Summary
本手稿描述了一个协议，用于在商业支架上使用实验室制造的介质对未成熟的猫卵母细胞进行最小体积玻璃化。它涵盖了从卵母细胞分离从外体内性腺到玻璃化和变暖的每一步。
Abstract
在野生动物保护计划中，游戏银行对于保护有价值的个体和稀有物种的遗传资源以及促进生物多样性保护至关重要。在幸福，大多数物种面临灭绝的威胁，国内品种被用作提高种质库协议效率的模型。在卵母细胞冷冻保存技术中，玻璃化在人类和兽医辅助生殖中越来越受欢迎。最初为人类卵母细胞和胚胎开发的冷冻体，已证明非常适合猫卵母细胞。该方法具有若干优点，如现场条件的可行性和工艺速度，当需要处理多个样品时，这都很有帮助。然而，效率在很大程度上取决于操作员的技能，需要实验室内和实验室间标准化以及人员培训。该协议描述了从卵母细胞收集到加热，商业支持上未成熟猫卵母细胞的最小体积玻璃化。按照协议，在变暖时保持卵母细胞的完整性和生存能力（高达90%）虽然气候变暖后成熟和胚胎发育结果仍有改进的余地，但可以预期。
Introduction
冷冻保存已成为辅助生殖技术（ART）的关键步骤。在人类中，它允许保留生育能力或因医疗或个人原因推迟为人父母。在动物中，有必要克服距离和时间在计划交配，特别是在农场动物和宠物，或保存遗传物质的宝贵主题在保护计划，特别是在野生濒危物种。游戏冷冻保存是最佳选择，当被培育的个体尚未被选中或为了避免与胚胎冷冻相关的伦理问题，特别是在人类医学1。Spermatozoa 相对容易保存，解冻后给出令人满意的结果，但由于卵母细胞的结构特征，其储存可能更为复杂。事实上，低表面/体积比，以及围绕乌普拉斯玛的佐纳佩普西达的存在，限制了低温保护物和水在细胞2的移动。此外，在家畜，包括幸福动物，他们的特点是脂质丰富的细胞质，这被认为是使他们更敏感的冷冻保存3。
大多数猫都受到威胁，由于常规的奥瓦里切除术提供性腺，家猫被用作开发种质保存协议的模型。在野生动物中，性腺可以在选择性手术后或（更频繁地）验尸后获得，并且可以检索到不成熟的（胚芽囊泡）游戏物。激素刺激旨在获得成熟（元相II）卵母细胞是不太常见的人类ART，因为伦理问题和物种和个人特异性反应治疗4。
因此，低温保存策略的发展侧重于不成熟的配子，这些配子通常可以在罕见个体意外或突然死亡后被检索。从生物学的角度来看，不成熟或成熟的配子的低温保存存在一些差异，每种游戏体都有其优点。首先，DNA在未成熟的卵母细胞中受到更多的保护，其胚芽囊囊含有被核膜包围的染色体，而元相II卵母细胞的卵母体主轴可能更容易受到低温损伤5。其次，冷诱发的细胞骨架损伤可能会影响主轴旋转、极体挤压、亲核迁移和细胞因子，根据卵母细胞发育阶段，它们可能产生不同的影响，影响美因病进展或受精后事件。最后，也许最重要的是，虽然成熟的卵母细胞已准备好受精，但不成熟的卵母细胞依靠周围积细胞的支持来度过核和细胞质成熟6，这就是为什么整个积细胞-卵母细胞复合物（COCs）是冷冻保存的原因。然而，累积细胞的丧失和/或游戏细胞与周围体细胞之间功能连接的丧失可能是未成熟COCs的低温保存的最有害影响。
在低温保存技术中，玻璃化是一种在野外条件下更容易应用的技术。与缓慢（或受控速率）冷冻相比，玻璃化速度更快，不需要特定的设备，如可编程冰柜。为了满足玻璃化的三个基本原则（即高粘度，与高低温保护浓度、体积小和超快速温度降低有关），在猫中特别开发和使用了几种介质和支架，用于成熟和成熟的卵母细胞。从简单的吸管7开始，设备被开发，以达到"最小体积"的目标。Cryoloop8，开拉吸管（OPS）9，塑料排水沟（改性吸管）10和冷冻管11已经使用，直到一个更高效的装置（即冷冻站）被采用11，改善生存和梅病恢复。Cryotop（ 补充图 1） 是一种市售支持， 已成为玻璃化的选修开放系统.它专为人类卵母细胞和胚胎的玻璃化而开发，由附着在硬塑料支架上的小型薄膜条组成，在储存12期间由塑料管盖保护。由于其可用性和极小的玻璃化体积（低至0.1μL），这也导致极快的冷却和变暖率，这种玻璃化支持已越来越多地应用于几个物种，包括家猫，其中它已被用于各种媒体13，14，15，16，17。13,14,15,16,17
