Summary
Здесь представлен протокол для лазерного захвата микродиссекции (LCM) тканей растений. LCM является микроскопическим методом для изоляции областей ткани в без загрязнения образом. Процедура включает фиксацию тканей, встраивание парафина, секциоирование, LCM и экстракцию РНК. РНК используется в ниже по течению ткани конкретных, временно решенный анализ транскриптомов.
Abstract
Развитие сложного многоклеточного организма регулируется отдельными типами клеток, которые имеют различные транскрипционные профили. Для выявления транскрипционных регуляторных сетей, регулирующих процессы развития, необходимо измерить пространственные и временные профили экспрессии генов этих отдельных типов клеток. Таким образом, понимание пространственно-временного контроля экспрессии генов имеет важное значение для получения понимания того, как регулируются биологические процессы и процессы развития. Здесь мы описываем метод микродиссекции лазерного захвата (LCM), чтобы изолировать небольшое количество клеток из трех органов эмбриона ячменя в течение времени во время прорастания с последующим профилированием стенограммы. Метод состоит из фиксации тканей, обработки тканей, встраивания парафина, секций, LCM и извлечения РНК с последующим ПЦР или РНК-сек в режиме реального времени. Этот метод позволил нам получить пространственные и временные профили транскрипций органов семян из различных количеств клеток (десятки и сотни), обеспечивая гораздо большую специфичность тканей, чем типичные анализы навалочных тканей. На основе этих данных мы смогли определить и сравнить транскрипционные регуляторные сети, а также предсказать факторы транскрипции кандидатов для отдельных тканей. Метод должен применяться к другим тканям растений с минимальной оптимизацией.
Introduction
Развитие и рост растений связаны с скоординированным действием транскрипционных регуляторных сетей в различных клетках, которые существуют в сложной клеточной среде. Чтобы понять активность этих регулятивных сетей, нам необходимы знания пространственной и временной экспрессии генов в различных типах клеток на разных стадиях развития. Однако анализ экспрессии генов чаще проводится в образцах целых органов или навалочных тканей из-за технической проблемы изоляции и анализа небольшого количества клеток. Метод, который мы описываем здесь, позволил получить анализ транскриптома пространственной и височной ткани путем соединения LCM с РНК-сек.
LCM был разработан два десятилетия назад Эммерт-Бак и его коллеги1. Техника позволила исследователям точно изолировать однокамеры или кластеры клеток из окружающей среды с помощью прямой микроскопической визуализации и манипуляции с помощью узкого лучалазера 1. С тех пор метод широко используется в биологии рака и патологии2,3. Многие исследовательские группы растений также адаптировали LCM для использования с различными видамирастений и различными типами тканей 4,,5,,6,,7,,8,,9,,10,,11. В последнее время несколько работ также использовали LCM на eudicot и семена монокота для изучения эмбрионов, эндоспермов и других структур семян во время развития семяни прорастания 10,12,13. Большинство других широко используемых одноклеточных методов изоляции, таких как микро-пипеттинг, сортировка клеток, магнитное разделение и микрофлюидные платформы, зависят от энзиматического пищеварения или механической гомогенизации для диссоциации клеток. Это может возмутить экспрессию генов, вводя технические артефакты, которые путаютинтерпретацию данных 14,,15. Эти методы также требуют, чтобы предыдущие знания маркерных генов для каждого типа клеток соотносить диссоциированные клетки с их пространственным расположением и истинным типом клеток. Дальнейшая группа методов зависит от сродства на основе изоляции подклеточных структур, а не целые клетки, например INTACT (Изоляция ядер, отмеченных в типах клеток) и TRAP (Перевод Рибосома Аффинити Очистка)16,17. Тем не менее, сродство маркировки и очистки ядер или рибосом являются технически сложными в видов растений, которые не имеют устоявшихся протоколов трансформации. LCM использует быструю фиксацию тканей для сохранения уровней транскрипции и обычной гистологической идентификации путем прямой визуализации клеток в пределах их нормальной ткани / органа контексте, что позволяет дискретных клеток, которые будут изолированы в течение короткогопериода времени 18,19.
