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Biology

पौधों में स्थानिक और लौकिक ऊतक-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन आरएनए-अनुक्रमण

Published: August 5, 2020 doi: 10.3791/61517
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,3
1Department of Animal, Plant and Soil Science, AgriBio Building, La Trobe University, 2Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology, La Trobe University, 3Australian Research Council Research Hub for Medicinal Agriculture, AgriBio Building, La Trobe University

Summary

यहां प्रस्तुत पौधों के ऊतकों के लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) के लिए एक प्रोटोकॉल है। एलसीएम ऊतक के क्षेत्रों को संदूषण मुक्त तरीके से अलग करने के लिए एक सूक्ष्म तकनीक है। प्रक्रिया में ऊतक निर्धारण, पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग, एलसीएम और आरएनए निष्कर्षण शामिल हैं। आरएनए का उपयोग डाउनस्ट्रीम ऊतक-विशिष्ट, ट्रांसक्रिप्टोम के अस्थायी रूप से हल किए गए विश्लेषण में किया जाता है।

Abstract

एक जटिल बहुकोशिकीय जीव का विकास अलग-अलग कोशिका प्रकारों द्वारा नियंत्रित होता है जिनमें अलग-अलग ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल होते हैं। विकासात्मक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले ट्रांसक्रिप्शनल नियामक नेटवर्कों की पहचान करने के लिए इन व्यक्तिगत सेल प्रकारों के स्थानिक और लौकिक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को मापना आवश्यक है। इसलिए, जैविक और विकासात्मक प्रक्रियाओं को विनियमित कैसे किया जाता है, इसकी समझ हासिल करने के लिए जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक-लौकिक नियंत्रण में अंतर्दृष्टि आवश्यक है। यहां, हम अंकुरण के दौरान एक समय-पाठ्यक्रम पर तीन जौ भ्रूण अंगों से कोशिकाओं की छोटी संख्या को अलग करने के लिए एक लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) विधि का वर्णन करते हैं जिसके बाद ट्रांसक्रिप्ट प्रोफाइलिंग होती है। विधि ऊतक निर्धारण, ऊतक प्रसंस्करण, पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग, एलसीएम और आरएनए निष्कर्षण के बाद वास्तविक समय पीसीआर या आरएनए-एसईक्यू के होते हैं। इस विधि ने हमें कोशिकाओं की अलग-अलग संख्या (दसियों से सैकड़ों) से बीज अंग ट्रांसक्रिप्टोम के स्थानिक और लौकिक प्रोफाइल प्राप्त करने में सक्षम बनाया है, जो विशिष्ट थोक-ऊतक विश्लेषणों की तुलना में बहुत अधिक ऊतक-विशिष्टता प्रदान करता है। इन डेटा से हम प्रतिलेखन नियामक नेटवर्क को परिभाषित करने और तुलना करने में सक्षम थे और साथ ही व्यक्तिगत ऊतकों के लिए उम्मीदवार नियामक प्रतिलेखन कारकों की भविष्यवाणी करते थे। विधि न्यूनतम अनुकूलन के साथ अन्य पौधे ऊतकों पर लागू होनी चाहिए।

Introduction

संयंत्र विकास और विकास में विभिन्न कोशिकाओं के भीतर ट्रांसक्रिप्शनल नियामक नेटवर्क की समन्वित कार्रवाई शामिल है जो एक जटिल सेलुलर वातावरण में मौजूद हैं। इन विनियामक नेटवर्कों की गतिविधि को समझने के लिए, हमें विकासात्मक चरणों में विभिन्न सेल प्रकारों के भीतर स्थानिक और लौकिक जीन अभिव्यक्ति के ज्ञान की आवश्यकता होती है । हालांकि, जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण अधिक आमतौर पर कोशिकाओं की छोटी संख्या को अलग करने और विश्लेषण करने की तकनीकी चुनौती के कारण पूरे अंगों या थोक ऊतक नमूनों में आयोजित किए जाते हैं । हम यहां जिस विधि का वर्णन करते हैं, उसने आरएनए-एसईक्यू के साथ एलसीएम को युग्मन करके स्थानिक और लौकिक ऊतक-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण प्राप्त करने की अनुमति दी है।

एलसीएम को दो दशक पहले Emmert-Buck और सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था1। इस तकनीक ने शोधकर्ताओं को सीधे सूक्ष्म दृश्य और संकीर्ण बीम लेजर 1 के साथ हेरफेर का उपयोग करके अपने पर्यावरण से एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों को ठीक से अलग करने में सक्षमबनाया। तब से इस विधि का व्यापक रूप से कैंसर जीव विज्ञान और पैथोलॉजी2,3 में उपयोग कियाजाता रहाहै . कई पादप अनुसंधान समूहों ने एलसीएम को विभिन्न पादप प्रजातियों और विभिन्न ऊतकों के प्रकार 4,,,5, 6 , 7,8,,,96,10,11के साथ उपयोगकेलिए भी अनुकूलित कियाहै। हाल ही में, बीज विकास और अंकुरण,,10, 12,13के दौरान भ्रूण, एंडोस्पर्म और अन्य बीज संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए यूडिकॉट और मोनोकॉट बीजों पर कई पत्रों का भी उपयोग किया गया है।13 माइक्रो-पिपटिंग, सेल छंटाई, चुंबकीय पृथक्करण और माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म जैसे अन्य आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अधिकांश एकल-कोशिका अलगाव विधियों को कोशिकाओं को अलग करने के लिए एंजाइमैटिक पाचन या यांत्रिक समरूपता पर निर्भर करता है। यह जीन अभिव्यक्ति को परेशान कर सकता है, तकनीकी कलाकृतियों को पेश कर सकता है जो डेटा व्याख्या14,,15को चकित करते हैं। इन तरीकों को भी प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए मार्कर जीन के पिछले ज्ञान की आवश्यकता को अपने स्थानिक स्थान और सही सेल प्रकार के लिए अलग कोशिकाओं से संबंधित है । तकनीकों का एक और समूह पूरी कोशिकाओं के बजाय उपकोशिकीय संरचनाओं के आत्मीयता-आधारित अलगाव पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए बरकरार (सेल प्रकारों में टैग किए गए नाभिक का अलगाव) और ट्रैप (राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि का अनुवाद)16,,17। हालांकि, नाभिक या राइबोसोम्स की आत्मीयता लेबलिंग और शुद्धि तकनीकी रूप से पौधों की प्रजातियों में चुनौतीपूर्ण है जिनके पास अच्छी तरह से स्थापित परिवर्तन प्रोटोकॉल नहीं हैं। एलसीएम अपने सामान्य ऊतक/अंग संदर्भ के भीतर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य द्वारा ट्रांसक्रिप्ट स्तर और पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल पहचान को संरक्षित करने के लिए त्वरित ऊतक निर्धारण का लाभ उठाता है, जो असतत कोशिकाओं को18,,19के समय की थोड़ी अवधि में अलग-थलग करने की अनुमति देता है ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल अनाज बीजों के ऊतक वर्गों से विशिष्ट कोशिकाओं या कोशिका प्रकारों के अलगाव के लिए एक अनुकूलित विधि है, जिसे अधिकांश कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है जिन्हें हिस्टोलॉजिकल रूप से पहचाना जा सकता है। एलसीएम सेल अलगाव की एक संपर्क मुक्त विधि प्रदान करता है, जो संदूषण को कम करता है और बरामद आरएनए की अखंडता को बढ़ाता है। इसके अलावा, विधि जैविक सामग्रियों की छोटी मात्रा के साथ शुरू बड़े पैमाने पर जीनोम व्यापक अध्ययन पर एलसीएम की शक्ति दिखाता है । हम डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्ट/ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषणों के लिए पर्याप्त इनपुट सामग्री उत्पन्न करने के लिए आरएनए के रैखिक प्रवर्धन का भी वर्णन करते हैं ।

