मांसपेशियों को बर्बाद करने से दृढ़ता से जोड़ा गया है, या तो शारीरिक उम्र4,,5, 6,6 या मांसपेशियों में अपक्षयी रोगों, जैसे मस्कुलर डिस्ट्रोप7,,8,,9,,10।

उपग्रह कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए दो मुख्य संस्कृति दृष्टिकोण मौजूद हैं पूर्व वीवो: मोनोन्यूक्लिटेड कोशिकाओं से प्राथमिक मायोजेनिक संस्कृतियां, यांत्रिक रूप से और रासायनिक रूप से पूरी मांसपेशी11,,12से अलग होती हैं; या अलग - थलग पड़े मायोफबर की संस्कृति13,14,15, 16,17,17,18,19,,20. पहले मामले में, उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव की प्रक्रिया में माउस से निकाली गई पूरी मांसपेशियों का ट्रिट्यूशन, एक रासायनिक पाचन, निस्पंदन और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छंटाई (FACS)21शामिल है। यह प्रक्रिया, हालांकि विभिन्न प्रकार के मॉडलों से उपग्रह कोशिकाओं को अलग-थलग करने में प्रभावी है, कई चरों पर जोर देती है जो उपग्रह कोशिकाओं को तनाव में बेनकाब करती हैं और उनके शारीरिक आला22,,23को बाधित करती हैं। इसके विपरीत, माइओफाइबर अलगाव में मैट्रिक्स अपमानजनक एंजाइमों के साथ मांसपेशियों के ऊतकों का एक जेंटलर पाचन और एक यांत्रिक श्रेडिंग शामिल है जो स्टेम सेल20के लिए कम आघात का कारण बनता है। यह दूसरा दृष्टिकोण व्यवहार्य उपग्रह कोशिकाओं की अधिक कुशल पुनर्प्राप्ति की अनुमति देता है, जो बेसल लैमिना और सारकोलेम्मा के बीच अपने माइफइबर से शारीरिक रूप से जुड़ा रहता है, इस प्रकार उनके शारीरिक आला19,,20के भीतर विश्लेषण की अनुमति देता है।

पिछले वर्षों के दौरान कंकाल की मांसपेशियों से एकल माइफबर को ठीक से और कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए कई अलग-अलग प्रोटोकॉल प्रस्तावित किए गए हैं। पहले से ही 1 9 86 में बिस्चोफ ने फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस13 से फाइबर को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव किया और बाद में, 1 99 5 में, रोसेनब्लैट एट अल ने मायोफबर14का अधिक कुशल अलगाव प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित किया। तब से, कई अन्य लेखकों ने अन्य मांसपेशियों पर समायोजित प्रक्रियाओं का प्रस्ताव किया, जैसे कि एक्सटेंसर डिजकोरम लोंगस (ईडीएल) और टिबिलिस पूर्वकाल (टीए) 15,,16,,17,,18,,19,,20,जो लंबे समय तक होते हैं, भले ही अधिक नाजुक, मांसपेशियां14। अलग myofibers तो आसंजन में दोनों की खेती की जा सकती है, उपग्रह कोशिकाओं के विस्तार के लिए अनुमति देने के लिए-व्युत्पन्न myoblasts, या अस्थाई परिस्थितियों में, ९६ घंटे तक, एकल उपग्रह कोशिकाओं से प्राप्त संतान का पालन करने के लिए19 (चित्रा 1)। संस्कृति माध्यम के भीतर सीरम की परिवर्तनीय सांद्रता का उपयोग उपग्रह कोशिकाओं के सक्रियण, प्रसार और/या भेदभाव को ट्रिगर करने के लिए किया जाता है, ताकि इन विभिन्न चरणों के माध्यम से ठीक से पारगमन करने की उनकी क्षमता का अध्ययन किया जा सके1।

हमने हाल ही में ईडीएमडी के माउस मॉडल में उपग्रह स्टेम सेल पूल की थकावट के पीछे एपिजेनेटिक तंत्र का वर्णन किया है, लैमिन 8-11-/-माउस7। चूंकि ये चूहे आमतौर पर24वर्ष की आयु के 4-8 सप्ताह के बीच मर जाते हैं, गंभीर मांसपेशियों की हानि के कारण, प्रसव के बाद की मांसपेशियों के विकास पर हमारे विश्लेषण को ध्यान केंद्रित करके रोग की शुरुआत में अंतर्निहित आणविक दोषों को पकड़ने का प्रयास किया गया था। फ्लोटिंग सिंगल माइफबर्स को जंगली प्रकार और लैमिन 8-11-/-उत्परिवर्ती 7 19 दिन पुराने चूहों से अलग और सुसंस्कृत किया गया था।7 इस स्तर पर, मांसपेशियों के दोष पहले से ही स्पष्ट हैं, लेकिन चूहे अभी भी व्यवहार्य हैं। हालांकि, चूंकि वयस्क चूहों की कंकाल मांसपेशियों के लिए एकल माइफबर्स निष्कर्षण के लिए उपरोक्त सभी उपर्युक्त प्रोटोकॉल अनुकूलित किए गए थे, इसलिए हमें उन्हें अपने उद्देश्यों के अनुकूल बनाने की आवश्यकता थी: उम्र और आकार की अवधि में बहुत छोटे चूहे, और बहुत नाजुक माइफबर। इस प्रकार, हम यहां रुडनिकी प्रयोगशाला19 द्वारा प्रस्तावित प्रोटोकॉल के हमारे पुनः अनुकूलन का वर्णन करते हैं ताकि प्रसव के बाद के विकास के दौरान चूहों से और गंभीर डिस्ट्रोफिक मांसपेशियों से एक महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त की जा सके, जैसे कि लैमिन 8-11-/-चूहों 24से प्राप्त हुए । इस दृष्टिकोण का अंतिम लक्ष्य किसी भी अन्य माउस मॉडल में मायोफिबर से जुड़े मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया प्रदान करना है जब प्रसव के बाद के विकास के शुरुआती चरण रुचि के होते हैं, या माउस मॉडल के मामले में किसी विशिष्ट बीमारी को ले जाते हैं जो माइोफिबर्स को यांत्रिक तनाव के लिए अधिक संवेदनशील बनाता है।

Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्राधिकरण एन 83/2019-पीआर) के नैतिक अनुमोदन के तहत किया गया था । जानवरों को सैन रफेल अस्पताल, मिलान, इटली (प्राधिकरण एन एन 127/2012-ए) में एक अधिकृत सुविधा में बनाए रखा गया था ।

1. मांसपेशी विच्छेदन और myofiber संस्कृति

  1. उपकरण तैयार करना।
    1. शुरू करने से पहले, तालिका 1में वर्णित सभी आवश्यक समाधान तैयार करें। इन समाधानों को हौसले से तैयार करने की जरूरत है ।
    2. 70% इथेनॉल के साथ प्रक्रिया के दौरान उपयोग की जाने वाली सभी सतहों और उपकरणों को साफ करें।
    3. चूहों के बलिदान के साथ शुरू करने से पहले, घोड़ा सीरम (एचएस) का उपयोग कर 100 मिमी और 35 मिमी पेट्री व्यंजनों की कोटिंग करें। प्लास्टिक से जुड़े होने से मायोफिबरर्स को रोकने के लिए सभी व्यंजनों को कोट करें। माउस प्रति एक 100 मिमी पकवान और चार 35 मिमी व्यंजन का उपयोग करने पर विचार करें।
    4. एचएस की अधिकता को हटाने के बाद, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में लेपित व्यंजन स्टोर करें। फिर इसे धोने के समाधान या संस्कृति माध्यम (माउस प्रति दो 35 मिमी व्यंजन) से भरें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, दुलबेक्को के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) में 10% एचएस का समाधान व्यंजन कोट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमेशा लेपित व्यंजनों का सेवन करें। विभिन्न आकार के संस्कृति व्यंजनों का उपयोग करना संभव है, लेकिन छोटे आयाम पेट्री व्यंजनों की सिफारिश की जाती है।
    5. फाइबर अलगाव के लिए, बाँझ पाश्चर पिपेट तैयार करें जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है। प्रत्येक माउस के लिए मांसपेशियों से निपटने और यांत्रिक विच्छेदन(चित्रा 2 ए)और फाइबर चयन (चित्रा2B)के लिए एक छोटा छेद पिपेट के लिए एक बड़ा होल बोर पिपेट तैयार करें। प्रत्येक ग्लास पिपेट को काटें, संभवतः एक हीरे की कलम का उपयोग करके, एक लौ पर वांछित लंबाई और चिकनी पिपेट के किनारों पर।
    6. उपयोग से पहले एचएस के साथ संक्षेप में गीला करके प्रत्येक पिपेट को कोट करें।
  2. माउस बलिदान और मांसपेशियों का विच्छेदन
    1. विच्छेदन प्रक्रिया शुरू करने से पहले 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पाचन समाधान को पूर्व-गर्म करें। पॉलीप्रोपाइलीन एफएस राउंड-बॉटम ट्यूब इस उद्देश्य के लिए सबसे उपयुक्त कंटेनर हैं।
    2. मांसपेशियों की पुनर्प्राप्ति की शुरुआत से तुरंत पहले, उचित राष्ट्रीय IACUC सिफारिश के अनुसार माउस का बलिदान करें।
    3. बालों को हटाने को आसान बनाने के लिए त्वचा को काटने से पहले अपने निचले शरीर को 70% इथेनॉल के साथ गीला करें।
    4. एल्यूमीनियम पेपर से ढके पॉलीस्टीरिन के समर्थन पर माउस को प्रवण स्थिति में रखें और त्वचा को पीठ के बीच से शुरू करने वाले टूावश्यक रूप से और पैरों की दिशा में काट लें।
    5. ध्यान से मांसपेशियों और टेंडन को छूने के बिना त्वचा को हटा दें। सभी त्वचा को चीर देना संभव है।
    6. माउस के दोनों पैरों को काटें और विच्छेदन के साथ तेजी से आगे बढ़ें।
      नोट: यदि यह अधिक आरामदायक है, तो पूरे माउस पर विच्छेदन जारी रखना संभव है लेकिन पैर पर काम करना बाद में कटौती में अधिक गतिशीलता और सटीकता की अनुमति देता है।
    7. पिन का उपयोग करके पैर के स्तर पर पैर को ठीक करें और इस क्रम में रुचि की कंकाल मांसपेशियों को अलग करना शुरू करें: टीए, ईडीएल, गैस्ट्रोस्नेमियस और सोलियस।
    8. टखने की ऊंचाई पर एक तेज चिमटी के साथ टीए के निचले टेंडन को उठाएं और इसे काट लें, फिर टीए मांसपेशी के चारों ओर ठीक कैंची से काटकर अन्य कण्डरा के स्तर पर अन्यकण्डरा (चित्रा 3 ए)के स्तर पर करें। पाचन समाधान में स्थानांतरित करें।
    9. ईडीएल के निचले टेंडन को उठाएं और इसे धीरे-धीरे अन्य कण्डरा तक ऊपर की ओर खींचकर अन्य मांसपेशियों से अलग करें। इसे काटकर पाचन समाधान में रखें।
