Summary
Presenteras här är ett protokoll för laser-capture microdissection (LCM) av växtvävnader. LCM är en mikroskopisk teknik för att isolera områden av vävnad på ett kontaminationsfritt sätt. Förfarandet omfattar vävnad fixering, paraffin inbäddning, snittning, LCM och RNA extraktion. RNA används i den nedströms vävnadsspecifika, tidsmässigt löst analys av transkriptomer.
Abstract
Utvecklingen av en komplex flercellig organism styrs av distinkta celltyper som har olika transkriptionella profiler. För att identifiera transkriptionella regleringsnätverk som styr utvecklingsprocesser är det nödvändigt att mäta dessa enskilda celltypers rumsliga och tidsmässiga genuttrycksprofiler. Därför är insikt i den spatio-temporala kontrollen av genuttryck avgörande för att få förståelse för hur biologiska och utvecklingsmässiga processer regleras. Här beskriver vi en laser-capture microdissection (LCM) metod för att isolera litet antal celler från tre korn embryo organ under en tid-kurs under grobarhet följt av avskrift profilering. Metoden består av vävnadsfixering, vävnadsbearbetning, paraffininbäddning, snittning, LCM- och RNA-extraktion följt av realtids-PCR eller RNA-seq. Denna metod har gjort det möjligt för oss att få rumsliga och tidsmässiga profiler av utsäde organ transkriptomer från varierande antal celler (tiotals till hundratals), vilket ger mycket större vävnad-specificitet än typiska bulk-vävnad analyser. Från dessa data kunde vi definiera och jämföra transkriptionella regulatoriska nätverk samt förutsäga kandidatreglerande transkriptionsfaktorer för enskilda vävnader. Metoden bör vara tillämplig på andra växtvävnader med minimal optimering.
Introduction
Växtutveckling och tillväxt innebär en samordnad åtgärd av transkriptionella regleringsnätverk inom olika celler som finns i en komplex cellulär miljö. För att förstå aktiviteten i dessa regleringsnätverk kräver vi kunskap om rumsliga och tidsmässiga genuttryck inom olika celltyper över utvecklingsstadier. Analyser av genuttryck utförs dock oftare i hela organ eller massvävnadsprover på grund av den tekniska utmaningen att isolera och analysera ett litet antal celler. Den metod vi beskriver här har tillåtit erhålla rumsliga och tidsmässiga vävnadsspecifika transkriptom analys genom koppling LCM med RNA-seq.
LCM utvecklades för två decennier sedan av Emmert-Buck och kollegor1. Tekniken gjorde det möjligt för forskare att exakt isolera enceller eller kluster av celler från sin omgivning med hjälp av direkt mikroskopisk visualisering och manipulation med en smal strållaser1. Sedan dess har metoden använts flitigt inom cancerbiologi och patologi2,3. Många växtforskningsgrupper har också anpassat LCM för användning med olika växtarter och olika vävnadstyper4,5,6,7,8,9,10,11. Nyligen har flera papper också använt LCM på eudikot och monocot frön att studera embryo, frövita och andra strukturer utsäde under utsäde utveckling och grobarhet10,12,13. De flesta av de andra vanligt förekommande encelliga isoleringsmetoderna som mikro-pipettering, cellsortering, magnetisk separation och mikrofluidiska plattformar är beroende av den enzymatiska matsmältningen eller mekanisk homogenisering för att dissociate celler. Detta kan genomsyra genuttryck, införa tekniska artefakter som förvirrar datatolkning14,15. Dessa metoder kräver också tidigare kunskaper om markörgener för varje celltyp för att relatera de dissocierade cellerna till deras rumsliga placering och sanna cell-typ. Ytterligare en grupp tekniker beror på affinitetsbaserad isolering av subcellulära strukturer istället för hela celler, till exempel INTAKT (Isolering av kärnor Taggade i celltyper) och TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)16,17. Affinitetsmärkning och rening av atomkärnor eller ribosomer är dock tekniskt utmanande hos växtarter som inte har väletablerade transformationsprotokoll. LCM drar fördel av snabb vävnad fixering för att bevara transkription nivåer och konventionella histologiska identifiering genom direkt visualisering av celler inom deras normala vävnad / organ sammanhang, som gör att diskreta celler isoleras på kort tid18,19.
