Summary
Præsenteret her er en protokol for laser-capture microdissection (LCM) af plantevæv. LCM er en mikroskopisk teknik til isolering af vævsområder på en forureningsfri måde. Proceduren omfatter vævsfiksering, paraffinindlejring, sektionsindtrækning, LCM- og RNA-ekstraktion. RNA anvendes i den downstream-vævsspecifikke, tidsmæssigt løste analyse af transskriptomer.
Abstract
Udviklingen af en kompleks flercellet organisme styres af forskellige celletyper, der har forskellige transskriptionelle profiler. For at identificere transskriptionelle reguleringsnetværk, der styrer udviklingsprocesser, er det nødvendigt at måle de rumlige og tidsmæssige genekspressionsprofiler for disse individuelle celletyper. Derfor er indsigt i spatio-tidsmæssig kontrol af genekspression afgørende for at få forståelse for, hvordan biologiske og udviklingsmæssige processer reguleres. Her beskriver vi en laser-capture microdissection (LCM) metode til at isolere et lille antal celler fra tre byg embryo organer over en tid-kursus under spiring efterfulgt af udskrift profilering. Metoden består af vævsfiksering, vævsbehandling, paraffinindlejring, sektionsoptrækning, LCM- og RNA-ekstraktion efterfulgt af pcr eller RNA-seq i realtid. Denne metode har gjort det muligt for os at opnå rumlige og tidsmæssige profiler af frø organ transkriptomer fra varierende antal celler (tiere til hundredvis), hvilket giver langt større væv-specificitet end typiske bulk-væv analyser. Ud fra disse data var vi i stand til at definere og sammenligne transskriptive regulerende netværk samt forudsige kandidat lovgivningsmæssige transskription faktorer for de enkelte væv. Metoden bør anvendes på andre plantevæv med minimal optimering.
Introduction
Planteudvikling og vækst indebærer en koordineret indsats af transskriptionelle regulerende netværk inden for forskellige celler, der findes i et komplekst cellulært miljø. For at forstå aktiviteten af disse regulatoriske netværk, kræver vi viden om rumlige og tidsmæssige genekspression inden for forskellige celletyper på tværs af udviklingsstadier. Men, analyser af genekspression er mere almindeligt udført i hele organer eller bulk vævsprøver på grund af den tekniske udfordring at isolere og analysere et lille antal celler. Den metode, vi beskriver her, har gjort det muligt at opnå rumlig og tidsspecifik transkriptionsanalyse ved at koble LCM med RNA-seq.
LCM blev udviklet for to årtier siden af Emmert-Buck og kolleger1. Teknikken gjorde det muligt for forskere præcist at isolere enkeltceller eller klynger af celler fra deres miljø ved hjælp af direkte mikroskopisk visualisering og manipulation med en smal strålelaser1. Siden da har metoden været meget anvendt i kræftbiologi og patologi2,3. Mange planteforskningsgrupper har også tilpasset LCM til brug med forskellige plantearterogforskellige vævstyper4, 5,66,7,8,9,10,11. For nylig har flere papirer også brugt LCM på eudicot og monocot frø til at studere embryo, endosperms og andre frø strukturer under frø udvikling og spiring10,12,13. De fleste af de andre almindeligt anvendte encellede isolationsmetoder såsom mikrorør, cellesortering, magnetisk separation og mikrofluidiske platforme afhænger af enzymatisk fordøjelse eller mekanisk homogenisering for at adskille celler. Dette kan forstyrre genekspression, indføre tekniske artefakter, der forvirrede data fortolkning14,15. Disse metoder kræver også tidligere kendskab til markørgener for hver celletype for at relatere de dissocierede celler til deres rumlige placering og sande celletype. En yderligere gruppe af teknikker afhænger af affinitetsbaseret isolering af delcellulære strukturer i stedet for hele celler, for eksempel INTAKT (Isolering af nuklei mærket i celletyper) og TRAP (Oversætte Ribosome Affinity Rensning)16,17. Men affinitet mærkning og rensning af kerner eller ribosomer er teknisk udfordrende i plantearter, der ikke har veletablerede transformation protokoller. LCM udnytter hurtig vævsfiksering til at bevare transskriptionsniveauer og konventionel histologisk identifikation ved direkte visualisering af celler i deres normale vævs-/organsammenhæng, hvilket gør det muligt at isolere diskrete cellerpå kort tid 18,19.