      नोट: चूंकि ईडीएल टीए से अलग से कटौती करने के लिए बहुत छोटा हो सकता है, इसलिए उन्हें एक साथ विच्छेदित किया जा सकता है(चित्रा 3 बी)। फिर, यदि पूरी मांसपेशी बहुत बड़ी है, तो इसे कण्डरा से शुरू होने वाले 2-3 टुकड़ों में काट लें और फाइबर को देशांतर दिशा(चित्रा 3 सी)में निम्नलिखित करें।
    10. पीठ की मांसपेशियों को दिखाते हुए पैर घुमाएं और पिन का उपयोग करके पैर को ठीक करें। आचिले के टेंडन को उठाएं, गैस्ट्रोस्नेमियस स्वचालित रूप से अन्य मांसपेशियों से अलग हो जाएगा। ऊपरी कण्डरा पटेला के पीछे ऊपर है। इसे काटें और मांसपेशियों को पाचन में जोड़ें।
    11. पैर के बाहरी कण्डरा (शरीर के संबंध में) उठाएं और सोलियस प्राप्त करें। धीरे-धीरे चिमटी के साथ नीचे स्क्रॉल करके इसे अन्य मांसपेशियों से अलग करें।
    12. दूसरे पैर के लिए भी ऐसा ही करें (1.2.7 से 1.2.11 तक के चरण)।
  3. मांसपेशियों का पाचन
    1. पाचन समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान में सभी मांसपेशियों को लगभग 45-50 मिनट तक इनक्यूबेट करें। पाचन समय के दौरान, अधिक पाचन से बचने के लिए नियमित रूप से मांसपेशियों की जांच करें। हर 10 मिनट पाचन ट्यूबों को एक ऊर्जावान आंदोलन के साथ 10x उलटा (भंवर से बचें)।
    2. पाचन बंद करो जब मांसपेशियों को ढीला करने के लिए शुरू और myofibers दिखाई देते हैं।
    3. पाचन समय के अंत में नमूनों को हिलाएं।
    4. पाचन को रोकने के लिए, पाचन निलंबन को सावधानीपूर्वक 100 मिमी पेट्री डिश में 10 एमएल धोने के समाधान के साथ स्थानांतरित करें।
      नोट: मांसपेशियों से अधिक पाचन से बचें क्योंकि इससे अनिवार्य रूप से हाइपर-अनुबंधित मायोफिबर के अलगाव में परिणाम होगा। आमतौर पर इस प्रोटोकॉल के साथ, होमोज़िगस उत्परिवर्ती चूहों की मांसपेशियों को पचाने में 45 मिनट का समय मिलता है, जबकि जंगली प्रकार के चूहों की मांसपेशियां 50-55 मिनट लेती हैं। पाचन समय को प्रायोगिक रूप से मान्य करने की आवश्यकता होती है।
  4. सिंगल माइफइबरर्स आइसोलेशन
    1. सबसे पहले एक कोटेड P200 पिपेट या छोटे छेद पाश्चर के साथ व्यक्तिगत रूप से उठाकर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे पहले से ही अलग फाइबर को अलग करें और उन्हें 100 मिमी पेट्री से एक नए 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, जिसमें 5 एमएल पूर्व-गर्म धोने के समाधान हैं।
    2. आगे myofibers जारी करने के लिए, मांसपेशियों को ऊपर और नीचे गर्म माध्यम के साथ एक बड़े छेद बोर ग्लास पिपेट का उपयोग कर, जब तक फाइबर यंत्रवत् जारी कर रहे हैं । बहुत लगातार न रहें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप फाइबर हानिकारक होंगे।
    3. मांसपेशियों से myofibers जारी रखें जब तक पकवान एक वांछनीय राशि शामिल है । यदि पेट्री डिश को 8 मिनट से अधिक समय तक कमरे के तापमान पर रखा जाता है, तो मध्यम को फिर से बराबरकरने के लिए न्यूनतम 5 मिनट इनक्यूबेशन 37 डिग्री सेल्सियस पर रुकें और प्रदर्शन करें।
    4. एकल माइफइबरर्स को संस्कृति माध्यम में स्थानांतरित करने से पहले, उन्हें कम से कम 1 घंटे के लिए वॉश डिश में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर छोड़ दें। यह myofibers इन विट्रो हालत को समायोजित करने में मदद करता है ।
      नोट: वयस्क myofibers तनाव के लिए कम अतिसंवेदनशील होते है और ~ 2-3x धोया जा सकता है । हालांकि, इस स्थिति में (प्रसव के बाद 19 दिनों में) मायोफाइबर क्षति को रोकने के लिए केवल एक धोने के कदम का प्रदर्शन करना बेहतर है। इसलिए, हमेशा मलबे या हाइपरकांक्टेड फाइबर न ले जाने से चयनित मायोफीबर को पर्याप्त रूप से साफ रखने पर ध्यान दें।
  5. एकल माइफइबर संस्कृति
    1. उपयुक्त संस्कृति माध्यम (उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय करने की अनुमति देने के लिए उच्च सीरम माध्यम, चित्र 1 देखें) के साथ एक नए पूर्व-गर्म पकवान में व्यक्तिगत myofibers स्थानांतरित करें।
    2. माध्यम को अलग-थलग माइफइबरर्स में बदलें, उन्हें नई संस्कृति माध्यम के साथ एक नए लेपित पकवान में स्थानांतरित करके, केवल संस्कृति के 48-72 घंटे के बाद किसी भी तनाव से बचने के लिए जो मायोफबर हाइपरकंट्राक्शन और व्यवधान का कारण बनेगा।

2. डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग: मायोफिबर क्रॉसलिंकिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस

नोट: मायोफिबर से जुड़े उपग्रह कोशिकाओं को ब्याज के समय इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) द्वारा कल्पना की जा सकती है। चूंकि अधिकांश प्रकाशित प्रोटोकॉल वयस्क माइफबर पर आईएफ प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित हैं, इसलिए यहां प्रसव के बाद की मांसपेशियों से अलग माइोफबर पर भी विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है।

  1. मायोफिबर क्रॉसलिंकिंग
    1. शुरू करने से पहले, तालिका 2में वर्णित सभी आवश्यक समाधान तैयार करें।
    2. नमूनों की संख्या के रूप में कई 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के साथ प्रीकोट। आगे बढ़ने से पहले सभी एचएस को हटाना सुनिश्चित कर लें। चूंकि क्रॉसलिंक किए गए फाइबर जीवित लोगों की तुलना में मुश्किल होते हैं और पिपेट करने के लिए अधिक कठिन होते हैं, इसलिए प्रति ट्यूब अलग से 200-300 फाइबर को क्रॉसलिंक करना सुनिश्चित करें।
    3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, उन सभी फाइबर को इकट्ठा करें जिन्हें स्वस्थ माना जा सकता है, उन्हें माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और फाइबर को व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए इनक्यूबेटर के अंदर 5 मिनट के लिए ट्यूब ऊर्ध्वाधर छोड़ दें।
    4. ट्यूब से बहुत धीरे-धीरे सुपरनिटेंट निकालें।
    5. ट्यूब में आरटी में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 1 एमएल जोड़कर क्रॉसलिंक फाइबर। फाइबर संकट से बचने के लिए इसे धीरे-धीरे करें।
    6. क्रॉसलिंकिंग के दौरान फाइबर को इंटरवीविंग से रोकने के लिए, ट्यूब को 10 मिनट के लिए बहुत कोमल आंदोलन में रखें।
    7. ट्यूब को आरटी में 5 मिनट के लिए एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखें ताकि फाइबर को व्यवस्थित करने की अनुमति दी जा सके, फिर पीएफए वॉल्यूम के बहुमत को हटाने के लिए सुपरनैंट सुनिश्चित करना छोड़ दें।
    8. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 मिलीएल जोड़ें और ट्यूबों को आरटी में 5 मिनट के लिए ऊर्ध्वाधर रखें ताकि फाइबर को तलछट में जाने दिया जा सके।
    9. सुपरनेट निकालें और धोने की प्रक्रिया (चरण 2.1.8.) को दो बार फिर से दोहराएं।
    10. क्रॉसलिंक किए गए नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: एक सप्ताह के लिए क्रॉसलिंक्ड मायोफिबरर्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना संभव है। यदि फाइबर इस स्थिति में एक सप्ताह से अधिक रहते हैं, तो यह अनिवार्य रूप से मायोफिबर्स इंटरट्विनमेंट में परिणाम देगा।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस
    1. फाइबर तलछट के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए आरटी पर खड़े फाइबर युक्त ट्यूब रखें।
    2. सुपरनैंट निकालें, किसी भी फाइबर को हटाने के लिए सुनिश्चित नहीं करने के लिए बस एक छोटी मात्रा छोड़ दें।
    3. पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 का 1 मिलियन जोड़ें और सौम्य आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. ट्यूबों को 5 मिनट के लिए ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखें, फिर सुपरनैंट निकालें।
    5. पीबीएस के 1.5 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें।
    6. ट्यूबों को 5 मिनट तक वर्टिकल पोजिशन में रखें, फिर सुपरनिटेंट को हटा दें।
    7. कोमल आंदोलन के साथ आरटी में 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान और इनक्यूबेट के 1 एमसीएल जोड़ें।
    8. ट्यूब 5 मिनट वर्टिकल पोजीशन में रखें, फिर सुपरनेट को हटा दें।
