Summary
ここに示されているのが、植物組織のレーザー捕捉マイクロ解剖(LCM)のプロトコルです。LCMは、汚染のない方法で組織の領域を単離するための顕微鏡的な技術です。手順は、組織固定、パラフィン埋め込み、切片、LCMおよびRNA抽出を含む。RNAは、下流組織特異的な、一時的に分解されたトランスクリプトムの分析に使用される。
Abstract
複雑な多細胞生物の開発は、異なる転写プロファイルを有する異なる細胞タイプによって支配される。発達過程を支配する転写調節ネットワークを同定するには、これらの個々の細胞タイプの空間的および時間的遺伝子発現プロファイルを測定する必要がある。したがって、生物学的および発達過程がどのように調節されているかを理解するためには、遺伝子発現の時空間的制御に関する洞察が不可欠である。ここでは、発芽中の時間経過に伴い、少量の細胞を3つの大麦胚器官から分離し、転写プロファイリングを行うレーザー捕捉マイクロ解剖(LCM)法について述べた。この方法は、組織固定、組織処理、パラフィン埋め込み、切片、LCMおよびRNA抽出に続いて、リアルタイムPCRまたはRNA-seqで構成されています。この方法により、さまざまな数の細胞(数十~数百)から種子臓器転写体の空間的および時間的プロファイルを取得することができ、典型的なバルク組織分析よりもはるかに大きな組織特異性を提供することができました。これらのデータから、転写調節ネットワークを定義および比較し、個々の組織の候補調節転写因子を予測することができました。この方法は、最小限の最適化で他の植物組織に適用できる必要があります。
Introduction
植物の開発と成長は、複雑な細胞環境に存在する異なる細胞内の転写調節ネットワークの協調作用を伴う。これらの制御ネットワークの活動を理解するためには、発達段階を越えた異なる細胞型における空間的および時間的遺伝子発現に関する知識が必要である。しかし、遺伝子発現の分析は、少数の細胞を隔離して分析するという技術的な課題により、臓器全体またはバルク組織サンプルでより一般的に行われます。ここで説明する方法により、LCMとRNA-seqを結合させることにより、空間的および時間的組織特異的な転写法を得ることが可能になった。
LCMは20年前にエマート・バックと同僚によって開発されました1.この技術により、研究者は狭いビームレーザー1による直接的な顕微鏡的視覚化と操作を使用して、単一細胞または細胞のクラスターを環境から正確に分離することができました。それ以来、この方法は癌生物学と病理22,3において広く用いられている。多くの植物研究グループはまた、異なる植物種と異なる組織,,タイプ44、5、6、7、8、9、10、115,6,7,8で使用するためにLCM10を11適応させました。9最近では、いくつかの論文はまた、種子の発達と発芽10、12、13,12の間に胚、胚および他の種子構造を研究するために、ユージコットおよびモノコット種子にLCMを13使用している。マイクロピペット、細胞選別、磁気分離、マイクロ流体プラットフォームなどの他の一般的に使用される単細胞分離法のほとんどは、細胞を解離するために酵素消化または機械的均質化に依存します。これは、遺伝子発現を摂動させ、データ解釈14,15,15を混乱させる技術的なアーティファクトを導入する。これらの方法では、解き分けされた細胞を空間的位置と真の細胞タイプに関連付けるために、各細胞タイプのマーカー遺伝子に関する以前の知識も必要です。さらなる一群の技術は、例えばINTACT(細胞型でタグ付き核の単離)およびTRAP(リボソーム親和性精製の翻訳)16,17,17など、細胞全体の代わりに細胞内構造の親和性に基づく単離に依存する。しかし、原子核やリボソームの親和性の標識と精製は、確立された変換プロトコルを持たない植物種では技術的に困難です。LCMは、正常な組織/器官コンテキスト内の細胞を直接可視化することによって、迅速な組織固定を利用して転写レベルおよび従来の組織学的同定を維持し、離散細胞を短期間18、19,19で単離することを可能にする。
ここで提示されるプロトコルは、特定の細胞または細胞タイプを穀物種子の組織セクションから分離するための最適化された方法であり、組織学的に同定できるほとんどの細胞に適用することができる。LCMは細胞の分離の接触のない方法を提供し、汚染を大幅に減らし、回収されたRNAの完全性を高める。さらに、この方法は、少量の生物材料から始まる大規模ゲノムワイド研究におけるLCMの力を示す。また、下流転写/転写分析のための十分な入力材料を生成するためのRNAの線形増幅についても説明する。
