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Biology

सीटू संकरण में दो रंग एकल अणु फ्लोरेसेंस का उपयोग करके एस्चेरिचिया कोलाई में अंतरिक्ष और समय में एमआरएनए काइनेटिक्स की जांच करना

Published: July 30, 2020 doi: 10.3791/61520
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2
1Department of Physics, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Center for the Physics of Living Cells, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

यह प्रोटोकॉल एमआरएनए संश्लेषण और क्षरण के वीवो काइनेटिक्स को मापने के लिए सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल-अणु फ्लोरेसेंस के अनुप्रयोग का वर्णन करता है।

Abstract

सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल-अणु फ्लोरेसेंस व्यक्तिगत कोशिकाओं में एमआरएएनए की पूर्ण संख्या की गणना करने की अनुमति देता है। यहां, हम एस्चेरिचिया कोलाईमें प्रतिलेखन और एमआरएनए क्षरण की दरों को मापने के लिए smfish के एक आवेदन का वर्णन करते हैं। चूंकि स्मफिश निश्चित कोशिकाओं पर आधारित है, इसलिए हम एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग के दौरान कई समय बिंदुओं पर smfish प्रदर्शन करते हैं, यानी, जब कोशिकाएं जीन अभिव्यक्ति के प्रेरण या दमन पर सिंक्रोनाइज्ड परिवर्तनों से गुजर रही होती हैं। हर समय बिंदु पर, एक एमआरएनए के उप-क्षेत्रों को प्रतिलेखन विस्तार और समय से पहले समाप्ति की जांच करने के लिए स्पेक्ट्रैल रूप से प्रतिष्ठित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का परिणाम कोशिकाओं के बीच एमआरएएनए कॉपी नंबरों में mRNAs और विषमता के इंट्रासेलुलर स्थानीयकरण का विश्लेषण करने की भी अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके कई नमूनों (~ 50) को 8 घंटे के भीतर संसाधित किया जा सकता है, जैसे कि कुछ नमूनों के लिए आवश्यक समय की मात्रा। हम चर्चा करते हैं कि बैक्टीरियल कोशिकाओं में विभिन्न mRNAs के प्रतिलेखन और क्षरण गतिज का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को कैसे लागू किया जाए।

Introduction

डीएनए से एमआरएनए और प्रोटीन तक आनुवंशिक जानकारी का प्रवाह सबसे मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं में से एक है, जिसका विनियमन सेलुलर फिटनेस1के लिए महत्वपूर्ण है। एक कोशिका में mRNAs की संख्या दो गतिशील प्रक्रियाओं, प्रतिलेखन, और mRNA गिरावट द्वारा निर्धारित किया जाता है। हालांकि, कैसे प्रतिलेखन और mRNA गिरावट समय में विनियमित कर रहे है और एक ही कोशिका के स्थान पूरी तरह से समझ में नहीं आता है, मोटे तौर पर प्रयोगात्मक तरीकों की कमी के कारण मात्रात्मक रूप से वीवो में अपने काइनेटिक्स को मापने के लिए ।

कोशिकाओं की आबादी से निकाले गए कुल mRNAs के आधार पर विधियां, जैसे उत्तरी दाग, आरटी-पीसीआर, आरएनए अनुक्रमण, और जीन अभिव्यक्ति microarrays, एमआरएनए के स्तर में सापेक्ष अंतर को माप सकते हैं और व्यापक,रूप से ट्रांसक्रिप्शन विस्तार2,3,4,5 या एमआरएनए,क्षरण6, 7,7की दर की दर का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है।, हालांकि, वे प्रति सेल एमआरएन की पूर्ण संख्या प्रदान नहीं करते हैं, और इसलिए, वे ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा8की दर की जांच करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इसके अलावा, क्योंकि mRNAs कोशिकाओं की आबादी से निकाले जाते हैं, एक ही कोशिका के भीतर mRNAs के स्थानिक वितरण और कोशिकाओं के बीच mRNA कॉपी संख्या की परिवर्तनशीलता मापा नहीं जा सकता है ।

व्यक्तिगत कोशिकाओं (scRNAseq) पर अगली पीढ़ी के आरएनए अनुक्रमण जीनोमिक स्केल9में प्रति सेल mRNAs की संख्या निर्धारित कर सकते हैं । हालांकि, नमूना तैयारी और उच्च लागत के साथ चुनौतियों के कारण ट्रांसक्रिप्शन काइनेटिक्स को मापने के लिए इस तकनीक का उपयोग करना मुश्किल बना हुआ है। विशेष रूप से, कम एमआरएनए बहुतायत10, 11,11के कारण बैक्टीरिया के लिए scRNAseq का आवेदन तकनीकी रूप से मुश्किल हो गया है।

सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल-अणु फ्लोरेसेंस फ्लोरोसेंटली-लेबल एकल-फंसे जांच के संकरण पर आधारित है जिनके दृश्य ब्याज12, 13,13के लक्ष्य एमआरएनए के पूरक हैं। अनुक्रम-विशिष्ट संकरण की अवधारणा उत्तरी दाग या आरटी-पीसीआर में उपयोग की जाने वाली है, लेकिन संकरण निश्चित कोशिकाओं के भीतर सीटू में किया जाता है, ताकि RNAs के मूल स्थानीयकरण को संरक्षित किया जा सके। एक एमआरएनए का संकेत कई जांचों का उपयोग करके परिलक्षित होता है, ~ 20 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) लंबाई में, एक एमआरएनए(चित्रा 1A)13के विभिन्न हिस्सों में संकरण। इस "टाइलिंग" जांच दृष्टिकोण में, एक ही mRNA का पता लगाने के लिए आवश्यक जांच की संख्या mRNA की लंबाई है कि assayed जा सकता है पर एक कम सीमा सेट । वैकल्पिक रूप से, ब्याज की एमआरएनए को ट्रांसक्रिप्शनली रूप से टैंडेम लाख ऑपरेटर दृश्यों की एक गैर-कोडिंग सरणी में जोड़ा जा सकता है, जैसे कि फ्लोरोसेंटली लेबल वाली लैको प्रोब की कई प्रतियां एक एमआरएनए(चित्रा 1 बी)14के लिए संकरित होती हैं।

smfish स्थिर राज्य में प्रति सेल mRNAs की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (यानी, जब संश्लेषण और क्षय संतुलन में हैं) और जीवाणु कोशिकाओं के बीच mRNAs के मतलब और परिवर्तनशीलता का विश्लेषण करने के लिए15,16,,17।, हाल ही में, ई. कोलाई,18, 19,19,20में जीन अभिव्यक्ति के प्रेरण या दमन के ठीक बाद, गैर-स्थिर स्थिति में एमआरएनए संख्याओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए smfish लागू किया गया है । पूर्ण एमआरएनए कॉपी नंबरों में अस्थायी परिवर्तन तब ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा, विस्तार और समाप्ति की दर की गणना करने के साथ-साथ एमआरएनए क्षरण की दर का उपयोग किया जाता था। इस आवेदन के लिए, पारंपरिक smfish प्रक्रियाओं बोझिल हो सकता है क्योंकि वहां कई नमूने हैं, प्रत्येक एक समय बिंदु का प्रतिनिधित्व करते हैं, कि कई बफर विनिमय कदम (यानी, अपकेंद्रित्र और धोने) के माध्यम से जाने की जरूरत है । यहां, हम एक स्मफिश प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें सेल को कवर्लिप की सतह का पालन करके और वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली14, 19,के साथ तरल पदार्थ को प्राप्त करके नमूना हैंडलिंग चरणों को नाटकीय रूप से सरल बनायाजाताहै। एक उदाहरण के रूप में ई. कोलाई में लैक्ज़ की अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए, पूर्ण कार्यप्रवाह(चित्रा 2)का प्रदर्शन किया जाता है, जिसमें छवि विश्लेषण(चित्र 3)ट्रांसक्रिप्शन (दीक्षा, विस्तार, और समाप्ति) के वीवो काइनेटिक्स में उपज और एमआरएनए क्षरण, एमआरएनए अभिव्यक्ति में सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता, और एमआरएनए स्थानीयकरण शामिल है। हम आशा करते हैं कि प्रोटोकॉल विभिन्न बैक्टीरिया प्रजातियों में वीवो काइनेटिक्स और अन्य mRNAs के स्थानीयकरण में जांच के लिए व्यापक रूप से लागू होता है।

Protocol

1. smfish जांच की तैयारी

नोट: एक ही फ्लोरोफोर के साथ smfish जांच लेबल करने के लिए, एनएचएस एस्टर रसायन विज्ञान21के आधार पर न्यूक्लिक एसिड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड लेबलिंग के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का पालन करें ।