Den protokol, der præsenteres her, er en optimeret metode til isolering af specifikke celler eller celletyper fra vævsafsnittene af kornfrø, som kan anvendes på de fleste af de celler, der kan histologisk identificeres. LCM giver en kontaktfri metode til celleisolering, hvilket i høj grad reducerer forureningen og øger integriteten af genvundet RNA. Desuden illustrerer metoden styrken af LCM på store genom brede undersøgelser startende med små mængder af biologiske materialer. Vi beskriver også lineær forstærkning af RNA til generering af tilstrækkeligt inputmateriale til downstream-transskription/transskriptionsanalyser.
Der er ti hovedtrin i denne LCM RNA-seq-protokol for rumlige og tidsmæssige vævsspecifikke transskriptioner, herunder fiksering af vævsprøver, dehydrering, paraffinfiltration, indlejring, sektionsopdelt, LCM- RNA-ekstraktion, RNA-forstærkning, RNA-kvantificering og qRT-PCR og/eller RNA-seq (Figur 1).
Figur 1: Rutediagram over LCM efterfulgt af RNA-seq eller qRT-PCR. LCM er en rumlig præcis og kontaktfri teknik til at indsamle celler fra faste vævssektioner ved hjælp af en laserstråle under mikroskopisk visualisering. Processen starter med fiksering af vævsprøver, efterfulgt af dehydrering ved hjælp af en gradient serie af ethanol og xylen, og færdig med paraffin infiltration. Processen kan være fuldt automatiseret ved hjælp af en vævsprocessor. Når vævet er infiltreret med paraffin, er det indlejret i en støbeform med smeltet paraffin ved hjælp af en indlejring station. Sektionssnit udføres ved hjælp af mikrotom indstillet til den ønskede tykkelse. Lysbilleder fremstilles, og LCM udføres umiddelbart før RNA skal udvindes fra tilfangetagne celler. RNA-ekstraktion efterfølges direkte af to runder RNA-forstærkning før qRT-PCR og/eller RNA-seq. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Da det endelige produkt er RNA, skal du passe på at undgå at forurene arbejdet med RNases. Iført handsker er et must. Brug diethylpyocarbonat (DEPC) -behandlet vand, buffere osv. Autoklave buffere og bage glasvarer før brug.
1. Vævsfiksering
- Forbered fiksering af valg afhængigt af art og væv typer; for bygfrø anvendes Landmandens fiksativ (75 % ethanol, 25 % iseddike (v/v)).
- Chill fiksativ på is før høst væv.
- Saml plantemateriale af interesse og om nødvendigt dissekere det i stykker af passende størrelse til at passe ind i den valgte indlejring skimmel. For byg frø, skæres frøet i halv langsgående for at hjælpe penetration af fiksativ opløsning og til at passe ind i indlejring skimmel.
- Nedsænk vævet i mindst 10x volumen af iskold fiksativ. For byg frø, nedsænkes frøet skåret i halve i fiksativ.
- Brug vakuuminfiltration til at fremskynde indtrængningen af fiksativ. Vævet skal synke efter vakuuminfiltration af fiksativ. For byg frø, bruge 30 min vakuum infiltration.
- Fikserings- og inkuberingsklud ved 4 °C, så fikseringen kan trænge helt ind i vævet. For bygfrø inkuberes prøverne natten over (~12-16 h).
BEMÆRK: Fortynder eller små væv vil kræve kortere fikseringstid på grund af den højere diffusionshastighed af fiksativ i vævet. - Fjern vævet fra fiksativ og overføre vævet i kassetter og derefter påbegynde vævsbehandling.
BEMÆRK: Lille eller skrøbeligt væv, såsom bladvæv, kan placeres i kassetter til fastgørelse for at sikre, at det ikke er beskadiget under fikseringen. Biopsi poser, puder eller wraps kunne bruges til at holde vævet sikkert inde i kassetter under væv fiksering og væv forarbejdning trin.
