Summary
Presentato qui è un protocollo per la microdissezione laser-cattura (LCM) di tessuti vegetali. LCM è una tecnica microscopica per isolare aree di tessuto in modo privo di contaminazione. La procedura include fissazione del tessuto, incorporamento di paraffina, sessazione, LCM e estrazione dell'RNA. L'RNA viene utilizzato nell'analisi dei trascrimi specifici del tessuto a valle e tempormente risolta.
Abstract
Lo sviluppo di un organismo multicellulare complesso è governato da tipi di cellule distinti che hanno diversi profili trascrizioni. Per identificare le reti di regolamentazione trascrizionali che governano i processi di sviluppo è necessario misurare i profili di espressione genica spaziale e temporale di questi singoli tipi di cellule. Pertanto, la comprensione del controllo spatio-temporale dell'espressione genica è essenziale per comprendere come sono regolati i processi biologici e di sviluppo. Qui, descriviamo un metodo di microdissezione laser-cattura (LCM) per isolare un piccolo numero di cellule da tre organi embrionali d'orzo in un corso di tempo durante la germinazione seguito dalla profilazione della trascrizione. Il metodo consiste nella fissazione dei tessuti, nell'elaborazione dei tessuti, nell'incorporazione di paraffina, nella sessazione, nell'estrazione di LCM e RNA seguita da PCR o RNA-seq in tempo reale. Questo metodo ci ha permesso di ottenere profili spaziali e temporali di trascrittori di organi di semi da un numero variabile di cellule (da decine a centinaia), fornendo una specificità del tessuto molto maggiore rispetto alle tipiche analisi dei tessuti sfusi. Da questi dati siamo stati in grado di definire e confrontare le reti normative trascrizioni, nonché prevedere i fattori di trascrizione normativa candidati per i singoli tessuti. Il metodo deve essere applicabile ad altri tessuti vegetali con ottimizzazione minima.
Introduction
Lo sviluppo e la crescita delle piante comportano l'azione coordinata delle reti di regolamentazione trascrizionali all'interno di diverse cellule esistenti in un ambiente cellulare complesso. Per comprendere l'attività di queste reti normative, abbiamo bisogno della conoscenza dell'espressione genica spaziale e temporale all'interno di diversi tipi di cellule attraverso le fasi di sviluppo. Tuttavia, le analisi dell'espressione genica sono più comunemente condotte in interi organi o campioni di tessuto sfusa a causa della sfida tecnica di isolare e analizzare un piccolo numero di cellule. Il metodo che descriviamo qui ha permesso di ottenere un'analisi del trascrittura specifica del tessuto spaziale e temporale accoppiando LCM con RNA-seq.
LCM è stato sviluppato due decenni fa da Emmert-Buck e colleghi1. La tecnica ha permesso ai ricercatori di isolare con precisione singole cellule o ammassi di cellule dal loro ambiente utilizzando la visualizzazione e la manipolazione microscopiche dirette con un laser a fasciostretto 1. Da allora il metodo è stato ampiamente utilizzato nella biologia del cancro e nellapatologia 2,3. Molti gruppi di ricerca vegetali hanno anche adattato LCM per l'uso con diverse specie vegetali e diversi tipi ditessuto 4,5,6,7,8,9,10,11. Recentemente, diversi documenti hanno anche usato LCM su semi di eudicot e monocot per studiare embrioni, endospermemi e altre strutture di semi durante lo sviluppo dei semi e lagerminazione 10,12,13. La maggior parte degli altri metodi di isolamento a cella singola comunemente utilizzati come micro-pipettazione, smistamento cellulare, separazione magnetica e piattaforme microfluidiche dipendono dalla digestione ezimatica o dall'omogeneizzazione meccanica per dissociare le cellule. Questo può perturbare l'espressione genica, introducendo artefatti tecnici che confondono l'interpretazionedei dati 14,15. Questi metodi richiedono anche una conoscenza precedente dei geni marcatori per ogni tipo di cellula per correlare le cellule dissociate alla loro posizione spaziale e al vero tipo di cellula. Un ulteriore gruppo di tecniche dipende dall'isolamento basato sull'affinità delle strutture subcellulari anziché delle celle intere, ad esempio INTACT (Isolation of Nuclei Tagged in Cell Types) e TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)16,17. Tuttavia, l'etichettatura di affinità e la purificazione di nuclei o ribosomi sono tecnicamente impegnative nelle specie vegetali che non hanno protocolli di trasformazione ben consolidati. LCM sfrutta la fissazione rapida dei tessuti per preservare i livelli di trascrizione e l'identificazione ircologica convenzionale mediante la visualizzazione diretta delle cellule all'interno del loro normale contesto di tessuto/organo, che consente alle cellule discrete di essere isolate in un breveperiodo di tempo 18,19.