  1. डिजाइन smfish जांच। ब्याज के जीन के लिए "टाइलिंग" जांच या "सरणी" जांच(चित्रा 1)का उपयोग करना है या नहीं, यह तय करें। निर्णय लेने के तरीके पर चर्चा अनुभाग देखें।
    1. "टाइलिंग" जांच(चित्रा 1A) केलिए, एक ऑनलाइन जांच डिजाइनर उपकरण का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. "सरणी" जांच(चित्रा 1B) केलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए एक ब्लास्ट अनुक्रम खोज करें कि जांच अनुक्रम किसी अन्य एमआरएनए दृश्यों के पूरक नहीं है।
    3. लैक्ज़ एमआरएनए ट्रांसक्रिप्शन और क्षरण काइनेटिक्स का अध्ययन करने के लिए, 24 जांच के दो सेट का उपयोग करें, प्रत्येक सेट में पहले और अंतिम 1 केबी क्षेत्रों को शामिल किया गया है जो लैक्ज़ (3,072 बीपी)19हैं।
      नोट: इन जांच सेटों को क्रमशः "5' mRNA जांच" और "3' mRNA जांच" के रूप में संदर्भित किया जाता है । इन जांचों के दृश्य सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं।
  2. 5 ' अंत में एक C6 अमीनो लिंकर के साथ डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के रूप में जांच दृश्यों का आदेश दें । 1 mm करने के लिए पानी में व्यक्तिगत जांच भंग।
  3. "5' mRNA जांच " और "3' mRNA जांच सेट के लिए जांच की समानता मात्रा में गठबंधन । उदाहरण के लिए, lacZके लिए निर्धारित 5 'mRNA जांच के लिए, प्रत्येक जांच के 20 माइक्रोन (सेट में कुल 24 प्रकार की जांच) को मिलाएं।
  4. प्राथमिक और माध्यमिक अमीनों (जैसे ट्रिस, ग्लाइसिन और अमोनियम लवण) के किसी भी संदूषण को हटाने के लिए संयुक्त जांच के22 इथेनॉल वर्षा करें जो संजीदगी प्रतिक्रिया को रोक सकते हैं। अंत में, डीएनए गोली को 100 माइक्रोल पानी में भंग करें (जांच सेट में डीएनए के ~ 4.5 mM उपज)।
    नोट: इस कदम की सिफारिश की है, भले ही जांच निर्माता द्वारा एक मानक desalt शुद्धिकरण से गुजरना पड़ा । इथेनॉल वर्षा के स्थान पर और इसके अलावा एक मानक फ़िल्टर-आधारित शुद्धिकरण काम कर सकता है।
  5. एक monofunctional एनएचएस एस्टर मोइजिटी के साथ दो स्पेक्ट्रेली अलग फ्लोरोफोरस चुनें, जैसे कि 5 ' और 3 ' mRNA जांच सेट अंतर लेबल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, 5 ' mRNA जांच के लिए Cy5 एनएचएस एस्टर और 3 ' mRNA जांच के लिए Cy3B एनएचएस एस्टर तैयार करें । निर्जल डीएमएसओ में प्रत्येक प्रकार के फ्लोरोफोरस को अंतिम 20 मिलीग्राम/एमएल (~ 25 mM) में भंग करें।
  6. प्रत्येक लेबलिंग प्रतिक्रिया से ठीक पहले 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट (पीएच 8.5) तैयार करें। लंबे समय तक हवा के संपर्क में आने से इसके पीएच कम हो जाएंगे और लेबलिंग दक्षता कम हो जाएगी।
  7. संयुग्म प्रतिक्रिया के लिए, निम्नलिखित को मिलाएं: Cy5 फ्लोरोफोर स्टॉक के 15 माइक्रोन (चरण 1.5 से), 5 एमआरएनए जांच सेट के 4 माइक्रोन (चरण 1.4 से), सोडियम बाइकार्बोनेट के 75 माइक्रोन (चरण 1.6 से), और पानी की 7 माइक्रोन। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब लपेटें और 3-6 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिला।
    नोट: अब इनक्यूबेशन जरूरी अधिक लेबलिंग दक्षता में परिणाम नहीं है । इसके अलावा, यदि घटकों की सांद्रता बनाए रखी जाती है तो प्रतिक्रिया को ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है।
  8. 3 ' mRNA जांच सेट और इसी फ्लोरोफोर (यानी, Cy3B एनएचएस-एस्टर) के लिए उपरोक्त कदम दोहराएं ।
  9. संयुक्त राष्ट्र की प्रतिक्रिया वाले डाई अणुओं को हटाने के लिए इथेनॉल वर्षा22 करें। 1एमएम ईडीटीए के साथ 10एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0) के ~ 50 माइक्रोन में गोली को भंग करें।
  10. यूवी-विस स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके डीएनए और फ्लोरोफोर की सांद्रता का अनुमान लगाएं।
    1. 260 एनएम और 559 एनएम (Cy3B) या 649 एनएम (Cy5) पर अवशोषण को मापें। यदि नमूना सटीक माप प्राप्त करने के लिए बहुत केंद्रित है, तो नमूने के 1 माइक्रोन को 10 माइक्रोन तक पतला करें।
    2. अवशोषण को एकाग्रता में परिवर्तित करें:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      ε डीएनए = 0.2 माइक्रोन-1 (20-एनटी एकल फंसे डीएनए के लिए), εCy5 = 0.25 μM-1,और εCy3B = 0.13 μM-1
      नोट: [डीएनए] समाधान के भीतर कुल जांच की एकाग्रता है । व्यक्तिगत जांच की एकाग्रता लगभग 24x कम है। कुल जांच की एकाग्रता इस बिंदु से "जांच सांद्रता" के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा । यदि [डीएनए] और [डाई] के बीच अनुपात 1 है, तो निम्नलिखित एचपीएलसी चरणको 23को छोड़ दिया जा सकता है, और नमूना को ते बफर में अंतिम 4-5 माइक्रोन तक पतला किया जाना चाहिए।
  11. (अनुशंसित) एचपीएलसी का उपयोग करके अवेलेबल जांच और मुफ्त रंगों से लेबल की गई जांच को शुद्ध करें।
    नोट: हालांकि इस अतिरिक्त शुद्धिकरण कदम नमूना के नुकसान के लिए नेतृत्व करेंगे, यह डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद है । अवेलेबल डीएनए जांच को हटाने से एमआरएनए लक्ष्यों से फ्लोरेसेंस सिग्नल में वृद्धि होगी और अप्रतिक्रियाओं के रंगों को हटाने से पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस कम हो जाएगी ।
    1. एक मानक विश्लेषणात्मक C18 कॉलम के साथ एचपीएलसी तैयार करें, 0.1 एम ट्राइथाइलामोनिय एसिटेट (टीए) बफर ए के रूप में, और बफर बी के रूप में एसीटोनीट्रिल।
    2. 0.1 मीटर टीए बनाने के लिए नमूने में 1 एम टीए (चरण 1.9 से) जोड़ें।
    3. ढाल कार्यक्रम को इस प्रकार निर्धारित करें: 0%B के साथ 0-5 मिनट, बी के 0-30% रैखिक ढाल के साथ 5-35 मिनट, बी के 30-100% रैखिक ढाल के साथ 35-37 मिनट, और 0% B के साथ 37-40 मिनट प्रवाह दर ०.१ mL/min पर रखें और २६० और ६४९ एनएम (Cy5-लेबल नमूनों के लिए) पर या २६० और ५५९ एनएम (Cy3B लेबल नमूनों के लिए) पर रिकॉर्ड क्रोमोग्राम ।
    4. डीएनए और फ्लोरोफोर दोनों चैनलों में अवशोषण बढ़ने पर एलुयूटी नमूना एकत्र करें।
    5. वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके एलुट किए गए नमूने को केंद्रित करें और 50-100 माइक्रोन ते बफर में गोली को फिर से निलंबित करें।
  12. यूवी-विस स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके डीएनए और फ्लोरोफोर की एकाग्रता की जांच करें (चरण 1.10 देखें)। यदि आवश्यक हो, तो 4-5 माइक्रोन के आसपास अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए। -20 डिग्री सेल्सियस पर जांच स्टोर करें

2. समाधान की तैयारी

  1. बड़ी मात्रा में डीईपीसी-उपचारित पानी और बफ़र्स(टेबल 1)तैयार करें। ये समाधान कमरे के तापमान पर एक साल से अधिक समय तक हो सकते हैं।
  2. 4x फिक्सिंग समाधान और धोने समाधान(तालिका 1)तैयार करें।
  3. प्री-हाइब्रिडाइजेशन सॉल्यूशन तैयार करें और हाइब्रिडाइजेशन सॉल्यूशन(टेबल 1) कीजांच करें। चरण 5.1 या चरण 6.1 में इनक्यूबेशन के दौरान जांच संकरण समाधान तैयार करें और फिर समाधान को प्रकाश के संपर्क को कम करने के लिए कवर के साथ 20-40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस काउंटरटॉप शेकर में रखें।
    नोट: वास्तविक संकेत को अधिकतम करते हुए पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए लैक्ज़ जांच सेट के लिए फॉर्ममाइड, एसएससी और जांच की सांद्रता को अनुकूलित किया गया था। विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इन सांद्रता को संशोधित करने के तरीके के बारे में विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें।

3. कवरस्लिप और ग्लास स्लाइड की तैयारी

  1. क्लीन कवर्लिप्स और ग्लास स्लाइड।
    1. संदंश का उपयोग करके एक कॉपलिन जार में व्यक्तिगत कवर्लिप्स और स्लाइड रखें। सुनिश्चित करें कि कवर्लिप्स और स्लाइड अलग हो जाएं और एक-दूसरे को न छूएं।
    2. जार को 100% इथेनॉल से भरें और ढक्कन बंद करें। जार को पानी से नहाने वाले अल्ट्रासोनिक क्लीनर में रखें और 15-20 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
      नोट: पानी-स्नान ध्वनिक के लिए, हीटर फ़ंक्शन को बंद करने की सिफारिश की जाती है।
    3. इथेनॉल डालें और अल्ट्रापुरे पानी से 3-4x धोएं। जल शोधन मशीन से सीधे बहने वाले पानी का उपयोग करें।
    4. जार से पानी बाहर डालो और 70% इथेनॉल के साथ इसे भरने। ढक्कन बंद करें और 15-20 मिनट के लिए सोनीशन करें और अल्ट्रापुरे पानी से धोएं।
    5. जार को अल्ट्रापुरे पानी से भरें और 15-20 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
      नोट: कवरस्लिप और ग्लास स्लाइड को अल्ट्रापुरे पानी से भरे कोप्लिन जार में रात भर रखा जा सकता है।
    6. साफ संदंश का उपयोग कर Coplin जार से बाहर एक स्लाइड या कवरलिप ले लो और झटका-यह एन2 गैस का उपयोग कर सूखी । शेष स्लाइड्स और कवरस्लिप के लिए इसे दोहराएं।
  2. चरण 7.5 में उपयोग होने तक सूखे स्लाइड्स को एक साफ स्टोरेज बॉक्स में रखें। सूखे कवरस्लिप को एक खाली 1,000-μL पिपेट टिप बॉक्स में रखें, जो शेष प्रक्रिया में "कक्ष" के रूप में काम करेगा।
  3. हाइड्रोफोबिक मार्कर का उपयोग करके, पिपेट टिप बॉक्स में गोलाकार छेद के बाद कवरस्लिप पर सर्कल खींचें। ये सर्कल (व्यास में ~ 0.5 सेमी) "कुओं" के रूप में काम करेंगे। मार्कर को पूरी तरह से सूखने के लिए कम से कम 5-10 मिनट इंतजार करें।
    नोट: टिप बॉक्स का ढक्कन हमेशा बंद रखें।
  4. प्रत्येक कुएं पर 0.1% पॉली-एल-लिसिन की 20-माइक्रोल ड्रॉप लागू करें। कमरे के तापमान पर 10-50 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: अच्छी तरह से आकार के अनुसार इस मात्रा को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि समाधान पूरी तरह से अच्छी तरह से क्षेत्र को कवर करता है। लंबे समय तक इनक्यूबेशन वाष्पीकरण से बचने के लिए सावधान रहें।
  5. इनक्यूबेशन के बाद सतह को छूने के बिना पॉली-एल-lysine aspirate के रूप में यह पाली-एल-lysine बंद परिमार्जन होगा । फिर पॉली-एल-लिसिन शोधित कुओं में डीईपीसी पानी की एक बूंद (~ 20 माइक्रोन) लगाएं। चरण 5.1 तक वाष्पीकरण को रोकने के लिए "कक्ष" के ढक्कन को बंद करें।