Протокол, представленный здесь, представляет 100-й метод изоляции конкретных клеток или типов клеток от тканевых секций семян зерновых, которые могут быть применены к большинству клеток, которые могут быть гисто логически идентифицированы. LCM предоставляет бесконтактный метод изоляции клеток, значительно снижая загрязнение и повышая целостность восстановленной РНК. Кроме того, метод иллюстрирует силу LCM на крупномасштабных исследованиях генома, начиная с небольших количеств биологических материалов. Мы также описываем линейное усиление РНК для генерации достаточного входного материала для анализа стенограммы/транскриптома ниже по течению.
Есть десять основных шагов в этом LCM РНК-сек протокол для пространственной и височной ткани конкретных транскриптомов, в том числе фиксации образцов тканей, обезвоживание, парафин инфильтрации, встраивания, секционирования, LCM, РНК экстракции, РНК усиления, РНК количественной оценки и qRT-PCR и / или РНК-сек (Рисунок 1).
Рисунок 1: Flowchart LCM следуют РНК-сек или qRT-PCR. LCM является пространственно точным и бесконтактной техникой для сбора клеток из фиксированных секций тканей с помощью лазерного луча под микроскопической визуализацией. Процесс начинается с фиксации образцов тканей, а затем обезвоживания с использованием градиента серии этанола и ксилена, и закончил с парафином инфильтрации. Процесс может быть полностью автоматизирован с помощью процессора ткани. После того, как ткань проникли с парафином, он встроен в форму с расплавленным парафином с помощью встраивания станции. Раздел осуществляется с использованием микротома, установленного до нужной толщины. Слайды готовятся и LCM проводится непосредственно перед РНК должна быть извлечена из захваченных клеток. Добыча РНК сопровождается непосредственно двумя раундами усиления РНК до qRT-PCR и/или РНК-сек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Поскольку конечный продукт РНК, заботиться, чтобы избежать загрязнения работы с RNases. Ношение перчаток является обязательным. Используйте дитил пирокарбонат (DEPC) - обработанную воду, буферы и т.д. Буферы автоклава и выпекать стеклянную посуду перед использованием.
1. Фиксация тканей
- Подготовка фиксации выбора в зависимости от видов и типов тканей; для семян ячменя используйте фиксатор фермера (75% этанола, 25% ледниковой уксусной кислоты (v/v)).
- Охладите фиксатор на льду до сбора тканей.
- Соберите растительный материал, представляющий интерес, и при необходимости рассектете его на кусочки соответствующего размера, чтобы вписаться в выбранную встраиваемую форму. Для семян ячменя, разрезать семена на половину продольно, чтобы помочь проникновению фиксаторного раствора и вписаться в встраивание формы.
- Погрузим ткань по крайней мере в 10-х объем ледяной фиксатор. Для семян ячменя, погрузить семена разрезать на половину в фиксатор.
- Используйте вакуумную инфильтрацию для ускорения проникновения фиксатора. Ткани должны тонуть после вакуумной инфильтрации фиксатора. Для семян ячменя используйте 30 мин вакуумного инфильтрации.
- Замените фиксатор и инкубировать при 4 градусов по Цельсию, чтобы позволить фиксатору полностью проникнуть в ткань. Для семян ячменя инкубировать образцы на ночь (12-16 ч).
ПРИМЕЧАНИЕ: Тоньше или малых тканей потребуется меньше времени фиксации из-за более высокой скорости диффузии фиксации в ткани. - Удалить ткани из фиксатора и передачи ткани в кассеты, а затем начать обработку тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Малые или хрупкие ткани, такие как лист ткани, могут быть помещены в кассеты для фиксации, чтобы убедиться, что он не поврежден во время фиксации. Биопсия мешки, прокладки или обертывания могут быть использованы для проведения ткани надежно внутри кассеты во время фиксации тканей и ткани обработки шагов.
