Summary
Denne protokollen beskriver en anvendelse av enkeltmolekylfluorescens in situ hybridisering (smFISH) for å måle in vivo kinetikk av mRNA syntese og nedbrytning.
Abstract
Enkeltmolekylfluorescens i situ hybridisering (smFISH) gjør det mulig å telle det absolutte antallet mRNAs i individuelle celler. Her beskriver vi en anvendelse av smFISH for å måle frekvensen av transkripsjon og mRNA nedbrytning i Escherichia coli. Siden smFISH er basert på faste celler, utfører vi smFISH på flere tidspunkter i løpet av et tidsforløpet, det vil vil vil at når celler gjennomgår synkroniserte endringer ved induksjon eller undertrykkelse av genuttrykk. På hvert tidspunkt utmerker underregioner av en mRNA seg ut til sondetranskripsjonsutnavming og for tidlig avslutning. Resultatet av denne protokollen gjør det også mulig å analysere intracellulær lokalisering av mRNAs og heterogenitet i mRNA-kopinumre blant celler. Ved hjelp av denne protokollen kan mange eksempler (~ 50) behandles innen 8 timer, som hvor mye tid som trengs for bare noen få eksempler. Vi diskuterer hvordan du bruker denne protokollen til å studere transkripsjon og nedbrytning kinetikk av ulike mRNAs i bakterielle celler.
Introduction
Flyten av genetisk informasjon fra DNA til mRNA og protein er en av de mest grunnleggende cellulære prosessene, hvis regulering er viktig for cellulær kondisjon1. Antall mRNAer i en celle bestemmes av to dynamiske prosesser, transkripsjon og mRNA-nedbrytning. Men hvordan transkripsjon og mRNA nedbrytning reguleres i tid og rom for en enkelt celle forblir ikke helt forstått, hovedsakelig på grunn av mangel på eksperimentelle metoder for å kvantitativt måle deres kinetikk in vivo.
Metoder basert på totale mRNAs hentet fra en populasjon av celler, for eksempel Northern blot, RT-PCR, RNA sekvensering og genuttrykk microarrays, kan måle den relative forskjellen i mRNA nivåer og har blitt mye brukt til å analysere frekvensen av transkripsjon forlengelse2,3,4,5 eller frekvensen av mRNA nedbrytning6,7. De gir imidlertid ikke det absolutte antallet mRNAer per celle, og dermed er de ikke egnet for å sonderere frekvensen av transkripsjonsinitiering8. Også fordi mRNAs er hentet fra en populasjon av celler, kan den romlige fordelingen av mRNAer i en enkelt celle og variabiliteten av mRNA-kopinumre mellom celler ikke måles.
Neste generasjons RNA-sekvensering på individuelle celler (scRNAseq) kan kvantifisere antall mRNAer per celle i genomisk skala9. Det er imidlertid fortsatt vanskelig å bruke denne teknikken til å måle transkripsjonskinetikk, på grunn av utfordringer med prøveforberedelse og høye kostnader. Spesielt har anvendelsen av scRNAseq til bakterier vært teknisk vanskelig på grunn av lav mRNA overflod10,11.
Enkeltmolekylfluorescens i situ hybridisering (smFISH) er basert på hybridisering av fluorescerende merkede enkelttrådet sonder hvis sekvenser er komplementære til målet mRNA av interesse12,13. Konseptet sekvensspesifikk hybridisering ligner på det som brukes i Nordlig blot eller RT-PCR, men hybridiseringen gjøres in situ i faste celler, for å bevare den opprinnelige lokaliseringen av mRNAs. Signalet til en enkelt mRNA forsterkes ved hjelp av mange prober, ~ 20 nukleotider (nt) i lengde, hybridiserer til forskjellige deler av en mRNA (figur 1A)13. I denne "flislegging" sonde tilnærming, antall sonder som trengs for å oppdage en enkelt mRNA setter en lavere grense på lengden på mRNA som kan analyseres. Alternativt kan mRNA av interesse være transkripsjonelt smeltet til en ikke-koding rekke tandem Lac operatør sekvenser, slik at flere kopier av en fluorescerende merket lacO sonde hybridisere til en enkelt mRNA (Figur 1B)14.
smFISH har blitt brukt til å kvantifisere antall mRNAer per celle ved steady state (det vil si når syntese og forfall er i balanse) og for å analysere gjennomsnittet og variasjonen til mRNAer blant bakterielleceller 15,,16,,17. Nylig har smFISH blitt brukt til å kvantifisere mRNA-tall ved ikke-steady state, rett etter induksjon eller undertrykkelse av genuttrykk i E. coli18,19,20. De timelige endringene i de absolutte mRNA-kopinumrene ble deretter brukt til å beregne frekvensen av transkripsjonsinitiering, forlengelse og oppsigelse, samt frekvensen av mRNA-nedbrytning. For dette programmet kan konvensjonelle smFISH-prosedyrer være tungvinte fordi det er mange prøver, som hver representerer ett tidspunkt, som må gå gjennom flere bufferutvekslingstrinn (det vil si sentrifugering og vasking). Her beskriver vi en smFISH-protokoll, der prøvehåndteringstrinnene forenkles dramatisk ved å få celler festet til overflaten av en dekkslipp og ved å aspirere væsker med et vakuumfiltreringssystem14,,19. Ved hjelp av uttrykket av lacZ i E. coli som eksempel, demonstreres hele arbeidsflyten ( figur2) inkludert bildeanalyse (figur 3) som gir in vivo kinetikk av transkripsjon (initiering, forlengelse og oppsigelse) og mRNA-nedbrytning, celle-til-celle-variabilitet i mRNA-uttrykk og mRNA-lokalisering. Vi forventer at protokollen er allment aktuelt for sonde in vivo kinetikk og lokalisering av andre mRNAs i ulike bakteriearter.
Protocol
1. Utarbeidelse av smFISH-sonder
MERK: For å merke smFISH-sonder med en enkelt fluorofor, følg en standardprotokoll for merking av nukleinsyre oligonukleotider basert på NHS esterkjemi21.
- Design smFISH sonder. Bestem om du vil bruke "flislegging" prober eller "array" prober (Figur 1) for genet av interesse. Se Diskusjon-delen om hvordan du tar beslutningen.
- For "flislegging" prober (Figur 1A) bruk et nettbasert sondeutformingsverktøy (f.eks. se Materialtabell).
- For "array" prober (Figur 1B) utfører du et BLAST-sekvenssøk for å forsikre deg om at sondesekvensen ikke utfyller andre mRNA-sekvenser.
- For å studere lacZ mRNA transkripsjon og nedbrytning kinetikk, bruk to sett med 24 sonder, hvert sett som dekker de første og siste 1 kb regioner av lacZ (3072 bp)19.
MERK: Disse probesettene er heretter kalt henholdsvis "5' mRNA-sonde" og "3" mRNA-sonde". Sekvenser av disse sondene er oppført i materialtabellen.