4. समय-पाठ्यक्रम प्रयोग और नमूना निर्धारण

  1. 250-एमएल फ्लास्क में ~ 20 एमएल तरल संस्कृति में ई कोलाई कोशिकाएं उगाएं। फ्लास्क को वॉटर बाथ शेकर (30 डिग्री सेल्सियस) में रखें और हिलते रहें। सैंपल लेते समय ही शेकर बंद करें।
    नोट: इस पेपर में प्रस्तुत परिणाम M9 न्यूनतम माध्यम में उगाए गए MG1655 कोशिकाओं से प्राप्त किए जाते हैं, जो 0.2% ग्लाइस्रोल, 0.1% कैसामिनो एसिड, और 1 मिलीग्राम/एल थिमाइन के साथ घातीय विकास चरण (ओडी600~ 0.2) के साथ पूरक होते हैं।
  2. एक खाली 1.5 एमएल ट्यूब में 4x फिक्सिंग समाधान के 250 μL जोड़ें। दोहराएं और कई ट्यूब तैयार करें, जितना समय अंक लिया जाना है। समय बिंदु संख्या के साथ ट्यूबों लेबल और उन्हें कमरे के तापमान पर रखने के लिए।
  3. समय-पाठ्यक्रम प्रयोग शुरू करने से पहले सेल कल्चर (ओडी600~ 0.2) के 750 माइक्रोन लें। "समय शून्य" (चरण 4.2 से) के लिए चिह्नित ट्यूब में संस्कृति जोड़ें। फिक्सिंग समाधान के साथ कोशिकाओं को मिलाने के लिए धीरे-धीरे ट्यूब को उलटें।
    नोट: कोशिकाओं पर मिश्रण, भंवर, या "किसी न किसी" होने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट न करें। यह नमूना दमित राज्य का प्रतिनिधित्व करता है और एक ही mRNA की फ्लोरेसेंस तीव्रता की गणना करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा (चरण 9.4 देखें)।
  4. लैक्ज़ अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए तरल संस्कृति में आइसोप्रोपिल β-डी-1-थिओगलाकोटोपिरानोसाइड (आईपीटीजी) का 0.02-1 mm जोड़ें। इस बिंदु पर एक टाइमर शुरू करें (टी = 0 मिनट) और तब से एक निश्चित समय अंतराल (उदाहरण के लिए, हर 1 मिनट) पर नमूना। नमूने के लिए, दोहराने चरण 4.3।
  5. लाख एक्सप्रेशन को दबाने के लिए टाइम-कोर्स प्रयोग (जैसे टी =1.5 मिनट) के दौरान एक निश्चित समय पर 5 एमएम ऑर्थोनिट्रोफेynl-β-डी-फ्यूकोपिरिनोसाइड (ओएनपीएफ) या 500 एमएम ग्लूकोज 24 जोड़ें। lacZ फिर से दमन के बाद, mRNA गिरावट को ट्रैक करने के लिए संस्कृतियों (चरण 4.3) का नमूना जारी रखें।
    नोट: दमन भी ~४०० μg/mL rifampicin, एक प्रतिलेखन दीक्षा अवरोधक25के साथ किया जा सकता है ।
  6. निर्धारण के लिए, 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना कोशिकाओं युक्त ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, इसके बाद 30 मिनट के लिए बर्फ में इनक्यूबेशन ।
  7. फिक्सेटिव्स को हटाने के लिए, कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 4,500 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। एक पिपेट के साथ सुपरनेट निकालें।
    नोट: सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एक अलग अपशिष्ट कंटेनर में फॉर्मलडिहाइड को त्यागना सुनिश्चित करें।
  8. 1 एमएल डीईपीसी-पीबीएस जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। अपकेंद्री दोहराएं और 2x अधिक बार पुनः निलंबन करें।
    नोट: फिक्स्ड कोशिकाओं नाजुक हैं और कोमल उपचार की जरूरत है। ध्यान से फिर से गोली निलंबित और बुलबुले से बचें।
  9. अंतिम धोने के कदम के बाद, ~30 माइक्रोन डीईपीसी-पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।

5. कोशिका झिल्ली का परिव्ययीकरण

  1. हर बार कवरस्लिप (~ 30 μL प्रति अच्छी तरह) पर विभिन्न कुओं के लिए बिंदु नमूना लागू करें। सतह पर पालन करने के लिए कोशिकाओं के लिए कमरे के तापमान पर 10-30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें । कुओं के बीच तरल बूंदों के विलय से बचें।
  2. अनबाउंड कोशिकाओं को कुल्ला करने के लिए, तरल को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से ~ 20 माइक्रोन डीईपीसी पीबीएस लागू करें। कुछ ही मिनटों के भीतर DEPC PBS Aspirate।
  3. 4 मिनट के लिए प्रत्येक कुएं में 70% इथेनॉल के 15 माइक्रोन लागू करके कोशिका झिल्ली को पार करें। 4 मिनट के बाद इथेनॉल को एस्पिरेट करें, और सुनिश्चित करें कि कुएं पूरी तरह से सूखे हैं।
    नोट: 4 मिनट के लिए इथेनॉल उपचार को सीमित करना महत्वपूर्ण है। लंबे समय तक उपचार के परिणामस्वरूप ओवर-पारमेबिलाइजेशन होगा।
  4. प्रत्येक कुएं में धोने के समाधान के 30 माइक्रोन लगाएं।

6. जांच संकरण

  1. प्रत्येक कुएं से धोने के समाधान को एस्पिरेट करें। प्रत्येक कुएं में पूर्व-संकरण समाधान के 30 माइक्रोन लागू करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में कक्ष इनक्यूबेट।
    नोट: आर्द्रता प्रदान करने के लिए कक्ष के नीचे ~ 50 मिलियन पानी जोड़ें।
  2. प्रत्येक कुएं से पूर्व-संकरण समाधान को एस्पिरेट करें। प्रत्येक अच्छी तरह से जांच संकरण समाधान के ~ 30 μL लागू करें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में एल्यूमीनियम पन्नी और इनक्यूबेट के साथ कक्ष को कवर करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि जांच संकरण समाधान इस कदम से पहले 37 डिग्री सेल्सियस काउंटरटॉप शेखर में है। कुओं के बीच तरल पदार्थ के विलय से बचें। यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक कुएं के समाधान की एक छोटी मात्रा लागू करें।

7. पोस्ट-हाइब्रिडाइजेशन वॉश और इमेजिंग के लिए तैयारी

  1. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, एक बार में प्रत्येक अच्छी तरह से धोने के समाधान के ~ 30 μL लागू करें। एस्पिरेट करें और धोने के 3-5x बार दोहराएं। 15-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में कक्ष को इनक्यूबेट करें।
  2. दो बार चरण 7.1 दोहराएं।
  3. प्रत्येक को डीईपीसी-पीबीएस 5x बार अच्छी तरह से धोएं। चरण 7.1 में उपयोग की जाने वाली विधि का पालन करें लेकिन इनक्यूबेशन प्रक्रिया को छोड़ दें।
  4. कवरस्लिप से तरल को एस्पिरेट करें। प्रत्येक कुएं में डीईपीसी-पीबीएस के 4 माइक्रोन लागू करें।
  5. संदंश का उपयोग करना, कवरस्लिप को उठाएं और फ्लिप करें, और धीरे-धीरे इसे एक ग्लास स्लाइड (चरण 3.2 से) पर रखें। बुलबुले से बचें।
  6. सिलिकॉन दंत गम के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें।
  7. गम जम जाने तक इंतजार करें। कोई भी यहां रुक सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्लाइड स्टोर कर सकता है।
    नोट: अन्य एसएमफिश प्रोटोकॉल ऑक्सीजन स्कैवेंजिंग रिएजेंट्स (जैसे, ग्लूकोज ऑक्सीडेस/कैटालेस) को जोड़ने या फ्लोरोफोरस की फोटोस्टेबिलिटी बढ़ाने के लिए एक वाणिज्यिक एंटी-फीका बढ़ते मध्यम14,,26 का उपयोग करने का सुझाव देते हैं।

8. इमेजिंग

  1. ब्याज का क्षेत्र खोजने के लिए, चरण कंट्रास्ट इमेजिंग के लाइव मोड का उपयोग करें। मंच जॉयस्टिक पैंतरेबाज़ी करके एक कुएं के भीतर देखने के क्षेत्र को बदलें। एक ऐसा क्षेत्र चुनें जहां सेल घनत्व इष्टतम हो (यानी, कई कोशिकाएं हैं जो ज्यादातर अलग हो जाती हैं)। जेड-फोकस को समायोजित करें जैसे कि चरण-विपरीत सेल छवियां फोकस में हैं।
  2. Cy5 (4-s एक्सपोजर), Cy3 (2-s एक्सपोजर), और चरण विपरीत (0.2-s एक्सपोजर) के क्रम में स्नैपशॉट लें।
    नोट: Cy3B डाई अणुओं Cy3 चैनल में छवि रहे हैं, और छवियों Cy3 छवियों के रूप में संदर्भित कर रहे हैं ।
  3. एक कुएं के भीतर ~ 10 विभिन्न क्षेत्रों की छवियों को प्राप्त करने के लिए चरण 8.1-8.2 दोहराएं।
  4. उद्देश्य को एक और अच्छी तरह से ले जाएं और 8.1-8.3 चरण दोहराएं।
  5. झगड़ा फ़ाइलों के रूप में निर्यात छवियों।
  6. (वैकल्पिक) छवि पंजीकरण उद्देश्यों के लिए Cy5 और Cy3 चैनलों के बीच स्थानिक बदलाव निर्धारित करने के लिए Cy5 और Cy3 चैनलों में कवरस्लिप सतह पर इमेज मल्टी-कलर मोती एडसोरब।
    1. एक साफ कवरस्लिप सतह पर बहु-रंग फ्लोरोसेंट मोतियों (0.2 माइक्रोन व्यास) के ~ 10 माइक्रोन लागू करें और 10-30 मिनट की प्रतीक्षा करें। पीबीएस के ~ 50 माइक्रोन के साथ धोने के बाद, पीबीएस के ~ 5 माइक्रोन लगाएं और एक ग्लास स्लाइड के साथ कवरलिप सैंडविच करें। माइक्रोस्कोप पर सील और माउंट।
    2. Cy5 और Cy3 दोनों चैनलों में छवि मोती।

9. छवि विश्लेषण

नोट: इस चरण में उपयोग किया जाने वाला मैटलैब कोड निम्नलिखित गिटहब वेबसाइट में उपलब्ध है: https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020। गिटहब फ़ोल्डर में छवि विश्लेषण के लिए आवश्यक सब कुछ शामिल है, जिसमें सेल विभाजन और स्पॉट पहचान के लिए पैरामीटर मूल्य शामिल हैं। इस चरण में प्रक्रिया को मास्टर स्क्रिप्ट में आगे समझाया गया है, जिसे "FISHworkflow.m" कहा जाता है।

  1. माइक्रोबट्रैकर27 या ऑवटी28और लोड फेज कंट्रास्ट इमेज जैसे सेल सेगमेंटेशन टूल खोलें। विभाजन प्रक्रिया शुरू करने के लिए "सभी फ्रेम" नामक एक बटन चुनें, जिसमें से कोशिकाओं की पहचान की जाती है और उनकी आकृति की गणना की जाती है(चित्र 3बी,सी)।
    नोट: इन सॉफ्टवेयर पैकेजों का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल ऑनलाइन उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, oufti.org)।
  2. माइक्रोबट्रैकर या Oufti के स्पॉटफाइंडर फ़ंक्शन में Cy5 फ्लोरेसेंस छवियों को लोड करें, और 2D गॉसियन फिटिंग(चित्रा 3बी,सी)के आधार पर स्पॉट पहचान और मात्राकरण शुरू करने के लिए"रन"बटन दबाएं। Cy3 चैनल में स्पॉट का विश्लेषण करने के लिए Cy3 फ्लोरेसेंस छवियों के लिए इस कदम को दोहराएं। यह चरण प्रत्येक कोशिका में स्पॉट की एक सूची तैयार करता है, जिसमें उनकी तीव्रता और निर्देशांक शामिल हैं।
  3. (वैकल्पिक) एक सीमा का उपयोग करके मंद धब्बे (झूठी सकारात्मक) को फ़िल्टर करें, जैसा कि FISHworkflow.m फ़ाइल में समझाया गया है।
    नोट: नकारात्मक नियंत्रण में फ्लोरोसेंट स्पॉट की जांच करें (उदाहरण के लिए MG1655 1lacZ)और झूठी सकारात्मक को फ़िल्टर करने के लिए सीमा निर्धारित करें।
  4. एक ही mRNA की जगह तीव्रता प्राप्त करने के लिए, समय शून्य पर मापा स्पॉट तीव्रता की एक सूची का उपयोग करें (आईपीटीजी जोड़ने से पहले), और दो मिश्रण घटकों के साथ एक गॉसियन मिश्रण मॉडल के साथ स्पॉट तीव्रता के वितरण फिट । एक ही एमआरएनए की स्पॉट तीव्रता के रूप में पहली गॉसियन आबादी (चित्रा 3 डी,ईमें ब्लैक लाइन) की चोटी की स्थिति लें। एक 5 ' और 3 ' लाखZ mRNA की जगह तीव्रता प्राप्त करने के लिए अलग से Cy5 स्पॉट और Cy3 स्पॉट के लिए यह प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: इसे हर बार-पाठ्यक्रम प्रयोग में दोहराएं क्योंकि एक ही एमआरएनए की स्पॉट तीव्रता अलग-अलग प्रयोगों में थोड़ी भिन्न हो सकती है।
  5. एक स्थान के भीतर mRNAs की संख्या प्राप्त करने के लिए एक ही mRNA की तीव्रता के साथ एक स्थान की फ्लोरेसेंस तीव्रता विभाजित (चरण 9.4 से) । एक सेल(चित्रा 3F)में एमआरएनए की कुल संख्या की गणना करने के लिए एक सेल के भीतर सामान्यीकृत स्पॉट तीव्रता राशि। 5 ' और 3 ' mRNA के लिए अलग से इन गणना प्रदर्शन करते हैं ।
  6. गणना करें और हर समय बिंदु (जैसे, चित्रा 4B)पर प्रति सेल मतलब mRNA संख्या की गणना करें और प्लॉट करें, और मतलब एमआरएनए स्तर(चित्रा 4B)में लौकिक परिवर्तन से ट्रांसक्रिप्शन और एमआरएनए क्षरण के वीवो काइनेटिक्स में विश्लेषण करें।
    1. प्रतिलेखन विस्तार की दर प्राप्त करने के लिए, 5 ' और 3 ' mRNA संकेतों में प्रारंभिक वृद्धि के लिए एक लाइन के एक कम वर्ग फिटिंग प्रदर्शन और बेसल स्तर(चित्रा 4B)के लिए अवरोध की पहचान । इन अवरोधों के बीच का अंतर आरएनएपी के लिए 5 ' जांच क्षेत्र से 3 ' जांच क्षेत्र तक यात्रा करने के लिए औसत समय को इंगित करता है । ट्रांसक्रिप्शन विस्तार की औसत दर प्राप्त करने के लिए इस समय के साथ दो जांच सेट (2 केबी) के बीच की दूरी को विभाजित करें।
    2. एमआरएनए क्षरण की दर प्राप्त करने के लिए, 5' और 3' एमआरएनए संकेतों (जैसे, चित्रा 4B)के अंतिम क्षय क्षेत्र के लिए एक घातीय क्षय समारोह, y = A·exp (-t/ο) फिट करें। फिटिंग पैरामीटर, α, औसत एमआरएनए जीवनकाल है।
  7. (वैकल्पिक) प्रत्येक सेल में एमआरएनए नंबरों के वितरण के आधार पर जीन अभिव्यक्ति (उदाहरण के लिए, चित्रा 4Cमें दिखाए गए प्रेरण के लिए सेल-टू-सेल भिन्नता) का विश्लेषण करें (चरण 9.5 में गणना)।
  8. (वैकल्पिक) एक सेल के प्रमुख और छोटे कुल्हाड़ियों के साथ स्पॉट स्थान के बारे में जानकारी का उपयोग करना (चरण 9.2 से प्राप्त), mRNAs(चित्रा 4D,ई)के स्थानीयकरण का विश्लेषण करें।
  9. (वैकल्पिक) Cy5 और Cy3 चैनलों में पाए गए स्थानों के स्थानीयकरण की तुलना करके 5' और 3' mRNAs(चित्रा 5)के सह-स्थानीयकरण का विश्लेषण करें।
    1. माइक्रोबट्रैकर में स्पॉटफाइंड फ़ंक्शन में बहु-रंग मोतियों (चरण 8.6) की छवियां लोड करें और Cy5 और Cy3 चैनलों में मनका सेंट्रोइड के निर्देशांक प्राप्त करें। एफ़िन ट्रांसफॉर्मेशन मैट्रिक्स की गणना करने के लिए सेंट्रोइड निर्देशांक की सूची का उपयोग करें, जो यह सूचित करता है कि Cy5 और Cy3 चैनलों को एक दूसरे के संबंध में स्थानांतरित और घुमाया जाता है29।
    2. Cy5 समन्वय में Cy3 छवियों को परिवर्तित करने के लिए Cy5 और Cy3 मछली छवियों के लिए एफ़िन ट्रांसफॉर्मेशन मैट्रिक्स लागू करें। यदि किसी स्थान को किसी अन्य चैनल में किसी अन्य स्थान के साथ सह-स्थानीयकृत किया जाता है तो वर्गीकृत करें। उदाहरण के लिए, Cy5 चैनल में एक स्थान को Cy3 चैनल में एक अन्य स्थान के साथ सह-स्थानीयकृत माना जाता है यदि उनके सेंट्रोइड्स के बीच की दूरी 150 एनएम(चित्रा 5)से कम है।
    3. विश्लेषण करें कि प्रत्येक समय बिंदु पर Cy3 स्पॉट के साथ कितने Cy5 स्पॉट को "सह-स्थानीयकृत" के रूप में वर्गीकृत किया गया है। इसके अलावा, सह-स्थानीयकृत स्थानों(चित्रा 5)की तीव्रता का विश्लेषण करें।

Representative Results

चित्रा 3 इस smfish प्रोटोकॉल से प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है। देखने का एक पूरा क्षेत्र (86.7 माइक्रोन x 66.0 माइक्रोन हमारे माइक्रोस्कोपी सामग्री की तालिकामें विस्तृत सेटअप का उपयोग कर) से पता चलता है ~ 500 ई. कोलाई कोशिकाओं पूरे क्षेत्र में फैलाया(चित्रा 3A)। यदि कोशिकाओं का घनत्व इस छवि में दिखाए गए मुकाबले की तुलना में बहुत अधिक है, तो स्वचालित कोशिका विभाजन मुश्किल हो जाता है क्योंकि विभाजन एल्गोरिदम एक दूसरे को छूने पर व्यक्तिगत कोशिकाओं की विश्वसनीय रूप से पहचान नहीं करते हैं। किसी को देखने के क्षेत्र में कोशिकाओं के इष्टतम घनत्व को प्राप्त करने के लिए सतह पालन (चरण 5.1) के लिए उपयोग किए जाने वाले कोशिकाओं और इनक्यूबेशन समय की एकाग्रता को समायोजित करने की आवश्यकता होती है।

चरण विपरीत छवियों में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान विभाजन प्रयोजनों(चित्रा 3A-सी)के लिए जीवित कोशिकाओं की तुलना में रहना चाहिए। यदि कोशिकाएं अधिक परिधीय होती हैं, तो सेल आकृति विज्ञान बदलता है (जैसे "भूत"; अनुपूरक चित्रा 1)। उस स्थिति में, चरण 5.3 में 70% इथेनॉल उपचार की अवधि को कम कर सकता है।

प्रेरण से पहले औसत लैक्ज़ अभिव्यक्ति स्तर ~ 0.03 mRNAs प्रति सेल था, जो पिछली रिपोर्ट15,,30के अनुरूप था। इसके अलावा, इंडक्शन से पहले लैक्ज़ एमआरएनए स्पॉट तीव्रता का वितरण उच्च तीव्रता वाले स्थानों(चित्र 3 डी,ई)के साथ स्पॉट की उपस्थिति के कारण सामान्य वितरण या पॉइसन वितरण के साथ अच्छी तरह से फिट नहीं था। इससे पता चलता है कि दमित राज्य के तहत पाए गए अधिकांश स्पॉट एक लाख्ज़ एमआरएनए का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन स्पॉट की एक छोटी आबादी में एक लाख से अधिक mRNA होता है। एक लाख एमआरएनए के साथ आबादी को अलग करने के लिए, हमने दो मिश्रण घटकों (चित्र 3 डी,ईमें इनसेट) के साथ एक गॉसियन मिश्रण मॉडल का उपयोग किया। फिर, पहले गॉसियन का मतलब एक एमआरएनए स्पॉट (उदाहरण के लिए, चित्रा 3 डीमें काले वक्र की चोटी) की औसत तीव्रता के रूप में लिया गया था और समय-पाठ्यक्रम प्रयोग में पाए गए किसी भी स्थान के लिए स्पॉट तीव्रता को mRNAs की संख्या में परिवर्तित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक कोशिका के भीतर mRNAs की कुल संख्या की गणना करने के लिए, सामान्यीकृत स्थान तीव्रता प्रत्येक कोशिका में अभिव्यक्त किया गया(चित्रा 3F)19।

जब लैक्ज़ एमआरएनए का अभिव्यक्ति स्तर कम होता है, तो एक या दो विवर्तन-सीमित लाख्ज़ एमआरएनए स्पॉट होते हैं जो एक कोशिका के भीतर अलग हो जाते हैं। इसलिए, इन धब्बों की छवियों को उनकी तीव्रता और स्थानीयकरण के लिए 2डी गॉसियन फिटिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है।

जब अभिव्यक्ति का स्तर अधिक होता है, तो ऐसे स्पॉट एक कोशिका के भीतर एक दूसरे के साथ ओवरलैप होते हैं, 2डी गॉसियन फिटिंग विश्वसनीय मात्राकरण नहीं करती है। उस मामले में, एमआरएनए स्तर की गणना एक एमआरएनए19की औसत तीव्रता के साथ एक कोशिका के भीतर कुल, पृष्ठभूमि-घटाया फ्लोरेसेंस सिग्नल को विभाजित करके की जानी चाहिए।

जब लैक्ज़ की अभिव्यक्ति प्रेरित होती है, तो 5 लाख एमआरएनए का संकेत पहले बढ़ता है और 3 'लाख मिलियन एमआरएनए) बाद में बढ़ जाता है(चित्रा 4B)। यदि लैक्ज़ की अभिव्यक्ति का दमन किया जाता है, तो 5 ' और 3 ' लाख एमआरएनए सिग्नल बीच में कुछ देरी के साथ कम होजाते हैं (चित्रा 4B)। प्रतिलेखन विस्तार की दर प्राप्त करने के लिए, 5 ' और 3 ' संकेतों की वृद्धि पहले लाइनों(चित्रा 4B)के साथ फिट हैं, और एक्स-इंटरसेप्ट्स में अंतर आरएनएपी के लिए दो जांच क्षेत्रों (२,००० nt) के बीच की दूरी की यात्रा करने के लिए समय के रूप में लिया जाता है । प्रतिलेखन विस्तार की दर को हर बार-पाठ्यक्रम प्रयोग से मापा जा सकता है और मानक विचलन की गणना प्रायोगिक डुप्लिकेट से की जा सकती है। प्रतिलेखन विस्तार की औसत दर हमारी प्रायोगिक शर्तों 19 के तहत15-30nt/s थी ।

इसके अतिरिक्त, एमआरएनए क्षरण (मतलब एमआरएनए जीवनकाल के विलोम) की दर क्षय क्षेत्र को घातीय कार्य(चित्रा 4B)के साथ फिट करके प्राप्त की गई थी। हमारे समय-पाठ्यक्रम डेटा में ट्रांसक्रिप्शन31के दौरान और बाद में एमआरएनए क्षरण होता है। जारी किए गए mRNAs के क्षरण की जांच करने के लिए 3 ' एमआरएनए (टी & 6 मिनट) के बाद हम समय अंक फिट करते हैं । हमने 5 ' या 3 ' लाख एमआरएनए 19 के औसत जीवनकाल के रूप में ~90एस प्राप्त किया।

प्रतिलेखन दीक्षा की दर की गणना 5' सिग्नल वृद्धि के बाद प्रेरण(चित्रा 4 बी,नीला) या स्थिर राज्य में औसत एमआरएनए संख्या से (जो गिरावट दर से विभाजित दीक्षा दर है) की ढलान से की जा सकती है। इसके अलावा, समय से पहले प्रतिलेखन समाप्ति की संभावना का अनुमान लगाया जा सकता है, या तो 3 ' सिग्नल वृद्धि बनाम 5 ' सिग्नल वृद्धि३२ के ढलान के बीच अनुपात लेने के द्वारा या 3 ' और 5 ' mRNA क्षेत्रों19के स्थिर राज्य के स्तर के बीच ।

क्योंकि smfish एक एकल सेल तकनीक है, हम प्रतिलेखन में सेल से सेल परिवर्तनशीलता का विश्लेषण कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, आईपीटीजी(चित्र 4सी)जोड़े जाने के बाद लाख एमआरएनए व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण कर सकता है। कोई भी यह पता कर सकता है कि शामिल होने के बाद एमआरएनए स्थानीयकरण में परिवर्तन होता है या नहीं। हमने देखा कि 5 ' और 3 ' लाख एमआरएनए स्पॉट थोड़ा जावक होते हैं, जो सेल के केंद्र(चित्रा 4डी, ई)से दूर हैं, जो पिछली रिपोर्ट33के अनुरूप है।

अंत में, 5 और 3 ' एमआरएनए स्पॉट के बीच सह-स्थानीयकरण का विश्लेषण जानकारीपूर्ण होसकता है (चित्रा 5A)। उदाहरण के लिए, दमित राज्य (समय शून्य) में, 5 एमआरएनए स्पॉट के लगभग 25% को 3'एमआरएनए स्पॉट के साथ सह-स्थानीयकृत किया जाता है। टी = 1 मिनट में, के रूप में कई जीन loci 5 ' mRNA संश्लेषण है, लेकिन अभी तक नहीं 3 ' mRNA संश्लेषण, 5 ' mRNA स्थानों के अधिकांश खुद के द्वारा 3 ' mRNA संकेत के बिना कर रहे है (यानी, सह स्थानीयकरण की कम संभावना) । हालांकि, जब 3 'एमआरएनए दिखाई देता है (यानी, टी = 2 मिनट), सह-स्थानीयकरण की संभावना बढ़ जाती है (चित्रा 5A,बीमें बैंगनी तीर)। इस बार बिंदु, जब सह-स्थानीयकरण अक्सर हो जाता है, प्रतिलेखन विस्तार की दर पर निर्भर करता है। इस समय बिंदु पर पता लगाया प्रत्येक सह-स्थानीयकरण स्थान के भीतर 5 ' और 3 ' लाख एमआरएनए नंबर के 2-डी घनत्व भूखंड का उपयोग लैक्ज़ जीन(चित्रा 5C)पर आरएनएपी के घनत्व का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है । जैसा कि पहले19रिपोर्ट किया गया था, इस भूखंड में 5 एमआरएनए संख्या से संकेत मिलता है कि अधिकांश लाखों की लोकी के डीएनए पर 10 से कम आरएनएपी हैं जब लैक्ज़ अभिव्यक्ति 1 एमएमएम आईपीटीजी द्वारा प्रेरित होती है। इसके अतिरिक्त, इस भूखंड में 3 ' एमआरएनए नंबर आरएनएपी34के क्लस्टरिंग से संबंधित है। तथ्य यह है कि 3 ' mRNA की संख्या एक के करीब है मतलब है कि मोटे तौर पर केवल एक आरएनएपी 3 ' जांच क्षेत्र में प्रवेश करती है । इससे पता चलता है कि लैकज़ जीन पर आरएनएपी को क्लस्टर (या "काफिले" बनाने के बजाय स्थानिक रूप से अलग किया जाता है)।

Figure 1
चित्रा 1: ब्याज की एक mRNA के लिए smfish जांच के डिजाइन । (क)खपरैल विधि। छोटे डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (लंबाई में ~ 20 बीपी) के दृश्यों को चुना जाता है ताकि वे ब्याज के एमआरएनए को कवर कर सकें। ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच फ्लोरोसेंट डाई अणु के साथ लेबल की जाती है। (ख)एक सरणी विधि । टैंडेम दृश्यों (जैसे,'लाको सरणी") की एक गैर-कोडिंग सरणी ट्रांसक्रिप्शनली से ब्याज के एमआरएनए में जुड़ी हुई है। फ्लोरोसेंटली लेबल जांच दोहराने इकाई के पूरक (उदाहरण के लिए, लंबाई में 17 बीपी की लाको जांच) का उपयोग एमआरएनए के संकेत को बढ़ाने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: smfish प्रयोगात्मक प्रक्रिया और प्रत्येक चरण की समय अवधि की योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: smfish छवि विश्लेषण। (A-C)smfish माइक्रोस्कोपी छवि 5 ' लाख MRNA (लाल) और 3 ' लाख mRNA (हरा) जंगली प्रकार ई. कोलाई (MG1655) में उगाया M9 ंयूनतम मध्यम ०.२% ग्लिसरोल के साथ पूरक में, 0.1% कैसामिनो एसिड, और 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीग्राम/एल थियामाइन।(ए)टी = 3 मिनट से एक नमूने की एक प्रतिनिधि छवि टी = 0 मिनट पर 0.05 mM IPTG के साथ प्रेरण के बाद और दमन टी = 1.5 मिनट पर 500 mM ग्लूकोज के साथ।A चरण के विपरीत और Cy5 के दो फ्लोरेसेंस छवियां (5' लाख एमआरएनए, लाल के लिए) और Cy3 (3' लाख mRNA, हरे रंग के लिए) छद्म रंग के साथ मढ़ा गया । छवि 86.7 माइक्रोन x 66.0 माइक्रोन का पूरा क्षेत्र दिखाती है। स्केल बार, 5 माइक्रोन। (ख)एक छोटे से क्षेत्र (पीला बॉक्स) में (ए) के ज़ूम-इन संस्करण । सेल की रूपरेखा सफेद में दिखाई जाती है, और छवि विश्लेषण से पहचाने गए फ्लोरेसेंस स्पॉट लाल बिंदुओं के साथ दिखाए जाते हैं। स्केल बार, 1 माइक्रोन। (ग)उच्च अभिव्यक्ति की स्थिति के तहत सेल रूपरेखा और फ्लोरोसेंट स्पॉट का पता लगाना (1 एमएमएम आईपीटीजी के साथ प्रेरण के बाद टी = 4 मिनट)। स्केल बार, 1 माइक्रोन। (D-E) आईपीटीजी (दमित राज्य) को जोड़ने से पहले मापा गया 5 ' और 3 ' एमआरएनए स्पॉट तीव्रता का वितरण। हिस्टोग्राम को दो गॉसियन कार्यों (ब्लैक एंड ग्रे) के साथ दिखाया गया है जिनके मतलब मूल्य गॉसियन मिश्रण मॉडल से हैं। इनसेट गॉसियन मिश्रण मॉडल से उत्पन्न यादृच्छिक संख्याओं की मात्रा-क्वांटाइल प्लॉट दिखाता है और प्रायोगिक रूप से एमआरएनए स्पॉट तीव्रता (एन = 1040 के लिए 5' एमआरएनए और 3'एमआरएनए के लिए 680) मापा जाता है। (च)पैनल (बी) में इंगित एक व्यक्तिगत कोशिका के लिए प्राप्त जानकारी। किसी दिए गए सेल (i) के लिए, Cy5 और Cy3 चैनलों में स्पॉट की पहचान की गई थी, और उनकी तीव्रता (I) और एक सेल(डी, एल)की छोटी और लंबी धुरी के साथ समन्वय 2 डी गॉसियन फिटिंग से निर्धारित किया गया था। सामान्यीकरण के बाद स्पॉट तीव्रता को इस कोशिका में कुल 5 या 3 ' mRNAs की कुल संख्या उत्पीधन करने के लिए अभिव्यक्त किया गया था। इसके अलावा, चित्र 5में दिखाए गए उदाहरण के रूप में विभिन्न चैनलों के स्थानों के बीच सह-स्थानीयकरण का विश्लेषण किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: ट्रांसक्रिप्शन और एमआरएनए क्षरण के वीवो काइनेटिक्स में विश्लेषण। (क)समय के साथ लैक्ज़ एमआरएनए स्तरों में परिवर्तन को मापने वाले दो रंग के स्मफिश प्रयोगों की योजनाबद्ध और प्रतिनिधि छवियां। लाल और हरे रंग की बिंदीदार रेखाएं Cy5 या Cy3B लेबल वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच का संकेत देती हैं जो क्रमशः ई. कोलाईमें 1-केबी-लंबे 5 और 3 ' एमआरएनए क्षेत्रों में लैक्ज़ एमआरएनए के लिए संकरण करती हैं। इसके अलावा टी = 0 मिनट पर 0.2 m M IPTG के साथ प्रेरण के बाद संकेत समय बिंदुओं पर एक चरण विपरीत छवि के साथ दो फ्लोरेसेंस छवियों के ओवरले हैं। प्रतिलेखन टी = 1.5 मिनट पर 500 mm ग्लूकोज के साथ दमित किया गया था। स्केल बार, 1 माइक्रोन। इस आंकड़े को किम एट अल19से संशोधित किया गया है । (ए) पैनल (ए) में वर्णित प्रयोग के दौरान समय के साथ प्रति सेल(B)5 ' और 3 ' लाख लाख mRNA संख्या । त्रुटि सलाखों के जूते का स्त्रोत एसईएमएस हैं। प्रति टाइम पॉइंट कम से कम 1,200 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। 5 ' और 3 ' mRNA संकेतों की प्रारंभिक वृद्धि एक लाइन (नीले रंग) के साथ फिट था । एक्स-इंटरसेप्ट्स में अंतर 1.93 मिनट था, जो 17.3 एनटी/एस के ट्रांसक्रिप्शन विस्तार की औसत दर का परिणाम है। 5 ' और 3 ' mRNA संकेतों के अंतिम क्षय एक घातीय क्षय समारोह (ग्रे) के साथ फिट था । फिट मापदंडों से संकेत मिलता है कि औसत एमआरएनए लाइफटाइम 5 ' एमआरएनए के लिए १.५२ मिनट और 3 ' एमआरएनए के लिए १.६६ मिनट है । (ग)में वर्णित प्रयोग के दौरान एक या अधिक लाख एमआरएनए स्पॉट वाली कोशिकाओं का प्रतिशत (ए)। त्रुटि सलाखों के जूते का स्त्रोत एसईएमएस हैं। (घ)एक कोशिका की छोटी धुरी के साथ एक स्थान का स्थानीयकरण । कोई भी कोशिका (डब्ल्यू) की आधी चौड़ाई के साथ छोटी धुरी(डी)के साथ स्थान को विभाजित करके झिल्ली के लिए एक स्थान की निकटता की मात्रा निर्धारित करसकता है। (ई)में वर्णित प्रयोग के दौरान कोशिकाओं की छोटी धुरी के साथ 5 ' और 3 ' लाख लाख mRNA स्पॉट के स्थानीयकरण में परिवर्तन ( ए) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: 5 ' और 3 ' mRNA स्पॉट के सह स्थानीयकरण का विश्लेषण । (ए)योजनाबद्ध 5 और 3 ' mRNA स्थानों के बीच की उंमीद सह स्थानीयकरण दिखा शामिल होने के बाद । जब 3 ' mRNA बनाया जाता है, एक 5 ' mRNA स्थान की संभावना सह एक 3 ' mRNA स्पॉट बढ़ जाती है (बैंगनी तीर) के साथ स्थानीयकृत किया जा रहा है । (ख)1 एमएम आईपीटीजी के साथ शामिल होने के बाद सह-स्थानीयकरण की संभावना। बैंगनी तीर समय बिंदु इंगित करता है जहां सह-स्थानीयकरण की संभावना पहले पैनल (ए) में योजनाबद्ध के अनुसार अक्सर हो जाती है। (ग)1 एमएमएम आईपीटीजी (कुल 841 स्पॉट) के साथ शामिल होने के बाद टी = 2 मिनट पर पाए गए सह-स्थानीयकरण स्थान के भीतर 5 और 3 लाख 10 लाख 100 मिलियन एमआरएएनए की संख्या। ग्रे डॉट्स व्यक्तिगत सह-स्थानीयकृत स्थानों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि लाल डॉट्स बिन्ड डेटा के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों एसईएम हैं। ग्रे की छाया ग्राफ के किसी दिए गए क्षेत्र में अंकों के घनत्व को इंगित करती है। बिंदीदार रेखा 1 की ढलान को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: जांच संकरण स्थिति का अनुकूलन। दो प्रकार के नमूनों का उपयोग किया गया: MG1655 कोशिकाओं के रूप में चित्रा 3 में वर्णित है और असेंपित (नीला) रहते है या 20 मिनट (लाल) के लिए ०.५ mM IPTG के साथ इलाज किया । जांच संकरण समाधान जांच की विभिन्न सांद्रता के साथ किया गया था (कुल 72 Cy5-संयुग्मित जांच पूरे लाख क्षेत्र टाइलिंग) और फॉर्ममाइड की। तदनुसार, पूर्व-संकरण समाधान और वॉश समाधान में फॉर्ममाइड सांद्रता को भी समायोजित किया गया था। "कोई जांच नहीं" (ग्रे लाइन) संकरण कदम के दौरान कोई जांच के साथ इलाज IPTG जोड़ा कोशिकाओं के फ्लोरेसेंस स्तर को इंगित करता है । सेल क्षेत्र (एयू) द्वारा सामान्यीकृत औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता की गणना 300-800 कोशिकाओं से की गई थी। त्रुटि सलाखों के जूते का स्त्रोत एसईएमएस हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: अधिक परिग्रह के कारण विकृत कोशिका मॉर्फोलोजी। 1 m IPTG के साथ प्रेरण के बाद 5' लाख एमआरएनए (Cy5, लाल), और 3 ' लाख mRNA (Cy3, ग्रीन) MG1655 कोशिकाओं की छवियों के ओवरले । (क)सामान्य कोशिकाओं और पीढ़ी पर फैली कोशिकाओं के मिश्रण को दिखाने वाला एक उदाहरण जिसमें सामान्य आकृति विज्ञान (गुलाबी तीरों के साथ इंगित) की कमी होती है। (ख)एक उदाहरण दिखा "भूत" कोशिकाओं को एक साथ झुरमुट । स्केल बार = 1 माइक्रोन. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

डीईपीसी पानी
अल्ट्रापुरे पानी में 0.1% डीईपीसी जोड़ें और बोतल (कवर) को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में इनक्यूबेट करें और अगले दिन ऑटोक्लेव करें।
डीईपीसी पीबीएस (10X)
निम्नलिखित मिलाएं:
80 ग्राम नैक (अंतिम 1.37 मीटर)
2 ग्राम केसीएल (अंतिम 27 एमएमएम)
14.2 ग्राम एनए 2एचपीओ4 (अंतिम 100 mM)
2.7 ग्राम KH2पीओ4 (अंतिम 20 mM)
अल्ट्रापुरे पानी 1L करने के लिए
एक कांच की बोतल में फिल्टर (0.22 μm) ।
0.1% डीईपीसी जोड़ें और डीईपीसी पानी के लिए निर्देश का पालन करें।
1X समाधान बनाने के लिए, डीईपीसी पानी के साथ 10 बार पतला करें।
1M DEPC सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4
निम्नलिखित मिलाएं:
115 ग्राम एनए 2एचपीओ4
22.8 ग्राम एनएएच2पीओ4
अल्ट्रापुरे पानी 1 एल करने के लिए
एक कांच की बोतल में फिल्टर (0.22 μm) ।
0.1% डीईपीसी जोड़ें और डीईपीसी पानी के लिए निर्देश का पालन करें।
4X फिक्सिंग समाधान (16% फॉर्मलडिहाइड)
5 एमएल 20% फॉर्मलडिहाइड
500 माइक्रोल डीईपीसी पानी
750 माइक्रोल 1M DEPC सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4
2-4 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
सावधानी: फॉर्मलडिहाइड विषाक्त है। दस्ताने पहनें और इस समाधान को बनाते समय धूम हुड का उपयोग करें।
समाधान धोएं
निम्नलिखित मिलाएं:
10 एमएल फॉर्ममाइड (अंतिम 25%)
4 एमएल 20X एसएससी (अंतिम 2X)
40 एमएल तक डीईपीसी का पानी भरें
फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन) और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
सावधानी: फॉर्ममाइड विषाक्त है। दस्ताने पहनें और इस समाधान को बनाते समय धूम हुड का उपयोग करें।
पूर्व-संकरण समाधान
200 माइक्रोल फॉर्ममाइड (अंतिम 20%)
100 माइक्रोल 20X एसएससी (अंतिम 2X)
10 माइक्रोल 100X वीआरसी (अंतिम 1X)
25 माइक्रोन 4% (w/v) बीएसए (अंतिम ०.१%)
685 माइक्रोल डीईपीसी पानी
नोट: भंवर 10 μL बाहर लेने से पहले VRC स्टॉक ।
सावधानी: फॉर्मामाइड विषाक्त और एक ज्ञात टेराटोजेन है। दस्ताने पहनें और इसे एक धुएं हुड के नीचे संभालें।
हाइब्रिडीकरण समाधान की जांच करें
200 माइक्रोल फॉर्ममाइड (अंतिम 20%)
100 माइक्रोल 20X एसएससी (अंतिम 2X)
10 माइक्रोल 100X वीआरसी (अंतिम 1X)
25 माइक्रोन 4% (w/v) बीएसए (अंतिम ०.१%)
10 माइक्रोल 40 मिलीग्राम/एमएल ई. कोलाई ट्रान (अंतिम ०.४ मिलीग्राम/एमएल)
200 माइक्रोल 50% डेक्सट्रान सल्फेट (अंतिम 10%)
एक्स माइक्रोन 5 ' mRNA जांच सेट (चरण १.१२ से) अंतिम 4 एनएम के लिए ।
वाई माइक्रोन 3 ' mRNA जांच सेट (चरण १.१२ से) अंतिम 4 एनएम के लिए ।
- कुल वॉल्यूम 1 एमएल बनाने के लिए डीईपीसी पानी
नोट: डेक्सट्रान सल्फेट पिछले जोड़ें । क्योंकि यह बहुत चिपचिपा है, 50% स्टॉक से 200 μL बाहर लेने से पहले एक पिपेट टिप के अंत में कटौती करें। डेक्सट्रान सल्फेट जोड़ने के बाद, समाधान को समरूप बनाने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।