Il protocollo qui presentato è un metodo ottimizzato per l'isolamento di cellule o tipi di cellule specifiche dalle sezioni tisssate dei semi di cereali, che possono essere applicate alla maggior parte delle cellule che possono essere identificate istologicamente. LCM fornisce un metodo senza contatto di isolamento cellulare, riducendo notevolmente la contaminazione e aumentando l'integrità dell'RNA recuperato. Inoltre, il metodo illustra la potenza della ML su larga scala su studi su tutto il genoma a partire da piccole quantità di materiali biologici. Descriviamo anche l'amplificazione lineare dell'RNA per generare materiale di input sufficiente per le analisi di trascrizione/trascrizione a valle.
Ci sono dieci passaggi principali in questo protocollo LCM RNA-seq per trascrittori spaziali e temporali specifici del tessuto, tra cui la fissazione di campioni di tessuto, disidratazione, infiltrazione di paraffina, incorporamento, sezionazione, LCM, estrazione dell'RNA, amplificazione dell'RNA, quantificazione dell'RNA e qRT-PCR e/o RNA-seq (Figura 1).
Figura 1: diagramma di flusso di LCM seguito da RNA-seq o qRT-PCR. LCM è una tecnica spazialmente precisa e senza contatto per raccogliere cellule da sezioni di tessuto fisse utilizzando un raggio laser sotto visualizzazione microscopica. Il processo inizia con la fissazione di campioni di tessuto, seguita da disidratazione utilizzando una serie di gradienti di etanolo e xylene, e finito con infiltrazione di paraffina. Il processo può essere completamente automatizzato utilizzando un processore di tessuto. Una volta che il tessuto è infiltrato con paraffina, è incorporato in uno stampo con paraffina fusa utilizzando una stazione di incorporamento. Il sessaggio viene eseguito utilizzando microtomo impostato allo spessore desiderato. I vetrini vengono preparati e LCM condotto immediatamente prima che l'RNA venga estratto dalle cellule catturate. L'estrazione dell'RNA è seguita direttamente da due cicli di amplificazione dell'RNA prima di qRT-PCR e/o RNA-seq. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Poiché il prodotto finale è l'RNA, fare attenzione a evitare di contaminare il lavoro con RNases. Indossare i guanti è un must. Utilizzare acqua trattata con dietile pirocarbonato (DEPC), tamponi, ecc. Tamponi autoclave e cuocere bicchieri prima dell'uso.
1. Fissazione dei tessuti
- Preparare il fissativo di scelta a seconda della specie e dei tipi di tessuto; per i semi d'orzo, utilizzare il fissativo del contadino (75% etanolo, 25% acido acetico glaciale (v/v)).
- Raffreddare il fissativo sul ghiaccio prima di raccogliere i tessuti.
- Raccogliere il materiale vegetale di interesse e, se necessario, sezionarlo in pezzi di dimensioni appropriate per adattarsi allo stampo di incorporamento selezionato. Per il seme d'orzo, tagliare il seme a metà longitudinalmente per aiutare la penetrazione della soluzione fissativa e per adattarsi allo stampo di incorporamento.
- Immergere il tessuto in almeno 10 volte il volume di fissativo ghiacciato. Per i semi d'orzo, immergere il seme tagliato a metà nel fissativo.
- Utilizzare l'infiltrazione sottovuoto per accelerare la penetrazione del fissativo. I tessuti dovrebbero affondare dopo l'infiltrazione sottovuoto del fissativo. Per il seme d'orzo, utilizzare 30 min di infiltrazione sottovuoto.
- Sostituire il fissativo e incubare a 4 gradi centigradi per consentire al fissativo di penetrare completamente nel tessuto. Per i semi d'orzo, incubare i campioni durante la notte (12-16 h).
NOTA: I tessuti più sottili o piccoli richiederanno tempi di fissazione più brevi a causa del più alto tasso di diffusione del fissativo nel tessuto. - Rimuovere il tessuto dal fissativo e trasferire il tessuto in cassette e quindi iniziare l'elaborazione del tessuto.