स्थानिक और लौकिक ऊतक विशिष्ट प्रतिलिपि के लिए इस एलसीएम आरएनए-एसईक्यू प्रोटोकॉल में दस मुख्य कदम हैं, जिनमें ऊतक नमूनों का निर्धारण, निर्जलीकरण, पैराफिन घुसपैठ, एम्बेडिंग, सेक्शनिंग, एलसीएम, आरएनए निष्कर्षण, आरएनए प्रवर्धन, आरएनए क्वांटिफिकेशन और क्यूआरटी-पीसीआर और/या आरएनए-सेक्यू(चित्रा 1)शामिल हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: एलसीएम का फ्लोचार्ट इसके बाद आरएनए-सेक्यू या क्यूआरटी-पीसीआर। एलसीएम सूक्ष्म दृश्य के तहत लेजर बीम का उपयोग करके निश्चित ऊतक वर्गों से कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक स्थानिक सटीक और संपर्क मुक्त तकनीक है। प्रक्रिया ऊतक नमूनों के निर्धारण के साथ शुरू होती है, जिसके बाद इथेनॉल और जाइलीन की ढाल श्रृंखला का उपयोग करके निर्जलीकरण होता है, और पैराफिन घुसपैठ के साथ समाप्त होता है। इस प्रक्रिया को पूरी तरह से एक ऊतक प्रोसेसर का उपयोग करके स्वचालित किया जा सकता है। एक बार जब ऊतक पैराफिन के साथ घुसपैठ हो जाती है, तो यह एम्बेडिंग स्टेशन का उपयोग करके पिघला हुआ पैराफिन के साथ एक मोल्ड में एम्बेडेड होता है। वांछित मोटाई के लिए माइक्रोटोम सेट का उपयोग करके सेक्शनिंग की जाती है। स्लाइड तैयार कर रहे है और एलसीएम तुरंत पहले आयोजित आरएनए कब्जा कर लिया कोशिकाओं से निकाला जाना है । आरएनए निष्कर्षण सीधे क्यूआरटी-पीसीआर और/या आरएनए-seq से पहले आरएनए प्रवर्धन के दो दौर से पीछा किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

चूंकि अंतिम उत्पाद आरएनए है, इसलिए RNases के साथ काम को दूषित करने से बचने के लिए ध्यान रखें। दस्ताने पहनना बहुत जरूरी है। डायथाइल पाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) -उपचारित पानी, बफ़र्स आदि का उपयोग करें। उपयोग से पहले ऑटोक्लेव बफ़र्स और बेक ग्लासवेयर।

1. ऊतक निर्धारण

  1. प्रजातियों और ऊतक प्रकारों के आधार पर पसंद का फिक्सेटिव तैयार करें; जौ के बीज के लिए, किसान के फिक्सेटिव (75% इथेनॉल, 25% हिमनदों एसिटिक एसिड (v/v)) का उपयोग करें।
  2. ऊतकों की कटाई से पहले बर्फ पर फिक्सेटिव ठंडा करें।
  3. ब्याज की पौधे की सामग्री एकत्र करें और यदि आवश्यक हो, तो इसे चयनित एम्बेडिंग मोल्ड में फिट करने के लिए उचित आकार के टुकड़ों में काट लें। जौ के बीज के लिए, बीज को आधे देशांतर में काट लें ताकि सुधारात्मक समाधान के प्रवेश में मदद मिल सके और एम्बेडिंग मोल्ड में फिट किया जा सके।
  4. ऊतक को बर्फ-ठंडे फिक्सेटिव की कम से कम 10x मात्रा में जलमग्न करें। जौ के बीज के लिए, बीज को आधे में घटाकर फिक्सेटिव में डूब जाएं।
  5. फिक्सेटिव के प्रवेश में तेजी लाने के लिए वैक्यूम घुसपैठ का उपयोग करें। सुधारक की वैक्यूम घुसपैठ के बाद ऊतकों को डूब जाना चाहिए। जौ के बीज के लिए, वैक्यूम घुसपैठ के 30 मिनट का उपयोग करें।
  6. सुधारक को पूरी तरह से ऊतक में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिक्सेटिव और इनक्यूबेट को बदलें। जौ के बीज के लिए, रात भर नमूनों को इनक्यूबेट (~ 12-16 एच)।
    नोट: पतले या छोटे ऊतकों को ऊतक में फिक्सेटिव की उच्च प्रसार दर के कारण कम निर्धारण समय की आवश्यकता होगी।
  7. ऊतक को सुधार से निकालें और ऊतक को कैसेट में स्थानांतरित करें और फिर ऊतक प्रसंस्करण शुरू करें।
    नोट: छोटे या नाजुक ऊतक, जैसे पत्ती के ऊतक, फिक्सिंग के लिए कैसेट में रखा जा सकता है यह सुनिश्चित करने के लिए यह निर्धारण के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं है । बायोप्सी बैग, पैड या रैप ऊतक निर्धारण और ऊतक प्रसंस्करण चरणों के दौरान कैसेट के अंदर सुरक्षित रूप से ऊतक को पकड़ने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