    9. समाधान को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें, उन्हें ट्यूबों में जोड़ें और कोमल आंदोलन में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें (सुझाए गए सांद्रता के लिए सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, प्राथमिक एंटीबॉडी को आरटी में 3 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया जा सकता है। हालांकि, रातोंरात इनक्यूबेशन इष्टतम धुंधला दिया । प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी दोनों के लिए इनक्यूबेशन मात्रा 300 माइक्रोल की होनी चाहिए जब तलछट फाइबर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के 100 माइक्रोनल पायदान तक पहुंच जाता है। जब फाइबर कम प्रचुर मात्रा में होते हैं, तो 100-200 माइक्रोन की मात्रा की सिफारिश की जाती है।
    10. ट्यूबों को 5 मिनट के लिए वर्टिकल पोजिशन में छोड़ दें और फिर सुपरनेट निकाल दें।
    11. पीबीएस में 0.25% ट्वीन-20 के 1 एमसीएल में 3 वॉश करें, कोमल आंदोलन में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करें और फिर हर बार 5 मिनट के लिए खड़े ट्यूबों को छोड़ दें।
      नोट: यहां से, फ्लोरोक्रोम ब्लीचिंग से बचने के लिए, अंधेरे में सभी चरणों को करें।
    12. समाधान को अवरुद्ध करने में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें, उन्हें ट्यूबों में जोड़ें और कोमल आंदोलन के साथ आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें (सांद्रता के लिए सामग्री की तालिकादेखें)।
    13. पीबीएस में 0.1% ट्वीन-20 के 1 एमसीएल में दो बार धोएं, कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करें और फिर ट्यूबों को 5 मिनट के लिए स्थायी स्थिति में छोड़ दें।
    14. सुपरनैंट निकालें, DAPI समाधान के 1 एमसीएल जोड़ें और कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    15. ट्यूबों को 5 मिनट के लिए एक रैक में खड़ी खड़े होने दें, फिर सुपरनेट को हटा दें।
    16. पीबीएस के 1 एमसीएल के साथ धोएं, कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करें और फिर ट्यूबों को 5 मिनट के लिए रैक में खड़े छोड़ दें।
    17. सुपरनैंट निकालें, लगभग 50 माइक्रोन की मात्रा छोड़ दें।
  3. फ्लोरोसेंटी के बढ़ते माइक्रोस्कोप स्लाइड पर myofibers लेबल
    1. एक P200 पिपेट टिप काटें और इसे अवरुद्ध समाधान के साथ कोट करें
      नोट: टिप कोट करने के लिए, फाइबर चुनने से पहले समाधान को कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें, यह टिप दीवार से चिपके रहने के लिए फाइबर से बचना होगा।
    2. ट्यूब से फाइबर ले लीजिए और उन्हें माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर फैलाएं।
    3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, दर्पण द्वारा परिलक्षित केवल प्राकृतिक प्रकाश का उपयोग करके, फाइबर फैलाने और अतिरिक्त तरल समाधान को हटाने के लिए एक नए (कट नहीं) P200 पिपेट टिप का उपयोग करें।
    4. स्लाइड के बारे में 10-15 मिनट के लिए अंधेरे में सूखी हवा के लिए छोड़ दें, जब तक समाधान की बहुत कम मात्रा में रहता है ।
    5. स्लाइड पर बढ़ते माध्यम जोड़ें (बढ़ते माध्यम की उचित मात्रा को कवरस्लिप के आयाम पर कैलिब्रेट किया जाना चाहिए: 24 x 40 मिमी कवरलिप के लिए, 20 माइक्रोन पर्याप्त है) और फिर धीरे-धीरे फाइबर वाले क्षेत्र पर एक कवर ग्लास रखना। चश्मे के बीच बुलबुले बनाने के लिए नहीं सावधान रहें।
    6. कवरलिप को दबाएं ताकि फाइबर एक क्षैतिज योजना पर रखना होगा।
    7. नेल पॉलिश का उपयोग करके कवरस्लिप को ठीक करें।
    8. नमूनों को 4 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    9. फ्लोरोसेंटी लेबल मायोफिबर्स की वांछित छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त करें।

Representative Results

हम आम तौर पर चार अलग-अलग मांसपेशियों (टीए, ईडीएल, सोलियस और गैस्ट्रोस्नेमियस)को पचाते हैं ताकि अच्छी मात्रा में लंबे और व्यवहार्य फाइबर प्राप्त किए जा सकें जो विकास-कारकों समृद्ध माध्यम(चित्रा 4ए, बी)में 96 घंटे जीवित रह सकते हैं। केवल सबसे बरकरार फाइबर संस्कृति माध्यम में स्थानांतरित किया जाना चाहिए, क्योंकि वे जीवित रहेंगे; अन्य सभी, जो भेदभाव और चयन करने में आसान हैं, उन्हें त्यागने की आवश्यकता है।