2. Обработка тканей
- Используйте автоматизированный процессор ткани в шаге 2 с минимум 10 камерами раствора и 2 нагретыми парафин-камерами (см. таблицу материалов).
- Убедитесь, что в каждой камере имеется достаточное количество растворов; заменить решения после каждых нескольких применений процессора тканей.
- Поместите кассеты с тканью в металлическую корзину. Прикрепите металлическую корзину к держателю над камерой 1. Держатель будет вращаться и "замочить и окунуть" кассеты в камеры, следуя назначенной программе.
- Установите программу, выполняя кнопку нажатия на панели управления процессора ткани, которые включают в себя установление продолжительности времени для каждой камеры.
- Нажмите кнопку«Старт»,чтобы начать программу обработки. Следующая программа предназначена для семян ячменя и работает на ночь (18 ч)
- Выполните обезвоживание, окунув кассету в течение 1 ч 30 мин каждый в градиентной серии этанола (75%, 85%, 100%, 100%, и 100% (v/v) этанола).
- Выполните очистку с использованием этанола: ксиленый градиент по 1 ч 30 мин каждый в 75:25, 50:50, 25:75 (этанол: ксилен%, в/в). Затем опустите кассету на 1 ч 30 мин каждый из 100% ксилена, то 100% ксилена.
- Выполните фильтрацию парафина при 55-60 градусов по Цельсию в течение 1 ч 30 мин дважды в расплавленном парафине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура камер парафинового нагревателя может быть установлена в задней части процессора ткани.
- На следующее утро снимите кассеты с процессора тканей и приступайте к встраиванию парафина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время программы может варьироваться между различными типами тканей. Вакуум и/или агитация могут быть использованы во время обработки тканей для ускорения проникновения выбранных растворов, нажавкнопки «V»и/или«агитация»на панели управления процессора ткани.
3. Парафин встраивание
- Используйте встраивающий машину на этом этапе (см. таблицу материалов).
- Предустановка встраивания машины, чтобы включить по крайней мере за несколько часов до встраивания, чтобы время для парафина в резервуарах, чтобы расплавиться полностью.
- Включите холодную тарелку перед началом.
- Вставлять образцы в формы, удерживая образцы в положении, используя тонкие типсы и дозирования расплавленного парафина в форму. Обеспечить надлежащую ориентацию образцов для каждого экспериментального назначения. Для семян ячменя, сориентировать семена продольные к направлению резки для получения продольных секций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Встраивание формы бывают разных размеров. Выберите соответствующий размер, чтобы позволить правильно расположенную и встроенную выборку. Ориентация образцов должна быть рассмотрена в зависимости от экспериментальных потребностей. При необходимости продольных секций образец должен быть ориентирован продольно в направлении резки, в то время как для поперечных секций образец следует ориентировать параллельно направлению резки. - Поместите чистую кассету на форму и убедитесь, что достаточный парафин полностью покроет всю кассету, чтобы держать образец на кассете.
- Поместите форму на холодную тарелку и дайте парафину установить полностью (10-20 мин), прежде чем освободить блок от плесени.
- Приступайте к разделу или передаче блоков на 4 градуса Цельсия для хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Встроенные блоки могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение трех месяцев.
4. Подготовка полиэтиленовых нафтхалат (ПЕН) мембранных слайдов
- Погружение ПЕН мембраны слайды в RNase деактивации раствора для 3 с следуют две краткие моет в DEPC-обработанной воды для удаления RNases на слайдах. Высушите слайды в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, чтобы удалить оставшийся раствор.
- УФ-обработать слайды с помощью УФ-лампы в шкафу ламинарного потока в течение 30 минут для повышения гидрофильных свойств для улучшения парафина адгезии.
5. Секция
- Используйте микротом в секционные шаг (см. Таблицу материалов).