2. ऊतक प्रसंस्करण

  1. न्यूनतम 10 समाधान कक्षों और 2 गर्म पैराफिन कक्षों (सामग्रियोंकी तालिका देखें) के साथ चरण 2 में एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर का उपयोग करें।
  2. जांच करें कि प्रत्येक कक्ष में पर्याप्त मात्रा में समाधान हैं; ऊतक प्रोसेसर के हर कुछ उपयोगों के बाद समाधान की जगह।
  3. धातु की टोकरी में ऊतक के साथ कैसेट रखें। 1 कक्ष के ऊपर अपने धारक को धातु की टोकरी संलग्न करें । धारक घुमाने और "डुबो देना और डुबकी" कक्षों में कैसेट, नामित कार्यक्रम के बाद होगा ।
  4. ऊतक प्रोसेसर के नियंत्रण पैनलों पर बटन क्लिक करके प्रोग्राम सेट करें जिसमें प्रत्येक कक्ष के लिए समय की लंबाई निर्धारित करना शामिल है।
  5. प्रोसेसिंग प्रोग्राम शुरू करने के लिए'स्टार्ट'बटन दबाएं। निम्नलिखित कार्यक्रम जौ के बीज के लिए डिज़ाइन किया गया है और रात भर चलता है (~ 18 एच)
    1. इथेनॉल (75%, 85%, 100%, 100%, और 100% (v/v) इथेनॉल) की ढाल श्रृंखला में 1 घंटे 30 मिनट प्रत्येक के लिए कैसेट डुबोकर निर्जलीकरण करें।
    2. इथेनॉल का उपयोग करके समाशोधन करें: 75:25, 50:50, 25:75 (इथेनॉल: जाइलीन%, v/v) पर 1 घंटे 30 मिनट के लिए जाइलीन ढाल। फिर 1 घंटे 30 मिनट के लिए कैसेट डुबकी 100% जाइलीन तो 100% जाइलीन।
    3. पिघले हुए पैराफिन में दो बार 1 घंटे 30 मिनट के लिए 55-60 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन घुसपैठ करें।
      नोट: पैराफिन हीटर कक्षों का तापमान ऊतक प्रोसेसर के पीछे सेट किया जा सकता है।
  6. अगली सुबह, ऊतक प्रोसेसर से कैसेट निकालें और पैराफिन एम्बेडिंग के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: कार्यक्रम का समय अलग-अलग ऊतक प्रकार के बीच भिन्न हो सकता है. ऊतक प्रसंस्करण के दौरान वैक्यूम और/या आंदोलन का उपयोग ऊतक प्रोसेसर के नियंत्रण कक्ष पर"वी"और/या आंदोलन"आंदोलन"बटन दबाकर चयनित समाधानों की घुसपैठ में तेजी लाने के लिए किया जा सकता है ।

3. पैराफिन एम्बेडिंग

  1. इस चरण में एक एम्बेडिंग मशीन का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. जलाशयों में पैराफिन के लिए समय पूरी तरह से पिघलने की अनुमति देने के लिए एम्बेडिंग से कम से कम कुछ घंटे पहले एम्बेडिंग मशीन को चालू करने के लिए प्रीसेट करें।
  3. शुरू करने से पहले ठंडी प्लेट चालू करें।
  4. नमूनों को बारीक संदंश का उपयोग करके स्थिति में रखकर मोल्ड में नमूनों को एम्बेड करें और मोल्ड में पिघला हुआ पैराफिन वितरित करें। प्रत्येक प्रायोगिक उद्देश्य के लिए नमूनों का उचित अभिविन्यास सुनिश्चित करें। जौ के बीज के लिए, देशांतर खंडों को प्राप्त करने के लिए काटने की दिशा में बीज अनुदेय।
    नोट: एम्बेडिंग मोल्ड विभिन्न आकारों में आते हैं। नमूने को ठीक से तैनात और एम्बेडेड करने की अनुमति देने के लिए एक उपयुक्त आकार का चयन करें। नमूनों के अभिविन्यास पर प्रायोगिक आवश्यकताओं के आधार पर विचार किया जाना चाहिए। यदि देशांतर वर्गों की आवश्यकता होती है, तो नमूने को काटने की दिशा में अनुदेयित किया जाना चाहिए जबकि ट्रांसवर्स वर्गों के लिए नमूना काटने की दिशा के समानांतर केंद्रित होना चाहिए।
  5. मोल्ड पर एक साफ कैसेट रखें और यह सुनिश्चित करें कि कैसेट पर नमूना रखने के लिए पूरी तरह से कैसेट को कवर करने के लिए पर्याप्त पैराफिन पूरी तरह से कवर करें।
  6. मोल्ड को ठंडी प्लेट पर रखें और मोल्ड से ब्लॉक जारी करने से पहले पैराफिन को पूरी तरह से (10-20 मिनट) सेट करने की अनुमति दें।
  7. भंडारण के लिए ब्लॉकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर अनुभागित या स्थानांतरित करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । एम्बेडेड ब्लॉक को तीन महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

4. पॉलीथीन नेफ्थेलेट (पेन) झिल्ली स्लाइड की तैयारी

  1. 3 एस के लिए RNase निष्क्रिय समाधान में डूब कलम झिल्ली स्लाइड के बाद DEPC में दो संक्षिप्त वॉश-इलाज पानी स्लाइड पर RNases हटाने के लिए । बाएं समाधान को हटाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्लाइड्स को सुखाएं।
  2. यूवी-बेहतर पैराफिन आसंजन के लिए हाइड्रोफिलिक गुणों को बढ़ाने के लिए 30 मिनट के लिए एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में एक यूवी लैंप का उपयोग करके स्लाइड्स का इलाज करें।