जब माइोफबर को विकास-कारकों में बनाए रखा जाता है, तो जंगली प्रकार के चूहों से प्राप्त समृद्ध मध्यम उपग्रह कोशिकाएं सक्रिय और पैदा होने लगती हैं, चित्र 1देखें। संस्कृति के ४८ एच पर, स्वस्थ हालत में(Lamin Τ8-11 +/+), उपग्रह कोशिकाओं MyoD upregulate और उनके पहले डिवीजन से गुजरना । सक्रिय Pax7 +/MyoD + उपग्रह कोशिकाओं तो पैदा होता है और संस्कृति में ७२ घंटे से, वे कोशिका myofiber से बंधे समुच्चय उत्पन्न, कि ९६ एच(चित्रा 5)पर और भी अधिक दिखाई दे रहे हैं । इन डिवीजनों के दौरान, उनमें से कुछ MyoD अभिव्यक्ति का दमन कर सकते हैं, स्टेम सेल पूल को फिर से आबाद करने के लिए आत्म नवीकरण के दौर से गुजर रहे हैं, जबकि जो MyoD को बनाए रखते हैं, वे पैक्स7 अभिव्यक्ति को कम करके भेदभाव के लिए प्रतिबद्ध हो जाते हैं। 96 घंटे के बाद, उपग्रह कोशिकाओं के समूहों में स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली MyoG + प्रतिबद्ध कोशिकाएं होती हैं, जो नए मायोफिबर(चित्र 1 और चित्रा 6)में अंतर कर सकती हैं। विशेष रूप से, इस प्रयोग के साथ, हम अपने जंगली प्रकार के समकक्षों (+/+), चित्रा 6देखें की तुलना में होमोज़िगस उत्परिवर्ती Lamin 18-11 चूहों (-/-) में उपग्रह सेल भेदभाव की एक देरी गतिशीलता वर्णित है ।

प्रत्येक एक प्रयोग के अंतिम परिणाम हमें लगता है कि गंभीर मांसपेशी डिस्ट्रॉफी के इस मॉडल से एकल myofibers अलगाव और संस्कृति के लिए विकसित प्रोटोकॉल सभी आगे अनुप्रयोगों के लिए अच्छी गुणवत्ता myofibers सुनिश्चित करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: उपग्रह कोशिकाओं के पुनर्योजी चरणों का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व फ्लोटिंग मायोफिबर में मॉडलिंग करता है। विकास कारकों अमीर माध्यम में संस्कृति के ४८ एच पर, Pax7 + कोशिकाओं को सक्रिय हो और पहले डिवीजन से गुजरना, Pax7 + /MyoD + कोशिकाओं के एक डबल को जंम दे रही है । MyoD सकारात्मक कोशिकाओं तो पैदा करना और विस्तार, वृद्धि दे रही है, संस्कृति के ७२ घंटे में, कई कोशिकाओं के एक समूह है जो एक ही उपग्रह सेल की संतान हैं । संस्कृति Pax7+/MyoD + कोशिकाओं के ९६ एच पर Pax7-/MyoG + कोशिकाओं में अंतर हो जाते हैं । विस्तार चरण के दौरान, Pax7 +/MyoD + कोशिकाओं का एक सबसेट मायोड अभिव्यक्ति को आत्म-नवीकरण के दौर से गुजरते हुए क्विसेंस में डाउनरेगेट करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बोर पाश्चर पिपेट की तैयारी। (A)देशांतर और ललाट दृश्य कैसे बड़ा छेद बोर पिपेट दिखाई देना चाहिए । (ख)देशांतर और ललाट दृश्य कैसे छोटे छेद बोर पिपेट अंत में दिखाई देना चाहिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: एकल मांसपेशी विच्छेदन के प्रतिनिधि चित्र। (A)टीए मांसपेशी का अलगाव । मांसपेशियों को कवर करने वाली पतली परत को हटाने से बचना मायोफिबर्स को अंदर की रक्षा करता है। (ख)टीए और ईडीएल मांसपेशियों को एक साथ अलग अभी भी पटेला के स्तर पर उनके ऊपरी कण्डरा से जुड़ी हुई है । (ग)देशांतर धुरी के साथ उन्हें काटकर अलगाव के बाद टीए और ईडीएल का विभाजन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: स्वस्थ और व्यवहार्य myofibers के उदाहरण। निलंबन में व्यवहार्य myofibers के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों। (क)लाल तीर दृश्यमान सारकोमेरे संगठन और उसके पक्ष में एक उपग्रह कोशिका के साथ एक मायोफाइबर इंगित करता है; नारंगी तीर टूटे हुए मायोफिबरर्स के कुछ टुकड़ों और संस्कृति के लिए अंतिम चयन से पहले पहली डिश में मौजूद कुछ मलबे का संकेत देते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन (ख)एक छोटे आवर्धन के तहत अन्य मायोफिबर का अधिक पूर्ण दृश्य। स्केल बार 500 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: wt और उत्परिवर्ती चूहों में स्टेम सेल समूहों के आयाम में अंतर। संस्कृति के ९६ एच के बाद 19 दिनों से निकाले गए मायोफीबरर्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला 8-11 चूहों (+/+ और-/-) । Pax7+ उपग्रह कोशिकाओं को दिखाया गया है। अधिकांश मामलों में सेल क्लस्टर का आयाम कोशिकाओं की संख्या के मामले में लैमिन 8-11 +/+ की तुलना में लामिन 8-11 +/+ में काफी बड़ा था । स्केल बार 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग, संस्कृति के 96 एच के बाद, 19 दिनों से निकाले गए मायोफर्स पर, लैमिन 8-11 चूहों (+/+ और -/-) का प्रदर्शन किया गया। Pax7+/MyoG-(लाल) और Pax7-/MyoG + (ग्रीन) कोशिकाओं को देखा गया । कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त छवियां। स्केल बार 25 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पाठ में समाधान का नाम घटक प्रतिशत अंतिम मात्रा/नमूना का सुझाव दिया नोट्स
धुलाई का समाधान डीएमईएम उच्च ग्लूकोज 90% 4 एमएल बाँझ रखें, उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें
घोड़ा सीरम (एचएस) 10%
पाचन समाधान डीएमईएम उच्च ग्लूकोज 9.80% 20 एमएल बेहद हानिकारक पाउडर। 0.22μm फिल्टर के साथ समाधान फ़िल्टर करें और फिर बाँझ रखें। उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें
कोलेजनस I 0.20%
संस्कृति माध्यम डीएमईएम उच्च ग्लूकोज 78% 10 एमएल बाँझ रखें, उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 20%
चिकन भ्रूण निकालने (सीईई) 1%
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) 1%