- Bestill sondesekvenser som DNA oligonucleotides med en C6 amino linker på 5 'slutten. Oppløs individuelle sonder i vann til 1 mM.
- Kombiner like store mengder sonder for "5" mRNA-sonde" og "3" mRNA-sondesett. For 5' mRNA-probesett for lacZkombinerer du for eksempel 20 μL av hver sonde (totalt 24 typer prober i settet).
- Utføretanolnedbør 22 av de kombinerte sondene for å fjerne eventuelle forurensninger av primære og sekundære aminer (som Tris, glycin og ammoniumsalter) som kan hemme konjugeringsreaksjonen. Til slutt oppløse DNA pellet i 100 μL vann (gir ~ 4,5 mM DNA i et sondesett).
MERK: Dette trinnet anbefales selv om sondene gjennomgikk en standard desaltrensing av produsenten. En standard filterbasert rensing kan fungere i stedet for og i tillegg til etanolnedbøren. - Velg to spektralt distinkte fluoroforer med en monofunksjonell NHS ester moiety, slik at 5 ' og 3 ' mRNA sonde sett kan merkes differensial. For eksempel, forberede Cy5 NHS ester for 5 ' mRNA sonder og Cy3B NHS ester for 3 ' mRNA sonder. Oppløs hver type fluoroforer i vannfri DMSO til endelig 20 mg/ml (~25 mM).
- Forbered 0,1 M natriumbikarbonat (pH 8,5) rett før hver merkereaksjon. Eksponering for luft i lang tid vil senke sin pH og redusere merkingeffektiviteten.
- For bøyningsreaksjonen, kombinere følgende: 15 μL av Cy5 fluoroforbestanden (fra trinn 1,5), 4 μL av 5' mRNA-probesett (fra trinn 1,4), 75 μL natriumbikarbonat (fra trinn 1,6) og 7 μL vann. Pakk røret med aluminiumsfolie og rist ved romtemperatur i 3-6 timer.
MERK: Lengre inkubasjon fører ikke nødvendigvis til større merkeeffektivitet. Reaksjonen kan også skaleres opp eller ned hvis konsentrasjonene av komponentene opprettholdes. - Gjenta trinnet ovenfor for 3'mRNA-probesettet og tilsvarende fluorofor (det vil vil vil at Cy3B NHS-ester).
- Utføretanolnedbør 22 for å fjerne ureagerte fargestoffmolekyler. Oppløs pelleten i ~50 μL TE-buffer (10mM Tris-HCl pH 8.0 med 1mM EDTA).
- Estimer konsentrasjonene av DNA og fluorofor ved hjelp av et UV-Vis spektrometer.
- Mål absorbansen ved 260 nm og 559 nm (Cy3B) eller 649 nm (Cy5). Hvis prøven er for konsentrert til å gi en nøyaktig måling, fortynner du 1 μL av prøven til 10 μL.
- Omregn absorbansen til konsentrasjonen:
εDNA = 0,2 μM-1 (for 20-nt enkelttrådet DNA), εCy5 = 0,25 μM-1og εCy3B = 0,13 μM-1
MERK: [DNA] er konsentrasjonen av totale prober i oppløsningen. Konsentrasjonen av individuelle sonder er ca 24x lavere. Konsentrasjonen av totale sonder vil bli brukt som "sondekonsentrasjoner" fra dette punktet. Hvis forholdet mellom [DNA] og [fargestoff] er 1, kan følgende HPLC-trinn hoppesover 23, og prøven skal fortynnes til endelig 4-5 μM i TE-buffer.
- (Anbefales) Rens de merkede sondene fra umerkede prober og gratis fargestoffer ved hjelp av HPLC.
MERK: Selv om dette ekstra rensetrinnet vil føre til tap av prøve, er det gunstig for nedstrømsapplikasjonene. Fjerning av umerkede DNA-prober vil øke fluorescenssignalet fra mRNA-mål, og fjerning av uaktete fargestoffer vil redusere bakgrunnsfluorescens.- Klargjør HPLC med en standard analytisk C18-kolonne, 0,1 M triethylammoniumacetat (TEAA) som buffer A, og acetonitril som buffer B.
- Legg til 1 M TEAA i prøven (fra trinn 1.9) for å lage 0,1 M TEAA.
- Still inn graderingsprogrammet på følgende måte: 0-5 min med 0 % B, 5-35 min med en 0-30 % lineær gradering på B, 35-37 min med en 30-100% lineær gradient på B, og 37-40 min med 0% B. Hold strømningshastigheten på 0,1 ml / min og registrer kromatrammer ved 260 og 649 nm (for Cy5-merkede prøver) eller på 260 og 559 nm (for Cy3B-merkede prøver).
- Samle den rømte prøven når absorbansen øker i både DNA- og fluoroforkanaler.
- Konsentrer den rømte prøven ved hjelp av en vakuumkonsentrator og suspender pelleten på nytt i 50-100 μL TE-buffer.
- Kontroller konsentrasjonen av DNA og fluorofor ved hjelp av et UV-Vis-spektrometer (se trinn 1.10). Fortynn om nødvendig for å gjøre endelig konsentrasjon rundt 4-5 μM. Oppbevar probene ved -20 °C
2. Utarbeidelse av løsninger
- Forbered et stort volum av DEPC-behandlet vann og buffere (tabell 1). Disse løsningene kan vare over et år ved romtemperatur.
- Klargjør 4x festeløsning og vaskeoppløsning (tabell 1).
- Klargjør prehybridiseringsløsningen og probehybridiseringsløsningen (tabell 1). Forbered probehybridiseringsløsningen under inkubasjon i trinn 5.1 eller trinn 6.1, og hold deretter løsningen i en 37 °C benkeplateshaker i 20-40 min med et deksel for å minimere eksponering for lys.
MERK: Konsentrasjonene av formamid, SSC og sonde ble optimalisert for lacZ-probesettene for å minimere bakgrunnsfluorescens samtidig som det virkelige signalet maksimeres. Se Diskusjon-delen for detaljer om hvordan du endrer disse konsentrasjonene for ulike bruksområder.
3. Utarbeidelse av dekkglass og glasssklier
- Rengjør dekkglass og glasssklier.
- Plasser individuelle dekkglass og lysbilder i en Coplin-krukke ved hjelp av tang. Kontroller at dekkslipper og lysbilder er atskilt og ikke berører hverandre.
- Fyll krukken med 100% etanol og lukk lokket. Legg krukken i et vannbad ultralyd renere og sonicate i 15-20 min.
MERK: For vannbade sonicator anbefales det å slå av varmeapparatfunksjonen. - Hell ut etanol og vask med ultrarent vann 3-4x. Bruk vann som strømmer direkte fra vannrensemaskinen.
- Hell ut vannet fra krukken og fyll det med 70% etanol. Lukk lokket og utfør sonikering i 15-20 min og vask med ultrarent vann.
- Fyll krukken med ultrarent vann og soniker i 15-20 min.