- Поместите новое лезвие в держатель ножа, и всегда держать нож охранник, когда не активно секции
ВНИМАНИЕ: Лезвия микротомы чрезвычайно острые и могут причинить значительный вред при ненадлежащем использовании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два механизма блокировки на микротоме, один находится на стороне машины, а другой на ручке колеса. Оба должны быть вовлечены, когда не активно секций. - Отрегулируйте блок ножа, чтобы быть как можно ближе к образцу, насколько это возможно, не касаясь. Убедитесь, что микротома рука никогда не вступает в полный контакт с ножом блок, как это приведет к катастрофическим структурным повреждением микротомы.
- Включите холодную тарелку перед началом. Держите парафиновые блоки на холодной пластине перед секцией и переохлаждать блоки, когда это необходимо во время секции, чтобы предотвратить размягчение блоков.
- Заполните водяную баню водой, обработанной DEPC, и нагрейте до 42 градусов по Цельсию до начала.
- Обрезка блоков до нужной глубины (где секция вас интересует) и секционные парафиновые блоки при желаемой толщине (6-10 мкм) с использованием микротомы; хорошо срезаемый блок сформирует 'риббон' на краю лезвия. Для семян ячменя, раздел с толщиной 8 мкм.
- Аккуратно перенесите ленты из микротома на водяную баню с помощью тонкой кисти краски или тонкой типса, гарантируя, что лента плоская на поверхности воды.
- Держите слайд под углом 45 градусов, используя восходящее движение, поднимите ленту из воды на горку и аккуратно удалите излишки воды с помощью ткани, свободной от ворса.
- Сухие горки в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию, чтобы устранить оставшиеся воды под парафином.
- Приступить к удалению парафина или хранить при 4 градусов по Цельсию в закрытой коробке в условиях обезвоживания (для использования в течение нескольких дней).
- Удалить парафин путем мытья слайдов 3x для 20 с каждый в ксилен, а затем 2x моет 30 с в 100% (V / V) этанола и 2x моет 30 с в 70% (V / V) этанола.
- Немедленно приступайте к микроразливу захвата лазера после удаления парафина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Cryosectioning является альтернативным методом, который был успешно в сочетании с LCM. Пример подготовки к криозеции будет отличаться.
6. Лазерная захвата микродиссекции
- Используйте микроскоп микродиссекции с лазерным захватом (см. таблицу материалов)для микродиссекции клеток из депаафинизированных и высушенных секций тканей.
- Загрузите слайды на трех доступных слотах.
- Используйте специальные клеевые колпачки коллекционные трубки для сбора взятых образцов. Захват без жидкости ("сухой" сбор) сводит к минимуму активность RNase. Загрузите трубки коллекции в доступные слоты.
- Переместите этап, чтобы найти область выборки, которая должна быть сокращена. Это можно сделать с помощью мыши или джойстика машины LCM, или клавиши стрелки на клавиатуре.
- Для оптимизации скорости резки, резки энергии и фокусировки, лазерного давления катапультирования (LPC) энергии и фокуса, сначала вырезать на пустой сегмент, свободный от ткани на мембране слайда. Для семян ячменя, скорость резки No 18, CutEnergy No 52 CutFocus 63, LPCEnergy 78, LPC фокус No 61 при 10x увеличении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Резка фокус и энергии должны быть скорректированы для различных слайдов, различных тканей, и захватили области, но общие правила катапультирования власти выше, чем режущей мощности и лазер должен быть дефокусирован для катапультирования. Чем выше увеличение объектива цели, тем меньше фокус лазера и тем выше энергия. - Используйте инструменты рисования для выбора ячеек, описывая область интереса.
- Выберите функцию RoboLPC от панели инструментов функции до катапультных ячеек в клеевые колпачки на основе оптимизированных параметров, полученных путем резки на черном сегменте выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры LCM различаются между типами тканей, а также толщиной сечения, твердостью тканей и объективными линзами. Таким образом, лучше всего оптимизировать каждый слайд на простой мембранной области без образца ткани, прежде чем резки фактического образца. - Используйте инструменты Флага, чтобы отметить области, представляющие интерес, чтобы найти их немедленно, выбрав этот флаг из списка элементов.