Det protokoll som presenteras här är en optimerad metod för isolering av specifika celler eller celltyper från vävnadssektionerna i spannmålsfrön, som kan appliceras på de flesta av de celler som kan histologiskt identifieras. LCM ger en kontaktfri metod för cellisolering, kraftigt minska kontaminering och öka integriteten av återvunnet RNA. Vidare illustrerar metoden LCM:s kraft på storskaliga genomsvida studier som börjar med små mängder biologiska material. Vi beskriver också linjär förstärkning av RNA för att generera tillräckligt med inmatningsmaterial för nedströms avskrift/transkriptomanalyser.
Det finns tio huvudsteg i detta LCM RNA-seq-protokoll för rumsliga och tidsmässiga vävnadsspecifika transkriptomer, inklusive fixering av vävnadsprover, uttorkning, paraffinininfiltration, inbäddning, snittning, LCM, RNA-extraktion, RNA-amplifiering, RNA-kvantifiering och qRT-PCR och/eller RNA-seq (Figur 1).
Bild 1: Flödesschema av LCM följt av RNA-seq eller qRT-PCR. LCM är en rumsligt exakt och kontaktfri teknik för att samla in celler från fasta vävnadssektioner med hjälp av en laserstråle under mikroskopisk visualisering. Processen börjar med fixering av vävnadsprover, följt av uttorkning med hjälp av en gradient serie av etanol och xylen, och slutade med paraffin infiltration. Processen kan automatiseras helt genom att använda en vävnadsprocessor. När vävnaden är infiltrerad med paraffin, är det inbäddat i en form med smält paraffin med hjälp av en inbäddningsstation. Snittning utförs med hjälp av mikrotom inställd på önskad tjocklek. Diabilder bereds och LCM genomförs omedelbart innan RNA ska extraheras från fångade celler. RNA-extraktion följs direkt av två omgångar av RNA-amplifiering före qRT-PCR och/eller RNA-seq. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eftersom slutprodukten är RNA, var noga med att undvika att förorena arbetet med RNases. Att bära handskar är ett måste. Använd diethyl pyrocarbonate (DEPC) -behandlat vatten, buffertar etc. Autoklav buffertar och baka glasvaror före användning.
1. Fixering av vävnad
- Förbered fixativ av val beroende på art och vävnadstyper; för kornfrö, använd Farmer's fixative (75% etanol, 25% glacial ättiksyra (v/v)).
- Kyl fixativet på is innan du skördar vävnader.
- Samla in växtmaterial av intresse och vid behov dissekera den i bitar av lämplig storlek för att passa in i den valda inbäddning mögel. För kornfrö, skär fröet i halv longitudinellt för att hjälpa penetration av fixativ lösning och för att passa in i inbäddningsformen.
- Dränka vävnaden i minst 10x volym iskall fixativ. För kornfrö, dränka fröet halveras i fixativet.
- Använd vakuuminfiltration för att påskynda penetrationen av fixativ. Vävnaderna ska sjunka efter den fixativa vakuuminfiltrationen. För kornfrö, använd 30 min vakuuminfiltration.
- Sätt tillbaka fixativet och inkubera vid 4 °C för att fixativet ska kunna tränga in helt i vävnaden. För kornfrö, inkubera proverna över natten (~12-16 h).
OBS: Tunnare eller små vävnader kommer att kräva kortare fixeringstid på grund av den högre diffusionshastigheten av fixativt i vävnaden. - Avlägsna vävnaden från fixativ och överför vävnaden till kassetter och påbörja sedan vävnadsbearbetning.
OBS: Liten eller ömtålig vävnad, såsom bladvävnad, kan placeras i kassetter för fixering för att säkerställa att den inte skadas vid fixering. Biopsi påsar, kuddar eller wraps kan användas för att hålla vävnaden säkert inne i kassetterna under vävnad fixering och vävnad bearbetning steg.
2. Bearbetning av vävnad
- Använd en automatiserad vävnadsbehandlare i steg 2 med ett minimum av 10 lösningskammare och 2 uppvärmda paraffinkammare (se Tabell över material).