MERK: Dekkglass og glasssklier kan oppbevares over natten i Coplin-krukken fylt med ultrarent vann. - Ta en glide eller en dekkglass ut av Coplin-krukken ved hjelp av rene tang og tørk den med N2-gass. Gjenta dette for de gjenværende lysbildene og dekslepper.
- Plasser de tørkede lysbildene i en ren oppbevaringsboks til de brukes i trinn 7.5. Plasser de tørkede dekkglassene i en tom 1000-μL pipettespissboks, som vil tjene som et "kammer" i den gjenværende prosedyren.
- Bruk en hydrofob markør til å tegne sirkler på dekkglassene etter sirkulære hull i pipettespissen. Disse sirklene (~ 0,5 cm i diameter) vil tjene som "brønner". Vent minst 5-10 min for at markøren skal tørkes helt.
MERK: Hold alltid lokket på tuppboksen lukket. - Påfør en 20-μL dråpe på 0,1% poly-L-lysin til hver brønn. Inkuber i 10-50 min ved romtemperatur.
MERK: Juster dette volumet i henhold til brønnstørrelsen. Sørg for at løsningen dekker brønnområdet helt. For lengre inkubasjon, vær forsiktig med å unngå fordampning. - Etter inkubasjon aspirerer poly-L-lysin uten å berøre overflaten, da dette vil skrape poly-L-lysinen av. Påfør deretter en dråpe (~ 20 μL) av DEPC vann til poly-L-lysin behandlet brønner. Lukk lokket på "kammeret" for å forhindre fordampning til trinn 5.1.
4. Tidsforløpet eksperiment og prøvefiksering
- Vokse E. coli celler i ~ 20 ml flytende kultur i en 250 ml kolbe. Oppbevar kolben i en vannbadshaker (30 °C) og fortsett å riste. Stopp shakeren bare når du tar prøver.
MERK: Resultatene som presenteres i dette papiret er hentet fra MG1655-celler dyrket i M9 minimalt medium supplert med 0,2% glyserol, 0,1% casaminosyrer og 1 mg / L tiamin til en eksponentiell vekstfase (OD600~ 0,2). - Tilsett 250 μL av 4x festeløsningen i et tomt 1,5 ml rør. Gjenta og klargjør flere rør, så mange som tidspunktene som skal tas. Merk rørene med tidspunktnumre og hold dem ved romtemperatur.
- Ta 750 μL cellekultur (OD600~ 0,2) før du starter et tidsforløpet eksperiment. Legg kulturen til et rør merket for "time zero" (fra trinn 4.2). Inverter røret forsiktig for å blande celler med festeløsningen.
MERK: Ikke pipette opp og ned for å blande, vortex eller "være grov" på cellene. Dette eksemplet representerer den undertrykte tilstanden og vil bli brukt som en kontroll for å beregne fluorescensintensiteten til en enkelt mRNA (se trinn 9.4). - Tilsett 0,02-1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til den flytende kulturen for å indusere lacZ-uttrykk. Start en timer på dette punktet (t = 0 min) og prøv med et bestemt tidsintervall (f.eks. hvert 1 minutt) fra da av. Gjenta trinn 4.3 for prøvetaking.
- Tilsett 5 mM orthonitropheynl-β-D-fucopyranoside (ONPF) eller 500 mM glukose24 på et bestemt tidspunkt i løpet av tidsløpet (f.eks. ved t = 1,5 min) for å undertrykke lacZ-uttrykk. Etter undertrykkelse fortsetter du å prøve kulturene (trinn 4.3) for å spore mRNA-nedbrytning.
MERK: Undertrykkelse kan også gjøres med ~400 μg/ml rifampicin, en transkripsjonsinitieringshemmer25. - For fiksering, inkuber rørene som inneholder samplede celler ved romtemperatur i 15 min, etterfulgt av inkubasjon i is i 30 min.
- For å fjerne fikseringsmidler, sentrifuger rørene ved 4500 x g i 4 min ved romtemperatur. Fjern supernatanten med en pipette.
MERK: Pass på at du kaster formaldehyd i en separat avfallsbeholder etter sikkerhetsprotokollen. - Legg til 1 ml DEPC-PBS og re-suspendere cellene. Gjenta sentrifugering og re-suspensjon 2x flere ganger.
MERK: Faste celler er skjøre og trenger skånsom behandling. Forsiktig re-suspendere pellet og unngå bobler. - Etter det siste vasketrinnet, må celler suspenderes på nytt i ~30 μL DEPC-PBS.
5. Permeabilisering av cellemembraner
- Påfør hver gang punktprøve på forskjellige brønner på dekkslippen (~ 30 μL per brønn). Vent i 10-30 min ved romtemperatur for celler å holde seg på overflaten. Unngå sammenslåing av væskedråpene mellom brønnene.
- For å skylle av ubundne celler, aspirer væsken og påfør ~ 20 μL DEPC PBS til hver brønn. Aspirere DEPC PBS innen få minutter.
- Gjennomsyre cellemembranene ved å bruke 15 μL på 70% etanol til hver brønn i 4 min. Aspirer etanol etter 4 min, og sørg for at brønnene er helt tørre.
MERK: Det er viktig å begrense etanolbehandlingen i 4 min. Lengre behandling vil resultere i over-permeabilisering. - Påfør 30 μL av vaskeoppløsningen på hver brønn.
6. Hybridisering av sonde
- Aspirer vaskeoppløsningen fra hver brønn. Påfør 30 μL av pre-hybridiseringsløsningen på hver brønn. Inkuber kammeret i 37 °C ovnen i 30 min.
MERK: Tilsett ~50 ml vann til bunnen av kammeret for å gi fuktighet. - Aspirer pre-hybridiseringsløsningen fra hver brønn. Påfør ~ 30 μL av probehybridiseringsløsningen på hver brønn. Dekk kammeret med aluminiumsfolie og inkuber i 37 °C ovnen i 2 timer.
MERK: Kontroller at probehybridiseringsløsningen er i 37 °C benkeplate shaker før dette trinnet. Unngå sammenslåing av væsker mellom brønner. Påfør et mindre volum av løsningen på hver brønn, om nødvendig.
7. Etter hybridisering vask og forberedelse for bildebehandling
- Bruk en flerkanals pipette til å bruke ~30 μL av vaskeoppløsningen på hver av dem samtidig. Aspirer og gjenta 3-5x ganger vasking. Inkuber kammeret i 37 °C ovnen i 15-30 min.
- Gjenta trinn 7.1 to ganger til.
- Vask hver brønn med DEPC-PBS 5x ganger. Følg metoden som brukes i trinn 7.1, men hopp over inkubasjonsprosessen.
- Aspirer væsken fra dekkslippen. Påfør 4 μL DEPC-PBS på hver brønn.
- Bruk tang, løft og snu dekkglasset, og plasser den forsiktig over et glasssklie (fra trinn 3.2). Unngå bobler.
- Forsegle kantene på dekkslippen med silikon tannkjøtt.