2. Vævsbehandling
- Brug en automatiseret vævsprocessor i trin 2 med mindst 10 opløsningskamre og 2 opvarmede paraffinkamre (se Tabel over materialer).
- Kontroller, at der er tilstrækkelige mængder opløsning i hvert kammer; udskifte opløsninger efter hver få anvendelser af vævsprocessoren.
- Placer kassetter med væv i metalkurven. Fastgør metalkurven til holderen over kammeret 1. Indehaveren roterer og "dunker og dypper" kassetterne ind i kamrene efter det angivne program.
- Indstil programmet ved at udføre knap klik på kontrolpanelerne af væv processor, som indebærer indstilling af længden af tid for hvert kammer.
- Tryk på knappen "Start" for at starte behandlingsprogrammet. Følgende program er designet til byg frø og kører natten over (~ 18 h)
- Udfør dehydrering ved at dyppe kassetten i 1 h 30 min hver i gradient serie af ethanol (75%, 85%, 100%, 100%, og 100% (v / v) ethanol).
- Udfør rydning ved hjælp af ethanol: xylengradient i 1 time 30 min hver kl. Derefter dyppe kassetten i 1 h 30 min hver af 100% xylen derefter 100% xylen.
- Der udføres paraffinfiltration ved 55-60 °C i 1 time 30 min. to gange i smeltet paraffin.
BEMÆRK: Temperaturen af paraffinvarmeren kan indstilles på bagsiden af vævsprocessoren.
- Den næste morgen, fjerne kassetter fra væv processor og gå videre til paraffin indlejring.
BEMÆRK: Programtiden kan variere mellem vævstype. Vakuum og/eller omrøring kan anvendes under vævsbehandling til at fremskynde infiltrationen af udvalgte opløsninger ved at trykke på "V" og/eller "omrøring" knapper på kontrolpanelet på vævsprocessoren.
3. Indlejring af Paraffin
- Brug en indlejringsmaskine i dette trin (se Tabel over materialer).
- Forudindstille indlejringsmaskinen for at tænde mindst et par timer før indlejring for at give paraffin i reservoirerne til at smelte helt.
- Tænd for kølepladen, før du starter.
- Integrer prøverne i forme ved at holde prøverne på plads ved hjælp af fine saft og dispensering smeltet paraffin i formen. Sørg for korrekt orientering af prøver til hvert forsøgsformål. For bygfrø skal frøene vendes i længderetningen til skæreretningen for at opnå langsgående sektioner.
BEMÆRK: Indlejring forme kommer i forskellige størrelser. Vælg en passende størrelse, så prøveemnet kan placeres og integreres korrekt. Orienteringen af prøverne bør overvejes afhængigt af forsøgsbehovene. Hvis der kræves sektioner i længderetningen, skal prøven vendes i længderetningen til skæreretningen, mens prøven for tværgående sektioner skal vendes parallelt med skæreretningen. - Anbevis en ren kassette på formen, og sørg for, at der er tilstrækkelig paraffin til at dække hele kassetten helt til at holde prøven på kassetten.
- Placer formen på den kolde plade og lad paraffin til at indstille fuldt (10-20 min), før du slipper blokken fra mug.
- Fortsæt til trækning eller overførsel af blokkene til 4 °C til opbevaring.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. De indlejrede blokke kan opbevares ved 4 °C i op til tre måneder.
4. Fremstilling af polyethylennukhthalat (PEN) membrandias
- Nedsænk PEN membrandias i RNase deaktivering løsning til 3 s efterfulgt af to korte vasker i DEPC-behandlede vand for at fjerne RNases på dias. Slynglassene tørres i en 37 °C-inkubator for at fjerne den tilovers.
- UV-behandle dias ved hjælp af en UV-lampe i en laminar flow kabinet i 30 min at forbedre hydrofile egenskaber for forbedret paraffin vedhæftning.
5.
- Brug en mikrotom i sektionstrinnet (se Tabel over materialer).
- Sæt en ny kniv i knivholderen, og hold altid knivbeskyttelsen op, når du ikke aktivt sektioner
FORSIGTIG: Mikrotombladene er ekstremt skarpe og kan forårsage betydelig skade, når de håndteres uhensigtsmæssigt.