तालिका 1: उपयोग किए गए समाधानों के व्यंजन।

Discussion

यहां, हम ई. कोलाईमें mRNA काइनेटिक्स को मापने के लिए एक smfish प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया । बैक्टीरिया23के लिए पहले प्रकाशित smfish प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को प्रोटोकॉल के अंत तक ट्यूबों में रखा गया था, कि जब तक वे इमेजिंग के लिए तैयार हैं । हालांकि इसके कई लाभ हैं, जैसे कि कवरस्लिप सतह23पर फ्लोरोसेंट जांच के न्यूनतम गैर-विशिष्ट बाध्यकारी, जब एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग से कई नमूने होते हैं तो इन प्रोटोकॉल का पालन करना मुश्किल होता है। सबसे पहले, कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा (>1 mL) के लिए नमूना और यहां तक कि निर्धारण से पहले काटा जाना चाहिए । दूसरा, सेल नमूनों को समाधान का आदान-प्रदान करने और संकरण कदम के बाद धोने के लिए कई बार अपकेंद्री करने की आवश्यकता है । हमारे प्रोटोकॉल में, संस्कृति की एक छोटी मात्रा (<1 एमएल) सीधे एक १.५-एमएल ट्यूब में एक फिक्सिंग समाधान के साथ मिलाया जाता है, जो नमूने के समय सेल राज्य को जल्दी से "फ्रीज" करने में मदद करता है। इसके अलावा, कोशिकाएं पूरी प्रक्रिया में सतह से जुड़ी रहती हैं, और वैक्यूम फिल्ट्रेशन सिस्टम के साथ तरल पदार्थों को एस्पिरेशन करके और मल्टी-चैनल पिपेट के साथ एक बार में समाधान बूंदों को लागू करके विभिन्न समाधानों का आदान-प्रदान किया जा सकता है। यह अंतर हमारे प्रोटोकॉल को अत्यधिक लाभप्रद बनाता है जब बड़ी संख्या में नमूनों को एक बार में संसाधित करने की आवश्यकता होती है। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, 12-48 नमूनों को एक साथ संभाला जा सकता है और पूरी मछली प्रक्रिया ~ 8 घंटे के भीतर पूरी की जा सकती है, कुछ नमूनों(चित्रा 2)के लिए आवश्यक समय की एक समान राशि के बारे में। यद्यपि हमने एक उदाहरण के रूप में ई. कोलाई में लैक्ज़ की अभिव्यक्ति का उपयोग किया, प्रोटोकॉल नीचे चर्चा किए गए विचारों के साथ विभिन्न जीन और जीवाणु प्रजातियों पर व्यापक रूप से लागू होता है।

विभिन्न जीन के लिए, पहली बात पर विचार करने के लिए smfish जांच है । कोई भी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच कर सकता है जो ब्याज के एमआरएनए(चित्र 1ए)13को टाइल करता है । इस "टाइलिंग" जांच दृष्टिकोण में, प्रत्येक जांच ~ 20 आधार लंबी है और 5 ' या 3 ' टर्मिनस पर एक फ्लोरोफोर के साथ लेबल । यह रणनीति सुविधाजनक है क्योंकि कोई आनुवंशिक हेरफेर की जरूरत नहीं है । वैकल्पिक रूप से, ~ 20 बीपी अनुक्रम का एक मिलकर दोहराने, जीनोमिक अनुक्रम के लिए विदेशी (उदाहरण के लिए, Caulobacter वर्धमान14में लाको अनुक्रम की एक सरणी), ब्याज की एक जीन के अअनुवादित क्षेत्र में डाला जा सकता है और दोहराने इकाई के लिए एक एकल जांच पूरक mRNA लेबल ("सरणी" दृष्टिकोण; चित्रा 1B)। दोनों ही मामलों में, कई फ्लोरोफोरस एक एमआरएनए को सजाते हैं, जो परिलक्षित फ्लोरेसेंस संकेत देते हैं जिसे आसानी से एक कोशिका के अंदर गैर-विशिष्ट रूप से बंधे एक जांच से अलग किया जा सकता है।

"टाइलिंग" या "सरणी" दृष्टिकोण चुनना है या नहीं, यह नकारात्मक नियंत्रण पर निर्भर करता है, एक नमूना जहां जांच के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी का परीक्षण किया जाता है क्योंकि इसमें लक्ष्य एमआरएनए का अभाव है। टाइलिंग जांच(चित्रा 1A),ब्याज या एक शर्त के जीन के बिना एक उत्परिवर्ती तनाव के लिए, जिसमें जीन लिखित नहीं है (जैसे, lacZके दमन) जांच के गैर विशिष्ट बाध्यकारी परीक्षण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकते हैं । सरणी-आधारित smfish(चित्रा 1B)के लिए, सरणी की कमी वाला एक जंगली प्रकार का तनाव नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है क्योंकि इसमें जांच के लिए बाध्यकारी साइटें शामिल नहीं हैं।

इष्टतम संकरण की स्थिति जांच दृश्यों और यहां तक कि फ्लोरोफोर रंगों की पसंद पर निर्भर हो सकती है। हमने संकरण तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखकर और संकरण समाधान में जांच सेट और फॉर्ममाइड की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करके लैक्ज़ जांच सेटों के लिए संकरण स्थिति को अनुकूलित किया। फॉर्मामाइड की अधिक सांद्रता गैर - विशिष्ट और विशिष्ट बाध्यकारी दोनों26,35को कम करती है । हम संकरण समय और तापमान को समान रखते हुए व्यवस्थित रूप से संकरण और इसकी धोने की स्थिति को बदलने की सलाह देते हैं। के रूप में हालत और अधिक कठोर हो जाता है, दोनों गैर विशिष्ट और विशिष्ट बाध्यकारी कमी(चित्रा 6)। यह एक बिंदु है जहां गैर विशिष्ट बाध्यकारी आगे विशिष्ट बाध्यकारी समझौता किए बिना एक स्वीकार्य दहलीज से नीचे हिट करने के लिए शुरू होता है खोजने के लिए महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, हमने बिना किसी जांच ("कोई जांच नहीं") के बिना प्राप्त सिग्नल स्तर का उपयोग एक सीमा(चित्र 6) केरूप में किया।

एक एमआरएनए के दो अलग-अलग क्षेत्रों को लेबल करने वाली दो रंग की स्मफिश विधि लंबे जीन तक सीमित है। प्रतिलेखन विस्तार की दर को मापने के लिए, हमने इस तथ्य का लाभ उठाया कि लैक्ज़ लंबा (3075 बीपी) है और इसकी अभिव्यक्ति आईपीटीजी द्वारा प्रेरित की जा सकती है। जब एक जीन कम होता है, तो दो टाइलिंग प्रोब सेट (5' और 3 ' सिरों के पास) डिजाइन करना मुश्किल होता है और 5 ' बनाम 3 ' एमआरएनए क्षेत्रों के दिखावे के बीच समय की देरी को हल करना मुश्किल होता है । इस मामले में, कोई भी एसएमफिश द्वारा स्थिर स्थिति में नवजात mRNAs की गणना कर सकता है और एक विश्लेषणात्मक मॉडल के साथ उनके वितरण का विश्लेषण कर सकता है जिसमें एक फिटिंग पैरामीटर20के रूप में ट्रांसक्रिप्शन विस्तार की दर है। इसके अलावा, जब ब्याज का जीन अक्षुण्ण नहीं होता है, तो कोई भी समय शून्य पर रिफाम्पिकिन के साथ कोशिकाओं का इलाज कर सकता है और 5 ' और 3 ' mRNA उप-क्षेत्रों में लौकिक परिवर्तन को माप सकता है । 5 एमआरएनए सिग्नल की कमी से 3 ' एमआरएनए सिग्नल की कमी से देरी का उपयोग पहले31के अनुसार प्रतिलेखन विस्तार की दर की गणना करने के लिए किया जा सकता है।

अंत में, smfish प्रोटोकॉल बहुमुखी है और अन्य लेबलिंग योजनाओं के साथ जोड़ा जा सकता है। इससे पहले, डीएनए लोकस को या तो डीएनए फिश14 या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर-ऑपरेटर सिस्टम20के साथ एमआरएनए फिश के संयोजन से mRNAs के साथ एक साथ कल्पना की गई थी । एमआरएनए फिश14,36के साथ मिलकर इम्यूनोफ्लोरेसेंस करके प्रोटीन उत्पादों की कल्पना की जा सकती है । इसके अलावा, इसे तीन आयामी सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी37 के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि तीनों आयामों38,,39में आरएएनए की कल्पना की जा सके।

Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह प्रोटोकॉल एस. के. द्वारा हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट और येल विश्वविद्यालय में माइक्रोबियल साइंसेज इंस्टीट्यूट में डॉ क्रिस्टीन जैकब्स-वैगनर की प्रयोगशाला में अपने पोस्टडॉक्टोरल शोध के दौरान विकसित किया गया था । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन के लिए विधि विकास और लौरा ट्रॉयर के दौरान विभिन्न आदानों के लिए डॉ जैकब्स-वैगनर और उनके लैब सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । एस. के. Searle विद्वानों कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करते हैं; केवी इलिनोइस विश्वविद्यालय से जेम्स स्कॉलर प्रीबल रिसर्च अवार्ड के समर्थन को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial strain
Escherichia coli MG1655
Chemicals, peptides, and others
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34851 UPLC buffer B
Ammonium chloride Fisher Chemical A661-500 To make M9 medium
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich B2518 Probe hybridization
Calcium chloride Acros Organics 349610250 To make M9 medium
Casamino acid BD Difco 223050 To make M9 medium
Cy3B NHS ester GE Healthcare Life Sciences PA63101 Fluorophore for FISH probes
Cy5 NHS ester GE Healthcare Life Sciences PA15101 Fluorophore for FISH probes
DEPC Sigma-Aldrich D5758
Dextran sulfate Millipore S4030 Probe hybridization
Dextrose Fisher Chemical D16 To repress the expression of lacZ
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 To dissolve fluorophores
E. coli tRNA Sigma-Aldrich R1753 Probe hybridization
Ethanol Decon Laboratories 2701 Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips
FISH probes Biosearch Technologies Sequences are published in ref#16
Formaldehyde Ladd Research Industries 20295 Fixation
Formamide American Bio AB00600 Probe hybridization, pre-hybridization, and wash
Glycerol Americanbio AB00751-01000 To make M9 medium
Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) Invitrogen 15529019 lacZ induction
Magnesium sulfate Fisher Chemical M65-500 To make M9 medium
2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) Santa Cruz Biotechnology sc-216258 lacZ repression
Picodent twinsil 22 Picodent 1300 1000 Sealant
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920 To treat the coverslip surface
Potassium chloride Fisher BioReagents BP366-500 To make PBS
Potassium phosphate monobasic Fisher BioReagents BP362-500 To make PBS and M9 medium
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 To stop transcription initiation
Saline-sodium citrate buffer (SSC) Invitrogen AM9763 Probe hybridization, pre-hybridization, and wash
sodium bicarbonate Fisher BioReagents BP328-500 Fluorophore-probe conjugation
Sodium chloride Fisher BioReagents BP358-1 For DNA purification, PBS and M9 medium
Sodium phosphate dibasic Fisher BioReagents BP332-500 To make PBS and M9 medium
Sodium phosphate monobasic Fisher BioReagents BP329-500 To make a sodium phosphate buffer
Super PAP Pen Invitrogen 8899 Hydrophobic marker for coverslips
TetraSpek microspheres Invitrogen T7280 Controls for multi-channel registration
Thiamine Sigma-Aldrich T1270 To make M9 medium
Triethylammonium acetate Sigma-Aldrich 90358 UPLC buffer A
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) Sigma-Aldrich 94742 Probe hybridization and pre-hybridization
Equipment
C18 column Waters Acquity BEH C18 column
Countertop centrifuge Eppendorf 5425
Countertop incubator Eppendorf Thermomixer F1.5
Incubator (Oven) Thermo Scientific 51030514 Gravity convection
Water purification system Millipore Milli-Q Reference
Nanodrop Thermo Scientific 2000C
Nitrogen gas Building For blow-drying coverslips and glass slides
UPLC Waters Acquity UPLC system
Vacuum and aspirator Building Aspirator is made of a filtration flask with a side arm.
Vacuum concentrator Labconco 7810010 Centrivap; to dry samples collected from UPLC.
Vortexer Scientific Industries Genie-2 SI-0236
Water bath shaker New Brunswick Innova 3100 Critical for time-course experiments
Water bath sonicator VWR 97043-960 To clean coverslips and glass slides
Tools
1.5-mL tubes Eppendorf 22431021 DNA lobind tubes
1000-uL pipette tip box Denville Scientific P1126 An empty box after using all the tips
Coplin jar SPI 01240-AB To clean coverslips and glass slides
Coverslip Fisher Scientific 22-050-230 24x60 No1
Filtered pipette tips Denville Scientific P1121,P1122,P1126 SHARP® Precision Barrier Tips
Forceps SPI K35a To handle clean coverslips and glass slides
Glass slide Fisher Scientific 12-544-1
Gloves Microflex MK-296-M
Multichannel pipetter Eppendorf 2231300045 To use in the washing step (#7)
Pipette Gilson P1000, P200, P20
Reagent reservoir MTC Bio P8025-1S To use in the washing step (#7)
Syringe filter (0.22 um) Millipore SLGS033SS
Timer VWR 62344-641
Software and algorithms
MATLAB Mathworks R2013 and up https://www.mathworks.com
MicrobeTracker or Oufti https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker
https://oufti.org/
Stellaris Probe Designer Biosearch Technologies https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer
Microscope
CCD camera Hamamatsu Photonics Orca-II-ER
Cy3 filter set Chroma 49004
Cy5 filter set Chroma 49006
Epi-fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti For phase-contrast and epi fluorescence
Fluorescence excitation source Lumencor SOLA-E
Nikon Elements software Nikon software that controls the microscope setup
Phase-contrast 100x objective Nikon Plan Apochromat (NA 1.45)
Probe sequence
DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end Biosearch Technologies Inc
lacZ1 GTGAATCCGTAATCATGGTC 5' mRNA
lacZ2 TCACGACGTTGTAAAACGAC 5' mRNA
lacZ3 ATTAAGTTGGGTAACGCCAG 5' mRNA
lacZ4 TATTACGCCAGCTGGCGAAA 5' mRNA
lacZ5 ATTCAGGCTGCGCAACTGTT 5' mRNA
lacZ6 AAACCAGGCAAAGCGCCATT 5' mRNA
lacZ7 AGTATCGGCCTCAGGAAGAT 5' mRNA
lacZ8 AACCGTGCATCTGCCAGTTT 5' mRNA
lacZ9 TAGGTCACGTTGGTGTAGAT 5' mRNA
lacZ10 AATGTGAGCGAGTAACAACC 5' mRNA
lacZ11 GTAGCCAGCTTTCATCAACA 5' mRNA
lacZ12 AATAATTCGCGTCTGGCCTT 5' mRNA
lacZ13 AGATGAAACGCCGAGTTAAC 5' mRNA
lacZ14 AATTCAGACGGCAAACGACT 5' mRNA
lacZ15 TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT 5' mRNA
lacZ16 ATCTTCCAGATAACTGCCGT 5' mRNA
lacZ17 AACGAGACGTCACGGAAAAT 5' mRNA
lacZ18 GCTGATTTGTGTAGTCGGTT 5' mRNA
lacZ19 TTAAAGCGAGTGGCAACATG 5' mRNA
lacZ20 AACTGTTACCCGTAGGTAGT 5' mRNA
lacZ21 ATAATTTCACCGCCGAAAGG 5' mRNA
lacZ22 TTTCGACGTTCAGACGTAGT 5' mRNA
lacZ23 ATAGAGATTCGGGATTTCGG 5' mRNA
lacZ24 TTCTGCTTCAATCAGCGTGC 5' mRNA
lacZ25 ACCATTTTCAATCCGCACCT
lacZ26 TTAACGCCTCGAATCAGCAA
lacZ27 ATGCAGAGGATGATGCTCGT
lacZ28 TCTGCTCATCCATGACCTGA
lacZ29 TTCATCAGCAGGATATCCTG
lacZ30 CACGGCGTTAAAGTTGTTCT
lacZ31 TGGTTCGGATAATGCGAACA
lacZ32 TTCATCCACCACATACAGGC
lacZ33 TGCCGTGGGTTTCAATATTG
lacZ34 ATCGGTCAGACGATTCATTG
lacZ35 TGATCACACTCGGGTGATTA
lacZ36 ATACAGCGCGTCGTGATTAG
lacZ37 GATCGACAGATTTGATCCAG
lacZ38 AAATAATATCGGTGGCCGTG
lacZ39 TTTGATGGACCATTTCGGCA
lacZ40 TATTCGCAAAGGATCAGCGG
lacZ41 AAGACTGTTACCCATCGCGT
lacZ42 TGCCAGTATTTAGCGAAACC
lacZ43 AAACGGGGATACTGACGAAA
lacZ44 TAATCAGCGACTGATCCACC
lacZ45 GGGTTGCCGTTTTCATCATA
lacZ46 TCGGCGTATCGCCAAAATCA
lacZ47 TTCATACAGAACTGGCGATC
lacZ48 TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG
lacZ49 ACGGAACTGGAAAAACTGCT 3' mRNA
lacZ50 TATTCGCTGGTCACTTCGAT 3' mRNA
lacZ51 GTTATCGCTATGACGGAACA 3' mRNA
lacZ52 TTTACCTTGTGGAGCGACAT 3' mRNA
lacZ53 GTTCAGGCAGTTCAATCAAC 3' mRNA
lacZ54 TTGCACTACGCGTACTGTGA 3' mRNA
lacZ55 AGCGTCACACTGAGGTTTTC 3' mRNA
lacZ56 ATTTCGCTGGTGGTCAGATG 3' mRNA
lacZ57 ACCCAGCTCGATGCAAAAAT 3' mRNA
lacZ58 CGGTTAAATTGCCAACGCTT 3' mRNA
lacZ59 CTGTGAAAGAAAGCCTGACT 3' mRNA
lacZ60 GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT 3' mRNA
lacZ61 TACGCCAATGTCGTTATCCA 3' mRNA
lacZ62 TAAGGTTTTCCCCTGATGCT 3' mRNA
lacZ63 ATCAATCCGGTAGGTTTTCC 3' mRNA
lacZ64 GTAATCGCCATTTGACCACT 3' mRNA
lacZ65 AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT 3' mRNA
lacZ66 ATGTCTGACAATGGCAGATC 3' mRNA
lacZ67 ATAATTCAATTCGCGCGTCC 3' mRNA
lacZ68 TGATGTTGAACTGGAAGTCG 3' mRNA
lacZ69 TCAGTTGCTGTTGACTGTAG 3' mRNA
lacZ70 ATTCAGCCATGTGCCTTCTT 3' mRNA
lacZ71 AATCCCCATATGGAAACCGT 3' mRNA
lacZ72 AGACCAACTGGTAATGGTAG 3' mRNA

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References

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जीव विज्ञान अंक 161 एसएमफिश आरएनए इमेजिंग एमआरएनए स्थानीयकरण एकल कोशिका एकल अणु प्रतिलेखन प्रतिलेखन विस्तार समय से पहले समाप्ति एमआरएनए क्षरण
सीटू संकरण में दो रंग एकल अणु फ्लोरेसेंस का उपयोग करके <em>एस्चेरिचिया कोलाई</em> में अंतरिक्ष और समय में एमआरएनए काइनेटिक्स की जांच करना
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Kim, S., Vaidya, K. Probing mRNA… More

Kim, S., Vaidya, K. Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (161), e61520, doi:10.3791/61520 (2020).

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