तालिका 1: धारा 1 में उपयोग किए जाने वाले समाधानों के लिए व्यंजनों।

पाठ में समाधान का नाम घटक प्रतिशत अंतिम मात्रा/नमूना का सुझाव दिया नोट्स
4% पीएफए पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए) 4% 2-3 एमएल पाउडर और फिर समाधान बेहद हानिकारक हैं
Pbs 96%
0.5% ट्राइटन एक्स-100 ट्राइटन एक्स-100 0.50% 2-3 एमएल ट्राइटन एक्स-100 बेहद चिपचिपा है, अधिमानतः इसे अलीकोट करने के लिए पिपेट की नोक को काटता है
Pbs 99.50%
0.25% ट्वीन-20 ट्वीन-20 0.25% 10 एमएल ट्वीन-20 बेहद चिपचिपा है, अधिमानतः इसे अलीकोट करने के लिए पिपेट की नोक को काटता है
Pbs 99.75%
0.1% ट्वीन-20 ट्वीन-20 0.10% 10 एमएल ट्वीन-20 बेहद चिपचिपा है, अधिमानतः इसे अलीकोट करने के लिए पिपेट की नोक को काटता है
Pbs 99.90%
समाधान अवरुद्ध करना भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 10% 10 एमएल ताजा समाधान तैयार करें और 3 सप्ताह से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (हमेशा उपयोग से पहले स्पष्टता की जांच करें)
Pbs 90%
दापी दापी 0.10% 2-3 एमएल अंधेरे में रखें
Pbs 99.90%

तालिका 2: धारा 2 में उपयोग किए जाने वाले समाधानों के लिए व्यंजनों।

Discussion

बरकरार एकल myofibers के अलगाव मायोजेनेसिस के क्षेत्र में एक आवश्यक विधि है जब मुख्य उद्देश्य के लिए अपने आला के भीतर मांसपेशियों स्टेम कोशिकाओं की कोशिका स्वायत्त पुनर्योजी क्षमताओं की विशेषता है, स्वस्थ और रोग की स्थिति में । हालांकि, जब जैव रासायनिक या जीनोमिक अध्ययन रुचि के हैं, FACS-अलग उपग्रह कोशिकाओं सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है ।

एकल माइफबर अलगाव पूर्व-वीवो का पालन करने की अनुमति देता है, लेकिन सबसे शारीरिक तरीके से, मांसपेशियों के उत्थान के दौरान सभी चरणों एकल उपग्रह कोशिकाओं की गतिशीलता से गुजरना पड़ता है, जो हैं: सक्रियण, कोशिका विभाजन (असममित और सममित), भेदभाव और आत्म-नवीकरण द्वारा क्विसेंस पर लौटें। एक बार myofibers अस्थाई परिस्थितियों में बड़े हो रहे हैं, एकल उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय और कोशिकाओं के एक समूह के गठन का विस्तार, सभी एक ही उपग्रह सेल से प्राप्त । प्रसार, भेदभाव, सक्रियण या स्टेमनेस मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण तब कोशिका चरणों के बीच अनुपात को निर्धारित करने के लिए इष्टतम है।