- Vent til tannkjøttet er størknet. Man kan ta en pause her og lagre lysbildet over natten ved 4 °C.
MERK: Andre smFISH-protokoller foreslår å tilsette oksygenrensingsreagenser (f.eks. glukoseoksidase/katalase) eller bruke et kommersielt antifandemonteringsmedium14,26 for å øke fotokontabiliteten til fluoroforene.
8. Bildebehandling
- Hvis du vil finne et interesseområde, bruker du live-modusen for fasekontrastavbildning. Endre synsfeltet i en brønn ved å manøvrere scenen joystick. Velg et område der celletettheten er optimal (det vil si at det er mange celler som for det meste er separert). Juster z-fokus slik at cellebilder med fasekontrast er i fokus.
- Ta øyeblikksbilder i rekkefølge av Cy5 (4-s eksponering), Cy3 (2-s eksponering) og fasekontrast (0,2-s eksponering).
MERK: Cy3B fargestoffmolekyler er avbildet i Cy3-kanalen, og bildene kalles Cy3-bilder. - Gjenta trinn 8.1-8.2 for å skaffe bilder av ~ 10 forskjellige områder i en brønn.
- Flytt målet til en annen brønn og gjenta trinn 8.1-8.3.
- Eksporter bilder som TIFF-filer.
- (Valgfritt) Bilde multi-farge perler adsorbert på coverslip overflaten i Cy5 og Cy3 kanaler for å bestemme romlig skifte mellom Cy5 og Cy3 kanaler for bilderegistrering formål.
- Påfør ~ 10 μL av multi-farge fluorescerende perler (0,2 μm diameter) på en ren dekkglass overflate og vent i 10-30 min. Etter vask med ~ 50 μL PBS, påfør ~ 5 μL PBS og smør dekkslipsen med et glasssklie. Forsegle og monter på mikroskopet.
- Bildeperler i både Cy5 og Cy3 kanaler.
9. Bildeanalyse
MERK: Matlab-kode som brukes i dette trinnet er tilgjengelig på følgende GitHub-webområde: https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020. GitHub-mappen inneholder alt som trengs for bildeanalysen, inkludert parameterverdier for cellesegmentering og spotidentifikasjon. Prosedyren i dette trinnet er videre forklart i hovedskriptet, kalt "FISHworkflow.m".
- Åpne et cellesegmenteringsverktøy, for eksempel microbeTracker27 eller Oufti28, og last inn fasekontrastbilder. Velg "Uavhengige rammer" og trykk på en knapp kalt "Alle rammer" for å starte segmenteringsprosessen, hvorfra celler identifiseres og konturene beregnes (Figur 3B,C).
MERK: Detaljerte protokoller for bruk av disse programvarepakkene er tilgjengelige på nettet (f.eks. oufti.org). - Last Cy5 fluorescens bilder i spotFinder funksjon av microbeTracker eller Oufti, og trykk på "Kjør" knappen for å starte spot identifikasjon og kvantifisering basert på 2D Gaussian montering (Figur 3B,C). Gjenta dette trinnet for Cy3 fluorescens bilder for å analysere flekker i Cy3-kanalen. Dette trinnet gir en liste over flekker i hver celle, inkludert intensiteter og koordinater.
- (Valgfritt) Filtrer ut dimmepunkter (falske positiver) ved hjelp av en terskel, som forklart i FISHworkflow.m-filen.
MERK: Undersøk lysstoffflekker i den negative kontrollen (f.eks. MG1655 ΔlacZ) og bestem terskelen for å filtrere ut falske positiver. - For å oppnå spotintensiteten til en enkelt mRNA, bruk en liste over spotintensiteter målt til punkt null (før du legger til IPTG), og passer til fordelingen av spotintensiteter med en gaussisk blandingsmodell med to blandingskomponenter. Ta toppposisjonen til den første gaussiske befolkningen (svart linje i figur 3D,E) som spotintensiteten til en enkelt mRNA. Utfør dette for Cy5-flekker og Cy3-flekker separat for å oppnå spotintensiteten til en enkelt 5' og 3' lacZ mRNA.
MERK: Gjenta dette i hvert tidsforløpets eksperiment fordi spotintensiteten til én enkelt mRNA kan variere noe i forskjellige eksperimenter. - Del fluorescensintensiteten til et sted med intensiteten til en enkelt mRNA (fra trinn 9.4) for å få antall mRNAer på et sted. Sum normaliserte spotintensiteter i en celle for å beregne det totale antallet mRNA i en celle (figur 3F). Utfør disse beregningene for 5' og 3' mRNA separat.
- Beregn og plott de gjennomsnittlige mRNA-tallene per celle på hvert tidspunkt (f.eks. figur 4B), og analyser in vivo kinetikken til transkripsjon og mRNA-nedbrytning fra den timelige endringen i gjennomsnittlig mRNA-nivåer (figur 4B).
- For å oppnå frekvensen av transkripsjon forlengelse, utføre en minst kvadrater montering av en linje til den første økningen i 5 'og 3' mRNA signaler og identifisere avskjæringer til basalnivåer (Figur 4B). Forskjellen mellom disse avskjæringene indikerer gjennomsnittlig tid for RNAPs å reise fra 5 'sonde regionen til 3'sonde regionen. Del avstanden mellom to probesett (2 kb) med denne tiden for å oppnå gjennomsnittlig grad av transkripsjonsutravmelse.
- For å oppnå frekvensen av mRNA-nedbrytning, monter en eksponentiell forfallsfunksjon, y = A·exp(-t/τ) til det endelige forfallsområdet for 5- og 3 mRNA-signalene (f.eks. figur 4B). Tilpasningsparameteren τ er gjennomsnittlig mRNA-levetid.
- (Valgfritt) Analyser celle-til-celle-variasjonen i genuttrykk (f.eks. respons på cellenivå på induksjonen som vises i figur 4C),basert på fordelingen av mRNA-tall i hver celle (beregnet i trinn 9.5).
- (Valgfritt) Ved hjelp av informasjon om spotplassering langs de store og mindre aksene i en celle (hentet fra trinn 9.2), analyserer du lokaliseringen av mRNAer (figur 4D,E).
- (Valgfritt) Analyser sam lokalisering av 5' og 3' mRNAs (figur 5) ved å sammenligne lokalisering av flekker oppdaget i Cy5- og Cy3-kanalene.
- Last inn bilder av flerfargede perler (trinn 8.6) i spotFinderF-funksjonen i microbeTracker og få koordinater av perle centroids i Cy5- og Cy3-kanaler. Bruk listen over centroid koordinater til å beregne affin transformasjon matrise, som informerer hvordan Cy5 og Cy3 kanaler er forskjøvet og rotert med hensyn til hverandre29.
- Påfør affine transformasjon matrisen til Cy5 og Cy3 FISH bilder for å konvertere Cy3 bilder i Cy5 koordinaten. Klassifiser om et sted er samentisert med et annet sted i en annen kanal. For eksempel anses et sted i Cy5-kanalen å være sam-lokalisert med et annet sted i Cy3-kanalen hvis avstanden mellom deres centroids er mindre enn 150 nm (figur 5).