BEMÆRK: Der er to låsemekanismer på mikrotomen, den ene er ved siden af maskinen, og den anden er på hjulets håndtag. Begge skal engageres, når de ikke aktivt sektioner. - Juster knivblokken, så den er så tæt på prøven som muligt uden at røre ved. Sørg for, at mikrotomarmen aldrig kommer i fuld kontakt med knivblokken, da dette vil forårsage katastrofale strukturelle skader på mikrotomen.
- Tænd for kølepladen, før du starter. Hold paraffinblokke på kølepladen før trækning og afkøl blokke igen, når det er nødvendigt under trækningen for at forhindre, at blokkene blødgøres.
- Vandbadet fyldes med DEPC-behandlet vand og opvarmes til 42 °C, inden det påbegyndes.
- Trim blokke til den ønskede dybde (hvor den sektion, du er interesseret i) og sektion paraffin blokke ved den ønskede tykkelse (6-10 μm) ved hjælp af mikrotom; en velsektionsblok danner et 'bånd' i kanten af klingen. For bygfrø, sektion med 8 μm tykkelse.
- Overfør forsigtigt bånd fra mikrotomet til vandbadet ved hjælp af fin pensel eller fine fakbånd, hvilket sikrer, at båndet er fladt på vandoverfladen.
- Hold et dias i en vinkel på 45°, ved hjælp af en opadgående bevægelse, løft et bånd op af vandet på rutsjebanen og fjern forsigtigt overskydende vand med et fnugfrit væv.
- Tør rutsjebaner i 30 minutter ved 37 °C for at fjerne eventuelt resterende vand under paraffinen.
- Der fortsættes med paraffinfjernelse, eller opbevares ved 4 °C i en lukket kasse under dehydrerende forhold (anvendes inden for flere dage).
- Paraffin fjernes ved at vaske objektglassene 3x i 20 s hver i xylen efterfulgt af 2x vaske af 30 s i 100% (v/v) ethanol og 2x vaske af 30 s i 70% (v/v) ethanol.
- Fortsæt straks til laser-capture mikrodissektion efter paraffin er fjernet.
BEMÆRK: Cryosectioning er en alternativ metode, der er blevet kombineret med LCM. Prøve forberedelse til krysektion vil afvige.
6. Laser-capture mikrodissektion
- Brug et mikrodissektionmikroskop til laserfangst (se Materialetabel)til mikrodissect-celler fra de-paraffiniserede og tørrede vævssektioner.
- Læg dias på de tre tilgængelige pladser.
- Brug de særlige selvklæbende hætter af opsamlingsrør til at indsamle de tilfangetagne prøver. Indfangning uden væske ("tør" samling) minimerer RNase aktivitet. Læg opsamlingsrørene i de tilgængelige pladser.
- Flyt scenen for at finde det område af prøven, der skal skæres. Dette kan gøres ved hjælp af mus eller joystick af LCM maskinen, eller piletasterne på tastaturet.
- For at optimere skærehastighed, skære energi og fokus, laser tryk katapulting (LPC) energi og fokus, først skæres på et tomt segment fri for væv på membranen dias. For bygfrø, skærehastighed = 18, CutEnergy = 52 CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, LPC fokus = 61 ved 10x forstørrelse.
BEMÆRK: Skærefokus og energi skal justeres for forskellige dias, forskellige væv og erobret område, men generelle regler er katapulterende effekt er højere end skæreeffekten, og laseren skal defokuseres til katapulting. Jo højere forstørrelse af objektivet linse, jo mindre fokus for laser og jo højere energi. - Brug tegneværktøjerne til at markere celler ved at skitsere interesseområdet.
- Vælg RoboLPC-funktion fra funktionsværktøjslinjen for at katapultere celler i de selvklæbende hætter baseret på de optimerede parametre, der opnås ved at skære på et sort segment ovenfor.
BEMÆRK: LCM parametre varierer mellem vævstyper samt tykkelse af sektion, væv hårdhed og objektive linser. Derfor er det bedst at optimere hvert dias på et almindeligt membranområde uden vævsprøve, før den faktiske prøve skæres. - Brug værktøjerne Flag til at markere interesseområder til at finde dem med det samme ved at vælge flaget på grund af elementerne.
