Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Minimum volumen vitrifikation af umodne Feline Oocytter

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61523
Automatic Translation
1, 1
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

Summary

Dette manuskript beskriver en protokol for den mindste volumen vitrifikation af umodne kat oocytter med laboratorie-made medier på kommercielle støtter. Det dækker hvert skridt fra oocyt isolation fra ex vivo gonader til vitrifikation og opvarmning.

Abstract

I vilde dyr 'bevarelse programmer, er gamet bankvirksomhed afgørende for at beskytte genetiske ressourcer af værdifulde individer og sjældne arter og for at fremme bevarelse af biodiversiteten. I felids, er de fleste arter truet af udryddelse, og indenlandske racer bruges som en model for at øge effektiviteten af protokoller for kimplasma bank. Blandt oocyt kryopræservering teknikker, vitrification er mere og mere populær i menneskers og veterinære assisteret reproduktion. Cryotop vitrifikation, som i første omgang blev udviklet til menneskelige oocytter og embryoner, har vist sig at være velegnet til kat oocytter. Denne metode giver flere fordele, såsom gennemførligheden i marken betingelser og hastigheden af proceduren, som kan være nyttige, når flere prøver skal behandles. Effektiviteten afhænger imidlertid i høj grad af operatørens færdigheder, og der er behov for standardisering inden for og på laboratoriet samt personaleuddannelse. Denne protokol beskriver minimum volumen vitrifikation af umodne katteoocytter på en kommerciel støtte i en trin for trin felt-venlige protokol, fra oocyt indsamling til opvarmning. Efter protokollen, bevarelse af oocyt integritet og levedygtighed ved opvarmning (så højt som 90%) kan forventes, selv om der stadig er plads til forbedringer i efteropvarmning modning og embryonale udvikling resultater.

Introduction

Kryopræservering er blevet et vigtigt trin i assisteret reproduktion teknikker (ARTs). Hos mennesker, det giver mulighed for bevarelse af frugtbarhed eller udsættelse af forældreskab af medicinske eller personlige årsager. Hos dyr er det nødvendigt at overvinde afstand og tid i planlagte parringer, især i husdyr og kæledyr, eller at bevare genetisk materiale af værdifulde emner i bevaringsprogrammer, især i vilde truede arter. Gamete kryopræservering er det bedste valg, når de personer, der skal opdrættes ikke er blevet valgt endnu, eller for at undgå etiske spørgsmål i forbindelse med embryo frysning, især i humanmedicin1. Spermatozoer er relativt nemme at bevare og give tilfredsstillende resultater efter optøning, men oocytter, på grund af deres strukturelle funktioner, kan være mere komplekse at opbevare. Faktisk, den lave overflade / volumen forholdet, samt tilstedeværelsen af zona pellucida omkring ooplasma, begrænser flytning af kryoprotektanter og vand på tværs afcellen 2. Desuden, i husdyr, herunder felids, de er kendetegnet ved en lipid-rige cytoplasma, som menes at gøre dem mere følsomme over for kryopræservering3.

De fleste felids er truet, og den indenlandske kat bruges som en model til at udvikle protokoller for germplasm bevarelse takket være tilgængeligheden af gonader fra rutinemæssig ovariektomi. Hos vilde dyr kan gonader fås efter elektive operationer eller (hyppigere) post mortem, og umodne (germinale vesikel) gameter kan hentes. Hormonel stimulation har til formål at opnå modne (metafase II) oocytter er ikke så almindeligt som i menneskelige ARTs på grund af de etiske spørgsmål og art- og individuel-specifikke svar på behandlinger4.

Derfor har udviklingen af kryopræserveringsstrategier fokuseret på umodne gametter, som normalt kan hentes efter sjældne individers uventede eller pludselige død. Fra et biologisk synspunkt, er der nogle forskelle i kryopræservering af umodne eller modne gameter, hver har sine fordele. For det første er DNA mere beskyttet i umodne oocytter, hvis germinale vesikel indeholder kromosomer omgivet af en nuklear membran, mens den meiotiske spindel af metafase II oocytter kunne være mere sårbar over for kryoinjuries5. For det andet, kold-induceret cytoskeleton skader kan påvirke spindel rotation, polære krop ekstrudering, pronuclear migration og cytokinese, som kan have forskellige virkninger i henhold til oocyt udviklingsmæssige fase, påvirker meiose progression eller post-befrugtning begivenheder. Endelig, og måske vigtigst af alt, mens modne oocytter er klar til at blive befrugtet, er umodne gameter afhængige af støtte fra de omkringliggende cumulus celler til at gå gennem nukleare og cytoplasmatisk modning6, og det er grunden til, at hele cumulus-oocyte komplekser (COCs) er cryopreserved. Men tabet af cumulus celler og / eller tab af funktionelle forbindelse mellem gamet og de omkringliggende somatiske celler er sandsynligvis den mest skadelige virkning af kryopræservering af umodne cocs.