5. सेक्शनिंग

  1. सेक्शनिंग स्टेप (सामग्री की तालिकादेखें) में एक माइक्रोटॉम का उपयोग करें।
  2. चाकू धारक में एक नया ब्लेड रखें, और हमेशा चाकू गार्ड रखने के लिए जब सक्रिय रूप से अनुभागिंग नहीं
    सावधानी: माइक्रोटॉम ब्लेड बेहद तेज होते हैं और अनुपयुक्त रूप से संभाले जाने पर महत्वपूर्ण नुकसान पहुंचा सकते हैं।
    नोट: माइक्रोटॉम पर दो लॉकिंग तंत्र हैं, एक मशीन के किनारे पर है और दूसरा पहिया के हैंडल पर है। सक्रिय रूप से सेक्शनिंग न होने पर दोनों की सगाई होनी है ।
  3. चाकू ब्लॉक को छूने के बिना संभव के रूप में नमूने के करीब होने के लिए समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोटॉम हाथ चाकू ब्लॉक के साथ पूर्ण संपर्क में कभी नहीं आता है क्योंकि इससे माइक्रोटॉम को भयावह संरचनात्मक क्षति होगी।
  4. शुरू करने से पहले ठंडी प्लेट चालू करें। ब्लॉक को नरम होने से रोकने के लिए सेक्शनिंग के दौरान आवश्यक होने पर खंड और फिर से शांत ब्लॉक से पहले ठंड की प्लेट पर पैराफिन ब्लॉक रखें।
  5. शुरू करने से पहले डीईपीसी-उपचारित पानी और गर्मी के साथ 42 डिग्री सेल्सियस तक पानी स्नान भरें।
  6. वांछित गहराई (जहां आप जिस अनुभाग में रुचि रखते हैं) और माइक्रोटॉम का उपयोग करके वांछित मोटाई (6-10 माइक्रोन) पर सेक्शन पैराफिन ब्लॉक, वांछित गहराई तक ब्लॉक करें; एक अच्छी तरह से खंडित ब्लॉक ब्लेड के किनारे पर एक 'रिबन' बनाएगा। जौ के बीज के लिए, 8 माइक्रोन मोटाई के साथ अनुभाग।
  7. धीरे-धीरे ठीक पेंट ब्रश या ठीक संदंश का उपयोग करके पानी स्नान करने के लिए माइक्रोटोम से रिबन स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करना कि रिबन पानी की सतह पर सपाट है।
  8. एक 45 डिग्री कोण पर एक स्लाइड पकड़ो, एक ऊपर की गति का उपयोग कर, स्लाइड पर पानी से बाहर एक रिबन लिफ्ट और ध्यान से एक लिंट मुक्त ऊतक के साथ अतिरिक्त पानी को हटा दें।
  9. पैराफिन के नीचे किसी भी बचे हुए पानी को खत्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सूखी स्लाइड।
  10. डिहाइड्रेटिंग स्थितियों के तहत बंद बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन हटाने या स्टोर करने के लिए आगे बढ़ें (कई दिनों के भीतर उपयोग किया जाना)।
  11. जाइलीन में 20 एस के लिए स्लाइड 3x धोकर पैराफिन निकालें, इसके बाद 100% (v/v) इथेनॉल में 30 एस के 2x वॉश और 70% (v/v) इथेनॉल में 30 एस के 2x वॉश करें।
  12. पैराफिन को हटाने के बाद लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
    नोट: क्रायोसेक्शनिंग एक वैकल्पिक तरीका है जिसे सफलतापूर्वक एलसीएम के साथ मिलकर किया गया है। क्रायोसेक्शनिंग के लिए नमूना तैयारी अलग-अलग होगी।

6. लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन

  1. डी-पैराफिनाइज्ड और सूखे ऊतक वर्गों से कोशिकाओं को माइक्रोडिसेक्ट करने के लिए लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन माइक्रोस्कोप (सामग्री की टेबलदेखें) का उपयोग करें।
  2. तीन उपलब्ध स्लॉट पर स्लाइड लोड करें।
  3. पकड़े गए नमूनों को इकट्ठा करने के लिए संग्रह ट्यूबों की विशेष चिपकने वाली टोपियां का उपयोग करें। तरल के बिना कैप्चर करना ("सूखा" संग्रह) RNase गतिविधि को कम करता है। संग्रह ट्यूबों को उपलब्ध स्लॉट में लोड करें।
  4. नमूने के उस क्षेत्र का पता लगाने के लिए चरण को स्थानांतरित करें जिसे काटने की आवश्यकता है। यह एलसीएम मशीन के माउस या जॉयस्टिक, या कीबोर्ड पर तीर कुंजी का उपयोग करके किया जा सकता है।
  5. काटने की गति को अनुकूलित करने के लिए, ऊर्जा और ध्यान में कटौती, लेजर दबाव गुलेल (एलपीसी) ऊर्जा और ध्यान, पहले झिल्ली स्लाइड पर ऊतक से मुक्त एक खाली खंड पर कटौती । जौ बीज के लिए, गति में कटौती = 18, CutEnergy = 52 CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, एलपीसी फोकस = 61 पर 10x आवर्धन।
    नोट: फोकस और ऊर्जा को काटना विभिन्न स्लाइडों, विभिन्न ऊतकों और कैप्चर किए गए क्षेत्र के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, लेकिन सामान्य नियम हैं गुलेल की शक्ति काटने की शक्ति से अधिक है और लेजर को गुलेल के लिए अपमानित किया जाना चाहिए। उद्देश्य लेंस का आवर्धन जितना अधिक होगा, लेजर का ध्यान उतना ही छोटा होगा और ऊर्जा उतनी ही अधिक होगी।
  6. ब्याज के क्षेत्र को रेखांकित करके कोशिकाओं का चयन करने के लिए ड्राइंग टूल का उपयोग करें।
  7. ऊपर एक काले खंड पर काटने के द्वारा प्राप्त अनुकूलित मापदंडों के आधार पर चिपकने वाली टोपियां में चिपकने वाली टोपियां में कोशिकाओं गुलेल करने के लिए समारोह टूलबार से रोबोलपीसी समारोह का चयन करें।
    नोट: एलसीएम पैरामीटर ऊतक प्रकारों के साथ-साथ अनुभाग की मोटाई, ऊतक कठोरता और उद्देश्य लेंस के बीच भिन्न होते हैं। इसलिए, वास्तविक नमूने को काटने से पहले ऊतक नमूने के बिना एक सादे झिल्ली क्षेत्र पर प्रत्येक स्लाइड को अनुकूलित करना सबसे अच्छा है।
  8. तत्वों की सूची से उस ध्वज का चयन करके उन्हें तुरंत खोजने के लिए रुचि के क्षेत्रों को चिह्नित करने के लिए फ्लैग टूल का उपयोग करें।
  9. नमूनों की पुष्टि करने के लिए चिपकने वाली टोपी का निरीक्षण करने के लिए"कैपचेक"बटन द्वारा जांच की गई। आमतौर पर, आरएनए निष्कर्षण के लिए प्रति कैप 10-15 वर्गों (~ 200 कोशिकाओं) के एलसीएम की आवश्यकता होती है।
  10. पकड़े गए नमूनों को बर्फ पर रखें। आरएनए क्षरण से बचने के लिए आरएनए निष्कर्षण के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
    नोट: कुछ एलसीएम माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट प्रकाश से लैस हैं जो फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल कोशिकाओं को पकड़ने की अनुमति देता है।