- Kontroller ved "CapCheck" knappen for at inspicere den selvklæbende hætte for at bekræfte prøver blev fanget. Typisk, LCM af 10-15 sektioner (~ 200 celler) pr hætte er påkrævet for RNA ekstraktion.
- Hold de tilfangetagne prøver på is. Fortsæt straks for RNA-ekstraktion for at undgå RNA-nedbrydning.
BEMÆRK: Nogle LCM mikroskopi er udstyret med fluorescerende lys, som gør det muligt at fange celler mærket med fluorescerende markører.
7. RNA-udvinding
- Brug et RNA-isolationssæt med lavt input (se Materialetabel)til RNA-ekstraktion efter LCM. Sådanne kits er designet til at genvinde høj kvalitet samlede RNA konsekvent fra færre end ti celler.
- Isoler det samlede RNA fra de optagne celletyper i henhold til producentens anvisninger, herunder dnasebehandling på kolonnen.
BEMÆRK: Det første trin i RNA-ekstraktionen, hvor røret vendes og knipses, er afgørende for at sikre, at de tilfangetagne prøver på låget er i kontakt med den tilsat ekstraktionsbuffer.
8. RNA forstærkning
- Brug et antisense RNA-forstærkningssæt (se Materialetabel) til aRNA-forstærkning fra RNA'et udvundet ved in vitro-transskription til at producere tilstrækkelig aRNA til RNA-seq bibliotekssyntese.
- Udfør to runder af forstærkning ved hjælp af aRNA forstærkning Kit i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Det er vigtigt at forvarme termocyren og låget til den temperatur, som kittet (se materialetabel)anbefaler. En alternativ tilgang i stedet for RNA forstærkning er at bruge en lav input bibliotek forberedelse kit til at syntetisere biblioteket direkte fra udvundet RNA.
9. RNA-kvantificering
- Kvantificer og kvalificer aRNA ved hjælp af et automatiseret elektroforesesystem (se Tabel over materialer).
BEMÆRK: Et automatiseret elektroforesesystem foretrækkes, da det kræver mindre prøve (1-2 μL) og giver et gellignende billede og elektroferogram for hver enkelt prøve.
10. qRT-PCR og/eller RNA-seq
- Syntetisere cDNA fra aRNA for qRT-PCR eller for at gøre RNA-seq biblioteker ved hjælp af standard RNA-seq bibliotek kits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi genererede rumlige og tidsmæssige vævsspecifikke transkriptoer fra bygfrø under spiring ved hjælp af vores LCM RNA-seq protokol10. Undersøgelsen blev udført ved at anvende LCM RNA-seq på et lille antal celler fra tre embryoorganer (plumule, radikelspids, scutellum) hver 8 timer over et 48 timers tidsforløb under spiring (0-48 h, 7 tidspoint) (Figur 2A,B).
Figur 2: Celler indsamlet fra bygfrø af LCM. AA) Langel tværsnit af et bygfrø og indsat en udvidet tegneserie, der angiver de områder, hvorfra cellerne blev fanget. Blå = plumule, magenta = radikel, grøn = scutellum. BB) LCM af fjerdragt, radikel og scutellum. Toppanel, væv før lasertryk katapulting (LPC). Nederste panel, væv efter LPC. Cellerne blev fanget fra 5 på hinanden følgende langsgående afsnit af hver prøve med tre biologiske replikater pr. prøve. Hver replikat bestod af ca. 200 celler (~0,05 - 0,15 mm2 totalareal). Bar = 100 μm. E = endosperm, C = knust cellelag, SE = scutellar epitel, S = scutellum. Figur gengivet fra tidligere data i The Plant Journal med tilladelse10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fikseringen og indlejringen er kritiske trin, da dårligt fastgjort vævsprøve kan resultere i vævsskader og tab af RNA-kvantitet og -kvalitet. Disse trin skal optimeres og justeres for forskellige arter og vævstyper19,20,21. Her brugte vi vakuuminfiltration til at forbedre indtrængningen af fiksativerne i frøvæv og celler. Dehydrering og paraffininfiltration udføres gradvist for at undgå skader på vævsprøverne. Vi har accelereret hele dehydrering og paraffin infiltration proces ved hjælp af en automatiseret væv processor med agitation og vakuum anvendes på hvert trin. Dette reducerer i høj grad risikoen for RNA-nedbrydning, der opstår under de langvarige vævsbehandlingstrin udført af en menneskelig operativ. Før trækning er det afgørende at behandle membranslidsen for at sikre paraffinvedhæftning og for at sikre, at det er RNase-fri. Hvis membrandiasene ikke er forberedt korrekt, vil prøvesektionen ikke holde sig til membranen, hvilket vil påvirke LCM-katapulttrinet og reducere vævsoverførslen til klæbehætterne, fordi prøven vil adskille sig fra membranen (se figur 1).
