Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur minimalen Volumenverglasung unreifer Katzenoozyten mit im Labor hergestellten Medien auf kommerziellen Trägern. Es deckt jeden Schritt von der Eizellenisolierung von ex vivo Gonaden bis zur Verglasung und Erwärmung ab.
Abstract
In den Erhaltungsprogrammen für Wildtiere ist Das Gamete Banking von entscheidender Bedeutung, um die genetischen Ressourcen wertvoller Individuen und seltener Arten zu schützen und die Erhaltung der biologischen Vielfalt zu fördern. Bei Feliden sind die meisten Arten vom Aussterben bedroht, und heimische Rassen werden als Modell verwendet, um die Effizienz von Protokollen für das Keimplasma-Banking zu erhöhen. Unter den Eizellen-Kryokonservierungstechniken ist die Verglasung in der humanen und tierärztlichen assistierten Reproduktion immer beliebter. Die Cryotop-Verglasung, die zunächst für menschliche Eizellen und Embryonen entwickelt wurde, hat sich als gut für Katzenoozyten geeignet erwiesen. Diese Methode bietet mehrere Vorteile, wie die Machbarkeit unter Feldbedingungen und die Geschwindigkeit des Verfahrens, die hilfreich sein können, wenn mehrere Proben verarbeitet werden müssen. Die Effizienz hängt jedoch stark von den Fähigkeiten des Bedieners ab, und es sind eine labor- und laborübergreifende Standardisierung sowie eine Personalschulung erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt minimale Volumen verglasung von unreifen Katzenoozyten auf einer kommerziellen Unterstützung in einem Schritt für Schritt feldfreundliches Protokoll, von der Oozytensammlung bis zur Erwärmung. Nach dem Protokoll, Erhaltung der Oozytenintegrität und Lebensfähigkeit bei Erwärmung (bis zu 90%) zu erwarten, obwohl es noch Raum für Verbesserungen bei der Reifung nach der Erwärmung und den Ergebnissen der embryonalen Entwicklung gibt.
Introduction
Die Kryokonservierung ist zu einem wichtigen Schritt der assistierten Reproduktionstechniken (ARTs) geworden. Beim Menschen, Es ermöglicht die Erhaltung der Fruchtbarkeit oder Verschiebung der Elternschaft aus medizinischen oder persönlichen Gründen. Bei Tieren ist es notwendig, Distanz und Zeit in geplanten Paarungen zu überwinden, insbesondere bei Nutztieren und Haustieren, oder genetisches Material wertvoller Subjekte in Naturschutzprogrammen, insbesondere in wildgefährdeten Arten, zu konservieren. Gamete Kryokonservierung ist die beste Wahl, wenn die Individuen gezüchtet wurden noch nicht ausgewählt oder um ethische Fragen im Zusammenhang mit embryo nieren, vor allem in der Humanmedizin zu vermeiden1. Spermatozoen sind relativ einfach zu erhalten und geben zufriedenstellende Ergebnisse nach dem Auftauen, aber Eizellen, aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften, könnte komplexer zu speichern. Tatsächlich begrenzt das niedrige Oberflächen-Volumen-Verhältnis sowie das Vorhandensein der Zona-Pellucida, die das Ooplasma umgibt, die Bewegung von Kryoprotektoren und Wasser über die Zelle2. Darüber hinaus sind sie bei Haustieren einschließlich Feliden durch ein lipidreiches Zytoplasma gekennzeichnet, das3sie empfindlicher gegenüber Kryokonservierung 3 machen soll.
Die meisten Felide sind bedroht, und die Hauskatze wird als Modell verwendet, um Protokolle zur Erhaltung von Keimplasma zu entwickeln, dank der Verfügbarkeit von Gonaden aus der routinemäßigen Ovariektomie. Bei Wildtieren können Gonaden nach Wahloperationen oder (häufiger) post-mortemgewonnen werden, und unreife (keimförmige Vesikel) Gameten können geborgen werden. Hormonelle Stimulation, die darauf abzielt, reife (Metaphase II) Eizellen zu erhalten, ist aufgrund der ethischen Fragen und der art- und individualspezifischen Reaktion auf Behandlungen4nicht so häufig wie in menschlichen ARTs.