7. आरएनए निष्कर्षण

  1. एलसीएम के बाद आरएनए निष्कर्षण के लिए कम इनपुट आरएनए आइसोलेशन (टेबल ऑफ मैटेरियल)किट का उपयोग करें। इस तरह के किट दस से कम कोशिकाओं से लगातार उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए को ठीक करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं।
  2. ऑन-कॉलम DNase उपचार सहित निर्माता के निर्देशों के अनुसार कैप्चर किए गए सेल प्रकारों से कुल आरएनए को अलग करें।
    नोट: आरएनए निष्कर्षण का पहला कदम जहां ट्यूब उलटा और झटका है यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ढक्कन पर कैप्चर किए गए नमूने निष्कर्षण बफर के संपर्क में हैं।

8. आरएनए प्रवर्धन

  1. आरएनए-सेक्यू लाइब्रेरी संश्लेषण के लिए पर्याप्त aRNA का उत्पादन करने के लिए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा निकाले गए आरएनए प्रवर्धन से आरएनए प्रवर्धन के लिए एक एंटीसेंस आरएनए (आरएनए) प्रवर्धन किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए प्रवर्धन किट का उपयोग करके प्रवर्धन के दो दौर करें।
    नोट: किट (सामग्रीकी तालिका देखें) निर्माता द्वारा निर्देशित तापमान के लिए थर्मो-साइकिलर और ढक्कन को पहले से गरम करना महत्वपूर्ण है। आरएनए प्रवर्धन के बजाय एक वैकल्पिक दृष्टिकोण यह है कि पुस्तकालय को निकाले गए आरएनए से सीधे संश्लेषित करने के लिए कम इनपुट लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करें।

9. आरएनए मात्राकरण

  1. एक स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके एएनएन की मात्रा निर्धारित और अर्हता प्राप्त करें।
    नोट: एक स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम को पसंद किया जाता है क्योंकि इसके लिए कम नमूना (1-2 माइक्रोन) की आवश्यकता होती है और प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने के लिए जेल जैसी छवि और इलेक्ट्रोफेरोग्राम प्रदान करता है।

10. क्यूआरटी-पीसीआर और/या आरएनए-एसईक्यू

  1. क्यूआरटी-पीसीआर के लिए आरएनए से सीडीएनए का संश्लेषण करें या मानक आरएनए-सेक्यू लाइब्रेरी किट का उपयोग करके आरएनए-एसईक्यू पुस्तकालयों को बनाएं।

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Representative Results

हमने अपने एलसीएम आरएनए-सेक्यू प्रोटोकॉल10का उपयोग करके अंकुरण के दौरान जौ के बीजों से स्थानिक और लौकिक ऊतक-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोम उत्पन्न किए। यह अध्ययन एलसीएम आरएनए-सेक्यू को तीन भ्रूण अंगों (प्लंयूल, रेडिकल टिप, स्कूटलम) से कोशिकाओं की छोटी संख्या में अंकुरण (0-48 एच, 7 समय अंक)(चित्रा 2ए, बी)के दौरान 48 घंटे के समय के पाठ्यक्रम पर हर 8 घंटे में लागू करके किया गया था।

Figure 2
चित्रा 2: एलसीएम द्वारा जौ के बीजों से एकत्र की गई कोशिकाएं। (A)जौ के बीज का देशांतर पार अनुभाग और, इनसेट, एक बढ़े हुए कार्टून जो उन क्षेत्रों को दर्शाता है जिनसे कोशिकाओं को पकड़ा गया था । नीला = प्लंयूल, मजेंटा = रेडिकल, हरा = स्कूटी। (ख)प्लंयूल, रेडिकल और स्कूटी के एलसीएम। शीर्ष पैनल, लेजर दबाव गुलेल (एलपीसी) से पहले ऊतक । नीचे पैनल, एलपीसी के बाद ऊतक। कोशिकाओं को प्रति नमूने तीन जैविक प्रतिकृति के साथ प्रत्येक नमूने के लगातार 5 देशांतर वर्गों से कब्जा कर लिया गया था । प्रत्येक दोहराने में लगभग 200 कोशिकाएं (~ 0.05 - 0.15 मिमी2 कुल क्षेत्र) शामिल थीं। बार = 100 माइक्रोन ई = एंडोस्पर्म, सी = कुचल सेल परत, एसई = स्कूटलर एपिथेलियम, एस = स्कूटीलम। अनुमति10के साथ संयंत्र जर्नल में पिछले डेटा से पुन: पेश आंकड़ा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

निर्धारण और एम्बेडिंग महत्वपूर्ण कदम हैं क्योंकि खराब रूप से तय ऊतक नमूने के परिणामस्वरूप ऊतक क्षति और आरएनए मात्रा और गुणवत्ता की हानि हो सकती है। इन चरणों को विभिन्न प्रजातियों और ऊतकप्रकारों 19 , 20,21,के लिए अनुकूलित और समायोजित किया जाना चाहिए। यहां हमने बीज ऊतकों और कोशिकाओं में फिक्सेटिव्स के प्रवेश को बेहतर बनाने के लिए वैक्यूम घुसपैठ का उपयोग किया। ऊतक के नमूनों को नुकसान से बचने के लिए निर्जलीकरण और पैराफिन घुसपैठ धीरे-धीरे आयोजित की जाती है। हमने प्रत्येक चरण पर लागू आंदोलन और वैक्यूम के साथ एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर का उपयोग करके पूरे निर्जलीकरण और पैराफिन घुसपैठ प्रक्रिया में तेजी लाई है। यह मानव ऑपरेटिव द्वारा किए गए लंबे समय तक ऊतक प्रसंस्करण चरणों के दौरान होने वाले आरएनए क्षरण के जोखिम को अत्यधिक कम कर देता है। सेक्शनिंग से पहले, पैराफिन आसंजन सुनिश्चित करने के लिए झिल्ली स्लाइड का इलाज करना और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि यह RNase-मुक्त है। यदि झिल्ली स्लाइड ठीक से तैयार नहीं हैं तो नमूना अनुभाग झिल्ली का पालन नहीं करेगा, जो एलसीएम गुलेल चरण को प्रभावित करेगा और चिपकने वाली टोपियां में ऊतक हस्तांतरण को कम करेगा क्योंकि नमूना झिल्ली से अलग होगा (चित्र 1देखें)।