このLCM RNA-seqプロトコルには、組織サンプルの固定、脱水、パラフィン浸潤、埋め込み、切除、LCM、RNA抽出、RNA増幅、RNA定量およびqRT-PCRおよび/またはRNA-セク法を含む、空間的および時間的組織特異的な転写術のための10の主要なステップがある(図1)。
図1:LCMのフローチャートに続いてRNA-seqまたはqRT-PCRが続く。LCMは、顕微鏡の視覚化の下でレーザービームを使用して固定組織セクションから細胞を収集する空間的に正確で、接触のない技術です。このプロセスは、組織サンプルの固定から始まり、次いでエタノールとキシレンの勾配シリーズを用いた脱水を行い、パラフィン浸潤で終了する。プロセスはティッシュのプロセッサを使用して完全に自動化することができる。組織にパラフィンを浸透させたら、埋め込みステーションを使用して溶融パラフィンを用いた型に埋め込まれる。断面化は、所望の厚さに設定されたミクロトームを用いて行われる。スライドは、RNAが捕捉された細胞から抽出される直前に調製され、LCMを行う。RNA抽出は、qRT-PCRおよび/またはRNA-セクの前に2ラウンドのRNA増幅を直接行います。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
最終製品はRNAであるため、RNasesでの作業を汚染しないように注意してください。手袋を着用することは必須です。ジエチルパイロカーボネート(DEPC)-処理水、緩衝液などを使用してください。オートクレーブバッファーとベークガラス製品を使用する前に。
1. 組織固定
- 種や組織の種類に応じて選択の固定剤を準備します。大麦種子の, 使用ファーマーズ固定剤 (75% エタノール, 25% 氷酢酸 (v/v)).
- 組織を収穫する前に氷の上で固定剤を冷やしてください。
- 目的の植物材料を収集し、必要に応じて、選択した埋め込み金型に収まるように適切なサイズの部分にそれを解剖します。大麦の種子の場合は、固定溶液の浸透を助け、埋め込み型に収まるように、種子を半分の縦方向に切ります。
- 組織を氷冷固定液の少なくとも10倍の体積に沈めます。大麦の種子の場合は、セクキュアに半分に切った種子を水没します。
- 真空浸潤を使用して固定剤の浸透を加速します。組織は、固定剤の真空浸潤後に沈む必要があります。大麦の種子の場合は、真空浸潤の30分を使用してください。
- 固定剤を交換し、4°Cでインキュベートして、固定剤が組織に完全に浸透できるようにします。大麦の種子については、サンプルを一晩(〜12〜16時間)インキュベートします。
注:薄いまたは小さな組織は、組織への固定の高い拡散率のために、より短い固定時間を必要とします。 - 固定剤から組織を取り除き、カセットに組織を移し、組織処理を開始します。
注:葉のティッシュのような小さいか壊れやすいティッシュは固定の間に損傷を与えないことを保障するために固定のためのカセットに置くことができる。生検袋、パッドまたはラップは、組織固定および組織処理工程中にカセットの内部に組織をしっかりと保持するために使用することができる。
2. 組織処理
- ステップ 2 で、最低 10 個の溶液チャンバと 2 つの加熱パラフィンチャンバーを使用する自動組織プロセッサを使用します ( 材料表を参照)。
- 各チャンバに十分な量の溶液があることを確認してください。ティッシュプロセッサの数回の使用の後にソリューションを交換してください。
- カセットとティッシュを入れて金属かごに入れます。金属バスケットをチャンバー1の上のホルダーに取り付けます。ホルダーは、指定されたプログラムに従って、カセットを回転させてチャンバーに「ダンクアンドディップ」します。
- 各チャンバの時間の長さを設定する必要がある組織プロセッサのコントロールパネル上のボタンクリックを実行することにより、プログラムを設定します。
- [開始] ボタンを押して、処理プログラムを開始します。次のプログラムは大麦の種子のために設計され、一晩実行されます (〜18 時間)
- カセットをエタノールの勾配シリーズ(75%、85%、100%、100%、100%エタノール)でそれぞれ1時間30分間浸漬して脱水を行います。
- エタノールを使用してクリアを行う:75:25、50:50、25:75(エタノール:キシレン%、v/v)でそれぞれ1時間30分間のキシレン勾配。その後、カセットを100%キシレンをそれぞれ1時間30分間浸し、100%キシレンを浸します。
- 溶融パラフィンで1時間30分間55〜60°Cでパラフィン浸潤を行います。
注:パラフィンヒーターチャンバーの温度は、ティッシュプロセッサの背面に設定することができます。