Blandt kryopræservering teknikker, vitrification er en, der kan anvendes lettere i marken betingelser. Sammenlignet med langsom (eller kontrolleret hastighed) frysning, vitrification er hurtigere og kræver ikke specifikt udstyr, såsom en programmerbar fryser. For at opfylde de tre grundlæggende principper for vitrifikation (dvs. høj viskositet, forbundet med høj kryobeskyttende koncentration, små mængder og ultra-hurtig temperatur fald), flere medier og støtter især er blevet udviklet og anvendes i katte til både umodne og modne oocytter. Begyndende med simple sugerør7, enheder blev derefter udviklet til at nå "Minimum volumen" mål. Cryoloop8, åbne trukket sugerør (OPS)9, plast tagrender (modificeret halm)10 og cryotubes11 er blevet brugt, indtil en mere effektiv enhed (dvs. Cryotop) blevansat 11, forbedre overlevelse og meiose genoptagelse. Cryotop (Supplerende figur 1) er en kommercielt tilgængelig støtte, som er blevet det valgfrie åbne system til vitrifikation. Udviklet til vitrifikation af menneskelige oocytter og embryoner, den består af en lille filmstrimmel fastgjort til en hård plast holder, beskyttet af en plastrør hætte under opbevaring12. Takket være dens anvendelighed og den ekstreme reduktion i vitrifikation volumen (så lidt som 0,1 μL), hvilket også fører til ekstremt hurtig køling og opvarmning satser, denne vitrification støtte er i stigende grad blevet anvendt i flere arter, herunder den indenlandske kat, hvor det har været anvendt med en række medier13,14,15,16,17.

Formålet med dette manuskript er at beskrive en samling-vitrification-warming protokol, med mindre ændringer fra den oprindeligt udviklet til menneskelige oocytter, som beskæftiger laboratorie-made medier og kommercielle støtter for minimum volumen vitrification og kan let anvendes i marken betingelser for kryopræservering af umodne feline COCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De procedurer, der herved er afbildet, blev ikke godkendt af etisk materiale, da katteovgestokkene blev indsamlet på dyrlægeklinikker som biprodukter fra ejerbesøgte rutinemæssige ovariektomomi eller ovariohysterektomi.

1. Oocyte samling

  1. Før du starter forsøgene, skal du forberede løsninger til æggestok- og oocytkollektion. Ovgesegenopsamlingsopløsningen til klargør med fosfatbufferet saltvand (PBS) med en blanding af antibiotika og antimykotika (100 IE/ml penicillin G natrium, 0,1 mg/ml streptomycinsulfat, 0,25 μg/ml amphotericin B). Oocytopsamlingsopløsning (dvs. PBS/PVA) klargøres med PBS med 100 IE/ml penicillin G natrium, 0,1 mg/ml streptomycinsulfat og 0,1 % (w/v) polyvinylalkohol (PVA).
  2. Opbevar opløsninger til æggestok- og oocytopsamling ved 4 °C indtil brug.
  3. På dagen for dronningers spaying, et par timer før behandlingen af prøverne, tage en del af æggestok og oocyt indsamling løsninger og lad dem varme op ved stuetemperatur (RT; 25 ± 2 °C).
  4. Når prøverne ankommer til laboratoriet, isoleres æggestokkene fra det omgivende bindevæv og fra fårkanalen og vaskes i frisk æggestokindsamlingsmediet i en petriskål.
  5. Fyld en 35 mm petriskål til hver dronning med ca. 3 ml RT PBS/PVA, og endnu en skål til opsamling af oocytter.
  6. Placer et par æggestokke i en petriskål og hakker cortex med en kirurgisk skalpel. Sørg for, at alle follikler er blevet brudt ved hjælp af et stereomikroskop (forstørrelse 8x).
  7. Der opsames cocs med en pipette, og flyt dem i frisk PBS/PVA i den tildelte petriskål. Vælg gode kvaliteter COCs, med en homogen, mørk cytoplasma og omgivet af flere kompakte lag af cumulus celler (klasse I18).