- Проверьтекнопку "CapCheck",чтобы проверить клеевую крышку, чтобы подтвердить, что образцы были захвачены. Как правило, LCM из 10-15 секций (200 клеток) на крышку требуется для извлечения РНК.
- Храните взятые образцы на льду. Немедленно приступайте к экстракции РНК, чтобы избежать деградации РНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые LCM микроскопии оснащены флуоресцентным светом, который позволяет захвата клеток помечены флуоресцентными маркерами.
7. Добыча РНК
- Используйте комплект для извлечения РНК с низким входом (см.таблицу материалов) для извлечения РНК после LCM. Такие наборы предназначены для восстановления высококачественной общей РНК последовательно из менее чем десяти клеток.
- Изолировать общую РНК от захваченных типов клеток в соответствии с инструкциями производителя, включая на колонке DNase лечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первый шаг извлечения РНК, где трубка инвертирована и щелкнул имеет решающее значение для обеспечения захваченных образцов на крышке находятся в контакте с буфером извлечения добавил.
8. Усиление РНК
- Используйте набор усиления антисенсейной РНК (аРНК) (см. таблицу материалов) для усиления РНК из РНК, извлеченной с помощью транскрипции in vitro, для получения достаточного количества аРНК для синтеза библиотеки РНК-сек.
- Выполните два раунда усиления с помощью комплекта усиления аРНК в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно разогреть термо-циклер и крышку до температуры, проинструктированные производителем комплекта (см. Таблицуматериалов). Альтернативный подход вместо усиления РНК заключается в использовании комплекта подготовки библиотек с низким вводом для синтеза библиотеки непосредственно из извлеченной РНК.
9. Количественная оценка РНК
- Количественная оценка и квалификация аРН С помощью автоматизированной системы электрофореза (см. таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированная система электрофореза является предпочтительной, поскольку она требует меньше образцов (1-2 йл) и обеспечивает гель-как изображение и электроферограмма для каждого отдельного образца.
10. qRT-PCR и/или РНК-сек
- Синтезировать cDNA из аРН для qRT-PCR или сделать РНК-сек библиотеки с использованием стандартных наборов библиотеки РНК-сек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы создали пространственные и временные ткани конкретных транскриптомов из семян ячменя во время прорастания с помощью нашего LCM РНК-сек протокол10. Исследование было проведено путем применения LCM РНК-сек на небольшое количество клеток из трех органов эмбриона (слив, кончик радикула, scutellum) каждые 8 ч в течение 48 ч время курса во время прорастания (0-48 ч, 7 точек времени) (Рисунок 2A,B).
Рисунок 2: Клетки, собранные из семян ячменя LCM. (A)Продольное поперечное сечение семян ячменя и, вставка, увеличенный мультфильм, указывающий на регионы, из которых были захвачены клетки. Синий - слив, пурпурный - радикул, зеленый - scutellum. (B)LCM из оперения, радикула и скутеллума. Верхняя панель, ткань перед катапультирование лазерного давления (LPC). Нижняя панель, ткань после LPC. Клетки были захвачены из 5 последовательных продольных секций каждого образца с тремя биологическими репликациями на образец. Каждая репликация состояла примерно из 200 ячеек (0,05 - 0,15 мм2 общей площади). Бар No 100 мкм. E - эндосперм, C - измельченный клеточный слой, SE - скутеллий эпителий, S - scutellum. Рисунок воспроизводится из предыдущих данных в журнале завода с разрешения10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Фиксация и встраивание являются критическими шагами, так как плохо зафиксированный образец ткани может привести к повреждению тканей и потере количества и качества РНК. Эти шаги должны быть оптимизированы и скорректированы для различных видов итипов тканей 19,,20,,21. Здесь мы использовали вакуумное проникновение для улучшения проникновения фиксаторов в семенные ткани и клетки. Обезвоживание и проникновение парафина проводятся постепенно, чтобы избежать повреждения образцов тканей. Мы ускорили весь процесс обезвоживания и фильтрации парафина с помощью автоматизированного процессора тканей с возбуждением и вакуумом, применяемых на каждом шагу. Это значительно снижает риск деградации РНК, происходящих в течение длительных этапов обработки тканей, проводимых человеком оперативного. Перед разделом, очень важно для лечения мембраны слайд для обеспечения парафина адгезии и убедиться, что это RNase бесплатно. Если мембранные слайды не подготовлены должным образом, образец секции не будет придерживаться мембраны, что повлияет на шаг катапультирования LCM и уменьшить передачу тканей в клеевые колпачки, потому что образец будет отделяться от мембраны (см. Рисунок 1).