- 翌朝、カセットを組織処理装置から取り出し、パラフィン埋め込みに進みます。
メモ:プログラムの時間は、異なる組織の種類によって異なる場合があります。真空および/または攪拌は、組織処理のコントロールパネルの「V」および/または「攪拌」ボタンを押すことによって、選択した溶液の浸潤を加速するために、組織処理中に使用することができます。
3. パラフィン埋め込み
- この手順では、埋め込みマシンを使用します (「 資料表」を参照)。
- 埋め込み機は、埋め込み前に少なくとも数時間前にオンにして、貯水池のパラフィンが完全に溶ける時間を確保するように設定します。
- 始める前に冷たいプレートをオンにします。
- サンプルを細かい鉗子で固定し、溶融パラフィンを金型に分配することで、サンプルを金型に埋め込みます。実験目的ごとにサンプルの適切な向きを確認します。大麦シードの場合、シード縦方向を切断方向に向けて縦断面を得る。
注: 埋め込み金型のサイズは異なります。サンプルを適切に配置して埋め込むには、適切なサイズを選択します。サンプルの向きは、実験のニーズに応じて考慮する必要があります。縦方向のセクションが必要な場合、サンプルは切断方向に縦方向に向け、横断セクションではサンプルを切断方向に平行に向ける必要があります。 - カセットをカセットに入れるため、カセット全体を十分に覆う十分なパラフィンを金型に置きます。
- 金型をコールドプレートに置き、パラフィンを完全に(10〜20分)セットしてから、ブロックを金型から解放します。
- 切り離しに進むか、4 °Cに保管のためにブロックを移します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。埋め込みブロックは、最大3ヶ月間4°Cで保存することができます。
4. ポリエチレンナフタレート(PEN)膜スライドの調製
- 3 sのRNase不活性化溶液に沈むPEN膜スライドは、スライド上のRNasesを除去するためにDEPC処理水中に2回の短いスリングが続きます。37°Cインキュベーターでスライドを乾燥させて、残った溶液を取り除きます。
- 30分間の層流キャビネットにUVランプを使用してスライドをUV処理し、パラフィン接着性を向上させる親水性特性を高めます。
5. 断面化
- 断面化のステップでミクロトームを使用します (「 材料表」を参照)。
- ナイフホルダーに新しい刃を入れ、積極的に切断しないときには常にナイフをガードしてください
注意:ミクロトームブレードは非常に鋭く、不適切に取り扱うと重大な損害を引き起こす可能性があります。
メモ:ミクロトームには2つのロック機構があり、1つは機械の側面にあり、もう1つは車輪のハンドルにあります。どちらも積極的に断面化していない場合に従事する予定です。 - ナイフブロックを、触れることなくできるだけサンプルに近づけるように調整します。マイクロトームアームがマイクロトームに壊滅的な構造的損傷を引き起こすので、マイクロトームアームがナイフブロックに完全に接触しないようにしてください。
- 始める前に冷たいプレートをオンにします。切り離し前にパラフィンブロックを冷たいプレートに保管し、切り離し時に必要に応じてブロックを再冷却してブロックが柔らかくなるのを防ぎます。
- DEPC処理水で水浴を満たし、開始する前に42°Cに加熱します。
- ミクロトームを使用して、希望の深さ(興味のあるセクション)にブロックをトリミングし、希望の厚み(6〜10 μm)でパラフィンブロックを切ります。よく切り離されたブロックは、ブレードの端に「リボン」を形成します。大麦シードの場合、8 μmの厚さのセクション。
- 細かい塗料ブラシや細かい鉗子を使用して、マイクロトームからウォーターバスにリボンを穏やかに移し、リボンが水面に平らであることを確認します。
- 上向きの動きを使用して、45°の角度でスライドを保持し、スライドに水からリボンを持ち上げ、慎重に糸くずのない組織で余分な水を除去します。
- 37°Cで30分間ドライスライドし、パラフィンの下の残りの水を除去します。
- 脱水状態で閉じた箱に4°Cでパラフィン除去または保存に進みます(数日以内に使用します)。
- スライド3xをキシレンで20sずつ洗浄し、続いて30sの2x洗浄を100%(v/v)エタノールで20s、30sの2x洗浄を70%(v/v)エタノールで除去します。
- パラフィンを取り除いた後、すぐにレーザー捕捉マイクロディシスセクションに進みます。
注意: 凍結断面は LCM と正常に結合された別の方法です。凍結切除のサンプル準備は異なります。