Et andet kritisk skridt i LCM RNA-seq-protokollen er LCM-parameteroptimering. Der er fem hovedparametre, der skal optimeres: (1) skærehastighed; 2) skæreenergi 3) skærefokus 4) LPC-energi og (5) LPC-fokus. Det er vigtigt at justere skæreparametrene korrekt for at skære det valgte område præcist og løsne sig fra omgivende væv uden at brænde kanten af det valgte område (Figur 3A,B). Den korrekte LPC energi og fokus er afgørende for pålideligt katapult det valgte område fra dias til de særlige selvklæbende hætter af indsamlingsrør, og altid inspicere tilfangetagne prøver i hætter for at sikre nok materiale er indsamlet (Figur 3C). Effektiviteten af LCM gør det muligt at fange 1000 celler inden for en time, hvilket i høj grad reducerer sandsynligheden for RNA-nedbrydning under prøvebehandling. Brugen af opsamlingsrør med klæbende hætter tillader "tør" indsamling uden nogen opfangende væske, hvilket reducerer mulige RNases aktiviteter. Det er vigtigt at holde de tilfangetagne prøver på is og gøre RNA ekstraktion umiddelbart efter indsamling af alle replikater.
RNA-ekstraktion og forstærkning udføres ved hjælp af kommercielt tilgængelige sæt ved at følge producentens anvisninger. Kvantificering af total RNA før RNA-forstærkning ved hjælp af automatiseret elektroforesesystem vil detektere forskellige elektroforetiske bånd og fluorescerende toppe på 18S og 28S ribosomale underenheder i RNA-prøver af god kvalitet (Figur 3D). Yderligere toppe svarende til chloroplast og mitokondriel ribosomal RNA vil blive fundet før 18S og 28S toppe. På grund af flere RNA-toppe i plantearter er RIN-værdierne (RNA Integrity Number) typisk lavere end 9 (den forventede RIN-værdi fra pattedyrvæv) og afspejler ikke nøjagtigt RNA-integriteten22. Det er hensigtsmæssigt at fortsætte med RNA-forstærkning, når klare 18S- og 28S-toppe er synlige uden tegn på RNA-nedbrydning. Mængden af RNA genvundet i vores byg frø eksperiment varierede mellem tre forskellige vævstyper (plumule, radikel og scutellum) og, også mellem tidlige og sene stadier af spiring, på trods af omtrent lige mange celler, der høstes. Mængderne fra bygfrø varierede fra 100 pg til 20 ng fra omtrentlige 200 celler (0,5 til 100 pg per celle). Den mindste mængde input RNA, der anbefales til RNA-forstærkning, var 100 pg. Mængden af RNA ekstraheret afhænger af effektiviteten af ekstraktion fra forskellige høstede celler og total udskriftstæthed i den pågældende celletype på dette udviklingstrin19,21. Det er nyttigt at overveje dette, når du planlægger et LCM RNA-seq eksperiment, selvom sådanne forudgående oplysninger ikke vil være tilgængelige i alle tilfælde.
En vellykket syntetiseret aRNA vil udvise en unimodal, symmetrisk størrelsesfordeling fra 100 til 1000 nukleotider med en top på omkring 300 nukleotider efter to runder forstærkning (Figur 3E). I vores byg frø eksperiment, opnåede vi 500 pg til 2 μg aRNA efter to runder af RNA forstærkning10. Sammenligning mellem forstærket og uforstærket RNA har vist, at RNA-forstærkning er reproducerbar, lineær og ikke medfører en systematisk bias i transskriptionsdata23,24,25. Output aRNA kan bruges til qRT-PCR og/eller RNA-seq til rumlig og tidsmæssig vævsspecifik genekspressionsanalyse. Validering efter RNA-seq skal udføres for at underbygge resultater fra analyse af aRNA. Dette kan gøres ved at undersøge ekspression af cellemærkegener fra RNA-seq-data ved hjælp af RNA in situ-hybridisering.