एलसीएम आरएनए-एसईक्यू प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम एलसीएम पैरामीटर अनुकूलन है। अनुकूलित किए जाने वाले पांच मुख्य पैरामीटर हैं: (1) गति में कटौती; (2) ऊर्जा में कटौती; (3) फोकस में कटौती; (4) एलपीसी ऊर्जा; और (5) एलपीसी फोकस । चयनित क्षेत्र को ठीक से काटने और चयनित क्षेत्र(चित्रा 3ए, बी)के किनारे को जलाने के बिना आसपास के ऊतकों से बेदखल करने के लिए काटने के मापदंडों को सही ढंग से समायोजित करना महत्वपूर्ण है। उचित एलपीसी ऊर्जा और ध्यान मज़बूती से संग्रह ट्यूबों की विशेष चिपकने वाली टोपियां करने के लिए स्लाइड से चयनित क्षेत्र गुलेल के लिए आवश्यक हैं, और हमेशा टोपियां में कब्जा कर लिया नमूनों का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त सामग्री एकत्र(चित्रा 3C)एकत्र किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए । एलसीएम की दक्षता 1000 कोशिकाओं को एक घंटे के भीतर कब्जा करने में सक्षम बनाती है, जो नमूना प्रसंस्करण के दौरान आरएनए क्षरण की संभावना को बहुत कम कर देती है। चिपकने वाली टोपियां के साथ संग्रह ट्यूबों का उपयोग किसी भी कैप्चरिंग तरल के बिना "शुष्क" संग्रह की अनुमति देता है, जो संभव आरएनएएस गतिविधियों को बहुत कम करता है। बर्फ पर कब्जा किए गए नमूनों को रखना और सभी प्रतिकृति एकत्र करने के तुरंत बाद आरएनए निष्कर्षण करना महत्वपूर्ण है।

आरएनए निष्कर्षण और प्रवर्धन निर्माताओं के निर्देशों का पालन करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके किया जाता है। स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रणाली का उपयोग करके आरएनए प्रवर्धन से पहले कुल आरएनए का मात्राकरण अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए नमूनों(चित्र 3 डी)में 18S और 28S रिबोसोमल सबइकाइट्स की विशिष्ट इलेक्ट्रोफोरेटिक बैंड और फ्लोरोसेंट चोटियों का पता लगाएगा। क्लोरोप्लास्ट और माइटोकॉन्ड्रियल रिबोसोमल आरएनए के अनुरूप अतिरिक्त चोटियां 18S और 28S चोटियों से पहले पाई जाएंगी। पौधों की प्रजातियों में कई आरएनए चोटियों के कारण, रिन (आरएनए इंटीग्रिटी नंबर) मूल्य आमतौर पर 9 (स्तनधारी ऊतकों से अपेक्षित आरआईआईएन मूल्य) से कम होते हैं और आरएनए अखंडता22को सही ढंग से प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। आरएनए क्षरण के संकेत के बिना स्पष्ट 18S और 28S चोटियों दिखाई दे रहे हैं जब आरएनए प्रवर्धन जारी रखने के लिए उपयुक्त है। हमारे जौ बीज प्रयोग में बरामद आरएनए की मात्रा तीन अलग-अलग ऊतक प्रकारों (प्लंयूल, रेडिकल और स्कूटलम) के बीच भिन्न होती है और, अंकुरण के शुरुआती और देर से चरणों के बीच भी, कोशिकाओं की लगभग समान संख्या के बावजूद काटा जा रहा है। जौ के बीजों से लगभग 200 कोशिकाओं (0.5 से 100 पीजी प्रति सेल) से 100 पीजी से लेकर 20 एनजी तक की मात्रा। आरएनए प्रवर्धन के लिए अनुशंसित इनपुट आरएनए की न्यूनतम राशि 100 पीजी थी। निकाली गई आरएनए की मात्रा विभिन्न कटी हुई कोशिकाओं से निकालने की दक्षता और विकास19,21के उस चरण में विशेष कोशिका-प्रकार में कुल प्रतिलिपि बहुतायत पर निर्भर करती है । एलसीएम आरएनए-एसईक्यू प्रयोग की योजना बनाते समय इस पर विचार करना उपयोगी है, हालांकि ऐसी पूर्व जानकारी सभी मामलों में उपलब्ध नहीं होगी।

