Summary
Aquí se presenta un protocolo para la microdisección de captura láser (LCM) de tejidos vegetales. LCM es una técnica microscópica para aislar áreas de tejido de una manera libre de contaminación. El procedimiento incluye fijación de tejido, incrustación de parafina, seccionamiento, LCM y extracción de ARN. El ARN se utiliza en el análisis de transcriptomas de transcriptomas específicos del tejido aguas abajo y resueltos temporalmente.
Abstract
El desarrollo de un organismo multicelular complejo se rige por tipos celulares distintos que tienen diferentes perfiles transcripcionales. Para identificar las redes reguladoras transcripcionales que rigen los procesos de desarrollo es necesario medir los perfiles de expresión génica espacial y temporal de estos tipos de células individuales. Por lo tanto, la comprensión del control espacio-temporal de la expresión génica es esencial para comprender cómo se regulan los procesos biológicos y de desarrollo. Aquí, describimos un método de microdisección de captura láser (LCM) para aislar un pequeño número de células de tres órganos embrionarios de cebada durante un curso de tiempo durante la germinación seguido de perfiles de transcripción. El método consiste en fijación de tejidos, procesamiento de tejidos, incrustación de parafina, seccionamiento, LCM y extracción de ARN seguido de PCR en tiempo real o ARN-seq. Este método nos ha permitido obtener perfiles espaciales y temporales de transcriptomas de órganos de semillas de diferentes números de células (decenas a cientos), proporcionando una especificidad tisular mucho mayor que los análisis típicos de tejido a granel. A partir de estos datos pudimos definir y comparar redes reguladoras transcripcionales, así como predecir los factores de transcripción regulatorias candidatos para tejidos individuales. El método debe ser aplicable a otros tejidos vegetales con una optimización mínima.
Introduction
El desarrollo y crecimiento de las plantas implican la acción coordinada de las redes reguladoras transcripcionales dentro de diferentes células que existen en un entorno celular complejo. Para entender la actividad de estas redes reguladoras, requerimos el conocimiento de la expresión génica espacial y temporal dentro de diferentes tipos de células en todas las etapas del desarrollo. Sin embargo, los análisis de la expresión génica se llevan a cabo más comúnmente en órganos enteros o muestras de tejido a granel debido al desafío técnico de aislar y analizar un pequeño número de células. El método que describimos aquí ha permitido obtener análisis de transcriptomas espaciales y temporales específicos del tejido mediante el acoplamiento de LCM con RNA-seq.
LCM fue desarrollado hace dos décadas por Emmert-Buck y colegas1. La técnica permitió a los investigadores aislar con precisión células individuales o grupos de células de su entorno utilizando la visualización microscópica directa y la manipulación con un láser de haz estrecho1. Desde entonces el método ha sido ampliamente utilizado en la biología del cáncer y la patología2,3. Muchos grupos de investigación vegetal también han adaptado LCM para el uso con diferentes especies de plantas y diferentes tipos de tejidos4,,5,6,7,8,9,10,11. Recientemente, varios trabajos también han utilizado LCM sobre semillas eudicot y monocot para estudiar embriones, endospermas y otras estructuras de semillas durante el desarrollo de semillas y la germinación10,,12,,13. La mayoría de los otros métodos de aislamiento de una sola célula comúnmente utilizados, como micro-pipetting, clasificación celular, separación magnética y plataformas microfluídicas dependen de la digestión enzimática o homogeneización mecánica para disociar las células. Esto puede perturbar la expresión génica, introduciendo artefactos técnicos que confunda la interpretación de los datos14,15. Estos métodos también requieren el conocimiento previo de los genes marcadores para cada tipo de célula para relacionar las células disociadas con su ubicación espacial y el tipo de célula verdadero. Otro grupo de técnicas depende del aislamiento basado en afinidad de estructuras subcelulares en lugar de células enteras, por ejemplo INTACT (Aislamiento de núcleos etiquetados en tipos de celdas) y TRAP (Traducción de la purificación de afinidad ribosoma)16,17. Sin embargo, el etiquetado y la purificación de afinidad de núcleos o ribosomas son técnicamente desafiantes en especies vegetales que no tienen protocolos de transformación bien establecidos. LCM aprovecha la fijación rápida del tejido para preservar los niveles de transcripción y la identificación histológica convencional mediante la visualización directa de las células dentro de su contexto normal de tejido/órgano, lo que permite aislar las células discretas en un corto período de tiempo18,,19.