6. レーザーキャプチャマイクロディシブ
- レーザーキャプチャマイクロディスセクション顕微鏡( 材料表を参照)を使用して、脱パラフィン化および乾燥組織切片から細胞をマイクロディス分離します。
- 3 つの使用可能なスロットにスライドをロードします。
- 収集サンプルを収集するために、収集管の特殊な接着剤キャップを使用してください。液体(乾燥した」コレクション)なしで捕獲することはRNase活動を最小にする。使用可能なスロットにコレクションチューブをロードします。
- ステージを移動して、切り取る必要があるサンプルの領域を見つけます。これは、LCMマシンのマウスまたはジョイスティック、またはキーボードの矢印キーを使用して行うことができます。
- 切断速度、切断エネルギーと焦点、レーザー圧カタパルト(LPC)エネルギーとフォーカスを最適化するために、最初に膜スライド上の組織のない空白のセグメントに切断します。大麦シードの場合、切削速度= 18、カットエネルギー = 52 カットフォーカス = 63、LPCEnergy = 78、LPC フォーカス = 10 倍倍率で 61。
注:カットフォーカスとエネルギーは、異なるスライド、異なる組織、および捕獲領域のために調整する必要がありますが、一般的なルールは、カタパルト力が切断力よりも高く、レーザーはカタパルトのために焦点を外す必要があります。対物レンズの倍率が高いほど、レーザーの焦点が小さくなり、エネルギーが高くなります。 - [描画] ツールを使用して、対象領域のアウトラインを使用してセルを選択します。
- 上記の黒いセグメントをカットして得られた最適化されたパラメータに基づいて、接着キャップに細胞をカタパルトする機能ツールバーから RoboLPC機能 を選択します。
注:LCMパラメータは、組織の種類だけでなく、セクションの厚さ、組織硬度および対物レンズの間で異なります。したがって、実際のサンプルを切断する前に、組織標本のない平野膜領域上の各スライドを最適化することが最善です。 - [フラグ] ツールを使用して、要素リストからそのフラグを選択して、関心のある領域をすぐに見つける領域をマークします。
- 「CapCheck」ボタンで確認し、接着剤のキャップを検査してサンプルが取り込まれたことを確認します。典型的には、1キャップあたり10〜15セクション(〜200細胞)のLCMがRNA抽出に必要とされる。
- 捕獲したサンプルを氷の上に置いておきなさい。RNAの分解を避けるために、すぐにRNA抽出に進みます。
注意:一部のLCM顕微鏡は蛍光灯を備え、蛍光マーカーで標識された細胞を捕捉することができます。
7. RNA抽出
- LCM後のRNA抽出には、低入力RNA分離( 材料表を参照)キットを使用してください。このようなキットは、10個未満の細胞から一貫して高品質の総RNAを回収するように設計されています。
- オンカラムDNase処理を含むメーカーの指示に従って、キャプチャされた細胞タイプから総RNAを分離します。
注: チューブが反転してフリックされる RNA 抽出の最初のステップは、蓋のキャプチャされたサンプルが、追加された抽出バッファーと接触していることを確認するために重要です。
8. RNA増幅
- インビトロ転写によって抽出されたRNAからaRNA増幅用のアンチセンスRNA(aRNA)増幅キット (材料表を参照) を使用して、RNA-seqライブラリ合成に十分なaRNAを生成します。
- メーカーの指示に従ってaRNA増幅キットを使用して2ラウンドの増幅を行います。
メモ:サーモサイクラーと蓋を、キットの指示温度( 材料表を参照)のメーカーに予熱することが重要です。RNA増幅の代わりに別のアプローチは、抽出されたRNAから直接ライブラリを合成するために低入力ライブラリ調製キットを使用することです。
9. RNA定量
- 自動電気泳動システムを使用してaRNAを定量化し、修飾します( 材料表を参照)。
注:自動化された電気泳動システムは、必要なサンプル(1~2 μL)が少なく、個々のサンプルにゲル状の画像とエレクトロフェログラムを提供するため、好ましいです。
10. qRT-PCRおよび/またはRNA-セク
- qRT-PCR 用の aRNA から cDNA を合成するか、標準の RNA-seq ライブラリ キットを使用して RNA-seq ライブラリを作成します。
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Representative Results