सफलतापूर्वक संश्लेषित aRNA प्रवर्धन के दो दौर(चित्रा 3E)के बाद 300 न्यूक्लियोटाइड के आसपास एक चोटी के साथ 100 से 1000 न्यूक्लियोटाइड के लिए एक यूनिमोडल, सममित आकार वितरण प्रदर्शित करेगा। हमारे जौ बीज प्रयोग में, हम आरएनए प्रवर्धन10के दो दौर के बाद aRNA के 2 माइक्रोन के ५०० स्नातकोत्तर प्राप्त की । प्रवर्धित और अमुद्रीकृत आरएनए के बीच तुलना से यह पता चला है कि आरएनए प्रवर्धन पुन: पेश करने योग्य, रैखिक है और डेटा 23 , 24,,2525को ट्रांसक्रिप्ट करने के लिए व्यवस्थित पूर्वाग्रह पेश नहीं करता है ।24 आउटपुट आरएनए का उपयोग स्थानिक और लौकिक ऊतक-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए क्यूआरटी-पीसीआर और/या आरएनए-सेक्यू के लिए किया जा सकता है । आरएनए-एसईक्यू के बाद सत्यापन आरएनए के विश्लेषण से परिणामों की पुष्टि करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए। यह सीटू संकरण में आरएनए का उपयोग करके आरएनए-एसईक्यू डेटा से सेल-प्रकार मार्कर जीन की अभिव्यक्ति की जांच करके किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: एलसीएम का प्रतिनिधि परिणाम। (A)उचित कटिंग एनर्जी और फोकस के साथ काटने के बाद टिश्यू । जहां कट बनाया गया था, वहां एक स्पष्ट फाइन लाइन देखी जा सकती है । चयनित क्षेत्र को आसपास की सामग्रियों से उखाड़ फेंका जाएगा। बार = 100 माइक्रोन (बी)गलत काटने ऊर्जा और ध्यान के साथ काटने के बाद ऊतक। चयनित क्षेत्र अभी भी आसपास की सामग्रियों से जुड़ा हुआ है। बार = 100 माइक्रोन (C)संग्रह ट्यूबों की विशेष चिपकने वाली टोपियां में कैप्चर की गई कोशिकाओं की जांच करना। बार = 100 माइक्रोन(डी)आरएनए प्रवर्धन से पहले कुल आरएनए प्रोफाइल का एक उदाहरण (बाएं, जेल जैसी छवि; दाएं, इलेक्ट्रोफेरोग्राम) 18S और 28S रिबोसोमल सबयूनिट की विशिष्ट इलेक्ट्रोफोरेटिक बैंड और फ्लोरोसेंट चोटियों के साथ। अवेलेबल चोटियां क्लोरोप्लास्ट और माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम्स सहित अतिरिक्त रिबोसोमल आरएनए के अनुरूप हैं। (ई)आरएनए प्रवर्धन के बाद एक ठेठ aRNA प्रोफ़ाइल का एक उदाहरण (बाएं, जेल की तरह छवि; सही, इलेक्ट्रोफेरोग्राम) । 100 से 1000 न्यूक्लियोटाइड के आकार का वितरण, 300 न्यूक्लियोटाइड के आसपास एक चोटी के साथ, पाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जैविक त्रिपिक में सभी नमूनों पर आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण किए गए। अंकुरण के 48 घंटे से अधिक विभिन्न ऊतकों में व्यक्त जीन की एक बहुआयामी स्केलिंग (एमडीएस) साजिश एक ही समय बिंदु से नमूनों की तुलना में एक ही ऊतक के नमूनों के बीच अधिक समानता दिखाता है लेकिन विभिन्न ऊतकों(चित्रा 4A)। हम अगले बाहर सेट करने के लिए निर्धारित कैसे बड़े पैमाने पर जीन अभिव्यक्ति अंकुरण के दौरान समय के साथ व्यक्तिगत ऊतकों में अंतर विनियमित किया गया । अंतर व्यक्त जीन (DEGs) की संख्या प्रत्येक ऊतक में अंकुरण के दौरान उत्तरोत्तर वृद्धि हुई है, कि ऊतक के 0 एच समय बिंदु(चित्रा 4B)के सापेक्ष । प्लंकुले के पच्चीस प्रतिशत (910), रेडिकल के 34% (1876) और स्कूटलम डीग्स के 41% (2562) को विशेष रूप से उस ऊतक में अलग-अलग व्यक्त किया गया था (यानी, ये जीन अन्य ऊतकों, चित्रा 4Cमें अलग-अलग व्यक्त नहीं किए गए थे)। एक साथ लिया, इन परिणामों को प्रदर्शित कैसे एलसीएम आरएनए-seq संयंत्र के विकास के दौरान लौकिक और स्थानिक जीन अभिव्यक्ति को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 4
चित्रा 4: एलसीएम नमूनों के आरएनए पुस्तकालयों का विश्लेषण जौ अंकुरण के 48 घंटे से अधिक विभिन्न ऊतकों के अलग-अलग जुदाई दिखाता है। (A)48 घंटे के अंकुरण से अधिक विभिन्न ऊतकों में व्यक्त जीन की बहुआयामी स्केलिंग (एमडीएस) साजिश। प्रत्येक बिंदु 1 नमूना का प्रतिनिधित्व करता है, और 2 अंकों के बीच की दूरी इसी आरएनए नमूनों के अग्रणी लॉग गुना परिवर्तन (एफसी) को दर्शाती है। एक्स, वाई, और जेड अक्ष पहले, दूसरे और तीसरे आयामी लॉगएफसी का प्रतिनिधित्व करते हैं। पी = प्लंयूल, आर = रेडिकल, एस = स्कूटलम, 0-48h = अंकुरण के एच, R1-3 = दोहराने 1-3 । (ख)तीन ऊतक प्रकारों के लिए टाइम पॉइंट 0 एच की तुलना में छह समय बिंदुओं के लिए महत्वपूर्ण अप-विनियमित (लाल) और डाउन-रेगुएटेड (नीला) की संख्या अलग-अलग जीन (डीईजी) को छह बार अंक के लिए व्यक्त की गई है । (ग)वेन आरेख तीन ऊतक प्रकारों में डीईजी की संख्या दिखाता है । ओवरलैपिंग सेट में जीन दो या तीन ऊतक प्रकारों में अंतर अभिव्यक्ति दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

कई ऊतक विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति अध्ययन नमूनों के हाथ विच्छेदन द्वारा सीमित किया गया है, जो समय लेने वाली है, श्रम गहन, संदूषण का एक उच्च जोखिम है और केवल नमूनों का उपयोग कर सकते है कि एक मानव ऑपरेटिव पर्याप्त फसल के लिए निपुण है । एलसीएम सूक्ष्म दृश्य के तहत यांत्रिक रूप से संचालित लेजर बीम का उपयोग करके निश्चित ऊतक वर्गों से कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक सटीक और संपर्क मुक्त तकनीक है।