2. Vitrifikation

  1. Forbered ækvilibrerings- og vitrifikationsmedier.
    1. Der klargøres en equilibrationsopløsning (ES) med 7,5 % (v/v) ethylelylycol (EG) og 7,5 % (v/v) dimethylsulfphoxid (DMSO) i Medium 199 med 20 % føtalt kvægserum (FBS).
    2. Klargør vitrifikationsopløsning (VS) med 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO og 0,5 M saccharose i Medium 199, med 20% FBS (ændret fra 19).
    3. Lad ES og VS varme op på RT før brug.
      BEMÆRK: Kryobeskyttende midler (f.eks. EG, DMSO) er kendt for at være cytotoksiske. En strategi for at imødegå deres toksicitet er at reducere den temperatur, hvor cellerne udsættes for dem20,og oocytter er normalt udsat for kryobeskyttende på RT. Således er hele proceduren, fra oocyt indsamling til vitrifikation, udføres på RT i denne protokol for at undgå temperaturudsving.
  2. Forbered vitrifikation skålen (dvs. en særlig skål bestående af seks koniske brønde opdelt i to rækker, kendt som "Repro plade"). Forbered en række (tre brønde) for hver vitrification støtte.
    1. Der tilsættes 20 μL ES i bunden af den første brønd.
    2. Der tilsættes 300 μL VS i bunden af den anden (dvs. 1VS) og tredje (dvs. 2VS) brønde.
  3. Ligevægts-COC'er i ES.
    1. Med en lille boring pipette (f.eks en Pasteur pipette trukket på en Bunsen næb for at gøre det tyndere - diameter skal være mindst 200 μm), overføre en (eller flere) COC (r) på bunden af den første brønd.
      BEMÆRK: Vælg størrelsen af pipetten i henhold til antallet af lag af cumulus celler omkring oocytter, så til cocs dimensioner, der sigter mod at reducere så meget som muligt mængden af medier, der overføres med cocs i hvert trin. Med denne protokol, uddannede operatører kan vitrify held op til otte feline COCs pr hver vitrification støtte.
    2. Der tilsættes langsomt 20 μL ES på grænsen til dråben. Vent i 3 minutter.
    3. Tilsæt langsomt andre 20 μL ES på grænsen til dråben. Vent i 3 minutter.
    4. Tilsæt langsomt 240 μL ES på grænsen til dråben. Vent i 9 minutter.
    5. Mens du venter, forberede en kasse med flydende kvælstof (LN2), mærke en vitrification støtte med eksperimentet / kat identifikationskode og lad den stå åben. Sæt dem begge i nærheden af stereomikroskopet, så de nemt kan nås, mens de arbejder.
      Forsigtighed! Bær personlige værnemidler ved håndtering af LN2.
    6. Hvis flere cocs skal forglasses, skal det første ækvilibreringstrin begynde (se trin 2.3.1 - 2.3.2) for en anden gruppe af coc'er (som vil blive lagt på en ny vitrifikationsstøtte).
  4. Vitrify COCs i VS på mindre end 90 sekunder.
    1. Brug den samme lille boring pipette, fylde den med 1VS, tage cocs fra bunden af den første brønd (ES) og flytte dem til overfladen af den anden brønd (1VS).
    2. Vask pipetten med 1VS.
    3. Tag de cocs og flytte dem i et andet område (nederst) af brønden; blande mediet omkring dem med pipetten.
    4. Fyld pipetten med 1VS i et andet område af brønden, tag cocs, flytte dem og bland mediet omkring dem med pipetten.
    5. Gentag trin 2.4.4.
    6. Vask pipetten med 2VS.
    7. Tag de cocs og flytte dem på bunden af den tredje brønd (2VS); blande mediet omkring dem med pipetten.
    8. Fyld pipetten med 2VS i et andet område af brønden, tag cocs, flytte dem og bland mediet omkring dem med pipetten.
    9. Gentag trin 2.4.8.
    10. Fyld pipetten med 2VS i et andet område af brønden, tag cocs og læg dem på strimlen af vitrifikationsstøtten så tæt som muligt på spidsen. Indsug overskydende medium for at reducere mængden af VS så meget som muligt.
    11. Straks springe vitrification støtte i LN2, flytte den. Luk den ved hjælp af nogle klemmer, og sørg for, at det altid forbliver nedsænket i LN2.
      BEMÆRK: Det er afgørende at holde den rette timing på grund af kryobeskyttende celletoksicitet. På grund af deres høje koncentration i vitrifikation medier, celle eksponering skal kontrolleres, også ved fejlfri udførelse af teknikken21. Hvis prøverne er rigelige, overveje at opdele dem til at behandle dem hurtigere og minimere mængden af tid fra oocyt indsamling til vitrifikation.
  5. Opbevar de lastede vitrifikationsstøtter i et bæger og opbevar dem i en LN2-tank til opvarmning.
    BEMÆRK: Alle de foregående trin i protokollen kan også anvendes i feltbetingelser, hvis LN2 er tilgængelig. En tør afsender vil være nødvendigt at transportere prøverne til laboratoriet sikkert og derefter fortsætte der med følgende faser.