- Analyser hvor mange Cy5-flekker som er klassifisert som "sam-lokaliserte" med Cy3-flekker på hvert tidspunkt. Analyser også intensiteten til de sam-lokaliserte flekkene (figur 5).
Representative Results
Figur 3 viser representative bilder fra denne smFISH-protokollen. Et fullt synsfelt (86,7 μm x 66,0 μm ved hjelp av vårt mikroskopioppsett som er beskrevet i Materials tabell)viser ~500 E. coli-celler spredt over hele feltet ( figur3A). Hvis tettheten av celler er mye høyere enn det som vises i dette bildet, blir automatisk cellesegmentering vanskelig da segmenteringsalgoritmer ikke pålitelig identifiserer individuelle celler når celler berører hverandre. Man må justere konsentrasjonen av celler og inkubasjonstid som brukes til overflateoverholdelse (trinn 5.1) for å oppnå optimal tetthet av celler innen visning.
Morfologien til celler i fasekontrastbildene skal forbli sammenlignbare med levende celler for segmenteringsformål (figur 3A-C). Hvis cellene er overgjennomtrengelige, endres cellemorfologien (som "spøkelser"; Tilleggstall 1). I så fall kan man redusere varigheten av 70% etanolbehandling i trinn 5.3.
Før induksjon var gjennomsnittlig lacZ-uttrykksnivå ~0,03 mRNAs per celle, i samsvar medtidligere rapporter 15,30. Også fordelingen av lacZ mRNA spotintensiteter før induksjon passet ikke godt med en normal fordeling eller en Poisson-fordeling på grunn av tilstedeværelse av flekker med høye intensiteter (figur 3D,E). Dette tyder på at de fleste stedene som oppdages under den undertrykte tilstanden representerer en enkelt lacZ mRNA, men en liten populasjon av flekker inneholder mer enn én lacZ mRNA. For å isolere befolkningen med en enkelt lacZ mRNA, brukte vi en gaussisk blandingsmodell med to blandingskomponenter (innsetter i figur 3D,E). Deretter ble gjennomsnittet av den første gaussiske tatt som gjennomsnittlig intensitet av et enkelt mRNA-sted (f.eks. toppen av den svarte kurven i figur 3D) og brukes til å konvertere spotintensiteten til antall mRNAs, for eventuelle flekker som oppdages i tidskurseksperimentet. For å beregne totalt antall mRNA-er i en celle, ble de normaliserte spotintensitetene summert i hver celle (figur 3F)19.
Når uttrykksnivået for lacZ mRNA er lavt, er det en eller to diffraksjonsbegrensede lacZ mRNA-flekker som er romlig separert i en celle. Derfor kan bildene av disse stedene analyseres av 2D Gaussian montering for deres intensitet og lokalisering.
Når uttrykksnivået er høyt, slik at flekker overlapper med hverandre i en celle, gjør 2D Gaussian-tilpasning ikke pålitelig kvantifisering. I så fall bør mRNA-nivået beregnes ved å dele det totale bakgrunnsavseende fluorescenssignalet i en celle med gjennomsnittlig intensitet av en enkelt mRNA19.
Når uttrykket av lacZ er indusert, øker signalet om 5' lacZ mRNA først og det av 3' lacZ mRNA øker senere (figur 4B). Hvis uttrykket av lacZ er undertrykt, reduseres både 5' og 3' lacZ mRNA-signaler med en viss forsinkelse mellom (figur 4B). For å oppnå frekvensen av transkripsjon forlengelse, økningen av 5 'og 3' signaler er først passer med linjer (Figur 4B), og forskjellen i x-intercepts er tatt som tid for RNAPs å reise avstanden mellom to sonde regioner (2000 nt). Frekvensen av transkripsjonsutravmelse kan måles fra hvert tidsforløpet eksperiment og standardavvik kan beregnes fra eksperimentelle duplikater. Den gjennomsnittlige frekvensen av transkripsjon forlengelse var 15-30 nt / s under våre eksperimentelle forhold19.
I tillegg ble frekvensen av mRNA-nedbrytning (invers av gjennomsnittlig mRNA-levetid) oppnådd ved å montere forfallsregionen med en eksponentiell funksjon (figur 4B). Våre tidsforløpets data inneholder mRNA-nedbrytning under og etter transkripsjon31. Vi passer til tidspunktene etter at 3' mRNA begynte å forfalle (t > 6 min) for å undersøke nedbrytningen av utgitte mRNAs. Vi fikk ~ 90 s som en gjennomsnittlig levetid på enten 5 'eller 3' lacZ mRNA19.
Frekvensen av transkripsjonsinitiering kan beregnes fra skråningen av 5' signaløkning etter induksjon (figur 4B, blå), eller fra gjennomsnittlig mRNA-nummer ved steady state (som er initieringshastigheten delt på nedbrytningshastigheten). Videre kan sannsynligheten for tidlig transkripsjonsoppsigelse estimeres, enten ved å ta forholdet mellom skråningen av 3's signaløkning i forhold til 5's signaløkning32 eller mellom steady-state nivåer av 3 ' og 5 ' mRNA regioner19.
Fordi smFISH er en encellet teknikk, kan vi analysere celle-til-celle-variasjon i transkripsjon. For eksempel kan man analysere prosentandelen av celler som uttrykker lacZ mRNA etter at IPTG er lagt til (figur 4C). Man kan også ta opp om mRNA lokalisering endres etter induksjon. Vi observerte at 5' og 3 ' lacZ mRNA flekker beveger seg litt utover, bort fra midten av cellen (Figur 4D, E), i samsvar med en tidligere rapport33.
Til slutt kan analyse av sam lokalisering mellom 5' og 3' mRNA flekker være informativ (Figur 5A). For eksempel, i den undertrykte tilstanden (tid null), er ca 25% av 5 ' mRNA flekker sam-lokalisert med en 3 'mRNA spot. Ved t = 1 min, så mange genloci har 5' mRNA syntese, men ennå ikke 3' mRNA syntese, de fleste av de 5' mRNA flekker er av seg selv uten 3' mRNA signal (det vil si lav sannsynlighet for co-lokalisering). Men når 3'mRNA vises (det vil si t = 2 min), øker sannsynligheten for sam lokalisering (lilla pil i figur 5A,B). Denne gangen, når co-lokaliseringen blir hyppig, avhenger av frekvensen av transkripsjon forlengelse. 2D tetthet tomten på 5 'og 3' lacZ mRNA tall innenfor hver co-lokalisering spot oppdaget på dette tidspunktet kan brukes til å utlede tettheten av RNAPs på lacZ genet (Figur 5C). Som tidligere rapportert19,5 ' mRNA tall i dette plottet indikerer at de fleste av lacZ loci har mindre enn 10 RNAPs på DNA når lacZ uttrykk er indusert av 1 mM IPTG. I tillegg er 3 mRNA-tallene i denne handlingen knyttet til klynger av RNAPs34. Det faktum at antall 3 'mRNA er nær en betyr at omtrent bare én RNAP kommer inn i 3 'sonde regionen. Dette tyder på at RNAPs på lacZ genet er romlig separert, i stedet for å danne en klynge (eller "konvoi").