एलसीएम के लिए अच्छा नमूना तैयार करना महत्वपूर्ण है। यह प्रक्रिया ऊतक आकृति विज्ञान और आरएनए की अखंडता के बीच एक अच्छा संतुलन बनाए रखने के लिए नमूनों के उचित फिक्सिंग और एम्बेडिंग पर निर्भर करती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल जौ के बीजों के लिए अनुकूलित फिक्सिंग और एम्बेडिंग कदम प्रदान करता है जिसमें फिक्सेटिव्स का समय और वैक्यूम घुसपैठ तय करना शामिल है। विभिन्न ऊतकों या प्रजातियों के विश्लेषण के लिए शर्तों के अनुकूलन की आवश्यकता होगी, क्योंकि ये आमतौर पर ऊतकों के बीच भिन्न होते हैं। इस प्रोटोकॉल का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू आरएनए प्रवर्धन कदम है जो यह सुनिश्चित करता है कि आरएनए-एसईक्यू पुस्तकालय निर्माण के लिए पर्याप्त मात्रा में आरएनए उत्पन्न होते हैं। हम पाते हैं कि आरएनए प्रवर्धन उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों में परिणाम है, लेकिन वैकल्पिक रूप से कम इनपुट पुस्तकालय तैयारी विधियों25 नियोजितकिया जा सकता है । लक्ष्य कोशिकाओं की हिस्टोलॉजिकल पहचान हमारी विधि में एक महत्वपूर्ण कदम है और दुर्लभ या खराब विशेषता कोशिका प्रकार के लिए चुनौतियां प्रदान कर सकता है। पूर्वप्रसंक्रम के हिस्से के रूप में पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल दाग या इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग का उपयोग करके या वैकल्पिक रूप से, ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग करके लक्ष्य सेल मान्यता में सुधार किया जा सकता है जो फ्लोरोसेंटली लेबल सेल-विशिष्ट मार्कर26,,27को व्यक्त करते हैं।

एलसीएम तकनीक को सबसे पहले सेल-टाइप-स्पेसिफिक ट्रांसक्रिप्ट एनालिसिस1के लिए पशु-व्युत्पन्न नमूनों पर इस्तेमाल करने के लिए विकसित किया गया था । हालांकि, जीनोमिक, प्रोटेओमिक और एपिजेनेटिक विश्लेषणों की एक विस्तृत श्रृंखला बाद में विकसित की गई है। पौधों के जैविक अध्ययन में आवेदन के लिए इन तरीकों को अनुकूलित करना एक सतत चुनौती है18,19,20,28.28 Schad एट अल ने प्रदर्शन किया कि अरबीडोप्सिस संवहनी बंडलों से प्रोटीन और मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण एलसीएम का उपयोग करके 2-डी जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और मास स्पेक्ट्रोमेट्री29,,30के साथ किया जा सकता है। हाल ही में, Latrasse एट अल. एलसीएम का उपयोग कर एलसीएम-विच्छेदित पुंकेसर और कार्पेल पर क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिcipitेशन (ChIP) -qPCR विश्लेषण किया, यह स्थापित करते हुए कि ऊतक एकरूपता सेल-विशिष्ट एपीजेनेटिक घटनाओं31के संकल्प में सुधार करती है। टर्को एट अल. ने ज्वार में संवहनी के दौरान डीएनए मिथाइलेशन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एलसीएम को बिसुल्फिट अनुक्रमण के साथ भी जोड़ा, जो संवहनी और गैर-वास्कुलर ऊतकों32के बीच ऊतक-विशिष्ट अंतर को उजागर करता है। दिलचस्प बात यह है कि कई अध्ययनों ने एलसीएम को पौधों-माइक्रोब और पौधे-रोगजनक बातचीत33, 34,,35का पता लगानेके35लिए लागू किया है। विभिन्न संक्रमण चरणों में कोशिकाओं की कल्पना और कब्जा करने के लिए एलसीएम की क्षमता संक्रमित कोशिकाओं के स्थानिक और लौकिक प्रतिक्रियाओं के बारे में जानकारी प्रदान की है ।

हमारे एलसीएम प्रोटोकॉल आरएनए-seq के साथ मिलकर यहां प्रस्तुत अलग सेल प्रकार के जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक-लौकिक वैश्विक प्रोफाइलिंग की सुविधा होगी । क्रोमेटिन और प्रोटीन के लिए बेहतर शुद्धिकरण विधियों के साथ-साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणों के साथ, एलसीएम पौधों में सेल-टाइप-विशिष्ट एपिजेनोमिक और प्रोटेओमिक अध्ययन की सुविधा के लिए एक उभरता हुआ उपकरण होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल सेंटर ऑफ एक्सीलेंस इन प्लांट एनर्जी बायोलॉजी (CE140100008) ने जेडब्ल्यू को सपोर्ट किया । M.G.L एक ला Trobe विश्वविद्यालय अनुदान शुरू द्वारा समर्थित था । हम ला ट्रोब जीनोमिक्स प्लेटफॉर्म को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण में उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। हम अपनी प्रयोगशाला में एलसीएम की स्थापना पर विशेषज्ञ सलाह के लिए एसोसिएट प्रोफेसर मैथ्यू टकर को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid 100 % ACS/R. AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 opaque Zeiss 415190-9181-000
Clear base moulds 8 X 10 Leica 3803015
Diethyl pyrocarbonate Sigma-Aldrich 40718-25ML
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579
Low­profile disp.blades DB80LS Leica 14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN Zeiss 415190-9041-000
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion (ThermoFisher) AMB17515
On-Column DNase I Digestion Set Sigma-Aldrich DNASE70
Ovation RNA-Seq System V2 NuGen (Integrated Science) 7102-08
Paraffin (Surgipath Paraplast) Leica 39601006
PicoPure RNA Isolation Kit ABI (ThermoFisher) KIT0214
RNaseZap RNase Decontamination Solution Ambion (ThermoFisher) AM9780
Xylene AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) VWRC28975.360
Leica Benchtop Tissue Processor Leica Biosystems TP1020
Leica Heated Paraffin Embedding Module Leica Biosystems EG1150H
Leica Cold Plate Leica Biosystems EG1150C
Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets LAF Technologies Pty Ltd Safemate 1.5
Leica Fully Automated Rotary Microtome Leica Biosystems RM2265 with PALMRobo v 4.6 software
Zeiss PALM MicroBeam LCM system Zeiss miscroscopy
TapeStation Agilent TapeStation 2200

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References

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जीव विज्ञान अंक 162 लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन एलसीएम ट्रांसक्रिप्टोम ऊतक-विशिष्ट आरएनए-सेक्यू जीन अभिव्यक्ति स्थानिक
पौधों में स्थानिक और लौकिक ऊतक-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन आरएनए-अनुक्रमण
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