Daher hat sich die Entwicklung von Kryokonservierungsstrategien auf unreife Gameten konzentriert, die in der Regel nach dem unerwarteten oder plötzlichen Tod seltener Personen abgerufen werden können. Aus biologischer Sicht gibt es einige Unterschiede in der Kryokonservierung von unreifen oder reifen Gameten, von denen jeder seine Vorteile hat. Erstens ist die DNA in unreifen Eizellen geschützt, deren Keimbläschen Chromosomen enthält, die von einer Kernmembran umgeben sind, während die meiotische Spindel der Metaphase II Oozyten anfälliger für Kryoverletzungen sein könnte5. Zweitens können kaltinduzierte Zytoskelettschäden die Spindelrotation, die Polarkörperextrusion, die pronukleare Migration und die Zytokinese beeinflussen, die je nach Oozytenentwicklungsphase unterschiedliche Auswirkungen haben und die Meioseprogression oder Ereignisse nach der Befruchtung beeinflussen. Schließlich, und vielleicht am wichtigsten, während reife Oozyten zur Befruchtung bereit sind, verlassen sich unreife Gameten auf die Unterstützung der umgebenden Cumuluszellen, um durch die kernnukleare und zytoplasmatische Reifung6zu gehen, und dies ist der Grund, warum ganze Cumulus-Oozytenkomplexe (COCs) kryokonserviert sind. Der Verlust von Cumuluszellen und/oder der Verlust der funktionellen Verbindung zwischen der Gamete und den umgebenden somatischen Zellen sind jedoch wahrscheinlich die schädlichste Wirkung der Kryokonservierung unreifer COCs.
Unter den Kryokonservierungstechniken ist die Verglasung eine, die leichter unter Feldbedingungen angewendet werden kann. Im Vergleich zum langsamen (oder kontrollierten) Einfrieren ist die Verglasung schneller und erfordert keine spezifischen Geräte, wie z. B. einen programmierbaren Gefrierschrank. Um die drei Grundprinzipien der Vitrifizierung (d.h. hohe Viskosität, verbunden mit hoher Kryoprotektorkonzentration, geringen Volumina und ultraschnellem Temperaturabfall) zu erfüllen, wurden mehrere Medien und Stützen entwickelt und insbesondere bei Katzen für unreife und reife Oozyten verwendet. Ausgehend von einfachen Strohhalmen7wurden dann Geräte entwickelt, um das Ziel "Minimum Volume" zu erreichen. Cryoloop8, offen gezogene Strohhalme (OPS)9, Kunststoffrinnen (modifiziertes Stroh)10 und Kryotubes11 wurden verwendet, bis ein effizienteres Gerät (d.h. Cryotop) eingesetzt wurde11, verbesserungder Überleben und Meiose Wiederaufnahme. Cryotop (Supplemental Figure 1) ist eine kommerziell erhältliche Unterstützung, die das wahloffene System für die Vitrifizierung geworden ist. Entwickelt für die Verglasung von menschlichen Eizellen und Embryonen, besteht es aus einem kleinen Folienstreifen, der an einem Hartplastikhalter befestigt ist, geschützt durch eine Kunststoffrohrkappe während der Lagerung12. Dank ihrer Verwendbarkeit und der extremen Reduzierung des Verglasungsvolumens (nur 0,1 l), die auch zu extrem schnellen Abkühlungs- und Erwärmungsraten führt, wurde diese Verglasungsunterstützung zunehmend bei mehreren Arten angewendet, einschließlich der Hauskatze, bei der sie mit einer Vielzahl von Medien13,14,15,16,17verwendet wurde.
Der Zweck dieses Manuskripts ist es, ein Sammlungs-Vitrifizierungs-Erwärmungsprotokoll zu beschreiben, mit geringfügigen Änderungen von dem ursprünglich für menschliche Eizellen entwickelten Protokoll, das im Labor hergestellte Medien und kommerzielle Stützen für minimale Volumenverglasung verwendet und leicht unter Feldbedingungen für die Kryokonservierung unreifer feliner COCs angewendet werden kann.