Figur 1: Design av smFISH-sonder for en mRNA av interesse. (A) En flislegging metode. Sekvenser av korte DNA oligonucleotides (~ 20 bp i lengde) er valgt slik at de kan dekke mRNA av interesse. Oligonukleotidsondene er merket med et fluorescerende fargestoffmolekyl. (B) En matrisemetode. En ikke-koding rekke tandem sekvenser (f.eks "lacO array") er transkripsjonelt smeltet til mRNA av interesse. Fluorescerende merket sonde komplementært til gjentakelsesenheten (f.eks. lacO-probe på 17 bp i lengde) brukes til å forsterke signalet til en mRNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk for smFISH eksperimentell prosedyre og varighet av hvert trinn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: smFISH bildeanalyse. (A-C) smFISH mikroskopi bilde av 5 'lacZ mRNA (rød) og 3' lacZ mRNA (grønn) i vill-type E. coli (MG1655) dyrket i M9 minimal medium supplert med 0,2% glyserol, 0,1 % casaminosyrer og 1 mg/l tiamin ved 30 °C. (A) Et representativt bilde av en prøve fra t = 3 min etter induksjon med 0,05 mM IPTG ved t = 0 min og undertrykkelse med 500 mM glukose ved t = 1,5 min. Fasekontrast og to fluorescensbilder av Cy5 (for 5' lacZ mRNA, rød) og Cy3 (for 3' lacZ mRNA, grønn) ble overlaid med pseudo-fargestoffer. Bildet viser et helt felt på 86,7 μm x 66,0 μm. Vektstangen, 5 μm. (B) Zoom inn versjon av et lite område (gul boks) i (A). Celleomriss vises i hvitt, og fluorescensflekker identifisert fra bildeanalyse vises med røde prikker. Vektstangen, 1 μm. (C) Påvisning av celleomriss og fluorescerende flekker under høyuttrykkstilstand (t = 4 min etter induksjon med 1 mM IPTG). Vektstangen, 1 μm. (D-E) Fordelinger på 5' og 3' mRNA spotintensiteter målt før du legger til IPTG (den undertrykte tilstanden). Histogrammene er vist med to gaussiske funksjoner (svart og grått) hvis gjennomsnittsverdier er fra den gaussiske blandingsmodellen. Inndata viser quantile-quantile plot av tilfeldige tall generert fra gaussiske blandingsmodeller og eksperimentelt målte mRNA spot intensiteter (n = 1040 for 5' mRNA og 680 for 3' mRNA). (F) Informasjon innhentet for en enkelt celle som peker i panelet (B). For en gitt celle (i), flekker ble identifisert i Cy5 og Cy3 kanaler, og deres intensitet (I) og koordinere langs den korte og lange aksen av en celle (d, l) ble kvantifisert fra 2D Gaussian montering. Etter normalisering spot intensiteter ble oppsummert for å gi det totale antallet 5 'eller 3' mRNAs i denne cellen. Samtidig lokalisering mellom flekker fra forskjellige kanaler kan også analyseres som i eksemplet vist i figur 5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av in vivo kinetikk av transkripsjon og mRNA nedbrytning. (A) Skjematiske og representative bilder av to-farge smFISH eksperimenter måle endringer i lacZ mRNA nivåer over tid. Røde og grønne stiplede linjer indikerer Cy5 eller Cy3B merket oligonukleotid sonder som hybridisere til 1 kb-lang 5 'og 3' mRNA regioner av lacZ mRNA i E. coli, henholdsvis. Også vist er overlegg av to fluorescens bilder med en fase kontrast bilde på angitte tidspunkter etter induksjon med 0,2 mM IPTG på t = 0 min. Transkripsjon ble undertrykt med 500 mM glukose ved t = 1,5 min. Vektstangen, 1 μm. Figuren er endret fra Kim et al19. (B) 5' og 3' lacZ mRNA tall per celle over tid, under eksperimentet beskrevet i panelet (A). Feilfelt er bootstrapped SEMs. Minst 1200 celler ble analysert per tidspunkt. Den første økningen av 5'' og 3 ' mRNA signaler var egnet med en linje (blå). Forskjellen i x-intercepts var 1,93 min, noe som ga den gjennomsnittlige frekvensen av transkripsjon forlengelse av 17,3 nt / s. Endelig forfall av 5' og 3' mRNA signaler var egnet med en eksponentiell forfall funksjon (grå). Tilpasningsparametrene indikerer at gjennomsnittlig mRNA-levetid er 1,52 min for 5' mRNA og 1,66 min for 3' mRNA. (C) Prosentandel av celler med ett eller flere lacZ mRNA flekker under eksperimentet beskrevet i (A). Feilfelt er bootstrapped SEMs. (D)Lokalisering av et sted langs en celles korte akse. Man kan kvantifisere et steds nærhet til membranen ved å dele plasseringen langs den korte aksen (d) med halv bredde på cellen (w). (E) Endring i lokaliseringen av 5' og 3' lacZ mRNA flekker langs cellenes korte akse under eksperimentet beskrevet i (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av sam lokalisering av 5' og 3' mRNA flekker. (A) Skjematisk viser forventet sam-lokalisering mellom 5' og 3' mRNA flekker etter induksjon. Når 3 'mRNA er gjort, øker sannsynligheten for at en 5' mRNA-flekk blir sam-lokalisert med en 3' mRNA-flekk (lilla pil). (B)Sannsynligheten for sam lokalisering etter induksjon med 1 mM IPTG. Den lilla pilen angir tidspunktet der sannsynligheten for sam lokalisering først blir hyppig i henhold til skjematisk i panelet (A). (C) Antall 5' og 3' lacZ mRNAs innenfor en co-lokalisering spot oppdaget på t = 2 min etter induksjon med 1 mM IPTG (totalt 841 flekker). Grå prikker representerer individuelle sam lokaliserte flekker, mens røde prikker representerer gjennomsnittet av binned data. Feilfelt er SEM. Skyggen av grått indikerer tettheten av punkter i et gitt område av grafen. Den stiplede linjen indikerer en skråning på 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Optimalisering av probehybridiseringstilstanden. To typer prøver ble brukt: MG1655 celler dyrket som beskrevet i figur 3 og forblir uindusert (blå) eller behandlet med 0,5 mM IPTG i 20 min (rød). Probe hybridisering løsning ble laget med ulike konsentrasjoner av sonder (totalt 72 Cy5-konjugert sonder flislegging hele lacZ-regionen) og av formamid. Formamidkonsentrasjoner ble også justert i prehybridiseringsløsningen og vaskeløsningen, tilsvarende. "Ingen sonde" (grå linje) indikerer fluorescensnivået til de IPTG-tilføyde cellene som behandles uten sonder under hybridiseringstrinnet. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet normalisert etter celleområde (AU) ble beregnet fra 300-800 celler. Feilfelt er bootstrapped SEMs. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstall 1: Forvrengte cellemorfologier på grunn av overpermeabilisering. Overlegg av fasekontrast (gråskala), 5' lacZ mRNA (Cy5, rød) og 3' lacZ mRNA (Cy3, grønn) bilder av MG1655 celler 5 min etter induksjon med 1 mM IPTG. (A)Et eksempel som viser blanding av normale celler og altfor gjennomsyrede celler som mangler normal morfologi (indikert med rosa piler). (B) Et eksempel som viser "spøkelsesaktige" celler klumpet sammen. Scale bar = 1 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