Другим важным шагом в протоколе LCM RNA-seq является оптимизация параметров LCM. Существует пять основных параметров, которые необходимо оптимизировать: (1) скорость резки; (2) сокращение энергии; (3) режущие фокусировки; (4) энергия LPC; и (5) LPC фокус. Важно правильно отрегулировать режущие параметры, чтобы точно вырезать выбранную область и выбить из окружающих тканей, не сжигая край выбранной области(рисунок 3A,B). Надлежащая энергия и фокус LPC необходимы для надежной катапульты выбранной области от слайда до специальных клеевых колпачков коллекторских трубок, и всегда осматривают захваченные образцы в колпачках, чтобы обеспечить сбор достаточногоколичества материала (рисунок 3C). Эффективность LCM позволяет 1000 клеток быть захвачены в течение одного часа, что значительно снижает вероятность деградации РНК во время обработки образцов. Использование коллекторских трубок с клеевыми колпачками позволяет «сухой» сбор без захвата жидкости, что значительно снижает возможную деятельность RNases. Важно сохранить захваченные образцы на льду и сделать добычу РНК сразу после сбора всех репликаций.
Добыча и усиление РНК осуществляется с использованием коммерчески доступных комплектов, следуя инструкциям производителей. Количественная оценка общей РНК до усиления РНК с помощью автоматизированной системы электрофореза позволит обнаружить различные электрофоретические полосы и флуоресцентные пики 18S и 28S рибосомных подразделений в образцах РНК хорошего качества(рисунок 3D). Дополнительные пики, соответствующие хлоропласту и митохондриальной рибосомной РНК, будут обнаружены до пиков 18S и 28S. Из-за нескольких пиков РНК в видах растений, значения RIN (RNA Integrity Number), как правило, ниже 9 (ожидаемое значение RIN от тканей млекопитающих) и не точно отражают целостностьРНК 22. Целесообразно продолжать усиление РНК, когда ясные пики 18S и 28S видны без признаков деградации РНК. Количество РНК, восстановленное в нашем эксперименте семян ячменя, варьировалось между тремя различными типами тканей (слив, радикул и скутеллум), а также между ранними и поздними стадиями прорастания, несмотря на примерно равное количество собираемых клеток. Количество семян ячменя варьировалось от 100 пг до 20 нг от приблизительно 200 клеток (от 0,5 до 100 пг на клетку). Минимальный объем входной РНК, рекомендованный для усиления РНК, составил 100 пг. Количество извлеченной РНК зависит от эффективности извлечения из различных собранных клеток и общего изобилия транскрипта в конкретном клеточном типе наданном этапе развития 19,,21. Полезно учитывать это при планировании эксперимента LCM RNA-seq, хотя такая предварительная информация будет доступна не во всех случаях.
Успешно синтезированная аРНА будет работать unimodal, симметричное распределение размера от 100 до 1000 нуклеотидов с пиком около 300 нуклеотидов после двух раундов усиления (Рисунок 3E). В нашем эксперименте семян ячменя, мы получили от 500 пг до 2 мкг РНК после двух раундов усиления РНК10. Сравнение усиленной и неукрепляемой РНК показало, что усиление РНК воспроизводимо, линейно и не вводит систематического смещения к даннымстенограммы 23,,24,,25. Выходная аРН может быть использована для анализа экспрессии генов qRT-PCR и/или РНК-сек для анализа пространственной и височной ткани. Проверка после РНК-сек должна быть проведена для подтверждения результатов анализа аРНК. Это можно сделать путем изучения экспрессии генов маркеров клеточного типа из данных РНК-сек с использованием РНК на месте гибридизации.