3. Opvarmning

  1. Forbered opvarmning medier.
    1. Klargør optøningsopløsning (TS) med 1 M saccharose i Medium 199 med 20% FBS.
    2. Fortyndingsopløsning (DS) klargøres med 0,5 M saccharose i Medium 199 med 20 % FBS.
    3. Forbered vaskeopløsning (WS) med Medium 199 med 20% FBS.
    4. Før brug opvarmes TS til 38 °C og DS og WS ved RT.
  2. Der forberedes om nødvendigt kulturmediet til efterfølgende brug af opvarmede cocs (f.eks. in vitro-modning, IVM).
  3. Placer varmestadiet tæt på stereomikroskopet, og tænd det (38 °C). Sæt låget af en petriskål til at varme op.
  4. Når alt er klar, overføre vitrifikation støtter, som skal opvarmes fra lagertanken til en kasse med LN2, og sætte boksen i nærheden af stereomikroskop.
  5. Klargør "Repro plade". Forbered en række for hver vitrification støtte, der skal opvarmes.
    1. Der tilsættes 300 μL DS i bunden af den første brønd.
    2. Der tilsættes 300 μL WS i bunden af den anden (dvs. 1WS) og tredje (dvs. 2WS) brønde.
  6. Der kommer en dråbe TS (100 μL) på låget af petriskålen.
  7. Med klemmer åbnes en vitrifikationsstøtte i LN2.
  8. Sæt TS drop under stereomikroskopet og med en hurtig bevægelse tage vitrification støtte fra LN 2 og fordybe sinstrimmel i dråben, flytte den, indtil alle coCs løsrive. Fjern støtten fra faldet, så snart den er tom, men lad cocs i TS i 1 minut i alt (fra nedsænkning indtil det følgende trin).
  9. Tag en pipette svarende til den, der anvendes til vitrifikation og fylde den med DS. Tag cocs fra drop (TS) og flytte dem til bunden af den første brønd (DS). Vent i 3 minutter.
  10. Pipetten vaskes med 1WS. Tag de cocs og flytte dem på bunden af den anden brønd (1WS). Vent i 5 minutter.
  11. Pipetten vaskes med 2WS. Tag cocs og flytte dem på overfladen af den tredje brønd (2WS). Vent på, at de rører bunden af brønden.
  12. Gentag trin 3.11 med et andet område af brønden.
  13. Pipetten vaskes med kulturmedium, og oocytterne flyttes til kulturskålen til følgende brug (f.eks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter kat oocyt vitrifikation og opvarmning i henhold til denne protokol (Figur 1 og Supplerende Figur 1), langt de fleste gameter overleve. Efter vitrifikation kan rentabiliteten blandt andre teknikker vurderes ved det optiske mikroskop som morfologiskintegritet 22 eller ved hjælp af vitale pletter. En af sidstnævnte er fluoresceindiacetat /propidium iodid (FDA/PI), som gør det muligt at identificere levedygtige (lysegrøn fluorescens) og døde celler (rød fluorescens). Figur 2 viser et repræsentativt billede af forglasset-varmet kat PIC'er farves med FDA / PI lige efter opvarmning. Data fra forsøg , der viser overlevelsesprocenten efter vitrifikation , er angivet i tabel 1, som viser data efter opvarmningen af oocytter beregnet til in vitro modning17 eller in vitro embryoproduktion16. I det hele taget, i de to eksperimenter, der anvendes som eksemplerher 16,17, 395 ud af 435 oocytter overlevede, scorede en samlet 90,8% post-opvarmning levedygtighed.