- Kontrollera att det finns tillräckliga mängder lösning i varje kammare; ersätta lösningar efter varje få användningar av vävnadsbehandlaren.
- Placera kassetter med vävnad i metallkorgen. Fäst metallkorgen på dess hållare ovanför kammare 1. Hållaren kommer att rotera och "dunka och doppa" kassetterna i kamrarna, efter det utsedda programmet.
- Ställ in programmet genom att utföra knappklick på kontrollpanelerna i vävnadsprocessorn som innebär inställning av tidslängd för varje kammare.
- Tryck på "Start" -knappen för att starta bearbetningsprogrammet. Följande program är utformat för kornfrön och körs över natten (~ 18 h)
- Utför uttorkning genom att doppa kassetten i 1 h 30 min vardera i toningsserien av etanol (75 %, 85 %, 100 %, 100 % och 100 % (v/v) etanol).
- Utför clearing med hjälp av etanol: xylengradient i 1 h 30 min vardera vid 75:25, 50:50, 25:75 (etanol: xylen %, v/v). Doppa sedan kassetten i 1 h 30 min vardera på 100% xylen sedan 100% xylen.
- Utför paraffininfiltration vid 55-60 °C i 1 h 30 min två gånger i smält paraffin.
OBS: Temperatur på paraffinvärmare kammare kan ställas in på baksidan av vävnad processor.
- Nästa morgon, ta bort kassetter från vävnad processor och fortsätt att paraffin inbäddning.
OBS: Programtiden kan variera mellan olika vävnadstyp. Vakuum och/eller agitation kan användas under vävnadsbearbetning för att påskynda infiltrationen av utvalda lösningar genom att trycka på "V" och/eller "agitation" -knappar på vävnadsbehandlarens kontrollpanel.
3. Paraffin inbäddning
- Använd en inbäddningsmaskin i detta steg (se Tabell över material).
- Förinställ inbäddningsmaskinen att slå på minst några timmar före inbäddning för att ge tid för paraffinen i reservoarerna att smälta helt.
- Sätt på kallplattan före start.
- Bädda in prover i formar genom att hålla proverna i position med hjälp av fina tövövingar och dispensering smält paraffin i formen. Säkerställa korrekt orientering av prover för varje experimentellt ändamål. För kornfrö orienterar du fröet längsgående till skärriktningen för att erhålla längsgående sektioner.
OBS: Inbäddning formar finns i olika storlekar. Välj en lämplig storlek för att tillåta att provet placeras och bäddas in ordentligt. Orientering av proverna bör övervägas beroende på experimentella behov. Om longitudinella sektioner krävs bör provet orienteras i längdriktningen till skärriktningen medan provet för tvärgående sektioner bör orienteras parallellt med skärriktningen. - Placera en ren kassett på formen och se till att tillräckligt paraffin helt täcker hela kassetten för att hålla provet på kassetten.
- Placera formen på den kalla plattan och låt paraffin att ställa in helt (10-20 min) innan du släpper blocket från mögel.
- Gå vidare till snittning eller överför blocken till 4 °C för lagring.
OBS: Protokollet kan pausas här. De inbäddade blocken kan förvaras vid 4 °C i upp till tre månader.
4. Beredning av membransglas av polyetylennaftaftat (PEN)
- Submerge PEN-membranglas i RNase avaktiverande lösning för 3 s följt av två korta tvättar i DEPC-behandlat vatten för att avlägsna RNases på objektglasen. Torka objektglasen i en 37 °C inkubator för att avlägsna överb left over-lösning.
- UV-behandla diabilderna med hjälp av en UV-lampa i ett laminär flödesskåp i 30 min för att förbättra hydrofila egenskaper för förbättrad paraffinadhesion.
5. Snittning
- Använd en mikrotom i snittningssteget (se Tabell över material).
- Placera ett nytt blad i knivhållaren, och håll alltid knivskydd vid aktivt snittning
VAR FÖRSIKTIG: Mikrotombladen är extremt vassa och kan orsaka betydande skada när de hanteras på ett olämpligt sätt.