El protocolo presentado aquí es un método optimizado para el aislamiento de células o tipos celulares específicos de las secciones tisulares de las semillas de cereales, que se puede aplicar a la mayoría de las células que pueden ser identificadas histológicamente. LCM proporciona un método sin contacto de aislamiento celular, reduciendo en gran medida la contaminación y aumentando la integridad del ARN recuperado. Además, el método ilustra el poder de la MTC en estudios genómicos a gran escala a partir de pequeñas cantidades de materiales biológicos. También describimos la amplificación lineal del ARN para generar suficiente material de entrada para análisis de transcripción/transcriptoma posterior.
Hay diez pasos principales en este protocolo LCM RNA-seq para transcriptomas espaciales y temporales específicos de los tejidos, incluyendo la fijación de muestras de tejido, deshidratación, infiltración de parafina, incrustación, seccionamiento, LCM, extracción de ARN, amplificación de ARN, cuantificación de ARN y qRT-PCR y/o ARN-seq (Figura 1).
Figura 1: Diagrama de flujo de LCM seguido de RNA-seq o qRT-PCR. LCM es una técnica espacialmente precisa y libre de contacto para recoger células de secciones de tejido fijo utilizando un rayo láser bajo visualización microscópica. El proceso comienza con la fijación de muestras de tejido, seguido de deshidratación utilizando una serie de gradientes de etanol y xileno, y terminado con infiltración de parafina. El proceso se puede automatizar completamente mediante el uso de un procesador de tejidos. Una vez que el tejido se infiltra con parafina, se incrusta en un molde con parafina fundida utilizando una estación de incrustación. El seccionamiento se lleva a cabo utilizando microtomos ajustados al espesor deseado. Se preparan las diapositivas y se realiza LCM inmediatamente antes de que el ARN se extraiga de las células capturadas. La extracción de ARN es seguida directamente por dos rondas de amplificación de ARN antes de qRT-PCR y/o ARN-seq. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
Como el producto final es ARN, tenga cuidado de evitar contaminar el trabajo con ARN. Usar guantes es imprescindible. Utilice agua tratada con pirocarbonato de dietil (DEPC), tampones, etc. Búferes de autoclave y cristalería de hornear antes de su uso.
1. Fijación de tejidos
- Preparar fijador de elección dependiendo de la especie y los tipos de tejido; para la semilla de cebada, utilice el fijador del agricultor (75% etanol, 25% ácido acético glacial (v/v)).
- Enfríe el fijador en hielo antes de cosechar los tejidos.
- Recoger el material vegetal de interés y, si es necesario, diseccionarlo en trozos de tamaño adecuado para caber en el molde de incrustación seleccionado. Para la semilla de cebada, corte la semilla en la mitad longitudinalmente para ayudar a la penetración de la solución fijadora y para encajar en el molde de incrustación.
- Sumerja el tejido en al menos 10 veces el volumen de fijador helado. Para la semilla de cebada, sumerja la semilla cortada en la mitad en el fijador.
- Utilice la infiltración de vacío para acelerar la penetración de la fijación. Los tejidos deben hundirse después de la infiltración al vacío del fijador. Para la semilla de cebada, utilice 30 minutos de infiltración de vacío.
- Sustituya el fijador e incubar a 4 oC para permitir que el fijador penetre completamente en el tejido. Para la semilla de cebada, incubar las muestras durante la noche (12-16 h).
NOTA: Los tejidos más delgados o pequeños requerirán un tiempo de fijación más corto debido a la mayor tasa de difusión de fijador en el tejido. - Retire el tejido del fijador y transfiera el tejido a los casetes y luego comience el procesamiento del tejido.
NOTA: El tejido pequeño o frágil, como el tejido de la hoja, se puede colocar en casetes para asegurarse de que no se dañe durante la fijación. Las bolsas, almohadillas o envolturas de biopsia se pueden utilizar para mantener el tejido de forma segura dentro de los casetes durante los pasos de fijación de tejidos y procesamiento de tejidos.