LCM RNA-seq プロトコル10を使用して、発芽中に大麦の種子から空間的および時間的組織特異的な転写を生成しました。この研究は、発芽中の48時間の時間経過(0-48時間、7時間ポイント)にわたって、3つの胚器官(プルプル、ラジクル先端、スクテル)からの少数の細胞にLCM RNA-seqを適用することによって行われた(図2A,B)。
図2:LCMによって大麦の種子から採取された細胞。(A) 大麦の種の縦断面と、細胞が捕獲された領域を示す拡大漫画。青 = プルル、マゼンタ = ラディクル、緑 = スクテルム。(B) プルル、ラジクル、およびスクテルムの LCM。トップパネル、レーザー圧カタパルト(LPC)の前の組織。ボトムパネル、LPC後の組織。細胞は、各サンプルの5つの連続した縦断から、サンプルあたり3つの生物学的複製を用いて捕捉した。各複製は、約200個のセル(〜0.05~0.15 mm2 の面積)で構成されています。Bar = 100 μm. E = 子宮内精子、 C = 破砕細胞層、 SE = スクテラル上皮、 S = スクテルム図は、パーミッション10で工場ジャーナルの以前のデータから再現しました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
固定および埋め込みは、組織サンプルの固定不良が組織の損傷やRNA量と品質の損失をもたらす可能性があるため、重要なステップです。これらのステップは、異なる種および組織タイプ19、20、2120に合わせて最適化および21調整する必要があります。19ここでは、真空浸潤を使用して、種組織および細胞への固定剤の浸透を改善しました。脱水およびパラフィン浸潤は、組織サンプルへの損傷を避けるために徐々に行われる。各ステップで攪拌と真空を適用した自動化された組織プロセッサを使用して、脱水およびパラフィン浸潤プロセス全体を加速しました。これにより、人間の手術によって行われた長期の組織処理工程中に生じるRNA分解のリスクが非常に減少します。切除する前に、パラフィンの密着性を確保し、RNaseフリーであることを確認するために膜スライドを治療することが重要です。膜スライドが適切に準備されていない場合、サンプル部は膜に付着せず、LCMカタパルトステップに影響を与え、サンプルが膜から分離するため、粘着キャップへの組織移動が減少します(図1参照)。
LCM RNA-seq プロトコルのもう 1 つの重要なステップは、LCM パラメータの最適化です。最適化する5つの主要なパラメータがあります: (1) 切断速度;(2) エネルギーの切断(3) カッティングフォーカス(4) LPCエネルギー(5) LPC フォーカス。選択した領域を正確に切断し、選択した領域のエッジを燃焼せずに周囲の組織から外れるには、切断パラメータを正しく調整することが重要です(図3A,B)。適切なLPCエネルギーと焦点は、確実にスライドから収集管の特別な接着キャップに選択された領域をカタパルトし、十分な材料が収集されていることを確認するためにキャップで捕捉されたサンプルを検査するために不可欠です(図3C)。LCMの効率により、1時間で1000個の細胞を捕捉できるため、サンプル処理中のRNA分解の可能性が大幅に低下します。接着剤キャップ付きの回収チューブを使用することで、液体を捕捉することなく「ドライ」な回収が可能になり、可能なRNasesアクティビティを大幅に削減できます。捕獲したサンプルを氷の上に保管し、すべての複製物を採取した直後にRNA抽出を行うことが重要です。
RNAの抽出および増幅は、製造業者の指示に従うことによって市販のキットを使用して行われる。自動電気泳動システムを用いたRNA増幅前のRNA全体の定量化は、良質のRNAサンプル中の18Sおよび28Sリボソームサブユニットの別個の電気泳動バンドおよび蛍光ピークを検出する(図3D)。葉ロプラストおよびミトコンドリアリボソームRNAに対応する追加のピークは、18Sおよび28Sピークの前に見られる。植物種における複数のRNAピークのために、RIN(RNA完全性数)値は典型的には9(哺乳類組織からの期待RIN値)より低く、RNA完全性22を正確に反映しない。RNA分解の兆候なしに18Sおよび28Sのピークが見える場合にRNA増幅を継続することが適切である。大麦種子実験で回収されたRNAの量は、3つの異なる組織タイプ(プルプル、ラジクル、スクテルム)、および発芽の初期段階と後期段階の間で、ほぼ同じ数の細胞が収穫されているにもかかわらず、異なった。大麦の種子からの量は、およそ200細胞(セルあたり0.5〜100 pg)から100 pgから20 ngの範囲でした。RNA増幅に推奨される入力RNAの最小量は100pgであった。抽出されるRNAの量は、開発19,21のその段階での特定の細胞型における異なる採取細胞および総転写量からの抽出の効率に21依存する。LCM RNA-seq実験を計画する際に、この点を考慮すると役立ちますが、このような事前情報は、すべてのケースで利用できるわけではありません。