Figur 3: Repræsentativt resultat af LCM. (A)Væv efter skæring med korrekt skæreenergi og fokus. En klar fin linje kan ses, hvor snittet blev foretaget. Det valgte område vil blive fjernet fra de omgivende materialer. Bar = 100 μm. ( B )Vævefter skæring med forkert skæreenergi og fokus. Det valgte område er stadig forbundet med omgivende materialer. Bar = 100 μm. (C) Undersøgelse af tilfangetagne celler i specielle selvklæbende hætter af opsamlingsrør. Bar = 100 μm. (D) Et eksempel på total RNA-profil før RNA-forstærkning (venstre, gellignende billede; højre, elektropherogram) med tydelige elektroforetiske bånd og fluorescerende toppe på 18S og 28S ribosomale underenheder. Umærkede toppe svarer til yderligere ribosomal RNA, herunder chloroplast og mitokondrielle ribosomer. (E) Et eksempel på en typisk aRNA-profil efter RNA-forstærkning (venstre, gellignende billede; højre, elektroferogram). Der blev fundet en fordeling af størrelser fra 100 til 1000 nukleotider med et højdepunkt på omkring 300 nukleotider. Klik her for at se en større version af dette tal.
Der blev udført RNA-seq-analyser på alle prøver i biologiske tre eksemplarer. Et multidimensionalt skaleringsplot (MDS) af gener udtrykt i de forskellige væv over 48 h spiring illustrerer større lighed mellem prøver af et enkelt væv end mellem prøver fra samme tidspunkt, men forskellige væv (figur 4A). Vi satte os derefter for at bestemme, hvor omfattende genekspression blev differentieret reguleret i individuelle væv over tid under spiring. Antallet af differentierede gener (DEGs) steg gradvist i løbet af spiring i hvert væv i forhold til det vævs tidspunkt på 0 h (figur 4B). Femogtyve procent (910) af plumule, 34% (1876) radikel og 41% (2562) af scutellum DEGs blev anset for udelukkende at være differentieret udtrykt i dette væv (dvs. disse gener blev ikke differentieret udtrykt i de andre væv, figur 4C). Samlet set viser disse resultater, hvordan LCM RNA-seq kan bruges til at forstå tidsmæssig og rumlig genekspression under planteudvikling.
Figur 4: Analyse af RNA-biblioteker af LCM-prøver, der viser tydelig adskillelse af forskellige væv over 48 timer bygspiring. aA) Multidimensional skalering (MDS) plot af gener udtrykt i de forskellige væv over 48 h spiring. Hvert punkt repræsenterer 1 prøve, og afstanden mellem 2 punkter afspejler den førende log fold ændring (FC) af de tilsvarende RNA-prøver. X-, y- og z-aksen repræsenterer første, anden og tredjedimensionale logFC. P = plumule, R = radikel, S = scutellum, 0-48h = h af spiring, R1-3 = Repliker 1-3. bB) Antal signifikante opregulerede (røde) og nedregulerede (blå) differentierede gener (DEGs) i seks tidspunkter sammenlignet med tidspunkt 0 h for tre vævstyper. cC) Venn-diagram, der viser antallet af GD'er i tre vævstyper. Gener i overlappende sæt viser differentialudtrykket i to eller tre vævstyper. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange vævsspecifikke genudtryksundersøgelser er blevet begrænset ved hånddissektion af prøver, som er tidskrævende, arbejdskrævende, har en høj risiko for kontaminering og kan kun udnytte prøver, som en menneskelig agent er tilstrækkelig behændning til at høste. LCM er en præcis og kontaktfri teknik til at indsamle celler fra faste vævssektioner ved hjælp af en mekanisk betjent laserstråle under mikroskopisk visualisering.