2. Procesamiento de tejidos
- Utilice un procesador de tejido automatizado en el paso 2 con un mínimo de 10 cámaras de solución y 2 cámaras de parafina calentadas (ver Tabla de materiales).
- Compruebe que hay cantidades adecuadas de solución en cada cámara; reemplazar las soluciones después de cada pocos usos del procesador de tejidos.
- Coloque los casetes con tejido en la cesta metálica. Coloque la cesta metálica en su soporte por encima de la cámara 1. El soporte rotará y "dunk and dip" los cassettes en las cámaras, siguiendo el programa designado.
- Ajuste el programa realizando clics de botón en los paneles de control del procesador de tejido que implican el ajuste del tiempo para cada cámara.
- Pulse el botón "Inicio"para iniciar el programa de procesamiento. El siguiente programa está diseñado para semillas de cebada y se ejecuta durante la noche (18 h)
- Realice la deshidratación sumergiendo el cassette durante 1 h 30 minutos cada uno en la serie de gradientes de etanol (75%, 85%, 100%, 100% y 100% (v/v) etanol).
- Realice la limpieza con etanol: gradiente de xileno durante 1 h 30 min cada uno a 75:25, 50:50, 25:75 (etanol: % de xileno, v/v). A continuación, sumerja el cassette durante 1 h 30 min cada uno de 100% xileno y luego 100% xileno.
- Realizar la infiltración de parafina a 55-60 oC durante 1 h 30 min dos veces en parafina fundida.
NOTA: La temperatura de las cámaras del calentador de parafina se puede ajustar en la parte posterior del procesador de tejido.
- A la mañana siguiente, retire los casetes del procesador de tejidos y proceda a la incrustación de parafina.
NOTA: El tiempo del programa puede variar entre diferentes tipos de tejido. El vacío y/o la agitación se pueden utilizar durante el procesamiento de tejidos para acelerar la infiltración de soluciones seleccionadas pulsando los botones "V" y/o "agitación"en el panel de control del procesador de tejidos.
3. Incrustación de parafina
- Utilice una máquina de incrustación en este paso (consulte Tabla de materiales).
- Preestablecer la máquina de incrustación para que se encienda al menos unas horas antes de la incrustación para permitir tiempo para que la parafina en los depósitos se derrita por completo.
- Encienda la placa fría antes de empezar.
- Incruste las muestras en moldes sosteniendo las muestras en posición utilizando fórceps finos y dispensando parafina fundida en el molde. Asegurar la orientación adecuada de las muestras para cada propósito experimental. Para la semilla de cebada, orientar la semilla longitudinal a la dirección de corte para obtener secciones longitudinales.
NOTA: Los moldes de incrustación vienen en diferentes tamaños. Seleccione un tamaño adecuado para permitir que la muestra se coloque e incruste correctamente. La orientación de las muestras debe considerarse en función de las necesidades experimentales. Si se requieren secciones longitudinales, la muestra debe orientarse longitudinalmente a la dirección de corte, mientras que para las secciones transversales la muestra debe orientarse paralelamente a la dirección de corte. - Coloque un cassette limpio sobre el molde y asegúrese de que la suficiente parafina cubra completamente todo el cassette para sujetar la muestra en el cassette.
- Coloque el molde sobre la placa fría y deje que la parafina se ajuste completamente (10-20 min) antes de liberar el bloque del molde.
- Proceda a la seccionamiento o transferencia de los bloques a 4 oC para su almacenamiento.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los bloques embebidos se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de tres meses.
4. Preparación de portaobjetos de membrana de naftalina de polietileno (PEN)
- Sumerja los portaobjetos de membrana PEN en la solución de desactivación de RNase durante 3 s seguido de dos breves lavados en agua tratada con DEPC para eliminar las ADNs en los portaobjetos. Seque los portaobjetos en una incubadora de 37oC para eliminar la solución sobrante.
- Tratamiento UV de los portaobjetos utilizando una lámpara UV en un armario de flujo laminar durante 30 minutos para mejorar las propiedades hidrófilas para mejorar la adherencia a la parafina.