NOTA: Il tessuto piccolo o fragile, come il tessuto fogliare, può essere inserito in cassette per il fissaggio per garantire che non sia danneggiato durante la fissazione. Sacchetti di biopsia, pastiglie o involucri potrebbero essere utilizzati per tenere il tessuto in modo sicuro all'interno delle cassette durante la fissazione dei tessuti e le fasi di elaborazione dei tessuti.
2. Elaborazione dei tessuti
- Utilizzare un processore automatico di tessuti nel passaggio 2 con un minimo di 10 camere di soluzione e 2 camere di paraffina riscaldate (vedi Tabella dei materiali).
- Verificare che vi siano adeguate quantità di soluzione in ogni camera; sostituire le soluzioni dopo ogni pochi usi del processore dei tessuti.
- Mettere le cassette con tessuto nel cestello metallico. Fissare il cestello metallico al suo supporto sopra la camera 1. Il supporto ruoterà e "dunk e immergere" le cassette nelle camere, seguendo il programma designato.
- Impostare il programma eseguendo clic sui pannelli di controllo del processore del tessuto che comportano l'impostazione della durata per ogni camera.
- Premere il pulsante" Start" per avviare il programma di elaborazione. Il seguente programma è progettato per i semi d'orzo e funziona durante la notte (18 h)
- Eseguire la disidratazione immergendo la cassetta per 1 h 30 min ciascuno nella serie di gradienti di etanolo (75%, 85%, 100%, 100% e 100% (v/v) etanolo).
- Eseguire la compensazione utilizzando l'etanolo: gradiente di xylene per 1 h 30 min ciascuno a 75:25, 50:50, 25:75 (etanolo: xylene %, v/v). Quindi immergere la cassetta per 1 h 30 min ciascuno di 100% xylene poi 100% xylene.
- Eseguire l'infiltrazione di paraffina a 55-60 gradi centigradi per 1 h 30 min due volte in paraffina fusa.
NOTA: La temperatura delle camere di riscaldamento a paraffina può essere impostata sul retro del processore dei tessuti.
- La mattina successiva, rimuovere le cassette dal processore dei tessuti e procedere all'incorporamento di paraffina.
NOTA: il tempo di programma può variare tra diversi tipi di tessuto. Il vuoto e/o l'agitazione possono essere utilizzati durante l'elaborazione dei tessuti per accelerare l'infiltrazione di soluzioni selezionate premendo i pulsanti "V" e/o "agitazione" sul pannello di controllo del processore dei tessuti.
3. Incorporamento di paraffina
- Utilizzare una macchina di incorporamento in questo passaggio (vedere Tabella dei materiali).
- Preimpostare la macchina di incorporamento per accendere almeno un paio d'ore prima dell'incorporamento per consentire il tempo per la paraffina nei serbatoi di sciogliersi completamente.
- Accendere la piastra fredda prima di iniziare.
- Incorporare i campioni negli stampi tenendo i campioni in posizione utilizzando le fopando fini e erogando la paraffina fusa nello stampo. Garantire il corretto orientamento dei campioni per ogni scopo sperimentale. Per i semi d'orzo, orientare il seme longitudinale alla direzione di taglio per ottenere sezioni longitudinali.
NOTA: gli stampi di incorporamento sono disponibili in diverse dimensioni. Selezionare una dimensione appropriata per consentire il corretto inserimento e l'inserimento del campione. L'orientamento dei campioni deve essere considerato a seconda delle esigenze sperimentali. Se sono necessarie sezioni longitudinali, il campione deve essere orientato longitudinale alla direzione di taglio, mentre per le sezioni trasversali il campione deve essere orientato parallelamente alla direzione di taglio. - Posizionare una cassetta pulita sullo stampo e assicurarsi che una paraffina sufficiente copi completamente l'intera cassetta per tenere il campione sulla cassetta.
- Posizionare lo stampo sulla piastra fredda e lasciare che la paraffina si alisca completamente (10-20 min) prima di rilasciare il blocco dallo stampo.
- Procedere con la sezionazione o trasferire i blocchi a 4 gradi centigradi per lo stoccaggio.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I blocchi incorporati possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di tre mesi.
4. Preparazione di scivoli a membrana di naphthalate in polietilene (PEN)
- Immergere gli scivoli a membrana PEN nella soluzione di disattivazione RNase per 3 s seguita da due brevi lavaggi in acqua trattata dePC per rimuovere le rule sui vetrini. Asciugare i vetrini in un'incubatrice di 37 gradi per rimuovere la soluzione rimasta.
- UV-trattare i vetrini utilizzando una lampada UV in un cabinet di flusso laminare per 30 min per migliorare le proprietà idrofili per una migliore adesione paraffina.
5. Sezionazione
- Utilizzare un microtomo nel passaggio di sessazione (vedere Tabella dei materiali).
- Posizionare una nuova lama nel supporto del coltello, e tenere sempre la guardia coltello quando non sezionare attivamente
CAUTION: Le lame microtome sono estremamente affilate e possono causare danni significativi se trattate in modo inappropriato.
NOTA: Ci sono due meccanismi di bloccaggio sul microtome, uno è sul lato della macchina e l'altro è sulla maniglia della ruota. Entrambi devono essere impegnati quando non attivamente sezionare. - Regolare il blocco di coltello per essere il più vicino possibile al campione senza toccare. Assicurarsi che il braccio microtomo non entra mai in pieno contatto con il blocco di coltello in quanto ciò causerà danni strutturali catastrofici al microtome.
- Accendere la piastra fredda prima di iniziare. Mantenere i blocchi di paraffina sulla piastra fredda prima di sezionare e ri-raffreddare i blocchi quando necessario durante la sezionazione per evitare che i blocchi si ammorbidiscono.
- Riempire il bagno d'acqua con acqua trattata DEPC e riscaldare a 42 gradi centigradi prima di iniziare.
- Tagliare i blocchi alla profondità desiderata (dove la sezione che ti interessa) e i blocchi di paraffina di sezione allo spessore desiderato (6-10 m) utilizzando il microtomo; un blocco ben sezionato formerà un 'nastro' sul bordo della lama. Per i semi d'orzo, sezione con spessore di 8 m.
- Trasferire delicatamente i nastri dal microtomo al bagno d'acqua utilizzando pennello fine o forfettari fini, assicurando che il nastro sia piatto sulla superficie dell'acqua.
- Tenere uno scivolo ad un angolo di 45 gradi, utilizzando un movimento verso l'alto, sollevare un nastro dall'acqua sul scivolo e rimuovere con attenzione l'acqua in eccesso con un tessuto privo di lanugine.
- Asciugare gli scivoli per 30 minuti a 37 gradi centigradi per eliminare l'acqua rimanente sotto la paraffina.
- Procedere alla rimozione della paraffina o conservare a 4 gradi centigradi in una scatola chiusa in condizioni disidratante (da utilizzare entro diversi giorni).
- Rimuovere la paraffina lavando i vetrini 3x per 20 s ciascuno in xylene, seguita da 2x lavaggi di 30 s in etanolo 100% (v/v) e 2x lavaggi di 30 s in etanolo 70% (v/v).
- Procedere immediatamente alla microdissezione laser-cattura dopo la rimozione della paraffina.
NOTA: Il cryosectioning è un metodo alternativo che è stato accoppiato con successo con LCM. La preparazione del campione per la criosezione sarà diversa.
6. Microdissezione di cattura laser
- Utilizzare un microscopio a microscopia a cattura laser (vedi Tabella dei materiali) per microdissere le cellule da sezioni di tessuto de-paraffinato e essiccato.
- Caricare le diapositive sui tre slot disponibili.
- Utilizzare i tappi adesivo speciali dei tubi di raccolta per raccogliere i campioni catturati. L'acquisizione senza liquido (raccolta "a secco") riduce al minimo l'attività di RNase. Caricare i tubi di raccolta negli slot disponibili.
- Spostare lo stage per individuare l'area del campione da tagliare. Questo può essere fatto utilizzando il mouse o joystick della macchina LCM, o i tasti freccia sulla tastiera.
- Per ottimizzare la velocità di taglio, tagliare l'energia e la messa a fuoco, l'energia e la messa a fuoco della catapultamento della pressione laser (LPC), tagliare prima su un segmento vuoto privo di tessuto sullo scivolo a membrana. Per i semi d'orzo, velocità di taglio 18, CutEnergy - 52 CutFocus - 63, LPCEnergy - 78, messa a fuoco LPC - 61 a 10x ingrandimento.
NOTA: La messa a fuoco e l'energia di taglio devono essere regolate per diversi vetrini, tessuti diversi e area catturata, ma le regole generali sono che la potenza di catapulta è superiore alla potenza di taglio e il laser deve essere defocused per catapultare. Maggiore è l'ingrandimento della lente obiettivo, minore è la messa a fuoco del laser e maggiore è l'energia. - Utilizzare gli strumenti disegno per selezionare le celle delineando l'area di interesse.
- Selezionare la funzione RoboLPC dalla barra degli strumenti delle funzioni per catapultare le celle nei tappi adesive in base ai parametri ottimizzati ottenuti tagliando su un segmento nero sopra.
NOTA: i parametri LCM variano tra i tipi di tessuto, nonché lo spessore della sezione, la durezza del tessuto e le lenti oggettive. Pertanto, è meglio ottimizzare ogni diapositiva su una semplice area di membrana senza campione di tessuto prima di tagliare il campione effettivo. - Utilizzare gli strumenti Contrassegno per contrassegnare le aree di interesse per individuarle immediatamente selezionando tale contrassegno dall'elenco degli elementi.
- Controllare tramite il pulsante "CapCheck" per ispezionare il tappo adesivo per verificare che i campioni siano stati acquisiti. Tipicamente, LCM di 10-15 sezioni (200 cellule) per tappo è necessario per l'estrazione dell'RNA.
- Tenere i campioni catturati sul ghiaccio. Procedere immediatamente per l'estrazione dell'RNA per evitare la degradazione dell'RNA.
NOTA: Alcune microscopie LCM sono dotate di luce fluorescente che consente la cattura di cellule etichettate con marcatori fluorescenti.
7. Estrazione dell'RNA
- Utilizzare un kit di isolamento dell'RNA a basso input (vedere Tabella dei materiali) per l'estrazione dell'RNA dopo LCM. Tali kit sono progettati per recuperare costantemente RNA totale di alta qualità da meno di dieci cellule.
- Isolare l'RNA totale dai tipi di cellule catturate secondo le istruzioni del produttore, incluso il trattamento DNase su colonna.
NOTA: Il primo passo dell'estrazione dell'RNA in cui il tubo è invertito e sfarfallio è fondamentale per garantire che i campioni catturati sul coperchio siano a contatto con il buffer di estrazione aggiunto.
8. Amplificazione dell'RNA
- Utilizzare un kit di amplificazione antisense RNA (aRNA) (vedi Tabella dei Materiali) per l'amplificazione dell'aRNA dall'RNA estratto dalla trascrizione in vitro per produrre aRNA sufficiente per la sintesi della libreria RNA-seq.
- Eseguire due cicli di amplificazione utilizzando il kit di amplificazione aRNA secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: È importante preriscaldare il termo-ciclo e il coperchio alla temperatura istruita dal produttore del kit (vedi Tabella deimateriali ). Un approccio alternativo invece dell'amplificazione dell'RNA consiste nell'utilizzare un kit di preparazione della libreria a basso input per sintetizzare la libreria direttamente dall'RNA estratto.
9. Quantificazione dell'RNA
- Quantificare e qualificare l'ARNA utilizzando un sistema di elettroforesi automatizzato (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Un sistema di elettroforesi automatizzato è preferito in quanto richiede meno campioni (1-2 L) e fornisce un'immagine gel-like ed elettropherogramma per ogni singolo campione.
10. qRT-PCR e/o RNA-seq
- Sintetizzare cDNA dall'aRNA per qRT-PCR o per realizzare librerie RNA-seq utilizzando kit di libreria standard RNA-seq.
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Representative Results
Abbiamo generato trascrittori spaziali e temporali specifici del tessuto da semi d'orzo durante la germinazione utilizzando il nostro protocollo LCM RNA-seq10. Lo studio è stato condotto applicando LCM RNA-seq a un piccolo numero di cellule di tre organi embrionali (plumule, punta di radicolo, scutellum) ogni 8 h su un corso di tempo di 48 h durante la germinazione (0-48 h, 7 punti di tempo)(Figura 2A,B).
Figura 2: Celle raccolte da semi d'orzo da LCM. (A) Sezione longitudinale di un seme d'orzo e, inietti, un cartone animato ingrandito che indica le regioni da cui sono state catturate le cellule. Blu - plumule, magenta - radicolo, verde , scutellum. (B) LCM di plumule, radicolo e scutellum. Pannello superiore, tessuto prima della catapulta a pressione laser (LPC). Pannello inferiore, tessuto dopo LPC. Le cellule sono state catturate da 5 sezioni longitudinali consecutive di ogni campione con tre repliche biologiche per campione. Ogni replica consisteva di circa 200 celle (0,05 - 0,15 mm2 superficie totale). Bar : 100 m. E - endosperma, C - strato di cellule schiacciate, SE - epitelio scutellario, S - scutellum. Figura riprodotta dai dati precedenti in The Plant Journal con l'autorizzazione10. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La fissazione e l'incorporamento sono passaggi critici in quanto il campione di tessuto scarsamente fisso può causare danni ai tessuti e perdita di quantità e qualità dell'RNA. Questi passaggi devono essere ottimizzati e regolati per diverse specie e tipi ditessuto 19,20,21. Qui abbiamo usato l'infiltrazione sottovuoto per migliorare la penetrazione dei fissativi nei tessuti e nelle cellule del seme. La disidratazione e l'infiltrazione di paraffina vengono condotte gradualmente per evitare danni ai campioni di tessuto. Abbiamo accelerato l'intero processo di infiltrazione di disidratazione e paraffina utilizzando un processore di tessuto automatizzato con agitazione e vuoto applicato ad ogni passo. Questo riduce notevolmente il rischio di degradazione dell'RNA che si verifica durante le fasi prolungate di elaborazione del tessuto condotte da un operatore umano. Prima del sezionamento, è fondamentale trattare lo scivolo a membrana per garantire l'adesione della paraffina e per assicurarsi che sia privo di RNase. Se i vetrini della membrana non sono preparati correttamente, la sezione campione non aderisce alla membrana, il che influenzerà la fase di catapulta LCM e diminuirà il trasferimento del tessuto ai tappi adesivo perché il campione si separerà dalla membrana (vedere la figura 1).
Un altro passaggio critico nel protocollo LCM RNA-seq è l'ottimizzazione dei parametri LCM. Ci sono cinque parametri principali da ottimizzare: (1) velocità di taglio; (2) tagliare l'energia; (3) messa a fuoco di taglio; (4) Energia LPC; e (5) messa a fuoco LPC. È importante regolare correttamente i parametri di taglio per tagliare con precisione l'area selezionata e allontanarla dal tessuto circostante senza bruciare il bordo dell'area selezionata (Figura 3A,B). L'energia e la messa a fuoco LPC adeguate sono essenziali per catapultare in modo affidabile l'area selezionata dallo scivolo agli speciali tappi adesivi dei tubi di raccolta e ispezionare sempre i campioni catturati nei tappi per garantire la raccolta di materiale sufficiente (Figura 3C). L'efficienza di LCM consente di catturare 1000 cellule entro un'ora, riducendo notevolmente la probabilità di degradazione dell'RNA durante l'elaborazione del campione. L'uso di tubi di raccolta con tappi adesiva consente la raccolta "asciutta" senza alcun liquido di cattura, riducendo notevolmente le possibili attività RNases. È importante mantenere i campioni catturati sul ghiaccio e fare l'estrazione dell'RNA subito dopo aver raccolto tutte le repliche.
L'estrazione e l'amplificazione dell'RNA vengono effettuate utilizzando kit disponibili in modo commerciale seguendo le istruzioni dei produttori. La quantificazione dell'RNA totale prima dell'amplificazione dell'RNA utilizzando il sistema di elettroforesi automatico rileverà bande elettroforetiche distinte e picchi fluorescenti di sottounità 18S e 28S ribosomi in campioni di RNA di buonaqualità (Figura 3D). Ulteriori picchi corrispondenti al cloroplasto e all'RNA ribosomico mitocondriale si trovano prima dei picchi di 18S e 28S. A causa di più picchi di RNA nelle specie vegetali, i valori RIN (RNA Integrity Number) sono in genere inferiori a 9 (il valore RIN previsto dai tessuti dei mammiferi) e non riflettono con precisione l'integrità dell'RNA22. È opportuno continuare ad amplificare l'RNA quando i picchi 18S e 28S sono visibili senza segni di degradazione dell'RNA. La quantità di RNA recuperata nel nostro esperimento sui semi d'orzo variava tra tre diversi tipi di tessuto (plumule, radicolo e scutellum) e, anche tra le prime e le ultime fasi della germinazione, nonostante il numero approssimativamente uguale di cellule raccolte. Le quantità di semi d'orzo variavano da 100 pg a 20 ng da circa 200 celle (da 0,5 a 100 pg per cellula). La quantità minima di RNA di ingresso raccomandata per l'amplificazione dell'RNA era di 100 pg. La quantità di RNA estratta dipende dall'efficienza dell'estrazione da diverse cellule raccolte e dall'abbondanza totale di trascrizione nel particolare tipo di cellula in quella fase dellosviluppo 19,21. È utile considerare questo quando si pianifica un esperimento LCM RNA-seq, anche se tali informazioni precedenti non saranno disponibili in tutti i casi.
L'ARNA sintetizzato con successo esporrà una distribuzione di dimensioni unimodali e simmetriche da 100 a 1000 nucleotidi con un picco di circa 300 nucleotidi dopo due cicli di amplificazione (Figura 3E). Nel nostro esperimento sui semi d'orzo, abbiamo ottenuto da 500 pg a 2 g di aRNA dopo due cicli di amplificazione dell'RNA10. Il confronto tra RNA amplificato e non amplificato ha dimostrato che l'amplificazione dell'RNA è riproducibile, lineare e non introduce una distorsione sistematica ai dati ditrascrizione 23,24,25. L'aRNA di uscita può essere utilizzato per qRT-PCR e/o RNA-seq per l'analisi dell'espressione genica spaziale e temporale specifica del tessuto. La convalida dopo l'RNA-seq deve essere condotta per corroborare i risultati dell'analisi dell'aRNA. Questo può essere fatto esaminando l'espressione dei geni marcatori di tipo cellulare dai dati RNA-seq utilizzando l'RNA nell'ibridazione in situ.
Figura 3: Risultato rappresentativo di LCM. (A) Tessuto dopo il taglio con la corretta energia di taglio e messa a fuoco. Una linea sottile chiara può essere visto dove il taglio è stato fatto. L'area selezionata verrà sloggiata dai materiali circostanti. Barra - 100 m. (B) Tessuto dopo il taglio con energia di taglio e messa a fuoco non corretta. L'area selezionata è ancora collegata ai materiali circostanti. Barra - 100 m. (C) Esame delle cellule catturate in speciali tappi adesivo di tubi di raccolta. Barra - 100 m. (D) Un esempio di profilo totale di RNA prima dell'amplificazione dell'RNA (immagine a sinistra, gel; a destra, elettrofrastoriogramma) con bande elettroforetiche distinte e picchi fluorescenti di sottounità 18S e 28S ribosomica. I picchi senza etichetta corrispondono a RNA ribosomico aggiuntivo, tra cui cloroplasto e ribosomi mitocondriali. (E) Un esempio di un tipico profilo aRNA dopo l'amplificazione dell'RNA (a sinistra, immagine gel-like; destra, elettropherogramma). È stata rilevata una distribuzione di dimensioni da 100 a 1000 nucleotidi, con un picco di circa 300 nucleotidi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le analisi RNA-seq sono state eseguite su tutti i campioni in triplicati biologici. Un grafico di ridimensionamento multidimensionale (MDS) di geni espressi nei diversi tessuti oltre i 48 h di germinazione illustra una maggiore somiglianza tra i campioni di un singolo tessuto rispetto ai campioni dello stesso punto di tempo, ma di tessuti diversi(Figura 4A). Abbiamo poi stabilito come l'espressione genica sia stata regolata in modo differenziale nei singoli tessuti nel tempo durante la germinazione. Il numero di geni espressi in modo differenziale (DEG) è aumentato progressivamente nel corso della germinazione in ciascun tessuto, rispetto al punto di tempo 0 h di tale tessuto (Figura 4B). Il 25% (910) di plumule, il 34% (1876) di radicella e il 41% (2562) dei DEG scutellum sono risultati espressi esclusivamente in modo differenziale in tale tessuto (cioè, questi geni non sono stati espressi in modo differenziale negli altri tessuti, Figura 4C). Nel loro insieme, questi risultati dimostrano come l'RNA-seq LCM possa essere utilizzato per comprendere l'espressione genica temporale e spaziale durante lo sviluppo delle piante.