God prøve forberedelse er afgørende for LCM. Processen er afhængig af korrekt fastsættelse og indlejring af prøver for at opretholde en god balance mellem væv morfologi og integritet RNA. Protokollen præsenteres her giver optimeret fastsættelse og indlejring trin for byg frø, som omfatter længere fastsættelse tid og vakuum infiltration af fiksativer. Analyse af forskellige væv eller arter vil kræve optimering af betingelserne, da disse typisk varierer mellem væv. Et andet vigtigt aspekt af denne protokol er RNA forstærkningstrinnet, som sikrer, at der genereres tilstrækkelige mængder RNA til RNA-seq bibliotekskonstruktion. Vi finder, at RNA forstærkning resulterer i høj kvalitet biblioteker, men alternativt lav input bibliotek forberedelse metoder kan anvendes25. Histologisk identifikation af målceller er et kritisk skridt i vores metode og kan give udfordringer for sjældne eller dårligt karakteriserede celletyper. Målcellegenkendelse kan forbedres ved hjælp af traditionelle histologiske pletter eller immunfluorescenspletter som en del af forbehandlingstrinnet eller alternativt ved hjælp af transgene linjer, der udtrykker fluorescerende mærkede cellespecifikkemarkører 26,27.
LCM-teknikken blev først udviklet til at blive anvendt på animalske prøver til celletypespecifik transkriptionsanalyse1. Der er dog efterfølgende udviklet en bred vifte af genomiske, proteomiske og epigenetiske analyser. Tilpasning af disse metoder til anvendelse i plantebiologiske undersøgelser er en vedvarende udfordring18,19,20,28. Schad et al. påviste, at proteiner og metabolitter fra arabidopsis vaskulære bundter kunne analyseres ved hjælp af LCM med 2-D gelelektroforese og massespektrometri29,30. For nylig, Latrasse et al. udført chromatin immunoprecipitation (ChIP)-qPCR analyse på LCM-dissekeret støvdragere og carpels ved hjælp af LCM, fastslå, at væv homogenitet forbedrer opløsningen af celle-specifikke epigenetiske hændelser31. Turco et al. også koblet LCM med bisulfit sekventering at studere DNA methylering begivenheder under vaskularisering i sorghum, fremhæver vævsspecifikke forskel mellem vaskulære og ikke-vaskulære væv32. Interessant, flere undersøgelser har anvendt LCM at udforske plante-mikrobe og plante-patogen interaktioner33,34,35. LCM's evne til at visualisere og fange celler på forskellige infektionsstadier gav oplysninger om de rumlige og tidsmæssige reaktioner på inficerede celler.
Vores LCM-protokol kombineret med RNA-seq præsenteret her vil lette den spatio-tidsmæssige globale profilering af genekspression af forskellige celletyper. Med forbedrede rensningsmetoder for kromatin og proteiner sammen med forbedrede massespektrometriinstrumenter vil LCM være et nyt redskab til at lette celletypespecifikke epigenomiske og proteomiske undersøgelser i planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) til JW. M.G.L blev støttet af en La Trobe University start tilskud. Vi takker La Trobe Genomics Platform for deres støtte i høj-throughput sekventering og dataanalyse. Vi takker lektor Matthew Tucker for ekspertrådgivning om oprettelse af LCM i vores laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).
- Cong, P., et al. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).
- Blokhina, O., et al. Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants. Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).
- Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).
- Chen, Z., et al. LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.). The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).
- Jiao, Y., et al. A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies. Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).
- Kivivirta, K., et al. A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms. Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
- Matas, A. J., et al. Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation. The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).
- Sakai, K., et al. Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo. Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).
- Zhan, J., et al. RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. Single-Cell Omics. , Elsevier. 101-135 (2019).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).
- Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells. Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
- Takahashi, H., et al. A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).
- Ferreira, E. N., et al. Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA. Gene. 564 (2), 220-227 (2015).
- Schneider, J., et al. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).
- Shanker, S., et al. Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).
- Bhattacherjee, V., et al. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells. Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Blokhina, O., et al. Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce. Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).
- Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).
- Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).
- Latrasse, D., et al. The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22 (2017).
- Turco, G. M., et al. DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor. The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).
- Gomez, S. K., Harrison, M. J. Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).
- Roux, B., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing. The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).
- Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).