5. Seccionamiento
- Utilice un microtoma en el paso de seccionamiento (consulte Tabla de materiales).
- Coloque una nueva cuchilla en el portacuchillas y mantenga siempre la protección del cuchillo cuando no se secise activamente
ADVERTENCIA: Las cuchillas microtomos son extremadamente afiladas y pueden causar daños significativos cuando se manipulan de manera inadecuada.
NOTA: Hay dos mecanismos de bloqueo en el microtomo, uno está en el lado de la máquina y el otro está en el mango de la rueda. Ambos deben participar cuando no se seccionan activamente. - Ajuste el bloque de cuchillas para que esté lo más cerca posible de la muestra sin tocarlo. Asegúrese de que el brazo de microtomo nunca entre en contacto completo con el bloque de cuchillas, ya que esto causará daños estructurales catastróficos al microtoma.
- Encienda la placa fría antes de empezar. Mantenga los bloques de parafina en la placa fría antes de secciones y vuelva a enfriar los bloques cuando sea necesario durante el seccionamiento para evitar que los bloques se ablanden.
- Llene el baño de agua con agua tratada con DEPC y caliente a 42 oC antes de comenzar.
- Recortar bloques a la profundidad deseada (donde la sección que le interesa) y bloques de parafina de sección en el espesor deseado (6-10 m) utilizando el microtoma; un bloque bien seccionado formará una "cinta" en el borde de la hoja. Para semillas de cebada, sección con 8 m de espesor.
- Transfiera suavemente cintas desde el microtoma al baño de agua con un cepillo de pintura fino o fórceps finos, asegurándose de que la cinta esté plana en la superficie del agua.
- Sostenga un portaobjetos en un ángulo de 45o, utilizando un movimiento hacia arriba, levante una cinta del agua sobre el portaobjetos y retire cuidadosamente el exceso de agua con un tejido libre de pelusas.
- Secar los toboganes durante 30 minutos a 37 oC para eliminar el agua restante debajo de la parafina.
- Proceder a la extracción de parafina o almacenar a 4 oC en una caja cerrada en condiciones de deshidratación (que se utilizará en el plazo de varios días).
- Retire la parafina lavando los portaobjetos 3x durante 20 s cada uno en xileno, seguido de lavados 2x de 30 s en etanol 100% (v/v) y 2 lavados de 30 s en etanol 70% (v/v).
- Proceda inmediatamente a la microdisección de captura láser después de retirar la parafina.
NOTA: La criociructación es un método alternativo que se ha acoplado con éxito con LCM. La preparación de la muestra para la criocisión será diferente.
6. Microdisección de captura láser
- Utilice un microscopio de microdisección de captura láser (ver Tabla de materiales)para microdiseccionar las células de las secciones de tejido desfilizado y seco.
- Cargue las diapositivas en las tres ranuras disponibles.
- Utilice las tapas adhesivas especiales de los tubos de recogida para recoger las muestras capturadas. Capturar sin líquido (colección seca) minimiza la actividad de la RNase. Cargue los tubos de recogida en las ranuras disponibles.
- Mueva la etapa para localizar la región de la muestra que se debe cortar. Esto se puede hacer usando el ratón o el joystick de la máquina LCM, o las teclas de flecha en el teclado.
- Para optimizar la velocidad de corte, la energía de corte y el enfoque, la energía y el enfoque de la catapultación de presión láser (LPC), primero se corta en un segmento en blanco libre de tejido en el portaobjetos de membrana. Para la semilla de cebada, la velocidad de corte es 18, CutEnergy a 52 CutFocus a 63, LPCEnergy a 78, enfoque LPC a 61 a 10x de aumento.
NOTA: El enfoque de corte y la energía tienen que ser ajustados para diferentes diapositivas, diferentes tejidos, y el área capturada, pero las reglas generales son la potencia de catapultación es mayor que la potencia de corte y el láser tiene que ser desenfocado para la catapultación. Cuanto mayor sea el aumento de la lente objetivo, menor será el enfoque del láser y mayor será la energía. - Utilice las herramientas Dibujo para seleccionar celdas delineando el área de interés.
- Seleccione la función RoboLPC en la barra de herramientas de funciones para catapultar las células en las tapas adhesivas en función de los parámetros optimizados obtenidos cortando en un segmento negro arriba.
NOTA: Los parámetros de LCM varían entre los tipos de tejido, así como el grosor de la sección, la dureza del tejido y las lentes objetivas. Por lo tanto, es mejor optimizar cada diapositiva en un área de membrana simple sin muestra de tejido antes de cortar la muestra real. - Utilice las herramientas Marcar para marcar las regiones de interés para localizarlas inmediatamente seleccionando esa marca en la lista de elementos.
- Compruebe mediante el botón "CapCheck" para inspeccionar la tapa adhesiva para confirmar que las muestras fueron capturadas. Típicamente, LCM de 10-15 secciones (200 células) por tapa se requiere para la extracción de ARN.
- Mantenga las muestras capturadas en hielo. Proceda inmediatamente para la extracción de ARN para evitar la degradación del ARN.
NOTA: Algunas microscopíaS LCM están equipadas con luz fluorescente que permite la captura de células etiquetadas con marcadores fluorescentes.
7. Extracción de ARN
- Utilice un kit de aislamiento de ARN de entrada baja (consulte Tabla de materiales)para la extracción de ARN después de LCM. Estos kits están diseñados para recuperar ARN total de alta calidad consistentemente de menos de diez células.
- Aísle el ARN total de los tipos de células capturados de acuerdo con las instrucciones del fabricante, incluido el tratamiento DNase en columna.
NOTA: El primer paso de la extracción de ARN donde el tubo está invertido y parpadeado es crucial para asegurar que las muestras capturadas en la tapa estén en contacto con el búfer de extracción añadido.
8. Amplificación del ARN
- Utilice un kit de amplificación de ARN antisrés (ARN) (ver Tabla de materiales) para una amplificación del ARN extraído por la transcripción in vitro para producir un ARN suficiente para la síntesis de la biblioteca de ARN-seq.
- Realice dos rondas de amplificación utilizando el kit de amplificación de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Es importante precalentar el termociclista y la tapa a la temperatura indicada por el fabricante del kit (ver Tabla de Materiales). Un enfoque alternativo en lugar de amplificación de ARN es utilizar un kit de preparación de biblioteca de entrada baja para sintetizar la biblioteca directamente del ARN extraído.
9. Cuantificación del ARN
- Cuantifique y califique el ARNr mediante un sistema automatizado de electroforesis (ver Tabla de materiales).
NOTA: Se prefiere un sistema automatizado de electroforesis, ya que requiere menos muestra (1-2 l) y proporciona una imagen en forma de gel y un electroferograma para cada muestra individual.
10. qRT-PCR y/o ARN-seq
- Sintetice el ADNc del ARN para qRT-PCR o para crear bibliotecas RNA-seq utilizando kits de biblioteca RNA-seq estándar.
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Representative Results
Generamos transcriptomas espaciales y temporales específicos de tejidos a partir de semillas de cebada durante la germinación utilizando nuestro protocolo LCM RNA-seq10. El estudio se llevó a cabo aplicando LCM ARN-seq a un pequeño número de células de tres órganos embrionarios (plumule, radicle tip, scutellum) cada 8 h durante un curso de tiempo de 48 horas durante la germinación (0-48 h, 7 puntos de tiempo) (Figura 2A,B).
Figura 2: Células recogidas de semillas de cebada por LCM. (A) Sección transversal longitudinal de una semilla de cebada y, inserto, una caricatura ampliada que indica las regiones desde las que se capturaron las celdas. Azul , plumule, magenta, radio, verde, escutellum. (B) LCM de plomero, radio y escudillo. Panel superior, tejido antes de la catapultación por presión láser (LPC). Panel inferior, tejido después de LPC. Las células fueron capturadas de 5 secciones longitudinales consecutivas de cada muestra con tres réplicas biológicas por muestra. Cada réplica consistía en aproximadamente 200 celdas (0,05 - 0,15 mm2 de área total). Barra de 100 m. E , endospermo, C , capa de celda triturada, SE , epitelio escuelllar, S - escutellum. Figura reproducida a partir de datos anteriores en The Plant Journal con permiso10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La fijación y la incrustación son pasos críticos, ya que la muestra de tejido mal fijada puede resultar en daño tisular y pérdida de cantidad y calidad de ARN. Estos pasos deben optimizarse y ajustarse para diferentes especies y tipos de tejidos19,,20,,21. Aquí utilizamos la infiltración de vacío para mejorar la penetración de los fijadores en los tejidos y células de las semillas. La deshidratación y la infiltración de parafina se llevan a cabo gradualmente para evitar daños en las muestras de tejido. Hemos acelerado todo el proceso de deshidratación e infiltración de parafina mediante el uso de un procesador de tejidos automatizado con agitación y vacío aplicado en cada paso. Esto reduce en gran medida el riesgo de degradación del ARN que ocurre durante las medidas de procesamiento de tejido prolongadas llevadas a cabo por un agente humano. Antes de secciones, es crucial tratar el portaobjetos de membrana para asegurar la adhesión a la parafina y para asegurarse de que está libre de RNase. Si los portaobjetos de membrana no están preparados correctamente, la sección de la muestra no se adhiere a la membrana, lo que afectará al paso de catapultación de LCM y disminuirá la transferencia de tejido a las tapas adhesivas porque la muestra se separará de la membrana (ver Figura 1).
Otro paso crítico en el protocolo LCM RNA-seq es la optimización de parámetros LCM. Hay cinco parámetros principales que se optimizarán: (1) velocidad de corte; (2) energía de corte; (3) enfoque de corte; (4) Energía LPC; y (5) enfoque LPC. Es importante ajustar los parámetros de corte correctamente para cortar el área seleccionada con precisión y desalojar del tejido circundante sin quemar el borde del área seleccionada (Figura 3A,B). La energía y el enfoque LPC adecuados son esenciales para catapultar de forma fiable el área seleccionada desde el portaobjetos hasta las tapas adhesivas especiales de los tubos de recogida, y siempre inspeccionar las muestras capturadas en las tapas para asegurarse de que se recoge suficiente material (Figura 3C). La eficiencia de LCM permite capturar 1000 células en una hora, lo que reduce en gran medida la probabilidad de degradación del ARN durante el procesamiento de muestras. El uso de tubos de recogida con tapas adhesivas permite la recolección "seca" sin ningún líquido de captura, reduciendo en gran medida las posibles actividades de RNases. Es importante mantener las muestras capturadas en hielo y hacer la extracción de ARN inmediatamente después de recoger todas las réplicas.
La extracción y amplificación de ARN se llevan a cabo utilizando kits disponibles comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante. La cuantificación del ARN total antes de la amplificación del ARN mediante el sistema automatizado de electroforesis detectará bandas electroforéticas y picos fluorescentes distintos de las subunidades ribosomales 18S y 28S en muestras de ARN de buena calidad (Figura 3D). Se encontrarán picos adicionales correspondientes al cloroplasto y al ARN ribosomal mitocondrial antes de los picos 18S y 28S. Debido a múltiples picos de ARN en especies de plantas, los valores de RIN (RNA Integrity Number) suelen ser inferiores a 9 (el valor de RIN esperado de los tejidos de mamíferos) y no reflejan con precisión la integridad del ARN22. Es apropiado continuar con la amplificación del ARN cuando los picos claros 18S y 28S son visibles sin signo de degradación del ARN. La cantidad de ARN recuperada en nuestro experimento de semillas de cebada varió entre tres tipos de tejidos diferentes (plumule, radicle y scutellum) y, también entre las etapas tempranas y tardías de germinación, a pesar de que se está cosechando aproximadamente el mismo número de células. Las cantidades de semillas de cebada oscilaron entre 100 pg y 20 ng de aproximadamente 200 células (0,5 a 100 pg por célula). La cantidad mínima de ARN de entrada recomendada para la amplificación de ARN fue de 100 pg. La cantidad de ARN extraído depende de la eficiencia de la extracción de diferentes células cosechadas y de la abundancia total de transcripción en el tipo de célula particular en esa etapa de desarrollo19,,21. Es útil considerar esto al planificar un experimento LCM RNA-seq, aunque dicha información previa no estará disponible en todos los casos.
El ARN aRNA sintetizado con éxito exhibirá una distribución de tamaño unimodal y simétrico de 100 a 1000 nucleótidos con un pico de alrededor de 300 nucleótidos después de dos rondas de amplificación (Figura 3E). En nuestro experimento de semillas de cebada, obtuvimos de 500 pg a 2 g de ARNr después de dos rondas de amplificación de ARN10. La comparación entre ARN amplificado y no amplificado ha demostrado que la amplificación del ARN es reproducible, lineal y no introduce un sesgo sistemático en los datos de transcripción23,,24,,25. El ARN de salida se puede utilizar para qRT-PCR y/o ARN-seq para el análisis de expresión génica espacial y temporal específico del tejido. La validación después del ARN-seq debe llevarse a cabo para corroborar los resultados del análisis del ARN. Esto se puede hacer examinando la expresión de genes marcadores de tipo celular a partir de los datos de ARN-seq utilizando hibridación in situ de ARN.
Figura 3: Resultado representativo de LCM. (A) Tejido después del corte con la energía de corte adecuada y el enfoque. Se puede ver una línea fina clara donde se hizo el corte. El área seleccionada se desalojará de los materiales circundantes. Barra a 100 m. (B) Tejido después del corte con energía de corte y enfoque incorrectos. El área seleccionada sigue conectada a los materiales circundantes. Barra de 100 m. (C) Examen de las células capturadas en tapas adhesivas especiales de tubos de recogida. Barra de 100 m. (D) Un ejemplo del perfil total de ARN antes de la amplificación del ARN (izquierda, imagen similar a gel; derecha, electroferograma) con bandas electrofóricas distintas y picos fluorescentes de subunidades ribosomales 18S y 28S. Los picos sin etiqueta corresponden a ARN ribosomal adicional, incluidos cloroplastos y ribosomas mitocondriales. (E) Un ejemplo de un perfil típico de ARNar después de la amplificación del ARN (izquierda, imagen similar a un gel; derecha, electroferograma). Se detectó una distribución de tamaños de 100 a 1000 nucleótidos, con un pico de alrededor de 300 nucleótidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se realizaron análisis de ARN-seq en todas las muestras en triplicados biológicos. Una gráfica de escala multidimensional (MDS) de genes expresados en los diferentes tejidos a lo largo de 48 h de germinación ilustra una mayor similitud entre las muestras de un solo tejido que entre las muestras del mismo punto de tiempo pero diferentes tejidos (Figura 4A). A continuación nos propusimos determinar cuán ampliamente la expresión génica se reguló diferencialmente en los tejidos individuales a lo largo del tiempo durante la germinación. El número de genes expresados diferencialmente (DEG) aumentó progresivamente a lo largo de la germinación en cada tejido, en relación con el punto de tiempo de 0 h de ese tejido (Figura 4B). El veinticinco por ciento (910) de la plolo, el 34% (1876) del radio y el 41% (2562) de los DEG de scutellum se expresaron exclusivamente diferencialmente en ese tejido (es decir, estos genes no se expresaron diferencialmente en los otros tejidos, la Figura 4C). En conjunto, estos resultados demuestran cómo el ARN-seq de LCM se puede utilizar para comprender la expresión génica temporal y espacial durante el desarrollo de la planta.
Figura 4: Análisis de bibliotecas de ARN de muestras de LCM que muestran separación distinta de diferentes tejidos durante 48 h de germinación de cebada. (A) Gráfica de escala multidimensional (MDS) de genes expresados en los diferentes tejidos a lo largo de 48 h de germinación. Cada punto representa 1 muestra, y la distancia entre 2 puntos refleja el cambio de plegado del registro inicial (FC) de las muestras de ARN correspondientes. Los ejes x, y y z representan logFC de primera, segunda y tercera dimensión. P - plumule, R - radicle, S - scutellum, 0-48h á h de germinación, R1-3 - Replicar 1-3. (B) Número de genes significativos regulados hacia arriba (rojo) y regulados hacia abajo (azul) expresados diferencialmente (DEG) para seis puntos de tiempo en comparación con el punto de tiempo 0 h para tres tipos de tejido. (C) Diagrama de Venn que muestra el número de DEGs en tres tipos de tejido. Los genes en conjuntos superpuestos muestran la expresión diferencial en dos o tres tipos de tejido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Muchos estudios de expresión génica específicos de los tejidos se han visto limitados por la disección manual de muestras, que consume mucho tiempo, requiere mucho trabajo, tiene un alto riesgo de contaminación y sólo puede utilizar muestras de que un agente humano es lo suficientemente hábil para cosechar. LCM es una técnica precisa y sin contacto para recoger células de secciones de tejido fijo utilizando un rayo láser operado mecánicamente bajo visualización microscópica.
Una buena preparación de la muestra es fundamental para la LCM. El proceso se basa en la correcta fijación e incrustación de muestras para mantener un buen equilibrio entre la morfología tisular y la integridad del ARN. El protocolo presentado aquí proporciona pasos optimizados de fijación e incrustación para semillas de cebada que incluyen un tiempo de fijación más largo y la infiltración de vacío de los fijadores. El análisis de diferentes tejidos o especies requerirá la optimización de las condiciones, ya que estos típicamente difieren entre los tejidos. Otro aspecto importante de este protocolo es el paso de amplificación de ARN que garantiza que se generen cantidades suficientes de ARN para la construcción de la biblioteca RNA-seq. Encontramos que la amplificación del ARN da lugar a bibliotecas de alta calidad, pero alternativamente los métodos de preparación de la biblioteca de entrada baja podrían emplearse25. La identificación histológica de las células diana es un paso crítico en nuestro método y puede proporcionar desafíos para los tipos de células raras o mal caracterizadas. El reconocimiento celular objetivo puede mejorarse utilizando manchas histológicas tradicionales o manchas de inmunofluorescencia como parte del paso de preprocesamiento o, alternativamente, mediante el uso de líneas transgénicas que expresan marcadores específicos de células con etiqueta fluorescente26,,27.
La técnica LCM se desarrolló por primera vez para ser utilizada en muestras derivadas de animales para el análisis de transcripción específico de tipo celular1. Sin embargo, posteriormente se ha desarrollado una amplia gama de análisis genómicos, proteómicos y epigenéticos. La adaptación de estos métodos de aplicación en estudios biológicos vegetales es un reto continuo18,,19,,20,,28. Schad et al. demostraron que las proteínas y metabolitos de los haces vasculares de Arabidopsis podían analizarse utilizando LCM con electroforesis de gel 2-D y espectrometría de masas29,,30. Recientemente, Latrasse et al. llevaron a cabo análisis de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)-qPCR sobre estambres y carpelos diseccionados con LCM utilizando LCM, estableciendo que la homogeneidad tisular mejora la resolución de eventos epigenéticos específicos de células31. Turco y otros también acoplaron la LCM con la secuenciación de bisulfito para estudiar los eventos de metilación del ADN durante la vascularización en el sorgo, destacando la diferencia específica del tejido entre los tejidos vasculares y los tejidos no vasculares32. Curiosamente, varios estudios han aplicado LCM para explorar las interacciones plantas-microbio y patógenos vegetales33,34,35. La capacidad de LCM para visualizar y capturar células en diferentes etapas de infección proporcionó información sobre las respuestas espaciales y temporales de las células infectadas.
Nuestro protocolo LCM junto con el ARN-seq presentado aquí facilitará el perfil global espacio-temporal de la expresión génica de tipos celulares distintos. Con métodos de purificación mejorados para cromatina y proteínas junto con instrumentos de espectrometría de masas mejorados, la LCM será una herramienta emergente para facilitar estudios epigenómicos y proteómicos específicos del tipo celular en plantas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Centro de Excelencia en Biología de la Energía Vegetal del Consejo Australiano de Investigación (CE140100008) a JW. M.G.L fue apoyado por una beca inicial de la Universidad La Trobe. Agradecemos a La Trobe Genomics Platform por su apoyo en la secuenciación de alto rendimiento y análisis de datos. Agradecemos al Profesor Asociado Matthew Tucker por el asesoramiento experto sobre el establecimiento de LCM en nuestro laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
References
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