正常に合成されたaRNAは、2回の増幅後に300ヌクレオチドのピークを迎える100〜1000ヌクレオチドの単一モーダルで対称的なサイズ分布を示す(図3E)。大麦シード実験では、RNA増幅10の2ラウンド後に500pg〜2μgのaRNAを得た。増幅RNAとアンアンプ化RNAの比較は、RNA増幅が再現可能で直線的であり、転写データ23、24、2524,に系統的23バイアスを導入しないことを示している。25出力aRNAは、空間的および時間的組織特異的な遺伝子発現解析のためにqRT-PCRおよび/またはRNA-seqに使用することができます。RNA-seq後の検証は、aRNAの分析結果を裏付けるために行われなければならない。これは、RNA-seqデータから細胞型マーカー遺伝子の発現をその部位ハイブリダイゼーションで調べることで行うことができます。
図3:LCMの代表結果(A)適切な切断エネルギーとフォーカスで切断した後の組織。カットが行われた場所には、はっきりとした細い線が見えます。選択した領域は、周囲のマテリアルから外されます。バー = 100 μm. (B) 間違った切断エネルギーとフォーカスで切断した後の組織。選択した領域は、引き続き周囲のマテリアルに接続されています。Bar = 100 μm(C) 採取した細胞を、採取チューブの特殊な接着キャップで調べる。Bar = 100 μm(D) RNA 増幅前の RNA 全体のプロファイル(左、ゲル状の画像、右、エレクトロフェログラム)の例で、それぞれ異なる電気泳動バンドと蛍光ピークが18Sおよび28Sリボソームサブユニット。標識されていないピークは、葉ロプラストおよびミトコンドリアリボソームを含む追加のリボソームRNAに対応する。(E) RNA増幅後の典型的なaRNAプロファイルの例(左、ゲル状の画像、右、エレクトロフェログラム)。300ヌクレオチド前後のピークを有する100~1000ヌクレオチドの分布が検出された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
RNA-seq分析は、生物学的トリプライセート中のすべてのサンプルに対して行われた。発芽の48時間にわたって異なる組織で発現する遺伝子の多次元スケーリング(MDS)プロットは、同じ時点から異なる組織からのサンプル間よりも単一の組織のサンプル間の類似性が大きいことを示している(図4A)。次に、発芽中の個々の組織で遺伝子発現がどの程度広範囲に調節されているかを調べる。各組織の発芽の過程で、その組織の0時間のタイムポイントに対して、微分発現遺伝子(DEG)の数は徐々に増加した(図4B)。プルルの25%(910)、ラジクルの34%(1876)、スクテルムDEGの41%(2562)は、その組織において排他的に差動的に発現することが判明した(すなわち、これらの遺伝子は他の組織では差で発現しなかった、 図4C)。これらの結果をまとめて、LCM RNA-seqを使用して植物の開発中に時間的および空間的な遺伝子発現を理解する方法を示しています。
図4:大麦発芽の48時間にわたる異なる組織の明確な分離を示すLCMサンプルのRNAライブラリーの分析。(A)発芽の48時間にわたって異なる組織で発現する遺伝子の多次元スケーリング(MDS)プロット。各ポイントは1サンプルを表し、2点間の距離は、対応するRNAサンプルの先行ログフォールド変化(FC)を反映する。x、y、z 軸は、第 1、第 2、および第 3 の寸法 logFC を表します。P =プルル、R =ラジクル、S=スキュテルム、0-48h=発芽のh、R1-3=複製1-3。(B)3種類の組織タイプの時間ポイント0hと比較して、有意なアップレギュレート(赤)およびダウンレギュレート(青色)の遺伝子(DEG)の数を6つの時点で示した。(C)3種類の組織におけるDEGの数を示すベン図。重複集合中の遺伝子は、2種類または3種類の組織での差動発現を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
多くの組織特異的遺伝子発現研究は、時間がかかり、労働集約的であるサンプルの手による解剖によって制限されており、汚染のリスクが高く、人間の手術者が収穫に十分に器用であるサンプルのみを利用することができます。LCMは顕微鏡視覚化の下で機械操作のレーザービームを使用して固定組織セクションから細胞を集める精密で、無接触の技術である。