| DEPC vann | ||||
| Tilsett 0,1 % DEPC til ultrarent vann og inkuber flasken (dekket) i 37 °C ovnen over natten og autoklav neste dag. | ||||
| DEPC PBS (10X) | ||||
| Bland følgende: | ||||
| 80 g | NaCl (siste 1,37 M) | |||
| 2 g (andre) | KCl (siste 27 mM) | |||
| 14,2 g | Na2HPO4 (endelig 100 mM) | |||
| 2.7 g | KH2PO4 (endelig 20 mM) | |||
| Ultrarent vann til 1L | ||||
| Filter (0,22 μm) i en glassflaske. | ||||
| Tilsett 0,1% DEPC og følg instruksjonene for DEPC-vann. | ||||
| For å lage 1X oppløsning, fortynne 10 ganger med DEPC vann. | ||||
| 1M DEPC natriumfosfatbuffer, pH 7,4 | ||||
| Bland følgende: | ||||
| 115 g | Na2HPO4 | |||
| 22.8 g | NaH2PO4 | |||
| Ultrarent vann til 1 L | ||||
| Filter (0,22 μm) i en glassflaske. | ||||
| Tilsett 0,1% DEPC og følg instruksjonene for DEPC-vann. | ||||
| 4X festeløsning (16% formaldehyd) | ||||
| 5 ml | 20% formaldehyd | |||
| 500 μL | DEPC vann | |||
| 750 μL | 1M DEPC natriumfosfatbuffer, pH 7,4 | |||
| Oppbevares ved 4 °C i opptil 2-4 uker. | ||||
| FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig. Bruk hansker og bruk en røykhette når du lager denne oppløsningen. | ||||
| Vask oppløsning | ||||
| Bland følgende: | ||||
| 10 ml | Formamid (siste 25 %) | |||
| 4 ml | 20X SSC (endelig 2X) | |||
| Fyll DEPC-vann til 40 ml | ||||
| Filter (0,22 μm) og oppbevares ved 4 °C | ||||
| FORSIKTIG: Formamid er giftig. Bruk hansker og bruk en røykhette når du lager denne oppløsningen. | ||||
| Løsning for forhåndshybridisering | ||||
| 200 μL | Formamid (siste 20 %) | |||
| 100 μL | 20X SSC (endelig 2X) | |||
| 10 μL | 100X VRC (endelig 1X) | |||
| 25 μL | 4 % (w/v) BSA (siste 0,1 %) | |||
| 685 μL | DEPC vann | |||
| MERK: Vortex VRC-aksjen før du tar ut 10 μL. | ||||
| FORSIKTIG: Formamid er giftig og et kjent teragen. Bruk hansker og håndter det under en røykhette. | ||||
| Probe hybridisering løsning | ||||
| 200 μL | Formamid (siste 20 %) | |||
| 100 μL | 20X SSC (endelig 2X) | |||
| 10 μL | 100X VRC (endelig 1X) | |||
| 25 μL | 4 % (w/v) BSA (siste 0,1 %) | |||
| 10 μL | 40 mg/ml E. coli tRNA (endelig 0,4 mg/ml) | |||
| 200 μL | 50 % dekstransulfat (siste 10 %) | |||
| x μL | 5' mRNA probe sett (fra trinn 1.12) til siste 4 nM. | |||
| y μL | 3' mRNA probe sett (fra trinn 1.12) til siste 4 nM. | |||
| - | DEPC vann for å gjøre det totale volumet 1 ml | |||
| MERK: Tilsett dekstransulfat sist. Fordi det er veldig viskøs, kutt enden av en pipettespiss før du tar 200 μL ut fra 50% lager. Etter å ha lagt dekstransulfat, pipette opp og ned for å homogenisere løsningen. | ||||
Tabell 1: Oppskrifter på løsningene som brukes.
Discussion
Her presenterte vi en smFISH-protokoll for måling av mRNA-kinetikk i E. coli. I de tidligere publiserte smFISH-protokollene for bakterier23ble celler holdt i rørene helt til slutten av protokollen, det vil si til de er klare for bildebehandling. Selv om det har mange fordeler, for eksempel minimal uspesifikk binding av fluorescerende sonder på dekkglassoverflaten23,er det vanskelig å følge disse protokollene når det er mange prøver fra et tidsforløpets eksperiment. Først må et relativt stort volum av celler (> 1 ml) prøves og til og med høstes før fiksering. For det andre må celleprøvene sentrifugeres flere ganger for å utveksle løsninger og å vaske etter hybridiseringstrinnet. I vår protokoll blandes et lite volum (<1 ml) av kultur direkte med en festeløsning i et 1,5 ml rør, noe som bidrar til å raskt "fryse" celletilstanden i øyeblikket for prøvetaking. Cellene forblir også festet til overflaten gjennom hele prosedyren, og ulike løsninger kan byttes raskt ved å aspirere væsker med et vakuumfiltreringssystem og bruke løsningsdråper samtidig med en flerkanals pipette. Denne forskjellen gjør vår protokoll svært fordelaktig når et stort antall prøver må behandles samtidig. Ved hjelp av vår protokoll kan 12-48 prøver håndteres samtidig, og hele FISH-prosedyren kan fullføres innen ~ 8 timer, omtrent en lignende mengde tid som trengs for noen få prøver (figur 2). Selv om vi brukte uttrykket av lacZ i E. coli som et eksempel, er protokollen allment anvendelig for ulike gener og bakterielle arter med hensyn som diskuteres nedenfor.
For forskjellige gener er det første du må vurdere smFISH-sonder. Man kan designe oligonukleotid sonder som fliser mRNA av interesse (Figur 1A)13. I denne "flislegging" sonde tilnærming, hver sonde er ~ 20 base lang og merket med en fluorofor på 5 'eller 3' terminus. Denne strategien er praktisk som ingen genetisk manipulasjon er nødvendig. Alternativt kan en tandemg repeat av ~ 20 bp sekvens, fremmed for den genomiske sekvensen (f.eks. en rekke lacO-sekvens i Caulobacter crescentus14),settes inn i det uoversette området av et gen av interesse, og en enkelt sonde komplementær til gjentakelsesenheten brukes til å merke mRNA ("array" tilnærming; Figur 1B). I begge tilfeller dekorerer flere fluoroforer en mRNA, noe som gir forsterket fluorescenssignal som lett kan differensieres fra en enkelt sonde som ikke er spesifikt bundet inne i en celle.
Om du vil velge "flislegging" eller "array" tilnærminger avhenger av den negative kontrollen, et utvalg der uspesifikk binding av sonder er testet fordi den mangler målet mRNA. For flislegging sonder (Figur 1A), en mutant belastning uten genet av interesse eller en tilstand, der genet ikke er transkribert (f.eks undertrykkelse av lacZ) kan tjene som en negativ kontroll for testing av uspesifikk binding av sonder. For den matrisebaserte smFISH (figur 1B)kan en villtypebelastning som mangler matrisen, fungere som en negativ kontroll fordi den ikke inneholder bindingssteder for sondene.
Optimale hybridiseringsforhold kan avhenge av sondesekvensene og til og med valget av fluoroforfargestoffer. Vi optimaliserte hybridiseringstilstanden for lacZ-sondesett ved å holde hybridiseringstemperaturen ved 37 °C og teste ulike konsentrasjoner av sondesett og formamid i hybridiseringsløsningen. Høyere konsentrasjoner av formamid har en tendens til å redusere både uspesifikk og spesifikkbinding 26,,35. Vi anbefaler systematisk å endre hybridiseringen og vaskeforholdene samtidig som hybridiseringstid og temperatur er like. Etter hvert som tilstanden blir strengere, reduseres både uspesifikt og spesifikk binding (figur 6). Det er viktig å finne et punkt der den uspesifikke bindingen begynner å treffe under en akseptabel terskel uten ytterligere å gå på akkord med spesifikk binding. Vi brukte for eksempel signalnivået som ble oppnådd uten sonder ("ingen prober") som en terskel (figur 6).
Den tofargede smFISH-metoden som merker to separate regioner i en mRNA er begrenset til lange gener. For å måle frekvensen av transkripsjon forlengelse, vi tok nytte av det faktum at lacZ er lang (3075 bp) og uttrykket kan induseres av IPTG. Når et gen er kort, er det vanskelig å designe to fliser sonde sett (nær 5 'og 3 ' ender) og løse tidsforsinkelsen mellom opptredener av 5 'vs. 3' mRNA regioner. I dette tilfellet kan man telle gryende mRNAs på jevn tilstand ved smFISH og analysere fordelingen med en analytisk modell som har frekvensen av transkripsjon forlengelse som en passende parameter20. Også når et gen av interesse ikke er induserbart, kan man behandle celler med rifampicin på tid null og måle den timelige endringen i 5' og 3' mRNA-underregioner. Forsinkelsen fra reduksjonen av 5' mRNA-signal til 3' mRNA-signal kan deretter brukes til å beregne frekvensen av transkripsjonsutrevaluering som gjort tidligere31.
Til slutt er smFISH-protokollen allsidig og kan kombineres med andre merkingsordninger. Tidligere ble DNA-locus visualisert sammen med mRNAs ved å kombinere mRNA FISH med enten DNA FISH14 eller fluorescerende reporter-operatørsystem20. Proteinprodukter kan visualiseres ved å utføre immunofluorescence sammen med mRNA FISH14,36. Det kan også kombineres med tredimensjonal superoppløsning mikroskopi37 for å visualisere mRNAs i alle tre dimensjoner38,39.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne protokollen ble utviklet av S.K. under hennes postdoktorforskning i Dr. Christine Jacobs-Wagners laboratorium ved Howard Hughes Medical Institute og Microbial Sciences Institute ved Yale University. Vi takker Dr. Jacobs-Wagner og hennes laboratoriemedlemmer for ulike innspill under metodeutviklingen og Laura Troyer for kritisk lesing av manuskriptet. S.K. anerkjenner støtte fra Searle Scholars Program; K.V. anerkjenner støtte fra James Scholar Preble Research Award fra University of Illinois.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strain | |||
| Escherichia coli MG1655 | |||
| Chemicals, peptides, and others | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
| Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
| Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
| Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
| Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
| E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
| FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
| Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
| Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
| Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
| Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
| 2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
| Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
| Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
| Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
| Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
| Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
| TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
| Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
| Equipment | |||
| C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
| Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
| Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
| Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
| Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
| Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
| UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
| Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
| Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
| Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
| Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
| Tools | |||
| 1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
| 1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
| Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
| Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24x60 No1 |
| Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
| Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Gloves | Microflex | MK-296-M | |
| Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
| Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
| Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
| Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Software and algorithms | |||
| MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
| MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
| https://oufti.org/ | |||
| Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
| Microscope | |||
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
| Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
| Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
| Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
| Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
| Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
| Probe sequence | |||
| DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
| lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
| lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
| lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
| lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
| lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
| lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
| lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
| lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
| lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
| lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
| lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
| lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
| lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
| lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
| lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
| lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
| lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
| lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
| lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
| lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
| lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
| lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
| lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
| lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
| lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
| lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
| lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
| lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
| lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
| lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
| lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
| lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
| lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
| lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
| lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
| lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
| lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
| lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
| lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
| lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
| lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
| lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
| lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
| lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
| lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
| lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
| lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
| lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
| lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
| lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
| lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
| lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
| lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
| lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
| lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
| lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
| lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
| lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
| lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
| lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
| lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
| lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
| lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
| lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
| lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
| lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA | |
References
- Bervoets, I., Charlier, D. Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).
- Epshtein, V., Nudler, E. Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation. Science. 300 (5620), 801-805 (2003).
- Vogel, U., Jensen, K. F. The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate. Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).
- Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced. Nature Genetics. 9, 184 (1995).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16, 1128 (2009).
- Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation. Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).
- Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).
- Pérez-Ortín, J. E., Medina, D. A., Chávez, S., Moreno, J. What do you mean by transcription rate. BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Kuchina, A., et al. Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding. BioRxiv. , 869248 (2019).
- Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing. Nature Microbiology. , (2020).
- Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Montero Llopis, P., et al. Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria. Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).
- So, L. -h, et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression. Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).
- Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo. Nucleic Acids Research. 44 (18), 142 (2016).
- Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling. Cell. 179 (1), 106-119 (2019).
- Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality. Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).
- Joo, C., Ha, T. Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), Cold Spring Harbor. 1005-1008 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 4456 (2006).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Adesnik, M., Levinthal, C. The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).
- Campbell, E. A., et al. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell. 104 (6), 901-912 (2001).
- Raj, A., Tyagi, S. Methods in Enzymology. Walter, N. G. 472, Academic Press. 365-386 (2010).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. Methods in Enzymology. Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. 572, Academic Press. 1-49 (2016).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time. Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).
- Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli. Molecular Systems Biology. 11 (1), 781 (2015).
- Vogel, U., Sørensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation. Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).
- Yang, S., et al. Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli. Nature Communications. 10 (1), 5131 (2019).
- Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).
- Fontenete, S., Guimarães, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).
- Sepúlveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states. Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. eLife. 5, 13065 (2016).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