Рисунок 3: Репрезентативный результат LCM. (A)Ткань после резки с надлежащей резки энергии и фокусировки. Четкая тонкая грань можно увидеть, где разрез был сделан. Выбранный район будет выбит из окружающих материалов. Бар No 100 мкм.(B) Ткань после резки с неправильным резки энергии и фокуса. Выбранный район по-прежнему связан с окружающими материалами. Бар No 100 мкм.(C)Изучение захваченных клеток в специальных клеевых колпачках коллекторских трубок. Бар No 100 мкм.(D)Пример общего профиля РНК перед усилением РНК (слева, гелеобразное изображение; справа, электроферограмма) с различными электрофоретическими полосами и флуоресцентными пиками 18S и 28S рибосомных подразделений. Неоцеливные пики соответствуют дополнительной рибосомной РНК, включая хлоропласт и митохондриальные рибосомы. (E)Пример типичного профиля аРН после усиления РНК (слева, гелеобразное изображение; справа, электроферограмма). Было обнаружено распределение размеров от 100 до 1000 нуклеотидов с пиком около 300 нуклеотидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Анализ РНК-сек проводился на всех образцах в биологических трипликатах. Многомерный масштабирование (MDS) участок генов, выраженных в различных тканях более 48 ч прорастания иллюстрирует большее сходство между образцами одной ткани, чем между образцами из той же точки времени, но различные ткани (Рисунок 4A). Затем мы приступили к определению того, как широко экспрессия генов была дифференцированно регулируется в отдельных тканях с течением времени во время прорастания. Количество дифференцированно выраженных генов (DEGs) постепенно увеличивалось в течение прорастания в каждой ткани, по отношению к 0 h времени этой ткани(рисунок 4B). Было установлено, что 25% (910) оперения, 34% (1876) радикула и 41% (2562) скутеллума DEGs были исключительно дифференциально выражены в этой ткани (т.е. эти гены не были дифференцированно выражены в других тканях, рисунок 4C). В совокупности эти результаты показывают, как LCM RNA-seq может быть использован для понимания височной и пространственной экспрессии генов во время развития растений.
Рисунок 4: Анализ РНК-библиотек образцов LCM, показывающий четкое разделение различных тканей на 48 ч прорастания ячменя. (A) Многомерное масштабирование (MDS) участок генов, выраженных в различных тканях более 48 ч прорастания. Каждая точка представляет собой 1 образец, а расстояние между 2 точками отражает ведущее изменение складок журнала (FC) соответствующих образцов РНК. Оси x, y и z представляют собой первый, второй и третий мерный logFC. P - слив, R - радикл, S - scutellum, 0-48h - h прорастания, R1-3 - Replicate 1-3. (B)Количество значительных регулируемых (красных) и вниз регулируемых (голубых) дифференциально выраженных генов (DEGs) в течение шести точек времени по сравнению с точкой времени 0 ч для трех типов тканей. (C)Диаграмма Венна, показывающая количество DEGs в трех типах тканей. Гены в перекрывающихся наборах показывают дифференциальное выражение в двух или трех типах тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Многие исследования экспрессии генов, специфичные для тканей, были ограничены вскрытием образцов вручную, что является трудоемким, трудоемким, имеет высокий риск заражения и может использовать только образцы, которые оперативник человека достаточно ловкий, чтобы собрать урожай. LCM является точной и бесконтактной техникой для сбора клеток из фиксированных секций тканей с использованием механически управляемых лазерных лучей под микроскопической визуализацией.