本手稿的目的是描述一个收集-玻璃化-加热协议，与最初为人类卵母细胞开发的，使用实验室制造的介质和商业支持，以最小体积的玻璃化，可以很容易地应用于现场条件，为不成熟的猫科动物的低温保存。
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Protocol
特此描述的程序没有经过道德批准，因为猫卵巢是在兽医诊所收集的，作为从主人要求的常规卵巢切除术或卵巢切除术的副产品收集的。
1. 卵母细胞集合
- 在开始实验之前，为卵巢和卵母细胞的收集准备解决方案。用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 制备卵巢收集溶液，使用抗生素和抗霉药的混合物（100 IU/mL 青霉素 G 钠，0.1 mg/mL 硫酸链霉素，0.25 μg/mL 的氨基霉素 B）。使用 PBS 准备卵母细胞收集溶液（即 PBS/PVA），含 100 IU/mL 的青霉素 G 钠、0.1 mg/mL 的硫酸链霉素和 0.1% （w/v） 聚乙烯醇 （PVA）。
- 将卵巢和卵母细胞收集溶液储存在4°C，直到使用。
- 在皇后的温泉当天，在加工样品前几个小时，服用部分卵巢和卵母细胞收集溶液，让它们在室温下预热（RT;25 ~2 °C）。
- 当样品到达实验室时，将卵巢与周围的结缔组织和卵巢分离，并在培养皿中用新鲜的卵巢收集介质清洗。
- 为每位女王填充一个 35 mm 培养皿，并加注约 3 mL 的 RT PBS/PVA，以及一个多一个培养皿来收集卵母细胞。
- 将一对卵巢放在培养皿中，用手术手术刀切碎皮层。在立体显微镜的帮助下确保所有毛囊都破碎（放大8倍）。
- 使用移液器收集 COC，并在分配的培养皿中将它们在新鲜的 PBS/PVA 中移动。选择良好的品质COC，具有同质的，黑暗的细胞质，并包围着几个紧凑的层积团细胞（等级一18）。
2. 玻璃化
- 准备平衡和玻璃化介质。
- 在中 199 中用 7.5%（v/v） 乙二醇 （EG） 和 7.5% （v/v） 二甲基硫化物 （DMSO） 准备平衡溶液 （ES），用 20% 胎儿牛血清 （FBS）。
- 准备玻璃化溶液 （VS） 与 15% （v/v） EG， 15% （v/v） DMSO 和 0.5 M 蔗糖在中等 199， 与 20% FBS （修改 从 19）.
- 在使用之前，让 ES 和 Vs 在 RT 预热。
注：冷冻保护物（例如，EG、DMSO）已知为细胞毒性。对抗其毒性的策略是降低细胞暴露在20度的温度，而卵母细胞通常在RT时暴露在低温保护剂中。因此，在该协议中，从卵母细胞收集到玻璃化的整个过程在RT下执行，以避免温度波动。
- 准备玻璃化盘（即由六个锥形井组成的特殊菜盘，分为两排，称为"重现板"）。为每个玻璃化支持准备一行（三口井）。
- 在第一个井的底部加入20μL的ES。
- 在第二口（即1VS）和第三口（即2VS）井的底部添加300μL的VS。
- ES 中的均衡 COC。
- 使用小孔移液器（例如，在 Bunsen 嘴上拉下巴斯德移液器使其更薄 – 直径应至少为 200 μm），在第一个孔的底部传输一个（或更多）COC（s）。
注：根据卵母细胞周围的积液细胞层数选择移液器的大小，因此选择 COC 尺寸，旨在尽可能减少每一步中与 COC 一起传输的介质体积。根据本协议，经过培训的操作员可以成功进行每项玻璃化支持多达八个猫科动物的玻璃化。 - 在落点边界上缓慢添加 20 μL 的 ES。等待 3 分钟。
- 在落点边框上缓慢添加其他 20 μL 的 ES。等待 3 分钟。
- 在落点边界上缓慢添加 240 μL 的 ES。等待 9 分钟。
- 在等待时，准备一个带液氮（LN2）的盒子，用实验/猫识别码标记一个玻璃化支持，并留用它打开。将它们都放在立体显微镜附近，以便工作时可以方便地到达。