Nogle morfologiske ændringer kan dog mærkes efter opvarmning (Figur 3). I gametter forglasset-varmet efter denne protokol, de hyppigste morfologiske abnormiteter er ændringer i ooplasm form og granulering, delvis (eller, sjældent, samlede) tab af cumulus celler og (sjældent) zona pellucida frakturer. På den anden side, som rapporteret i vores tidligere værker om minimum volumen vitrifikation med samme støtte, disse vitrified cocs kanmodnes 17 og udvikle sig til embryoner in vitro16, selv om det ved lavere satser end friske cocs. Desuden, de normalt ikke til stede zona pellucida hærdning (som er en anden velkendt konsekvens af kryopræservering), da in vitro befrugtning (IVF) er en succes16.

Figure 1
Figur 1: Skematisk skildring af oocyt vitrifikation-opvarmning protokol.
Der henvises til manuskriptet for fuldstændige indikationer. COC= cumulus-oocyt komplekser; ES=ækvilibreringsopløsning VS=vitrification opløsning; TS=optøningsopløsning; DS=fortyndingsopløsning; WS=vaskeopløsning; LN2=flydende nitrogen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Levedygtigheden af levedygtige katteoocytter efter opvarmning.
Forglasset cumulus-oocyt komplekser farves med fluorescein diacetate / propidium iodid (FDA / PI) viser grøn fluorescens, når levedygtig (A) eller rød eller svag fluorescens, når død (B). Excitation/emission bølgelængder: 495 nm/517 nm for FDA; 538 nm/617 nm for PI. Skala bar: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Lette mikrografer af friske og forglassede katteoocytter.
(A) Friske cumulus-oocyt komplekser efter indsamling, før vitrifikation. (B) Vitrified cumulus-oocyt komplekser efter opvarmning, viser nogle fortrifikation-induceret skader (ændringer i form og tab af cumulus celler, sort pil). Skala bar: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Eksperiment Gruppe Opvarmede oocytter (n) Levedygtige oocytter (n) Levedygtighed (%) Levedygtighed (gennemsnit % ± SD)
1† 1 13 12 92.31 91,54 ± 3,66
2 47 44 93.62
3 52 45 86.54
4 26 24 92.31
5 41 40 97.56
6 21 19 90.48
7 50 44 88.00
2‡ 1 17 17 100.00 91,51 ± 9,16
2 17 17 100.00
3 9 8 88.89
4 21 21 100.00
5 30 23 76.67
6 26 23 88.46
7 17 13 76.47
8 10 10 100.00
9 15 14 93.33
10 23 21 91.30

Tabel 1: Repræsentative resultater af levedygtigheden i katteglasset-varmede oocytter. Data fra †Colombo et al. 201916 og ‡ Colombo et al. 202017.

Supplerende figur 1: Repræsentativt billede af de understøtninger, der anvendes til oocyt vitrifikation. Den kommercielle støtte måler 13 cm og er nem at håndtere og opbevare. Oocytter skal lægges på den tynde plaststrimmel øverst på enheden, så tæt som muligt på det sorte mærke nær spidsen. Ophavsret: Kitazato Corporation. Klik her for at downloade dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oocyt kryopræservering er en afgørende germplasme bevarelse teknik, især i taxa, hvor mange arter er truede, såsom Felidae familie. I dette manuskript blev der fremlagt en enkel og feltvenlig protokol for vitrificering af umodne katteoocytter. Laboratoriemedier, understrætning af mindstevolumen og uddannet personale er nøglefaktorerne for denne metodes succes, som gør det muligt at opnå levedygtige oocytter konsekvent og gentagne gange, som det fremgår af de repræsentative resultater, der hermed rapporteres.