LCM では、サンプルの準備が重要です。このプロセスは、組織形態とRNAの完全性とのバランスを良好に保つために、サンプルの適切な固定と埋め込みに依存しています。ここに示すプロトコルは、より長い固定時間と固定剤の真空浸潤を含む大麦種子のための最適化された固定および埋め込みステップを提供する。異なる組織や種の分析は、通常、組織間で異なるように、条件の最適化を必要とします。このプロトコルのもう一つの重要な側面は、RNA-seqライブラリ構築のために十分な量のRNAが生成されることを保証するRNA増幅ステップです。RNA増幅は高品質のライブラリを生じるが、代わりに低い入力ライブラリ調製方法が25を採用するかもしれないことを発見した。標的細胞の組織学的同定は、我々の方法において重要なステップであり、希少または不十分に特徴づけられる細胞タイプに対する課題を提供するかもしれない。標的細胞認識は、従来の組織学的染色または免疫蛍光染色を前処理工程の一部として用いることによって、または、あるいは、蛍光標識された細胞特異的マーカー26、27,27を発現するトランスジェニックラインを用いることによって改善され得る。
LCM技術は、細胞型の転写分析1のために動物由来のサンプルに使用されるように最初に開発された。しかし、その後、ゲノム解析、プロテオミクス解析、エピジェネティック解析の幅広い開発が進められている。植物,生物学的研究における応用のためにこれらの方法を適応させることは、18、19、20、2819,の継続的な課題である。182028Schad et al. は、2次元ゲル電気泳動と質量分析29,,30を用いて、シロイヌナズナディス血管束からのタンパク質および代謝産物を LCM を用いて分析できることを実証した。最近、LatrasseらはLCMを用いてLCM解剖された雄人およびカルペルに対してクロマチン免疫沈降(ChIP)-qPCR分析を行い、組織均質性が細胞特異的エピジェネティック事象31の分解能を向上することを確立した。Turco et al. また、LCMとバイサルファイトシーケンシングを結合して、ソルガムにおける血管化中のDNAメチル化事象を研究し、血管組織と非血管組織32との組織特異的な違いを強調する。興味深いことに、いくつかの研究は、植物微生物と植物病原体の相互作用を探索するためにLCMを適用しています33,,34,,35.LCMが異なる感染段階で細胞を可視化して捕捉する能力は、感染した細胞の空間的および時間的応答に関する情報を提供した。
ここで紹介するRNA-seqと結合した当社のLCMプロトコルは、異なる細胞型の遺伝子発現の時空間的グローバルプロファイリングを促進します。クロマチンおよびタンパク質の精製方法の改善と質量分析計の強化により、LCMは植物における細胞型エピゲノムおよびプロテオミクス研究を促進する新たなツールとなります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、オーストラリア研究評議会植物エネルギー生物学優秀センター(CE140100008)によってJWに支援されました。M.G.Lは、ラ・トローブ大学の助成金の開始によって支援されました。ラ・トローブ・ゲノミクス・プラットフォームがハイスループットシーケンシングとデータ分析をサポートしてくれたことに感謝します。私たちの研究室でLCMを確立するための専門家のアドバイスをマシュー・タッカー准教授に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Clear base moulds 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Lowprofile disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffin (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| Xylene | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | with PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss miscroscopy | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
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