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Protocol
Die hiermit dargestellten Verfahren wurden nicht ethisch zugelassen, da Katzeneierstöcke in Tierkliniken als Nebenprodukte aus der vom Eigentümer angeforderten Routine-Ovariektomie oder Ovariohysterektomie gesammelt wurden.
1. Oozyten-Sammlung
- Vor Beginn der Experimente, bereiten Sie Lösungen für Dieeier- und Eizellsammlung vor. Bereiten Sie Diestöcke-Sammlungslösung mit Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) mit einer Mischung aus Antibiotika und Antimykotika (100 I.E./ml Penicillin G-Natrium, 0,1 mg/ml Streptomycinsulfat, 0,25 g/ml Amphotericin B) vor. Herstellung einer Eizellensammellösung (d. h. PBS/PVA) mit PBS mit 100 I.E./ml Penicillin G-Natrium, 0,1 mg/ml Streptomycinsulfat und 0,1% (w/v) Polyvinylalkohol (PVA).
- Lösungen für die Eierstock- und Eizellensammlung bei 4 °C bis zur Verwendung lagern.
- Am Tag des Spayings der Königinnen, wenige Stunden vor der Verarbeitung der Proben, nehmen Sie einen Teil der Eierstock- und Eiozyten-Sammellösungen und lassen Sie sie bei Raumtemperatur aufwärmen (RT; 25 x 2 °C).
- Wenn Proben ins Labor gelangen, isolieren Sie die Eierstöcke aus dem umgebenden Bindegewebe und aus dem Eileiter und waschen Sie sie in frischem Eierstocksammelmedium in einer Petrischale.
- Füllen Sie eine 35 mm Petrischale für jede Königin mit ca. 3 ml RT PBS/PVA und eine weitere Schale, um die Eizellen zu sammeln.
- Legen Sie ein Paar Eierstöcke in eine Petrischale und zerkleinern Sie den Kortex mit einem chirurgischen Skalpell. Stellen Sie sicher, dass alle Follikel mit Hilfe eines Stereomikroskops gebrochen wurden (Vergrößerung 8x).
- CoCs mit einer Pipette sammeln und in frischer PBS/PVA in der zugeordneten Petrischale bewegen. Wählen Sie gute Qualitäten COCs, mit einem homogenen, dunklen Zytoplasma und umgeben von mehreren kompakten Schichten von Cumuluszellen (Grad I18).
2. Vitrifizierung
- Vorbereiten von Gleichgewichts- und Verglasungsmedien.
- Herstellung der Ausgleichslösung (ES) mit 7,5 % (v/v) Ethylenglykol (EG) und 7,5 % (v/v) Dimethylsulphoxid (DMSO) in Medium 199 mit 20 % fetalem Rinderserum (FBS).
- Vorbereiten sie Vitrifizierungslösung (VS) mit 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO und 0,5 M Saccharose in Medium 199, mit 20% FBS (modifiziert von 19).
- Lassen Sie ES und VS vor gebrauchen bei RT aufwärmen.
HINWEIS: Kryoprotektoren (z. B. EG, DMSO) sind als zytotoxisch bekannt. Eine Strategie, um ihre Toxizität entgegenzuwirken, ist die Temperatur zu reduzieren, bei der die Zellen ihnen ausgesetzt sind20, und Eizellen sind in der Regel Kryoprotektoren bei RT ausgesetzt. So wird das gesamte Verfahren, von der Eizellensammlung bis zur Verglasung, bei RT in diesem Protokoll durchgeführt, um Temperaturschwankungen zu vermeiden.
- Bereiten Sie die Verglasungschale (d.h. eine spezielle Schale bestehend aus sechs konischen Brunnen in zwei Reihen, bekannt als "Repro-Platte"). Bereiten Sie eine Reihe (drei Brunnen) für jede Verglasungsunterstützung vor.
- Fügen Sie 20 L ES auf der Unterseite des ersten Brunnens hinzu.
- Fügen Sie 300 l VS auf der Unterseite der zweiten (d. h. 1VS) und dritten (d. h. 2VS) Brunnen hinzu.
- CoCs in ES ausdematrieren.
- Mit einer Kleinbohrpipette (z.B. einer Pasteurpipette, die auf einem Bunsenschnabel gezogen wird, um sie dünner zu machen – der Durchmesser sollte mindestens 200 m betragen), übertragen Sie eine (oder mehrere) COC(s) auf den Boden des ersten Brunnens.
HINWEIS: Wählen Sie die Größe der Pipette nach der Anzahl der Schichten von Cumuluszellen, die die Eizellen umgeben, also nach COCs-Dimensionen, mit dem Ziel, das Medienvolumen, das in jedem Schritt mit COCs übertragen wird, so weit wie möglich zu reduzieren. Mit dem vorliegenden Protokoll können geschulte Bediener bis zu acht Katzen-COCs pro Verglasungsunterstützung erfolgreich vitrifyieren. - Fügen Sie langsam 20 L ES an der Grenze des Tropfens hinzu. Warten Sie 3 Minuten.
- Fügen Sie langsam weitere 20 L ES am Rand des Tropfens hinzu. Warten Sie 3 Minuten.
- Fügen Sie langsam 240 L ES an der Grenze des Tropfens hinzu. Warten Sie 9 Minuten.
- Während des Wartens eine Schachtel mit flüssigem Stickstoff (LN2)vorbereiten, eine Verglasungsunterstützung mit dem Experiment-/Katzen-Identifikationscode kennzeichnen und offen lassen. Setzen Sie beide in die Nähe des Stereomikroskops, so dass sie während der Arbeit leicht erreichbar sind.
Vorsicht! Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung beim Umgang mit LN2. - Wenn mehrere COCs verglast werden müssen, beginnen Sie alternativ den ersten Ausgleichsschritt (siehe Schritt 2.3.1 - 2.3.2) für eine andere Gruppe von COCs (die auf eine neue Verglasungsunterstützung geladen werden).
- Mit einer Kleinbohrpipette (z.B. einer Pasteurpipette, die auf einem Bunsenschnabel gezogen wird, um sie dünner zu machen – der Durchmesser sollte mindestens 200 m betragen), übertragen Sie eine (oder mehrere) COC(s) auf den Boden des ersten Brunnens.
- Vitrify COCs in VS in weniger als 90 Sekunden.
- Mit der gleichen Kleinbohrpipette, füllen Sie es mit 1VS, nehmen Sie die COCs von der Unterseite des ersten Brunnens (ES) und bewegen Sie sie an die Oberfläche des zweiten Brunnens (1VS).
- Waschen Sie die Pipette mit 1VS.
- Nehmen Sie die COCs und bewegen Sie sie in einem anderen Bereich (auf der Unterseite) des Brunnens; das sie umgebende Medium mit der Pipette vermischen.
- Füllen Sie die Pipette mit 1VS in einem anderen Bereich des Brunnens, nehmen Sie die COCs, bewegen Sie sie und mischen Sie das Medium um sie herum mit der Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4.4.
- Waschen Sie die Pipette mit 2VS.
- Nehmen Sie die COCs und bewegen Sie sie auf der Unterseite des dritten Brunnens (2VS); das sie umgebende Medium mit der Pipette vermischen.
- Füllen Sie die Pipette mit 2VS in einem anderen Bereich des Brunnens, nehmen Sie die COCs, bewegen Sie sie und mischen Sie das Medium um sie herum mit der Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4.8.
- Füllen Sie die Pipette mit 2VS in einem anderen Bereich des Brunnens, nehmen Sie die COCs und laden Sie sie auf den Streifen der Verglasungsstütze, so nah wie möglich an der Spitze. Aspirieren Sie überschüssiges Medium, um das Volumen von VS so weit wie möglich zu reduzieren.
- Tauchen Sie sofort die Verglasungsunterstützung in LN2ein, bewegen Sie sie. Schließen Sie es mit Hilfe einiger Klemmen, um sicherzustellen, dass es immer in LN2eingetaucht bleibt.
HINWEIS: Das richtige Timing zu halten ist aufgrund der kryoprotektoren Zelltoxizität von entscheidender Bedeutung. Aufgrund ihrer hohen Konzentration in Verglasungsmedien muss die Zellexposition auch durch einwandfreie Ausführung der Technik21kontrolliert werden. Wenn Proben reichlich vorhanden sind, sollten Sie sie teilen, um sie schneller zu verarbeiten und die Zeit von der Eizellensammlung bis zur Vitrifizierung zu minimieren.
- Bewahren Sie die geladenen Verglasungsstützen in einem Kelbeschunge auf und bewahren Sie sie bis zur Erwärmung in einem LN2-Tank auf.
HINWEIS: Alle vorherigen Schritte des Protokolls können auch unter Feldbedingungen angewendet werden, wenn LN2 verfügbar ist. Ein Trockenversender wird notwendig sein, um die Proben sicher ins Labor zu transportieren und dann mit den folgenden Phasen fortzufahren.
3. Erwärmung
- Bereiten Sie wärmende Medien vor.
- Bereiten Sie auftauende Lösung (TS) mit 1 M Saccharose in Medium 199, mit 20% FBS.
- Bereiten Sie Verdünnungslösung (DS) mit 0,5 M Saccharose in Medium 199, mit 20% FBS vor.
- Bereiten Sie Waschlösung (WS) mit Medium 199 mit 20% FBS.
- Vor gebrauchen TS auf 38 °C und DS und WS bei RT aufwärmen.
- Bereiten Sie ggf. das Kulturmedium auf die spätere Anwendung erwärmter COCs (z. B. In-vitro-Reifung, IVM) vor.
- Stellen Sie die Heizbühne in der Nähe des Stereomikroskops auf und schalten Sie sie ein (38 °C). Legen Sie den Deckel einer Petrischale zum Aufwärmen.
- Wenn alles fertig ist, übertragen Sie die Verglasungsstützen, die aus dem Lagertank erwärmt werden müssen, auf eine Box mit LN2, und legen Sie die Box in der Nähe des Stereomikroskops.
- Bereiten Sie die "Repro-Platte" vor. Bereiten Sie eine Zeile für jede Verglasungsunterstützung vor, die erwärmt werden muss.
- Fügen Sie 300 l DS auf der Unterseite des ersten Brunnens hinzu.
- Fügen Sie 300 L WS auf der Unterseite des zweiten (d. h. 1WS) und dritten (d. h. 2WS) Brunnen hinzu.
- Machen Sie einen Tropfen TS (100 l) auf den Deckel der Petrischale.
- Öffnen Sie mit Klemmen eine Verglasungsstütze im LN2.
- Legen Sie den TS-Tropfen unter das Stereomikroskop und nehmen Sie mit einer schnellen Bewegung die Verglasungsunterstützung des LN2 und tauchen Sie ihren Streifen in den Tropfen ein, indem Sie ihn bewegen, bis sich alle COCs lösen. Entfernen Sie die Unterstützung aus dem Drop, sobald sie leer ist, aber lassen Sie die COCs in TS insgesamt 1 Minute (vom Eintauchen bis zum folgenden Schritt).
- Nehmen Sie eine Pipette ähnlich der für die Verglasung verwendet und füllen Sie sie mit DS. Nehmen Sie die COCs aus dem Tropfen (TS) und verschieben Sie sie auf den Boden des ersten Brunnens (DS). Warten Sie 3 Minuten.
- Waschen Sie die Pipette mit 1WS. Nehmen Sie die COCs und bewegen Sie sie auf der Unterseite des zweiten Brunnens (1WS). Warten Sie 5 Minuten.
- Waschen Sie die Pipette mit 2WS. Nehmen Sie die COCs und bewegen Sie sie auf der Oberfläche des dritten Brunnens (2WS). Warten Sie, bis sie den Boden des Brunnens berühren.
- Wiederholen Sie Schritt 3.11 mit einem anderen Bereich des Brunnens.
- Die Pipette mit Kulturmedium waschen und die Eizellen für die folgende Verwendung (z.B. IVM) in die Kulturschale bewegen.
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Representative Results
Nach der Verglasung und Erwärmung der Katze nach dem vorliegenden Protokoll (Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 1) überlebt die überwiegende Mehrheit der Gameten. Nach der Vitrifizierung kann unter anderem die Lebensfähigkeit am optischen Mikroskop als morphologische Integrität22 oder unter Verwendung von vitalen Flecken bewertet werden. Eines der letzteren ist Fluorescein-Diacetat/Propidiumiodid (FDA/PI), das die Identifizierung lebensfähiger (hellgrüner Fluoreszenz) und abgestorbener Zellen (rote Fluoreszenz) ermöglicht. Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Bild von verglast-gewärmten Katzen-COCs, die direkt nach der Erwärmung mit FDA/PI gefärbt sind. Daten aus den Experimenten, die den Überlebensprozentsatz nach der Verglasung belegen, sind in Tabelle 1dargestellt, die Daten nach der Erwärmung von Eizellen zeigt, die für die In-vitro-Reifung bestimmt sind17 oder die In-vitro-Embryoproduktion16. Insgesamt überlebten in den beiden Hierverwendeten Experimente16,17, 395 von 435 Eizellen, die insgesamt 90,8 % nach der Erwärmung erreichten.
Nach der Erwärmung können jedoch einige morphologische Veränderungen festgestellt werden (Abbildung 3). In Gameten, die nach diesem Protokoll verglast-gewärmt sind, sind die häufigsten morphologischen Anomalien Veränderungen in der Ooplasmaform und -granulation, teilweiser (oder selten vollständiger) Verlust von Cumuluszellen und (selten) Zona-Pellucida-Frakturen. Auf der anderen Seite können diese verglasten COCs, wie in unseren früheren Arbeiten über die Verglasung mit der gleichen Unterstützung über mindestvolumen berichtet wurde,17 reifen und sich in vitro16zu Embryonen entwickeln, wenn auch mit niedrigeren Raten als frische COCs. Darüber hinaus stellen sie in der Regel keine Zona-Pellucida-Härtung dar (was eine weitere bekannte Folge der Kryokonservierung ist), da die In-vitro-Fertilisation (IVF) erfolgreich ist16.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls zur Verglasung und Erwärmung der Eizelle.
Vollständige Angaben finden Sie im Manuskripttext. COCs= Cumulus-Oozyten-Komplexe; ES=Ausgleichslösung; VS=Verglasungslösung; TS=Auftaulösung; DS=Verdünnungslösung; WS=Waschlösung; LN2=flüssiger Stickstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Lebensfähigkeit verglaster Katzenoozyten nach Erwärmung.
Verglaste Cumulus-Oozyten-Komplexe, die mit Fluorescein-Diacetat/Propidiumjodid (FDA/PI) gefärbt sind, zeigen grüne Fluoreszenz, wenn sie lebensfähig sind (A) oder rote oder schwache Fluoreszenz, wenn sie tot sind (B). Anregungs-/Emissionswellenlängen: 495 nm/517 nm für FDA; 538 nm/617 nm für PI. Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Leichte Mikrographien von frischen und verglasten Katzenoozyten.