谨慎！处理 LN 2 时穿戴个人防护设备。 - 或者，如果必须对多个 COC 进行玻璃化，则开始另一组 COC 的第一个平衡步骤（参见步骤 2.3.1 - 2.3.2）（这些步骤将加载到新的玻璃化支持中）。
- 使用小孔移液器（例如，在 Bunsen 嘴上拉下巴斯德移液器使其更薄 – 直径应至少为 200 μm），在第一个孔的底部传输一个（或更多）COC（s）。
- 在 90 秒内将 VS 中的 COC 进行玻璃化。
- 使用相同的小孔移液器，用 1VS 填充它，从第一个井 （ES） 的底部拿 COC，然后将它们移动到第二个井 （1VS） 的表面。
- 用 1VS 清洗移液器。
- 将 COC 放在井的另一个区域（底部）移动;将周围的介质与移液器混合。
- 在井的另一个区域用 1VS 填充移液器，采取 COC，移动它们，将周围的介质与移液器混合。
- 重复步骤 2.4.4。
- 用 2VS 清洗移液器。
- 拿COC，并移动他们在第三井（2VS）的底部;将周围的介质与移液器混合。
- 在井的另一个区域中，用 2VS 填充移液器，采取 COC，移动它们，将周围的介质与移液器混合。
- 重复步骤 2.4.8。
- 在井的另一个区域中用 2VS 填充移液器，将 COC 装载到玻璃化支撑条上，尽可能靠近尖端。吸气过剩介质，尽可能减少 VS 的体积。
- 立即在LN 2中跳投玻璃化支撑，移动它。在一些夹子的帮助下关闭它，确保它总是浸入LN2。
注：由于低温保护细胞毒性，保持正确的时间至关重要。由于其在玻璃化介质中的高浓度，细胞暴露需要控制，也通过完美执行技术21。如果样品丰富，请考虑将其分割，以更快地处理它们，并最大限度地减少从卵母细胞收集到玻璃化的时间。
- 将加载的玻璃化支架存放在杯中，并将它们存放在存储 LN2 罐中 ，直到加热。
注：如果 LN 2 可用，协议的所有前面步骤也可以应用于字段 条件中。干托运人需要将样品安全运送到实验室，然后进行以下阶段。
3. 加热
- 准备加热介质。
- 在中 199 中用 1 M 蔗糖准备解冻溶液 （TS），用 20% FBS。
- 在中 199 中用 0.5 M 蔗糖准备稀释溶液 （DS），用 20% FBS。
- 使用 20% FBS 准备带中 199 的洗涤液 （WS）。
- 使用前，在RT将 TS 预热至 38 °C 和 DS 和 WS。
- 如有必要，为随后使用加热的COC（例如体外成熟，IVM）准备培养培养。
- 将加热台靠近立体显微镜并打开（38°C）。把培养皿的盖子放在一个加热中。
- 当一切准备就绪时，将必须从储罐加热的玻璃化支架转移到带LN2的盒子上，然后将盒子放在立体显微镜附近。
- 准备"重现板"。为必须加热的每个玻璃化支持准备一行。
- 在第一个井的底部加入300μL的DS。
- 在第二口（即1WS）和第三口（即2WS）井的底部添加300μL的WS。
- 在培养皿的盖子上滴一滴 TS （100 μL）。
- 使用夹子，在 LN 2 中打开一个玻璃化支撑。
- 将 TS 滴放在立体显微镜下，通过一个快速移动，从 LN 2 中获得玻璃化支撑， 将其带子浸入跌落中，将其移动至所有 COC 分离。一旦跌落为空，立即从跌落中删除支撑，但将 COC 留在 TS 中总共 1 分钟（从浸入式到下一步）。
- 拿一个类似于玻璃化的移液器，用 DS 填充。从跌落 （TS） 中拿出 COC，然后将它们移动到第一个井 （DS） 的底部。等待 3 分钟。
- 用 1WS 清洗移液器。拿 COC，在第二个井（1WS）的底部移动它们。等待 5 分钟。
- 用 2WS 清洗移液器。拿 COC，在第三井（2WS）的表面移动它们。等他们摸井底。
- 使用井的另一个区域重复步骤 3.11。
- 用培养介质清洗移液器，将卵母细胞移动到培养盘中，用于以下用途（例如，IVM）。