Figura 4: Analisi delle librerie di RNA di campioni di LCM che mostrano una netta separazione di diversi tessuti oltre i 48 h di germinazione dell'orzo. (A) Grafico di scala multidimensionale (MDS) di geni espressi nei diversi tessuti oltre i 48 h di germinazione. Ogni punto rappresenta 1 campione e la distanza tra 2 punti riflette la variazione di piegatura del tronco iniziale (FC) dei campioni di RNA corrispondenti. Gli assi x, y e z rappresentano il logFC di primo, secondo e terzo formato. P - plumule, R - radicolo, S - scutellum, 0-48h - h di germinazione, R1-3 - Replicare 1-3. (B) Numero di geni significativi su-regolati (rosso) e down-regolati (blu) espressi in modo differenziale (DEG) per sei punti di tempo rispetto al punto di tempo 0 h per tre tipi di tessuto. (C) Diagramma di Venn che mostra il numero di DEG in tre tipi di tessuto. I geni nei set sovrapposti mostrano l'espressione differenziale in due o tre tipi di tessuto. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Molti studi sull'espressione genica specifici dei tessuti sono stati limitati dalla dissezione manuale di campioni, che richiede molto tempo e richiede lavoro, ha un alto rischio di contaminazione e può utilizzare solo campioni che un operatore umano è sufficientemente abile da raccogliere. LCM è una tecnica precisa e senza contatto per raccogliere cellule da sezioni di tessuto fisse utilizzando un raggio laser azionato meccanicamente sotto visualizzazione microscopica.
Una buona preparazione del campione è fondamentale per LCM. Il processo si basa su una corretta fissazione e incorporazione di campioni per mantenere un buon equilibrio tra morfologia dei tessuti e integrità dell'RNA. Il protocollo qui presentato fornisce misure di fissaggio e incorporamento ottimizzate per i semi d'orzo che includono tempi di fissaggio più lunghi e infiltrazione sottovuoto di fissativi. L'analisi di diversi tessuti o specie richiederà l'ottimizzazione delle condizioni, in quanto queste differiscono tipicamente tra i tessuti. Un altro aspetto importante di questo protocollo è la fase di amplificazione dell'RNA che garantisce la produzione di quantità sufficienti di RNA per la costruzione della libreria RNA-seq. Troviamo che l'amplificazione dell'RNA si traduce in librerie di alta qualità, ma in alternativa i metodi di preparazione della libreria di input basso potrebbero essereimpiegati 25. L'identificazione istologica delle cellule bersaglio è un passo fondamentale nel nostro metodo e può fornire sfide per i tipi di cellule rari o scarsamente caratterizzati. Il riconoscimento delle cellule target può essere migliorato utilizzando macchie itologiche tradizionali o macchie di immunofluorescenza come parte della fase di pre-elaborazione o, in alternativa, utilizzando linee transgeniche che esprimono marcatori fluorescenti etichettati in modo fluorescente26,27.
La tecnica LCM è stata sviluppata per essere utilizzata su campioni di origine animale per l'analisi della trascrizione specifica del tipo di cellula1. Tuttavia, è stata successivamente sviluppata un'ampia gamma di analisi genomiche, proteomiche ed epigenetiche. Adattare questi metodi per l'applicazione negli studi biologici vegetali è una sfida continua18,19,20,28. Schad et al. ha dimostrato che le proteine e i metaboliti dei fasci vascolari Arabidopsis potrebbero essere analizzati utilizzando LCM con elettroforesi gel 2D e spettrometria di massa29,30. Recentemente, Latrasse et al. ha effettuato l'analisi di immunoprecipitation cromatina (ChIP)-qPCR su stami e carpelli sezionati da LCM utilizzando LCM, stabilendo che l'omogeneità dei tessuti migliora la risoluzione degli eventi epigenetici specificidelle cellule 31. Turco et al. ha anche accoppiato LCM con sequenziamento bisulfite per studiare gli eventi di metilazione del DNA durante la vascolarizzazione nel sorgo, evidenziando la differenza tissunte-specifica tra i tessuti vascolari e nonvascolari 32. È interessante notare che, diversi studi hanno applicato LCM per esplorare le interazioni pianta-microbo e pianta-patogeno33,34,35. La capacità di LCM di visualizzare e catturare le cellule in diverse fasi di infezione ha fornito informazioni sulle risposte spaziali e temporali delle cellule infette.
Il nostro protocollo LCM abbinato all'RNA-seq qui presentato faciliterà la profilazione globale spatio-temporale dell'espressione genica di tipi di cellule distinte. Con metodi di purificazione migliorati per la cromatina e le proteine insieme a strumenti di spettrometria di massa migliorati, LCM sarà uno strumento emergente per facilitare gli studi epigenomici e proteomici specifici del tipo di cellule nelle piante.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) a JW. M.G.L è stato sostenuto da una sovvenzione di partenza dell'Università di La Trobe. Ringraziamo la piattaforma Genomica La Trobe per il loro supporto nel sequenziamento ad alta velocità effettiva e nell'analisi dei dati. Ringraziamo il Professore Associato Matthew Tucker per la consulenza di esperti su come stabilire LCM nel nostro laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
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