Begyndende med medierne forberedelse, bør protokollen følges nøjagtigt for at sikre de bedste resultater, men operatørens færdigheder er det største problem. Medier skal fremstilles samme dag som vitrifikationsproceduren, eller hvis dette ikke er muligt, skal de fremstilles dagen før og opbevares ved 4 °C. Under alle omstændigheder bør der, før prøvebehandling, være tilstrækkelig tid til, at løsningerne kan varme op til RT. Oocyt-indsamling og sprostsamling er hurtige og enkle procedurer, der rutinemæssigt udføres af alle ARTs-laboratorier. Kryopræservering er imidlertid den mest delikate procedure. Mens opvarmning procedure ikke er så kritisk, hvis protokollen og timingen følges, kan vitrifikation være mere kompleks. Efter ækvilibrering, hvor der kun skal tages hensyn til timingen, vil den mest udfordrende fase sandsynligvis være vitrifikationstrinnet (se 2.4. i denne protokol). Faktisk skal oocytoverførsler og pipettevask være vel timet og alle sammen udføres på mindre end 90 sekunder. For begyndere, er det tilrådeligt at tid proceduren med et stopur, mens uddannelse, mens også for uddannede personer kan det være nyttigt at have en timer bipper efter 60 sekunder som en advarsel om, at tiden løber op. Desuden vil dette give mulighed for en højere standardisering, da operatørerne, der vitrificerer grupper på 6-8 cocs, bør være tæt på overførslen af oocytterne fra den anden til den tredje brønd af repropladen (se trin 2.4.7 i denne protokol), når alarmen går i gang. Forhåbentlig, ved hjælp af denne artikel, en højere standardisering mellem enkeltpersoner og mellem laboratorier kunne opnås.

De største begrænsninger i protokollen er fortsat de iboende træk ved kryopræservering procedurer selv. Som tidligere nævnt, vitrification udsætter oocytter til ikke-fysiologiske og potentielt skadelige forhold, selv om det udføres fejlfrit. Inkubationen med kryoprotemidler og temperaturfald er de mest kritiskebegivenheder 20, og de skal holdes under streng kontrol. Blandt de mest almindelige kryoskader, nogle er let observeres på det optiske mikroskop (f.eks cumulus celletab, ændring af cellulære form og størrelse), mens andre ikke er synlige og ofte påvirker subcellulære strukturer (f.eks zona pellucida hærdning, oxidativstress, cytoskeleton skader, meiotiske spindel og DNA ændringer)23,24. Selv om det meste levedygtige, COCs forglasset efter denne protokol ofte præsentere nogle indlysende morfologiske anomalier efter opvarmning. Men der er ingen sammenhæng mellem morfologi og levedygtighed, som også kan være hæmmet på grund af subcellulæreskader 3,25, men morfologiske ændringer er sandsynligvis en konsekvens af kryoskader og delvis en grund til in vitro udviklingsmæssige resultater af vitrificerede oocytter, som er ganske dårlig, hvis sammenlignet med friske oocytter. Omhyggelig forberedelse af vitrifikationsmedier og præcis observation af protokoltiming bidrager til at opnå god levedygtighed efter opvarmning og morfologisk integritet, men der er stadig behov for forbedringer i yderligere in vitro-modning af oocytter og embryoudvikling, da levedygtigheden ofte falder i den følgende kultur16.