OBS: Det finns två låsmekanismer på mikrotomen, den ena är vid sidan av maskinen och den andra är på hjulets handtag. Båda ska vara förlovade, när inte aktivt dela upp. - Justera knivblocket så att det är så nära provet som möjligt utan att röra. Se till att mikrotomarmen aldrig kommer i full kontakt med knivblocket eftersom detta kommer att orsaka katastrofala strukturella skador på mikrotomen.
- Sätt på kallplattan före start. Förvara paraffinblock på kallplattan före snittning och svalt block igen vid behov under snittningen för att förhindra att blocken mjuknar.
- Fyll vattenbadet med DEPC-behandlat vatten och värm till 42 °C före start.
- Trimma block till önskat djup (där den sektion du är intresserad av) och sektionsparaffinblock vid önskad tjocklek (6-10 μm) med hjälp av mikrotomen; en välsnittad block kommer att bilda ett 'band' vid bladets kant. För kornfrö, sektion med 8 μm tjocklek.
- För försiktigt över band från mikrotomen till vattenbadet med hjälp av fin färgpensel eller fina tylikt, vilket säkerställer att bandet är platt på vattenytan.
- Håll en rutschkana i 45° vinkel, med hjälp av en rörelse uppåt, lyft upp ett band ur vattnet på rutschkanan och avlägsna försiktigt överflödigt vatten med en luddfri vävnad.
- Torra rutschkanor i 30 min vid 37 °C för att eliminera eventuellt kvarvarande vatten under paraffin.
- Fortsätt till paraffinborttagning eller förvara vid 4 °C i en sluten låda under uttorkande förhållanden (som ska användas inom flera dagar).
- Ta bort paraffin genom att tvätta objektglasen 3x för 20 s vardera i xylen, följt av 2x tvättar av 30 s i 100% (v/ v) etanol och 2x tvättar av 30 s i 70% (v/ v) etanol.
- Fortsätt omedelbart till laser-fånga mikrodissektion efter paraffin avlägsnas.
OBS: Kryosektionering är en alternativ metod som framgångsrikt kopplats ihop med LCM. Prov förberedelse för cryosectioning kommer att skilja sig.
6. Laser-fånga mikrodissektion
- Använd ett laserinfångande mikrodissektionmikroskop (se Tabell över material) till mikrodissektceller från de-paraffiniserade och torkade vävnadssektioner.
- Ladda diabilder på de tre tillgängliga facken.
- Använd de speciella självhäftande locken på uppsamlingsrör för att samla in de fångade proverna. Fånga utan vätska ("torr" samling) minimerar RNase aktivitet. Ladda uppsamlingsrören i de tillgängliga facken.
- Flytta scenen för att lokalisera den region i urvalet som måste klippas. Detta kan göras med hjälp av mus eller joystick av LCM-maskinen, eller piltangenterna på tangentbordet.
- För att optimera skärhastigheten, skärenergi och fokus, laser tryck katapult (LPC) energi och fokus, först skära på ett tomt segment fri från vävnad på membranet slide. För kornfrö, skärhastighet = 18, CutEnergy = 52 CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, LPC fokus = 61 vid 10x förstoring.
OBS: Skärfokus och energi måste justeras för olika diabilder, olika vävnader, och fångas område men allmänna regler är katapultkraften är högre än skäreffekten och lasern måste defocused för katapult. Ju högre förstoring av objektivet lins, desto mindre fokus på lasern och ju högre energi. - Använd Ritverktygen för att markera celler genom att beskriva intresseområdet.
- Välj RoboLPC-funktion från funktionsfältsfältet för att katapultcellerna i de självhäftande locken baserat på de optimerade parametrar som erhålls genom att skära på ett svart segment ovan.
OBS: LCM parametrar varierar mellan vävnadstyper samt tjocklek på avsnitt, vävnad hårdhet och objektiva linser. Därför är det bäst att optimera varje objektglas på ett vanligt membranområde utan vävnadsprov innan det faktiska provet skärs. - Använd flag-verktygen för att markera regioner av intresse för att lokalisera dem omedelbart genom att välja den flaggan från elementlistan.
- Kontrollera av "CapCheck" knappen för att inspektera den självhäftande locket för att bekräfta prover fångades. Typiskt krävs LCM av 10-15 sektioner (~200 celler) per lock för RNA-extraktion.