हमारे प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम व्यवहार्य और बरकरार myofibers प्राप्त करने के लिए तेजी से लेकिन कोमल मांसपेशी विच्छेदन माना जा सकता है, कण्डरा से कण्डरा अलगाव द्वारा, किसी भी मांसपेशियों की क्षति से बचने के लिए । हमारी सलाह केवल तेज कैंची और छोटे तेज चिमटी का उपयोग करने के लिए और दस मिनट के लिए पूरी मांसपेशी विच्छेदन प्रक्रिया को सीमित करने के लिए है । जब बहुत छोटी मांसपेशियों (यानी, ईडीएल और टीए) को अलग करना मुश्किल होता है, तो उन्हें एक साथ काटना और बाद में फाइबर के बाद देशांतर योजना के साथ काटने वाली ठीक कैंची का उपयोग करके उन्हें विभाजित करना संभव है। यह रणनीति अंततः कम बरकरार myofibers दे देंगे, लेकिन व्यवहार्यता समझौता नहीं किया जाएगा । पाचन को सुविधाजनक बनाने के लिए गैस्ट्रोस्नेमियस जैसी बड़ी मांसपेशियों पर भी ऐसा ही किया जाना चाहिए। पाचन समय का अनुकूलन, जिसे अनुभवजन्य रूप से मान्य करने की आवश्यकता है, और अलग-अलग फाइबर का न्यूनतम हेरफेर भी बाद के विश्लेषण के सकारात्मक परिणाम के लिए दो महत्वपूर्ण पहलू हैं।

यहां रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि इसे बहुत छोटे चूहों (उम्र और आयाम में) पर लागू किया जा सकता है, भले ही उनकी मांसपेशियां बेहद नाजुक हों। यहां तक कि यदि ऊपर उल्लेख नहीं किया गया है, तो तहखाने झिल्ली-लेपित व्यंजन18,,19का उपयोग करके लंबी अवधि के लिए संस्कृति व्यवहार्य मायोफिबर के लिए विच्छेदन के इस प्रोटोकॉल का पालन करना संभव है। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि यह स्थिति फ्लोटिंग स्थिति से पूरी तरह से अलग है, जहां आसंजन उत्तेजनाएं और निकटता उत्तेजनाएं अनुपस्थित हैं।

Disclosures

कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं ।

Acknowledgments

हम एंड्रिया बियांची, Laminopathies के इतालवी नेटवर्क और समर्थन और सभी रचनात्मक टिप्पणियों के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । हम कंफोकल माइक्रोस्कोप में बहुमूल्य मदद के लिए चियारा कॉर्डिग्लियरी के आभारी हैं। लेखक आंकड़ों के लिए तस्वीरें लेने में उनकी मदद के लिए डॉ बीट्राइस बिफेराली का शुक्रिया अदा करते हैं । यहां प्रस्तुत काम मेरा पहला AIRC अनुदान एन द्वारा समर्थित था । 18535, एएफएम-टेलीथॉन एन 21030, इटली के स्वास्थ्य मंत्री एन जीआर-2013-02355413 और कैरिप्लो 2017-0649 से सी.एल.सी.एम. को मेरा पहला एआईआरसी अनुदान एन 18993 और एएफएम-टेलीथॉन एन 22489 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole Sigma D9542
Chicken embryo extract Seralab CE650-DL
Collagenase type I SIGMA C0130-500MG
Donkey anti-Rabbit 488 antibody Thermofisher R37118 to be used 1:200
Dulbecco's modified Eagle's medium Gibco 10569-010
Fetal bovine serum Corning 35-015-CV
Horse serum Gibco 26050-088
MyoG antibody Millipore 219998 to be used 1:100
Paraformaldehyde SIGMA P6148
Pax7 antibody Developmental studies
Hybridoma bank		 to be used 1:20
Penicillin and Streptomycin Euroclone ECB3001D
Phosphate saline buffer Euroclone ECB4004L
Prolong gold antifade mountant Thermofisher P36930
Triton X-100 SIGMA T8787
Tween-20 SIGMA P1379
Lab equipment Manufacturer
Bunsen burner
Confocal microscope Leica
Diamond pen bio-optica
Dissection pins
FACS polypropylene tubes Falcon
Falcon tubes (50 and 15 mL) Falcon
Glass coverslips Thermofisher
Glass Pasteur pipettes (22cm) VWR
Glass slides Thermofisher
Micro dissecting scissors
Micropipette (1 mL and 200 µL) Gilson
Micropipette tips Corning
Petri dishes (100 and 35 mm diameter) Thermofisher
Plastic pipettes (5 and 10 mL) VWR
Rubber pipette bulbs VWR
Sharp tweezers
Stereo dissection microscope with transmission illumination Leica
Tissue culture hood or lamina flow cabinet
Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2)
Water bath at 37°C VWR

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References

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चिकित्सा अंक 161 एमरी-ड्रेफस मस्कुलर डिस्ट्रॉफी माउस मॉडल मायोफाइबर इम्यूनोफ्लोरेसेंस उपग्रह मांसपेशी स्टेम सेल विभेदन मांसपेशियों का उत्थान
एकल Myofiber अलगाव और संस्कृति एमरी के एक Murine मॉडल से-Dreifuss मस्कुलर डिस्ट्रॉफी जल्दी प्रसव के बाद विकास में
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Pegoli, G., Lucini, F., Mozzetta, C., Lanzuolo, C. Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development. J. Vis. Exp. (161), e61516, doi:10.3791/61516 (2020).

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