Koldinducerede skader opstår desværre ved hver kryopræserveringsmetode24. Den mindste mængdevisrifikationsstøtte, der anvendes i denne protokol, er udviklet for at reducere vitrifikationsvolumenet så meget som muligt, hvilket resulterer i bedre køle- og opvarmningshastigheder sammenlignet med andre kryopræserveringsanordninger (-23.000 °C/minut og 42.000 °C/minut i henhold til fabrikantens specifikationer). Som følge heraf foreligger der i humanmedicin, hvor der findes kliniske undersøgelser, der vurderer både in vitro (dvs. befrugtning og udvikling af embryoner) og in vivo-parametre (dvs. graviditetsrater og levendefødte), er det mest almindelige valg for oocyt kryopræservering på grund af dets uforlignelige resultater med hensyn til overlevelse efter opvarmning og endeliglevendefødte 12 fra vitrificerede modne humane oocytter. Hertil kommer, sammenlignet med andre vitrification enheder, den, der anvendes i denne protokol er lettere at bruge og sikrere atgemme 12,da det er behageligt at håndtere og er beskyttet af en hætte under opbevaring. For eksempel er Cryoloop også en effektiv støtte for at nå det minimale volumen mål, men dens struktur (en løkke understøtter en film af løsning, hvor oocytter er indlæst) er skrøbelig og tilbøjelig til utilsigtet opvarmning12. Sugerør (0,25 ml volumen) eller åbne trukket sugerør (OPS) kan også anvendes, men de tillader ikke en betydelig reduktion i vitrification volumen og er også udfordrende at fylde og tømme, som nogle oocytter kan gå tabt26. Mange andre støtter er blevetudviklet 2,men hver af dem har sine ulemper. I stedet, i forhold til langsom frysning, som tidligere var den mest anvendte kryopræservering teknik, de største fordele ved minimum volumen vitrifikation på kommercielle støtter er dens gennemførlighed og hastighed. Som tidligere nævnt, vitrifikation kræver ikke en programmerbar fryser, der skal udføres, og mens langsom frysning af oocytter tager omkring en time og halvdelen, der skal indgås25, vitrification kan ske i cirka 17 minutter efter denne protokol.

Afslutningsvis kan personalefærdigheder og standardisering mellem operatører være de mest udfordrende krav, når man starter en forglasset oocytbank, men de vil blive opnået med personaleuddannelse. Denne mindste volumen vitrifikation protokol for kat umodne oocytter giver konsekvent og repeterbare resultater, når de udføres af erfarne operatører. Der er dog stadig chancer for forbedringer i oocyt udviklingsrater, selv om post-opvarmning levedygtighed og integritet er tilfredsstillende. Med yderligere optimering kan denne protokol også anvendes i marken betingelser for vilde felids, for hvilke offentliggjorte data om oocyt kryopræservering er stadig knappe27. En udvidelse af anvendelsen af denne metode vil ikke blot øge muligheden for at forbedre kryopræserveringsprotokollerne, men vil også gøre det muligt at etablere forglassede oocytbiobanker til frugtbarhed og bevarelse af biodiversiteten i felids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 og af Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Vi vil også gerne takke Dr. MariaGiorgia Morselli for hendes bidrag til de hermed afbildede eksperimenter og til billederhvervelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2942 /
Automatic pipettes & tips / / Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL
Surgical scalpels / / Size 10 is usually ok
Bunsen beak / / /
Clamps / / Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen
Cryotop Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) 01.CR Distributors and catalog number may change in different countries
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 /
Ethylene glycol (EG) Sigma-Aldrich E9129 /
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 /
Glass Pasteur pipettes / / Advised lenght 230 mm (100+130)
Gobelets / / According to the canisters of the storage tank
Heating stage / / All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC
Liquid nitrogen / / /
Medium 199 Sigma-Aldrich M4530 /
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 /
Penicillin G sodium Sigma-Aldrich P3032 /
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136 /
Repro plate Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) 01.K-2 Distributors and catalog number may change in different countries
Stereomicroscope / / As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok
Storage tank / / Any regularly filled tank is ok
Streptomycin sulphate Sigma-Aldrich S9137 /
Styrofoam/nitrogen resistant box / / All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack"
Sucrose Sigma-Aldrich S1888 /
Timers / / All timers which can be set on times until 9 minutes are ok

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
  2. Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
  3. Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
  4. Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
  5. Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
  6. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  7. Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
  8. Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
  9. Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
  10. Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
  11. Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
  12. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
  13. Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
  14. Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
  15. Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
  16. Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
  17. Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
  18. Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
  19. Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
  20. Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
  21. Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
  22. Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
  23. Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
  24. Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
  25. Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
  26. Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
  27. Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).

Tags

Udviklingsbiologi Kat Bank Bevarelse Cryopreservation Cumulus-oocyt kompleks Felid Kvinde Frysning Gamete Germinal Vesicle Germplasm Rapid
Minimum volumen vitrifikation af umodne Feline Oocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colombo, M., Luvoni, G. C. Minimum… More

Colombo, M., Luvoni, G. C. Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes. J. Vis. Exp. (160), e61523, doi:10.3791/61523 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter