Summary
Ce manuscrit décrit un protocole pour la vitrification minimale de volume des ovocytes immatures de chat avec des médias de laboratoire-faits sur des supports commerciaux. Il couvre chaque étape de l’isolement des ovocytes des gonades ex vivo à la vitrification et au réchauffement.
Abstract
Dans les programmes de conservation des animaux sauvages, la banque de mentières est cruciale pour protéger les ressources génétiques d’individus précieux et d’espèces rares et pour promouvoir la préservation de la biodiversité. Chez les félidés, la plupart des espèces sont menacées d’extinction, et les races domestiques sont utilisées comme modèle pour accroître l’efficacité des protocoles pour les services bancaires de germplasme. Parmi les techniques de cryoconservation des ovocytes, la vitrification est de plus en plus populaire dans la procréation assistée humaine et vétérinaire. La vitrification cryotop, qui a d’abord été développée pour les ovocytes humains et les embryons, s’est avérée bien adaptée aux ovocytes de chat. Cette méthode offre plusieurs avantages, tels que la faisabilité dans les conditions de terrain et la vitesse de la procédure, qui peut être utile lorsque plusieurs échantillons doivent être traités. Toutefois, l’efficacité dépend fortement des compétences de l’opérateur, et une normalisation intra- et inter-laboratoires est nécessaire, ainsi que de la formation du personnel. Ce protocole décrit la vitrification minimale du volume des ovocytes félins immatures sur un support commercial dans un protocole étape par étape respectueux du terrain, de la collecte des ovocytes au réchauffement. Conformément au protocole, la préservation de l’intégrité des ovocytes et la viabilité au réchauffement (jusqu’à 90 %) bien qu’il y ait encore place à l’amélioration des résultats de maturation après le réchauffement et de développement embryonnaire.
Introduction
La cryoconservation est devenue une étape clé des techniques de procréation assistée (ART). Chez l’homme, il permet la préservation de la fertilité ou le report de la parentalité pour des raisons médicales ou personnelles. Chez les animaux, il est nécessaire de surmonter la distance et le temps dans les accouplements planifiés, en particulier chez les animaux de ferme et les animaux de compagnie, ou de préserver le matériel génétique de sujets précieux dans les programmes de conservation, en particulier chez les espèces sauvages menacées. La cryoconservation des ormons est le meilleur choix lorsque les individus à élever n’ont pas encore été choisis ou afin d’éviter les problèmes éthiques associés à la congélation d’embryons, en particulier en médecine humaine1. Les spermatozoïdes sont relativement faciles à préserver et donnent des résultats satisfaisants après la décongélation, mais les ovocytes, en raison de leurs caractéristiques structurelles, pourraient être plus complexes à stocker. En effet, le faible rapport surface/volume, ainsi que la présence de la zona pellucida entourant l’ooplasma, limite le mouvement des cryoprotectants et de l’eau à travers la cellule2. En outre, chez les animaux domestiques, y compris les félidés, ils sont caractérisés par un cytoplasme riche en lipides, qui est pensé pour les rendre plus sensibles à la cryoconservation3.
La plupart des félidés sont menacés, et le chat domestique est utilisé comme un modèle pour développer des protocoles pour la préservation du germplasme grâce à la disponibilité des gonades de l’ovariectomie de routine. Chez les animaux sauvages, les gonades peuvent être obtenues après des chirurgies électives ou (plus fréquemment) post-mortem,et les gamètes immatures (vésicule germinale) peuvent être récupérés. La stimulation hormonale visant à obtenir des ovocytes matures (métaphase II) n’est pas aussi commune que dans les ARTs humains en raison des questions éthiques et de la réponse spécifique à l’espèce et à l’individu aux traitements4.
Par conséquent, le développement de stratégies de cryoconservation s’est concentré sur les gamètes immatures, qui peuvent généralement être récupérés après la mort inattendue ou soudaine d’individus rares. D’un point de vue biologique, il existe certaines différences dans la cryoconservation des gamètes immatures ou matures, chacun ayant ses avantages. Tout d’abord, l’ADN est plus protégé dans les ovocytes immatures, dont la vésicule germinale contient des chromosomes entourés d’une membrane nucléaire, tandis que le fuseau meiotique des ovocytes métaphasé II pourrait être plus vulnérable aux cryoin jurys5. Deuxièmement, les dommages causés par le cytosquelette induits par le froid pourraient affecter la rotation des fuseaux, l’extrusion du corps polaire, la migration pronucléaire et la cytokinesis, qui pourraient avoir des impacts différents selon la phase développementale des ovocytes, influençant la progression de la méiose ou les événements post-fertilisation. Enfin, et peut-être le plus important, alors que les ovocytes matures sont prêts à être fécondés, les gamètes immatures s’appuient sur le soutien des cellules cumulus environnantes pour passer par la maturation nucléaire et cytoplasmique6, et c’est la raison pour laquelle des complexes cumulus-ovocytes entiers (COC) sont cryopréservés. Cependant, la perte de cellules cumulus et/ou la perte de connexion fonctionnelle entre le ormiste et les cellules somatiques environnantes sont probablement l’effet le plus néfaste de la cryoconservation des COC immatures.
Parmi les techniques de cryoconservation, la vitrification est une que l’on peut appliquer plus facilement dans des conditions de terrain. Comparativement à la congélation lente (ou à taux contrôlé), la vitrification est plus rapide et ne nécessite pas d’équipement spécifique, comme un congélateur programmable. Afin de satisfaire les trois principes fondamentaux de la vitrification (c.-à-d. une viscosité élevée, liée à une forte concentration cryoprotecteur, de petits volumes et une diminution de température ultra-rapide), plusieurs milieux et supports ont été développés et utilisés spécialement chez les chats pour les ovocytes immatures et matures. En commençant par de simples pailles7, des dispositifs ont ensuite été développés pour atteindre l’objectif « volume minimum ». Cryoloop8, pailles à tiré ouvertes (OPS)9, gouttières en plastique (paille modifiée)10 et cryotubes11 ont été utilisés, jusqu’à ce qu’un dispositif plus efficace (c.-à-d. Cryotop) a été utilisé11, améliorant la survie et la reprise de la méiose. Cryotop (Figure supplémentaire 1) est un support disponible dans le commerce qui est devenu le système ouvert électif pour la vitrification. Développé pour la vitrification des ovocytes humains et des embryons, il se compose d’une petite bande de film attachée à un support en plastique dur, protégé par un bouchon de tube en plastique pendant le stockage12. Grâce à sa facilité d’utilisation et à la réduction extrême du volume de vitrification (aussi peu que 0,1 μL), ce qui conduit également à des taux de refroidissement et de réchauffement extrêmement rapides, ce soutien à la vitrification a été de plus en plus appliqué chez plusieurs espèces, y compris le chat domestique, dans lequel il a été utilisé avec une variété de médias13,14,15,16,17.
Le but de ce manuscrit est de décrire un protocole de réchauffement de la vitrification-vitrification de collection, avec des modifications mineures de celui initialement développé pour les ovocytes humains, qui emploie des supports de laboratoire et commerciaux pour la vitrification minimale de volume et peut être facilement appliqué dans des conditions de champ pour la cryoconservation des COC félins immatures.
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Protocol
Les procédures décrites par les présentes n’ont pas fait l’objet d’une approbation éthique puisque les ovaires de chat ont été recueillis dans les cliniques vétérinaires comme sous-produits de l’ovariectomie de routine ou de l’ovariohystérectomie demandée par le propriétaire.
1. Collection d’ovocytes
- Avant de commencer les expériences, préparer des solutions pour la collecte des ovaires et des ovocytes. Préparer une solution de collecte d’ovaires avec de la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) avec un mélange d’antibiotiques et d’antimycotiques (100 UI/mL de pénicilline G sodium, 0,1 mg/mL de sulfate de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotericine B). Préparer une solution de collecte d’ovocytes (c.-à-d. PBS/PVA) avec pbs avec 100 UI/mL de pénicilline G sodium, 0,1 mg/mL de sulfate de streptomycine et 0,1 % (w/v) d’alcool polyvinyle (APV).
- Stockez les solutions pour la collecte des ovaires et des ovocytes à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
- Le jour de l’utilisation des reines, quelques heures avant le traitement des échantillons, prendre une partie des solutions de collecte des ovaires et des ovocytes et les laisser se réchauffer à température ambiante (RT; 25 ± 2 °C).
- Lorsque les échantillons arrivent au laboratoire, isoler les ovaires du tissu conjonctif environnant et de l’oviducte et les laver dans un milieu de collecte d’ovaires frais dans une boîte de Pétri.
- Remplissez une boîte de Pétri de 35 mm pour chaque reine avec environ 3 mL de RT PBS/PVA, et un plat de plus pour recueillir les ovocytes.
- Placez une paire d’ovaires dans une boîte de Pétri et émincer le cortex avec un scalpel chirurgical. Assurez-vous que tous les follicules ont été cassés à l’aide d’un stéréomicroscope (grossissement 8x).
- Recueillir les COC avec une pipette et les déplacer dans pbs frais / PVA dans la boîte de Pétri allouée. Choisissez de bonnes qualités COC, avec un cytoplasme homogène et sombre et entouré de plusieurs couches compactes de cellules cumulus (grade I18).
2. Vitrification
- Préparer les médias d’équilibre et de vitrification.
- Préparer une solution d’équilibre (ES) avec 7,5 % (v/v) d’éthylène glycol (EG) et 7,5 % (v/v) de diméthylsulphoxide (DMSO) dans le milieu 199, avec 20 % de sérum fœtal de bovins (FBS).
- Préparer la solution de vitrification (VS) avec 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO et 0,5 M de saccharose dans le moyen 199, avec 20% FBS (modifié à partir de 19).
- Laissez ES et VS se réchauffer à RT avant d’utiliser.
REMARQUE : Les cryoprotectants (p. ex., EG, DMSO) sont connus pour être cytotoxiques. Une stratégie pour contrer leur toxicité est de réduire la température à laquelle les cellules sont exposées à eux20, et les ovocytes sont généralement exposés à des cryoprotectants à RT. Ainsi, l’ensemble de la procédure, de la collecte des ovocytes à la vitrification, est effectué à RT dans ce protocole pour éviter les fluctuations de température.
- Préparer le plat de vitrification (c.-à-d. un plat spécial composé de six puits coniques divisés en deux rangées, connu sous le nom de « plaque de repro »). Préparer une rangée (trois puits) pour chaque support de vitrification.
- Ajouter 20 μL d’ES au bas du premier puits.
- Ajouter 300 μL de VS au bas des deuxièmes (c.-à-d. 1VS) et troisième (c.-à-d. 2VS).
- Équilibrer les COC dans ES.
- Avec une pipette à petit forage (p. ex., une pipette Pasteur tirée sur un bec de Bunsen pour la rendre plus mince – le diamètre doit être d’au moins 200 μm), transférer un (ou plusieurs) COC(s) sur le fond du premier puits.
REMARQUE : Choisissez la taille de la pipette en fonction du nombre de couches de cellules cumulus entourant les ovocytes, afin de réduire autant que possible le volume de support qui est transféré avec les COC à chaque étape. Avec le protocole actuel, les opérateurs formés peuvent vitrifier avec succès jusqu’à huit COC félins par chaque support de vitrification. - Ajouter lentement 20 μL d’ES à la bordure de la goutte. Attendez 3 minutes.
- Ajouter lentement 20 μL d’ES à la frontière de la goutte. Attendez 3 minutes.
- Ajouter lentement 240 μL d’ES à la bordure de la goutte. Attends 9 minutes.
- En attendant, préparer une boîte avec de l’azote liquide (LN2),étiqueter un support de vitrification avec le code d’identification de l’expérience/chat et la laisser ouverte. Mettez les deux près du stéréomicroscope, de sorte qu’ils peuvent être facilement accessibles tout en travaillant.
Attention! Portez de l’équipement de protection individuelle lors de la manipulation de LN2. - Sinon, si plusieurs COC doivent être vitrifiés, commencez la première étape d’équilibre (voir l’étape 2.3.1 - 2.3.2) pour un autre groupe de COC (qui sera chargé sur un nouveau support de vitrification).
- Avec une pipette à petit forage (p. ex., une pipette Pasteur tirée sur un bec de Bunsen pour la rendre plus mince – le diamètre doit être d’au moins 200 μm), transférer un (ou plusieurs) COC(s) sur le fond du premier puits.
- Vitrifier les COC en VS en moins de 90 secondes.
- À l’aide de la même pipette à petit forage, remplissez-la de 1VS, prenez les COC du bas du premier puits (ES) et déplacez-les à la surface du second puits (1VS).
- Laver la pipette avec 1VS.
- Prenez les COC et déplacez-les dans une autre zone (au fond) du puits; mélanger le milieu qui les entoure avec la pipette.
- Remplissez la pipette de 1VS dans une autre zone du puits, prenez les COC, déplacez-les et mélangez le milieu qui les entoure avec la pipette.
- Répétez l’étape 2.4.4.
- Laver la pipette avec 2VS.
- Prenez les COC et déplacez-les sur le fond du troisième puits (2VS); mélanger le milieu qui les entoure avec la pipette.
- Remplissez la pipette de 2VS dans une autre zone du puits, prenez les COC, déplacez-les et mélangez le milieu qui les entoure avec la pipette.
- Répétez l’étape 2.4.8.
- Remplissez la pipette de 2VS dans une autre zone du puits, prenez les COC et chargez-les sur la bande du support de vitrification, aussi près que possible de la pointe. Aspirate en excès de milieu pour réduire le volume de VS autant que possible.
- Plongez immédiatement le support de vitrification dans LN2, le déplaçant. Fermez-le à l’aide de quelques pinces, en vous assurant qu’il reste toujours immergé dans LN2.
REMARQUE : Le maintien du bon timing est crucial en raison de la toxicité des cellules cryoprotecantes. En raison de leur forte concentration dans les milieux vitrification, l’exposition cellulaire doit être contrôlée, également par l’exécution sans faille de la technique21. Si les échantillons sont abondants, envisagez de les diviser pour les traiter plus rapidement et de minimiser le temps entre la collecte des ovocytes et la vitrification.
- Conserver les supports de vitrification chargés dans un gobelet et les conserver dans un réservoir LN2 de stockage jusqu’à ce qu’ils se réchauffent.
REMARQUE : Toutes les étapes précédentes du protocole peuvent également être appliquées dans des conditions de terrain si LN2 est disponible. Un expéditeur à sec sera nécessaire pour transporter les échantillons au laboratoire en toute sécurité, puis procéder aux phases suivantes.
3. Réchauffement
- Préparez les médias qui réchauffent.
- Préparer la solution de décongélation (TS) avec 1 M de saccharose en 199 moyen, avec 20% de FBS.
- Préparer la solution de dilution (DS) avec 0,5 M de saccharose en 199 moyen, avec 20% FBS.
- Préparer la solution de lavage (WS) avec Medium 199 avec 20% FBS.
- Avant utilisation, réchauffez TS à 38 °C et DS et WS à RT.
- Si nécessaire, préparer le milieu de culture pour l’utilisation ultérieure de COC réchauffés (p. ex., maturation in vitro, IVM).
- Placez le stade de chauffage près du stéréomicroscope et allumez-le (38 °C). Mettre le couvercle d’une boîte de Pétri pour réchauffer.
- Lorsque tout est prêt, transférer les supports de vitrification qui doivent être réchauffés du réservoir de stockage à une boîte avec LN2, et mettre la boîte près du stéréomicroscope.
- Préparez la « plaque Repro ». Préparez une rangée pour chaque support de vitrification qui doit être réchauffé.
- Ajouter 300 μL de DS au bas du premier puits.
- Ajouter 300 μL de WS au bas des deuxièmes (c.-à-d. 1WS) et les troisièmes (c.-à-d. 2WS).
- Faire une goutte de TS (100 μL) sur le couvercle de la boîte de Pétri.
- Avec des pinces, ouvrez un support de vitrification dans le LN2.
- Mettez la chute TS sous le stéréomicroscope et avec un mouvement rapide prendre le support de vitrification de la LN2 et plonger sa bande dans la goutte, le déplaçant jusqu’à ce que tous les COC se détachent. Retirez le support de la goutte dès qu’elle est vide, mais laissez les COC en TS pendant 1 minute au total (de l’immersion jusqu’à l’étape suivante).
- Prenez une pipette semblable à celle utilisée pour la vitrification et remplissez-la de DS. Prenez les COC de la baisse (TS) et déplacez-les vers le bas du premier puits (DS). Attendez 3 minutes.
- Laver la pipette avec 1WS. Prenez les COC et déplacez-les sur le bas du deuxième puits (1WS). Attendez 5 minutes.
- Laver la pipette avec 2WS. Prenez les COC et déplacez-les à la surface du troisième puits (2WS). Attendez qu’ils touchent le fond du puits.
- Répétez l’étape 3.11 à l’aide d’une autre zone du puits.
- Laver la pipette avec un milieu de culture et déplacer les ovocytes dans le plat de culture pour l’utilisation suivante (p. ex., IVM).
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Representative Results
Après la vitrification et le réchauffement des ovocytes de chat selon le protocole actuel (figure 1 et figure supplémentaire 1),la grande majorité des gamètes survivent. Après la vitrification, entre autres techniques, la viabilité peut être évaluée au microscope optique comme l’intégrité morphologique22 ou avec l’utilisation de taches vitales. L’un de ces derniers est le diacétate/propidium de fluorescéine/ipodure de propidium (FDA/PI), qui permet l’identification des cellules viables (fluorescence verte claire) et mortes (fluorescence rouge). La figure 2 montre une image représentative des COC de chat vitrifiés-chauds tachés avec FDA/PI juste après le réchauffement. Les données des expériences montrant le pourcentage de survie après vitrification sont rapportées dans le tableau 1, qui décrit les données post-réchauffement des ovocytes destinés à la maturation in vitro17 ou à la production d’embryons in vitro16. Dans l’ensemble, dans les deux expériences utilisées comme exemples ici16,17, 395 sur 435 ovocytes ont survécu, marquant une viabilité globale de 90,8% après le réchauffement.
Cependant, certains changements morphologiques peuvent être remarqués après le réchauffement (figure 3). Chez les gamètes vitrifiés-réchauffés suivant ce protocole, les anomalies morphologiques les plus fréquentes sont les changements dans la forme et la granulation d’ooplasme, la perte partielle (ou, rarement, totale) des cellules cumulus et (rarement) les fractures de la zona pellucida. D’autre part, comme indiqué dans nos travaux précédents sur la vitrification de volume minimum avec le même soutien, ces COC vitrifiés peuvent mûrir17 et se développer en embryons in vitro16, même si à des taux inférieurs à cocs frais. En outre, ils ne présentent généralement pas de durcissement zona pellucida (qui est une autre conséquence bien connue de la cryoconservation), puisque la fécondation in vitro (FIV) est réussie16.
Figure 1 : Représentation schématique du protocole de réchauffement de la vitrification des ovocytes.
Veuillez consulter le texte du manuscrit pour obtenir des indications complètes. COC= complexes cumulus-oocytes; ES=solution d’équilibre; Solution VS=vitrification; Solution de dégel TS=; Solution de dilution DS=; WS=solution de lavage; LN2=azote liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Viabilité des ovocytes vitrifiés de chat après le réchauffement.
Les complexes vitrifiés de cumulus-oocytes tachés de diacétate/d’iodure de propidium (FDA/PI) montrent la fluorescence verte lorsqu’elles sont viables (A) ou la fluorescence rouge ou faible lorsqu’elles sont mortes (B). Longueurs d’onde d’excitation/émission : 495 nm/517 nm pour fda; 538 nm/617 nm pour PI. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Micrographes légers d’ovocytes de chats frais et vitrifiés.
(A) Complexes de cumulus-oocytes frais après la collecte, avant vitrification. (B) Complexes vitrifiés cumulus-oocytes après le réchauffement, montrant quelques blessures induites par la vitrification (changements de forme et de perte de cellules cumulus, flèche noire). Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Expérience | Groupe | Ovocytes réchauffés (n) | Ovocytes viables (n) | Viabilité (%) | Viabilité (moyenne % ± DS) |
| 1† | 1 | 13 | 12 | 92.31 | 91,54 ± 3,66 |
| 2 | 47 | 44 | 93.62 | ||
| 3 | 52 | 45 | 86.54 | ||
| 4 | 26 | 24 | 92.31 | ||
| 5 | 41 | 40 | 97.56 | ||
| 6 | 21 | 19 | 90.48 | ||
| 7 | 50 | 44 | 88.00 | ||
| 2‡ | 1 | 17 | 17 | 100.00 | 91,51 ± 9,16 |
| 2 | 17 | 17 | 100.00 | ||
| 3 | 9 | 8 | 88.89 | ||
| 4 | 21 | 21 | 100.00 | ||
| 5 | 30 | 23 | 76.67 | ||
| 6 | 26 | 23 | 88.46 | ||
| 7 | 17 | 13 | 76.47 | ||
| 8 | 10 | 10 | 100.00 | ||
| 9 | 15 | 14 | 93.33 | ||
| 10 | 23 | 21 | 91.30 |
Tableau 1 : Résultats représentatifs de la viabilité des ovocytes réchauffés par le chat. Données de †Colombo et coll. 201916 et ‡ Colombo et al. 202017.
Figure supplémentaire 1 : Image représentative des supports utilisés pour la vitrification des ovocytes. Le support commercial mesure 13 cm et est facile à manipuler et à stocker. Les ovocytes doivent être chargés sur la mince bande de plastique en haut de l’appareil, aussi près que possible de la marque noire près de la pointe. Droit d’auteur: Kitazato Corporation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
La cryoconservation des ovocytes est une technique cruciale de conservation du germplasme, en particulier dans les taxons où de nombreuses espèces sont en voie de disparition, comme la famille des Felidae. Dans ce manuscrit, un protocole simple et respectueux du terrain pour la vitrification des ovocytes immatures de chat a été présenté. Les médias fabriqués en laboratoire, les soutiens à la vitrification minimale en volume et le personnel formé sont les facteurs clés du succès de cette méthode, qui permet d’obtenir des ovocytes viables de façon cohérente et répétée, comme le montrent les résultats représentatifs rapportés par les présentes.
En commençant par la préparation des médias, le protocole doit être suivi avec précision pour assurer les meilleurs résultats, mais les compétences de l’opérateur sont le principal problème. Les supports doivent être préparés le jour même de la procédure de vitrification, ou, si cela n’est pas possible, ils doivent être préparés la veille et stockés à 4 °C. Dans tous les cas, avant le traitement de l’échantillon, il faut laisser suffisamment de temps pour permettre aux solutions de se réchauffer jusqu’à la collecte des ovocytes RT. Cependant, la cryoconservation est la procédure la plus délicate. Bien que la procédure de réchauffement ne soit pas si critique, si le protocole et les calendriers sont respectés, la vitrification pourrait être plus complexe. Après l’équilibre, dans lequel il faut veiller uniquement au respect des délais, la phase la plus difficile sera probablement l’étape de vitrification (voir 2.4. du présent protocole). En effet, les transferts d’ovocytes et les lavages de pipettes doivent être bien chronométrés et, tous ensemble, effectués en moins de 90 secondes. Pour les débutants, il est conseillé de chronométrage de la procédure avec un chronomètre pendant la formation, tout en aussi pour les personnes formées, il pourrait être utile d’avoir un bip de minuterie après 60 secondes comme une alerte que le temps est en cours d’exécution. En outre, cela permettrait une normalisation plus élevée, puisque les opérateurs vitrifiant les groupes de 6-8 COC devraient être proches du transfert des ovocytes du deuxième au troisième puits de la plaque Repro (voir l’étape 2.4.7 du protocole actuel) lorsque l’alarme se déclenche. Espérons qu’avec l’aide de cet article, une normalisation plus élevée entre les individus et entre les laboratoires pourrait être réalisée.
Les principales limites du protocole demeurent les caractéristiques intrinsèques des procédures de cryoconservation elles-mêmes. Comme indiqué précédemment, la vitrification expose les ovocytes à des conditions non physiologiques et potentiellement dommageables, même si elle est exécutée sans faille. L’incubation avec des cryoprotectants et la baisse de la température sont les événements les plus critiques20 et ils doivent être gardés sous contrôle strict. Parmi les cryoin jurys les plus courants, certains sont facilement observables au microscope optique (p. ex., perte de cellules cumulus, altération de la forme et de la taille cellulaires), tandis que d’autres ne sont pas visibles et affectent souvent les structures subcellulaires (p. ex., durcissement de la zona pellucida, stress oxydatif, dommages au cytosquelette, fuseaux méiotique et altérations de l’ADN)23,24. Bien que la plupart du temps viable, les COC vitrifiés suivant ce protocole présentent souvent quelques anomalies morphologiques évidentes après le réchauffement. Cependant, il n’y a aucune corrélation entre la morphologie et la viabilité, qui pourraient également être entravées en raison des dommages subcellulaires3,25, mais les altérations morphologiques sont probablement une conséquence des cryoin jurys et en partie une raison pour les résultats développementaux in vitro des ovocytes vitrifiés, qui sont assez pauvres si comparés à ceux des ovocytes frais. La préparation minutieuse des milieux de vitrification et l’observation précise du calendrier du protocole contribuent à obtenir une bonne viabilité post-réchauffement et une intégrité morphologique, mais des améliorations dans la maturation in vitro des ovocytes et le développement de l’embryon sont encore nécessaires, puisque la viabilité diminue souvent au cours de la culture suivante16.
Les blessures causées par le froid se produisent malheureusement avec chaque méthode de cryoconservation24. Le support de vitrification de volume minimum utilisé dans ce protocole a été développé pour réduire le volume de vitrification autant que possible, ce qui a entraîné de meilleurs taux de refroidissement et de réchauffement par rapport à d’autres dispositifs de cryoconservation (-23 000 °C/minute et 42 000 °C/minute respectivement, selon les spécifications du fabricant). En conséquence, en médecine humaine, où des études cliniques évaluant à la fois les paramètres in vitro (c.-à-d. la fécondation et le développement d’embryons) et les paramètres in vivo (c.-à-d. les taux de grossesse et les naissances vivantes) sont disponibles, la vitrification minimale du volume est le choix le plus courant pour la cryoconservation des ovocytes en raison de ses résultats incomparables en termes de survie post-réchauffement et, enfin, de naissances vivantes12 vitrifiés par des ovocytes humains matures. En outre, par rapport à d’autres dispositifs de vitrification, celui utilisé dans ce protocole est plus facile à utiliser et plus sûr pour stocker12, car il est confortable à manipuler et est protégé par un bouchon pendant le stockage. Par exemple, le Cryoloop est également un support efficace afin d’atteindre l’objectif de volume minimal, mais sa structure (une boucle soutenant un film de solution sur laquelle les ovocytes sont chargés) est fragile et sujette au réchauffement accidentel12. Des pailles (0,25 mL de volume) ou des pailles à air libre (OPS) peuvent également être utilisées, mais elles ne permettent pas une réduction significative du volume de vitrification et sont également difficiles à remplir et à vider, car certains ovocytes pourraient être perdus26. Beaucoup d’autres supports ont été développés2, mais chacun d’eux a ses inconvénients. Au lieu de cela, par rapport au gel lent, qui était auparavant la technique de cryoconservation la plus utilisée, les principaux avantages de la vitrification minimale du volume sur les supports commerciaux sont sa faisabilité et sa vitesse. Comme nous l’avons mentionné précédemment, la vitrification ne nécessite pas d’effectuer un congélateur programmable, et bien que la congélation lente des ovocytes prenne environ une heure et demie pour être conclue25, la vitrification peut être réalisée en environ 17 minutes suivant le protocole actuel.
En conclusion, les compétences du personnel et la normalisation inter-opérateurs pourraient être les exigences les plus difficiles lors du démarrage d’une banque vitrifiée d’ovocytes, mais elles seront réalisées avec la formation du personnel. Ce protocole de vitrification minimale de volume pour les ovocytes immatures de chat donne des résultats cohérents et répétables lorsqu’ils sont exécutés par des opérateurs expérimentés. Cependant, il y a encore des chances d’amélioration des taux de développement des ovocytes, même si la viabilité et l’intégrité post-réchauffement sont satisfaisantes. Avec une optimisation plus poussée, le protocole actuel pourrait également être appliqué dans des conditions de terrain pour les félidés sauvages, pour lesquels les données publiées concernant la cryoconservation des ovocytes sont encore rares27. L’élargissement de l’application de cette méthode augmenterait non seulement la possibilité d’améliorer les protocoles de cryoconservation, mais permettrait également d’établir des biobanques vitrifiées pour la fertilité et la préservation de la biodiversité chez les félidés.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été en partie soutenu par EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 et par Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Nous tenons également à remercier la Dre MariaGiorgia Morselli pour sa contribution aux expériences décrites par les présentes et à l’acquisition d’images.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