- Förvara de infångade proverna på is. Fortsätt omedelbart med RNA-extraktion för att undvika RNA-nedbrytning.
OBS: Vissa LCM mikroskopi är utrustade med fluorescerande ljus som gör det möjligt att fånga av celler märkta med fluorescerande markörer.
7. RNA-utvinning
- Använd en RNA-isolering med låg ingång (se Table of Materials) sats för RNA-extraktion efter LCM. Sådana kit är utformade för att återvinna högkvalitativa totala RNA konsekvent från färre än tio celler.
- Isolera det totala RNA från de fångade celltyperna enligt tillverkarens anvisningar inklusive den på-kolonnen DNase behandlingen.
OBS: Det första steget i RNA-extraktionen där röret är inverterat och snärtade är avgörande för att säkerställa att de fångade proverna på locket är i kontakt med extraktionsbufferten som tillsätts.
8. RNA-amplifiering
- Använd ett antisense RNA -amplifieringskit (se Table of Materials) för aRNA-amplifiering från RNA som extraheras genom in vitro-transkription för att producera tillräckligt aRNA för RNA-seq-bibliotekssyntes.
- Utför två omgångar av amplifiering med hjälp av ARNA-amplifieringssatsen enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Det är viktigt att förvärma termo-cycler och lock till den temperatur som instrueras av kit (se Tabell över material) tillverkare. Ett alternativt tillvägagångssätt i stället för RNA-amplifiering är att använda ett beredningspaket för lågindatabibliotek för att syntetisera biblioteket direkt från extraherat RNA.
9. Kvantifiering av RNA
- Kvantifiera och kvalificera aRNA med hjälp av ett automatiserat elektroforessystem (se Table of Materials).
OBS: Ett automatiserat elektroforessystem är att föredra eftersom det kräver mindre prov (1-2 μL) och ger en gelliknande bild och elektroferogram för varje enskilt prov.
10. qRT-PCR och/eller RNA-seq
- Syntetisera cDNA från aRNA för qRT-PCR eller för att göra RNA-seq bibliotek med hjälp av standard RNA-seq bibliotek kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi genererade rumsliga och temporala vävnadsspecifika transkriptomer från kornfrön under grobarhet med hjälp av vårt LCM RNA-seq-protokoll10. Studien genomfördes genom att tillämpa LCM RNA-seq på litet antal celler från tre embryoorgan (plumule, radiklespets, scutellum) var 8 h över en 48 h tidskurs under grobarhet (0-48 h, 7 tidspunkter) (Figur 2A,B).
Figur 2: Celler som samlats in från kornfrön av LCM. (A) Längsgående tvärsnitt av ett kornfrö och, inset, en förstorad tecknad film som anger de regioner från vilka celler fångades. Blå = plumule, magenta = radikkel, grön = scutellum. (B) LCM av plumule, radikel, och scutellum. Topppanel, vävnad före lasertryckskatapulting (LPC). Bottenpanel, vävnad efter LPC. Celler fångades från 5 på varandra följande längsgående avsnitt av varje prov med tre biologiska replikat per prov. Varje replikat bestod av cirka 200 celler (~0,05 - 0,15 mm2 total yta). Bar = 100 μm. E = frövita, C = krossat celllager, SE = scutellarepitelet, S = scutellum. Figur som återges från tidigare data i Växtjournalen med behörighet10. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Fixeringen och inbäddningen är kritiska steg eftersom dåligt fast vävnadsprov kan resultera i vävnadsskador och förlust av RNA-kvantitet och kvalitet. Dessa steg måste optimeras och justeras för olika arter ochvävnadstyper 19,20,21. Här använde vi vakuuminfiltration för att förbättra penetrationen av fixatives i frövävnaderna och cellerna. Uttorkning och paraffininfiltration bedrivs gradvis för att undvika skador på vävnadsproverna. Vi har accelererat hela dehydrering och paraffin infiltrationsprocessen genom att använda en automatiserad vävnad processor med agitation och vakuum tillämpas vid varje steg. Detta minskar i hög grad risken för att RNA-nedbrytning ska inträffa under de förlängda vävnadsbearbetningsstegen som utförs av en mänsklig agent. Innan snittning, Det är avgörande att behandla membranet bilden för att säkerställa paraffin vidhäftning och att se till att det är RNase-fri. Om membranets objektglas inte bereds ordentligt kommer provsektionen inte att hålla fast vid membranet, vilket kommer att påverka LCM-katapultsteget och minska vävnadsöverföringen till de självhäftande locken eftersom provet kommer att separera från membranet (se figur 1).
Ett annat kritiskt steg i LCM RNA-seq-protokollet är LCM-parameteroptimering. Det finns fem huvudparametrar som ska optimeras: (1) skärhastighet; (2) skärenergi; (3) skärfokus; (4) LPC energi; och (5) LPC-fokus. Det är viktigt att justera skärparametrarna korrekt för att skära det valda området exakt och rubba från omgivande vävnad utan att bränna kanten på valt område (Figur 3A,B). Den korrekta LPC energi och fokus är väsentliga för att tillförlitligt katapult det valda området från glid till den speciella självhäftande lock av insamlingsrör, och alltid inspektera fångade prover i locken för att säkerställa tillräckligt med material samlas in (Figur 3C). Effektiviteten hos LCM gör det möjligt att fånga 1000 celler inom en timme, vilket kraftigt minskar sannolikheten för RNA-nedbrytning under provbearbetningen. Användningen av insamlingsrör med självhäftande lock tillåter "torr" samling utan någon fånga vätska, kraftigt minska möjliga RNases aktiviteter. Det är viktigt att hålla de infångade proverna på is och göra RNA-extraktionen omedelbart efter att ha samlat alla replikat.
RNA-extraktion och förstärkning utförs med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit genom att följa tillverkarnas anvisningar. Kvantifiering av totalt RNA före RNA-amplifiering med hjälp av automatiserade elektroforessystem kommer att upptäcka distinkta elektroforetiska band och fluorescerande toppar på 18S och 28S ribosomala subenheter i RNA-prover av god kvalitet (Figur 3D). Ytterligare toppar som motsvarar kloroplast och mitokondriellt ribosomalt RNA kommer att hittas före 18S och 28S toppar. På grund av flera RNA-toppar hos växtarter är RIN-värdena (RNA Integrity Number) typiskt lägre än 9 (det förväntade RIN-värdet från däggdjursvävnader) och återspeglar inte RNA-integriteten22 påett exakt sätt . Det är lämpligt att fortsätta till RNA-amplifiering när tydliga 18S- och 28S-toppar är synliga utan tecken på RNA-nedbrytning. Mängden RNA som återvinns i vårt kornfröexperiment varierade mellan tre olika vävnadstyper (plumule, radik och scutellum) och, även mellan tidiga och sena stadier av grobarhet, trots att ungefär lika många celler skördas. Mängderna från korn frön varierade från 100 pg till 20 ng från cirka 200 celler (0,5 till 100 pg per cell). Den minsta mängd ingående RNA som rekommenderas för RNA-amplifiering var 100 pg. Mängden RNA som utvinns beror på effektiviteten vid utvinning från olika skördade celler och totalt avskriftsöverflöd i det cell-typ i detutvecklingsskedet 19,21. Det är bra att beakta detta när man planerar ett LCM RNA-seq-experiment, även om sådan förhandsinformation inte kommer att vara tillgänglig i alla fall.
Framgångsrikt syntetiseras aRNA kommer att uppvisa en unimodal, symmetrisk storlek distribution från 100 till 1000 nukleotider med en topp runt 300 nukleotider efter två omgångar av förstärkning (Figur 3E). I vårt kornfröexperiment erhöll vi 500 pg till 2 μg aRNA efter två omgångar av RNA-amplifiering10. Jämförelse mellan förstärkta och oförstärkt RNA har visat att RNA-amplifiering är reproducerbar, linjär och inte inför en systematisk bias för att avskrift data23,24,25. UtdataaRNA kan användas för qRT-PCR och/eller RNA-seq för rumslig och temporal vävnadsspecifik genuttrycksanalys. Validering efter RNA-seq måste genomföras för att bekräfta resultat från analys av aRNA. Detta kan göras genom att undersöka uttryck av cell-typ markör gener från RNA-seq data med hjälp av RNA in situ hybridisering.
Bild 3: Representativt resultat av LCM. (A) Vävnad efter skärning med korrekt skärenergi och fokus. En tydlig fin linje kan ses där snittet gjordes. Det valda området kommer att rubbas från omgivande material. Bar = 100 μm. ( B )Vävnadefter skärning med felaktig skärenergi och fokus. Det valda området är fortfarande anslutet till omgivande material. Bar = 100 μm. (C) Undersöka infångade celler i speciella självhäftande lock av uppsamlingsrör. Bar = 100 μm. (D) Ett exempel på total RNA-profil före RNA-amplifiering (vänster, gelliknande bild; höger, elektroferogram) med distinkta elektroforetiska band och fluorescerande toppar på 18S och 28S ribosomala subenheter. Omärkta toppar motsvarar ytterligare ribosomalt RNA inklusive kloroplast och mitokondriella ribosomer. (E) Ett exempel på en typisk aRNA-profil efter RNA-amplifiering (vänster, gelliknande bild; höger, elektroferogram). En fördelning av storlekar från 100 till 1000 nukleotider, med en topp runt 300 nukleotider, upptäcktes. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
RNA-seq-analyser utfördes på alla prover i biologiska tre exemplar. En MDS-plottning (multidimensional scaling) som uttrycks i de olika vävnaderna över 48 h av grobarhet illustrerar större likhet mellan prover av en enda vävnad än mellan prover från samma tidspunkt men olika vävnader (Figur 4A). Vi nästa anges att avgöra hur omfattande gen uttryck var differentiellt regleras i enskilda vävnader över tiden under grobarhet. Antalet differentiellt uttryckta gener (DEGs) ökade successivt under loppet av grobarhet i varje vävnad, i förhållande till den vävnadens 0 h tidspunkt (Figur 4B). Tjugofem procent (910) av plumule, 34% (1876) av radicle och 41% (2562) av scutellum DEGs befanns vara uteslutande differentiellt uttryckt i denna vävnad (dvs. dessa gener var inte differentiellt uttryckt i de andra vävnaderna, Figur 4C). Sammantaget visar dessa resultat hur LCM RNA-seq kan användas för att förstå tidsmässiga och rumsliga genuttryck under växtutveckling.
Figur 4: Analys av RNA-bibliotek av LCM-prover som visar distinkt separation av olika vävnader över 48 h korn grobarhet. (A) Multidimensionell skalning (MDS) tomt av gener uttryckt i de olika vävnaderna över 48 h av grobarhet. Varje punkt representerar 1 prov, och avståndet mellan 2 punkter återspeglar den ledande log fold-ändringen (FC) av motsvarande RNA-prover. X-, y- och z-axeln representerar första, andra och tredje dimensionella logFC. P = plumule, R = radikkel, S = scutellum, 0-48h = h av grobarhet, R1-3 = Replikat 1-3. (B) Antal betydande uppreglerade (röda) och nedreglerade (blå) differentially uttryckta gener (DEGs) för sex tidpunkter jämfört med tidpunkt 0 h för tre vävnadstyper. (C) Venndiagram som visar antal DEGs i tre vävnadstyper. Gener i överlappande uppsättningar visar differensuttrycket i två eller tre vävnadstyper. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många vävnadsspecifika genuttryck studier har begränsats genom hand dissekering av prover, som är tidskrävande, arbetsintensiva, har en hög risk för kontaminering och kan bara utnyttja prover som en mänsklig operativ är tillräckligt fingerfärdig att skörda. LCM är en exakt och kontaktfri teknik för att samla in celler från fasta vävnadssektioner med hjälp av en mekaniskt manövrerad laserstråle under mikroskopisk visualisering.
Bra provpreparering är avgörande för LCM. Processen bygger på korrekt fastställande och inbäddning av prover för att upprätthålla en god balans mellan vävnadsmorfologi och integritet RNA. Protokollet som presenteras här ger optimerade fäst- och inbäddningssteg för kornfrön som inkluderar längre fixeringstid och vakuuminfiltration av fixativ. Analys av olika vävnader eller arter kommer att kräva optimering av villkoren, eftersom dessa vanligtvis skiljer sig mellan vävnader. En annan viktig aspekt av detta protokoll är RNA-förstärkningssteget som säkerställer att tillräckliga mängder RNA genereras för RNA-seq-bibliotekskonstruktion. Vi finner att RNA-amplifiering resulterar i bibliotek av hög kvalitet, men alternativt kan metoder för förberedelse av lågindatabibliotek användas25. Histologisk identifiering av målceller är ett kritiskt steg i vår metod och kan ge utmaningar för sällsynta eller dåligt karakteriserade cell-typer. Målcellsigenkänningen kan förbättras genom att använda traditionella histologiska fläckar eller immunofluorescensfläckar som en del av preprocessingsteget eller alternativt genom att använda transgena linjer som uttrycker fluorescerande märkta cellspecifikamarkörer 26,27.
LCM-tekniken utvecklades först för att användas på djur-härledda prover för cell-typ-specifik avskrift analys1. Ett brett spektrum av genomiska, proteomiska och epigenetiska analyser har dock därefter utvecklats. Att anpassa dessa metoder för applicering i växtbiologiska studier är enfortgående utmaning 18,19,20,28. Schad et al. visade att proteiner och metaboliter från Arabidopsis vaskulära buntar kunde analyseras genom att använda LCM med 2-D gelelektrofores och masspektrometri29,30. Nyligen genomförde Latrasse et al. kromatin immunprecipitation (ChIP)-qPCR analys på LCM-dissekerade ståndare och carpels med hjälp av LCM, fastställa att vävnad homogenitet förbättrar upplösningen av cellspecifika epigenetiska händelser31. Turco et al. kopplade också LCM med bisulfitsekvensering för att studera DNA-metyleringshändelser under vaskulärisering i sorghum, vilket belyser den vävnadsspecifika skillnaden mellan vaskulära och nonvaskulära vävnader32. Intressant, flera studier har tillämpat LCM att utforska växt-mikrob och växt-patogen interaktioner33,34,35. Förmågan hos LCM att visualisera och fånga celler i olika infektionsstadium gav information om de rumsliga och tidsmässiga svaren från infekterade celler.
Vår LCM protokoll tillsammans med RNA-seq presenteras här kommer att underlätta spatio-temporala globala profilering av gen uttryck för distinkta celltyper. Med förbättrade reningsmetoder för kromatin och proteiner tillsammans med förbättrade masspektrometriinstrument kommer LCM att vara ett framväxande verktyg för att underlätta cell-typspecifika epigenomiska och proteomiska studier i växter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) till JW. M.G.L stöddes av ett la Trobe-universitet som började ge bidrag. Vi tackar La Trobe Genomics-plattformen för deras stöd inom sekvensering med hög genomströmning och dataanalys. Vi tackar docent Matthew Tucker för expertråd om att etablera LCM i vårt labb.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).
- Cong, P., et al. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).
- Blokhina, O., et al. Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants. Frontiers in Plant Science. 7, 1965 (2017).
- Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).
- Chen, Z., et al. LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.). The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).
- Jiao, Y., et al. A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies. Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).
- Kivivirta, K., et al. A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms. Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
- Matas, A. J., et al. Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation. The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).
- Sakai, K., et al. Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo. Plant Methods. 14 (1), 10 (2018).
- Zhan, J., et al. RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. Single-Cell Omics. , Elsevier. 101-135 (2019).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56 (2011).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).
- Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells. Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
- Takahashi, H., et al. A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (1), 3 (2006).
- Ferreira, E. N., et al. Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA. Gene. 564 (2), 220-227 (2015).
- Schneider, J., et al. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5 (1), 29 (2004).
- Shanker, S., et al. Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4 (2015).
- Bhattacherjee, V., et al. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells. Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Blokhina, O., et al. Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce. Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).
- Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).
- Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 1 (1), 2 (2005).
- Latrasse, D., et al. The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22 (2017).
- Turco, G. M., et al. DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor. The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).
- Gomez, S. K., Harrison, M. J. Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).
- Roux, B., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing. The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).
- Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).