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Representative Results
根据目前的协议（图1和补充图1），猫卵母细胞玻璃化和变暖后，绝大多数的卵母体存活下来。玻璃化后，除其他技术外，在光学显微镜上可以评估其形态完整性22或使用重要污渍。后者之一是荧光素二甲酸酯/碘化钠（FDA/PI），它允许识别可行的（明亮的绿色荧光）和死细胞（红荧光）。图 2显示了在加热后被染有 FDA/PI 的玻璃化加热猫 COC 的代表性图片。从实验数据显示玻璃化后生存百分比报告在表1，其中描述了用于体外成熟17或体外胚胎生产16的卵母细胞的后暖化数据。总的来说，在两个实验中，435,个卵母细胞中，有16、17、395个存活下来，在变暖后总体获得90.8%的生存能力。
然而，一些形态变化可以注意到变暖后（图3）。在按照此协议进行葡萄球化加热的亚泰两类中，最常见的形态异常是表粒形状和造粒的变化、积糖细胞的部分（或很少是总）损失和（很少）左骨裂变。另一方面，正如我们之前在相同支持下进行最小体积玻璃化的作品中所报道的，这些玻璃化COCs可以成熟17个，并在体外发育成胚胎16，即使其速率低于新鲜COCs。此外，他们通常不出现佐纳佩鲁西达硬化（这是另一个众所周知的低温保存的结果），因为体外受精（IVF）是成功的16。
图1：卵母细胞玻璃化加热协议的示意图描述。
有关完整指示，请参阅手稿文本。COCs= 积卵细胞复合物;ES=平衡解决方案;VS+玻璃化解决方案;TS=解冻解决方案;DS=稀释溶液;WS=洗涤溶液;LN2=液氮。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：气候变暖后，有活力的猫卵母细胞的生存能力。
沾染荧光素二甲酸酯/碘化钠（FDA/PI）的玻璃化积质-卵母细胞复合物在可行时（A）或死亡时出现红色或微弱荧光（B）。激励/发射波长：495 nm/517 nm，用于FDA;538 nm/617 nm 用于 PI。比例线： 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：新鲜和玻璃化猫卵母细胞的光显微图。
（A） 新鲜积卵-卵母细胞复合物收集后，在玻璃化之前。（B） 热化后脱硝积细胞复合物复合物，显示一些玻璃化诱发的伤害（形状变化和积细胞损失，黑色箭头）。比例线： 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
| 实验 | 组 | 加热卵母细胞 （n） | 可行的卵母细胞（n） | 可行性（%） | 可行性（平均百分比 = SD） |
| 1† | 1 | 13 | 12 | 92.31 | 91.54 × 3.66 |
| 2 | 47 | 44 | 93.62 | ||
| 3 | 52 | 45 | 86.54 | ||
| 4 | 26 | 24 | 92.31 | ||
| 5 | 41 | 40 | 97.56 | ||
| 6 | 21 | 19 | 90.48 | ||
| 7 | 50 | 44 | 88.00 | ||
| 2‡ | 1 | 17 | 17 | 100.00 | 91.51 × 9.16 |
| 2 | 17 | 17 | 100.00 | ||
| 3 | 9 | 8 | 88.89 | ||
| 4 | 21 | 21 | 100.00 | ||
| 5 | 30 | 23 | 76.67 | ||
| 6 | 26 | 23 | 88.46 | ||
| 7 | 17 | 13 | 76.47 | ||
| 8 | 10 | 10 | 100.00 | ||
| 9 | 15 | 14 | 93.33 | ||
| 10 | 23 | 21 | 91.30 |
表1：猫体化加热卵母细胞的代表性生存能力结果。 数据来自 [科伦坡等人 201916 和 ] 科伦坡等人 202017.