Хорошая подготовка образца имеет решающее значение для LCM. Этот процесс опирается на надлежащее фиксацию и встраивание образцов для поддержания хорошего баланса между морфологией тканей и целостностью РНК. Представленный здесь протокол предусматривает оптимизированные шаги по фиксации и встраиванию семян ячменя, которые включают в себя более длительное время фиксации и вакуумное проникновение фиксаторов. Анализ различных тканей или видов потребует оптимизации условий, так как они обычно отличаются между тканями. Другим важным аспектом этого протокола является этап усиления РНК, который обеспечивает достаточное количество РНК для строительства библиотеки РНК-сек. Мы считаем, что усиление РНК приводит к высококачественным библиотекам, но в качестве альтернативы методы подготовки библиотеки ввода могут быть использованы25. Гистологическая идентификация клеток-мишеней является важным шагом в нашем методе и может обеспечить проблемы для редких или плохо охарактеризованных типов клеток. Распознавание целевых клеток может быть улучшено с помощью традиционных гистологических пятен или иммунофлюоресценции пятна как часть шага предварительной обработки или, в качестве альтернативы, с помощью трансгенных линий, которые выражают флуоресцентно помеченыклеточно-специфические маркеры 26,27.
Техника LCM была впервые разработана для использования на образцах животного происхождения для клеточного анализа стенограммы1. Однако впоследствии был разработан широкий спектр геномных, протеомных и эпигенетических анализов. Адаптация этих методов для применения в биологических исследованиях растений являетсяпостоянной задачей 18,,19,,20,,28. Schad et al. продемонстрировали, что белки и метаболиты из сосудистых пучков Arabidopsis могут быть проанализированы с помощью LCM с 2-D гель электрофорезом и масс-спектрометрией29,30. Недавно Компания Latrasse et al. провела иммунопреципитацию хроматина (ChIP)-qPCR-анализ на LCM-рассеченных тычинок и карпелях с использованием LCM, установив, что однородность тканей улучшает разрешение клеточных эпигенетическихсобытий 31. Turco et al. также объединили LCM с секвенированием бисульфита для изучения событий метилирования ДНК во время васкуляризации в сорго, подчеркивая ткани-специфической разницы между сосудистыми и несосудистымитканями 32. Интересно, что несколько исследований применили LCM для изучения растительно-микробных и растительно-патогенныхвзаимодействий 33,,34,,35. Способность LCM визуализировать и захватывать клетки на разных стадиях инфекции предоставляла информацию о пространственных и временных реакциях инфицированных клеток.
Наш протокол LCM в сочетании с RNA-seq, представленный здесь, облегчит пространственно-временное глобальное профилирование экспрессии генов различных типов клеток. С улучшенными методами очистки хроматина и белков наряду с расширенными инструментами масс-спектрометрии, LCM будет новым инструментом для облегчения клеточного типа конкретных эпигеномных и протеомных исследований в растениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Австралийский научно-исследовательский совет Центр передового опыта в области биологии энергии растений (CE140100008) в JW. M.G.L была поддержана стартовым грантом Университета Ла Троб. Мы благодарим платформу La Trobe Genomics platform за поддержку в последовательности с высокой пропускной способностью и анализе данных. Мы благодарим доцента Мэтью Такера за экспертные советы по созданию LCM в нашей лаборатории.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).
- Cong, P., et al. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).
- Blokhina, O., et al. Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants. Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).
- Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).
- Chen, Z., et al. LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.). The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).
- Jiao, Y., et al. A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies. Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).
- Kivivirta, K., et al. A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms. Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
- Matas, A. J., et al. Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation. The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).
- Sakai, K., et al. Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo. Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).
- Zhan, J., et al. RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. Single-Cell Omics. , Elsevier. 101-135 (2019).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).
- Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells. Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
- Takahashi, H., et al. A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).
- Ferreira, E. N., et al. Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA. Gene. 564 (2), 220-227 (2015).
- Schneider, J., et al. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).
- Shanker, S., et al. Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).
- Bhattacherjee, V., et al. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells. Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Blokhina, O., et al. Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce. Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).
- Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).
- Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).
- Latrasse, D., et al. The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22 (2017).
- Turco, G. M., et al. DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor. The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).
- Gomez, S. K., Harrison, M. J. Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).
- Roux, B., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing. The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).
- Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).