补充图1：用于卵母细胞玻璃化的支架的代表性图片。 商业支持措施13厘米，易于处理和存储。卵母细胞必须加载到设备顶部的薄塑料条上，尽可能靠近尖端附近的黑色标记。版权所有：北泽公司。 请点击这里下载此图。
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Discussion
卵母细胞冷冻保存是一种关键的种质保护技术，特别是在许多物种濒临灭绝的分类中，如费利达家族。在这份手稿中，提出了一个简单和现场友好的协议，用于对未成熟的猫卵母细胞进行玻璃化。实验室制造的介质、最小体积的玻璃化支持和训练有素的人员是此方法成功的关键因素，它允许持续和反复地获得可行的卵母细胞，特此报告的代表性结果所示。
从媒体准备开始，应准确遵循协议以确保获得最佳结果，但操作员的技能是主要问题。介质应在玻璃化程序的同一天准备好，或者，如果不可能，应提前一天准备并储存在 4 °C。在任何情况下，在样品处理之前，应留出足够的时间让解决方案预热至RT.Oocyte收集和COC选择是快速和简单的程序，由每个ARTs实验室定期执行。然而，冷冻保存是最微妙的程序。虽然加热过程并不太重要，但如果遵循协议和时间安排，玻璃化可能更为复杂。在平衡之后，在尊重时机时必须小心，最具挑战性的阶段可能是玻璃化步骤（见本议定书的2.4.事实上，卵母细胞转移和移液器清洗需要及时进行，并且一起，在90秒内完成。对于初学者，建议在训练时使用秒表对程序进行时间处理，而对于训练有素的个人，在 60 秒后发出计时器蜂鸣声可能很有用，因为时间已过。此外，这将允许更高的标准化，因为当警报响起时，6-8 COC的操作员对质化组应接近卵母细胞从重现板的第二井转移到第三井（见本协议的第2.4.7步）。希望通过本文，个人之间和实验室之间能够实现更高的标准化。
该协议的主要局限性仍然是低温保存程序本身的内在特征。如前所述，玻璃化使卵母细胞暴露在非生理和潜在的破坏性条件下，即使它执行完美无瑕。与低温保护剂的孵育和温度的下降是最关键的事件20，它们需要严格控制。在最常见的低温损伤中，有些很容易在光学显微镜上观察到（例如，积团细胞损失，细胞形状和大小的改变），而另一些则不可见，并经常影响亚细胞结构（如佐纳佩图西达硬化，氧化应激，细胞骨架损伤，美感主轴和DNA改变）23，,24。虽然大多数是可行的，COCs在该协议后进行玻璃化，在变暖后通常呈现一些明显的形态异常。然而，形态学和生存能力之间没有相关性，这也可能因为亚细胞损伤3，25,25而受阻，但形态变化可能是低温损伤的结果，部分是由于体外发育的结果，体化卵母细胞，这是相当差，如果与新鲜的卵母细胞相比。精心制备玻璃化介质和精确观察协议时间有助于获得良好的后暖生存能力和形态完整性，但仍需要改进卵母细胞的体外成熟和胚胎发育，因为生存能力在以下培养过程中经常降低。
冷诱发的伤害不幸发生与每一个冷冻保存方法24。本协议中使用的最小体积玻璃化支持已开发，以尽可能减少玻璃化体积，与其他低温保存装置（-23，000 °C/分钟和42，000 °C/分钟，根据制造商规格）相比，冷却和加热率更好。因此，在人类医学中，在评估体外（即受精和胚胎发育）和体内参数（即怀孕率和活产）的临床研究可用时，由于卵母细胞冷冻保存在回暖后生存方面无可比拟的结果，以及最后，活产12 来自活体成熟人类卵母细胞，因此，最小体积的玻璃化是最常见的选择。此外，与其他玻璃化设备相比，该协议中使用的设备更易于使用，存储12更安全，因为它处理起来非常舒适，在存储过程中受盖保护。例如，Cryoloop 也是一个有效的支持，以达到最小体积目标，但其结构（一个循环支持一个循环，支持一个卷溶液，其中卵母细胞加载） 是脆弱的，并容易意外变暖12。稻草（0.25 mL体积）或开拉吸管（OPS）也可以使用，但他们不允许显著减少玻璃化体积，也具有挑战性填充和清空，因为一些卵母细胞可能会丢失26。许多其他支持已经开发2，但每个都有其缺点。相反，与以前使用最多的低温保存技术相比，慢速冷冻在商业支持上的主要优点是它的可行性和速度。如前所述，玻璃化不需要执行可编程冷冻机，而卵母细胞的缓慢冷冻需要大约一个半小时才能完成25日，玻璃化可以在本协议实施后约17分钟内完成。
总之，在启动玻璃化卵母细胞库时，员工技能和操作员间标准化可能是最具挑战性的要求，但通过人员培训将实现这些要求。这种最小体积玻璃化协议为猫不成熟的卵母细胞提供一致和可重复的结果，当由经验丰富的操作者执行。然而，即使后暖的生存能力和完整性令人满意，卵母细胞发育率仍有改善的机会。随着进一步优化，本协议也可以应用于野生卵母细胞的野外条件下，而有关卵母细胞冷冻保存的已发布数据仍然稀缺。扩大这种方法的应用不仅将增加改进低温保存协议的可能性，而且将允许建立玻璃化卵母细胞生物库，用于肥力和生物多样性保护。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了EVSSAR（欧洲小动物繁殖兽医学会）2016年赠款和米兰大学，钢琴迪索斯特格诺 alla Ricerca 2019（Linea 2 Azione A）的部分支持。我们还要感谢MariaGiorgiaMorselli博士对特此描述的实验和图像采集的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
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