(A) Frische Cumulus-Oozyten-Komplexe nach der Entnahme, vor der Vitrifizierung. (B) Verglaste Cumulus-Oozyten-Komplexe nach der Erwärmung, die einige Vitrifizierungs-induzierte Verletzungen zeigen (Änderungen in der Form und Verlust von Cumuluszellen, schwarzer Pfeil). Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Experiment | Gruppe | Erwärmte Eizellen (n) | Lebensfähige Eizellen (n) | Lebensfähigkeit (%) | Lebensfähigkeit (mittlerer % bei SD) |
| 1† | 1 | 13 | 12 | 92.31 | 91,54 € 3,66 |
| 2 | 47 | 44 | 93.62 | ||
| 3 | 52 | 45 | 86.54 | ||
| 4 | 26 | 24 | 92.31 | ||
| 5 | 41 | 40 | 97.56 | ||
| 6 | 21 | 19 | 90.48 | ||
| 7 | 50 | 44 | 88.00 | ||
| 2‡ | 1 | 17 | 17 | 100.00 | 91,51 € 9,16 |
| 2 | 17 | 17 | 100.00 | ||
| 3 | 9 | 8 | 88.89 | ||
| 4 | 21 | 21 | 100.00 | ||
| 5 | 30 | 23 | 76.67 | ||
| 6 | 26 | 23 | 88.46 | ||
| 7 | 17 | 13 | 76.47 | ||
| 8 | 10 | 10 | 100.00 | ||
| 9 | 15 | 14 | 93.33 | ||
| 10 | 23 | 21 | 91.30 |
Tabelle 1: Repräsentative Ergebnisse der Lebensfähigkeit in verglast-gewärmten Eizellen. Daten von "Colombo et al. 201916" und "Colombo et al. 202017"
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentatives Bild der stützen, die für die Eizellenverglasung verwendet werden. Die kommerzielle Unterstützung misst 13 cm und ist einfach zu handhaben und zu lagern. Oozyten müssen auf den dünnen Kunststoffstreifen an der Oberseite des Geräts geladen werden, so nah wie möglich an der schwarzen Markierung in der Nähe der Spitze. Copyright: Kitazato Corporation. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Oocyte Kryokonservierung ist eine entscheidende Keimplasma-Konservierungstechnik, vor allem in Taxa, wo viele Arten gefährdet sind, wie Felidae Familie. In diesem Manuskript wurde ein einfaches und feldfreundliches Protokoll zur Verglasung unreifer Katzenoozyten vorgestellt. Labormittel, minimale Volumenverglasungsstützen und geschultes Personal sind die Schlüsselfaktoren für den Erfolg dieser Methode, die es ermöglicht, lebensfähige Eizellen konsequent und wiederholt zu erhalten, wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen.
Beginnend mit der Medienvorbereitung sollte das Protokoll genau befolgt werden, um die besten Ergebnisse zu gewährleisten, aber die Fähigkeiten des Bedieners sind das Hauptproblem. Die Medien sollten am selben Tag des Verglasungsvorgangs vorbereitet werden, oder, wenn dies nicht möglich ist, sollten sie am Vortag vorbereitet und bei 4 °C gelagert werden. In jedem Fall sollte vor der Probenverarbeitung genügend Zeit gelassen werden, damit sich die Lösungen auf RT erwärmen können. Oozytensammlung und COCs-Auswahl sind schnelle und einfache Verfahren, die routinemäßig von jedem ARTs-Labor durchgeführt werden. Die Kryokonservierung ist jedoch das heikelste Verfahren. Während das Erwärmungsverfahren nicht so kritisch ist, wenn das Protokoll und die Timings befolgt werden, könnte die Verglasung komplexer sein. Nach dem Gleichgewicht, bei dem nur bei der Einhaltung der Zeitpläne Vorsicht geboten ist, dürfte die schwierigste Phase der Verglasungsschritt sein (siehe 2.4. des vorliegenden Protokolls). In der Tat müssen Eizellentransfers und Pipettenwäschen gut getimt und zusammen in weniger als 90 Sekunden durchgeführt werden. Für Anfänger ist es ratsam, die Prozedur mit einer Stoppuhr während des Trainings zu terminieren, während auch für trainierte Personen könnte es nützlich sein, einen Timer nach 60 Sekunden als Warnung zu haben, dass die Zeit läuft. Darüber hinaus würde dies eine höhere Standardisierung ermöglichen, da Betreiber, die Gruppen von 6-8 COCs verherrlichen, nahe an der Übertragung der Eizellen vom zweiten auf den dritten Brunnen der Repro-Platte (siehe Schritt 2.4.7 des vorliegenden Protokolls) sein sollten, wenn der Alarm erlischt. Hoffentlich könnte mit Hilfe dieses Artikels eine höhere Standardisierung zwischen Einzelpersonen und zwischen Laboratorien erreicht werden.
Die wesentlichen Einschränkungen des Protokolls bleiben die intrinsischen Merkmale der Kryokonservierungsverfahren selbst. Wie bereits erwähnt, Vitrifikation setzt Eizellen nicht-physiologischen und potenziell schädlichen Bedingungen aus, auch wenn sie einwandfrei durchgeführt wird. Die Inkubation mit Kryoprotektoren und die Abnahme der Temperatur sind die kritischsten Ereignisse20 und sie müssen unter strenger Kontrolle gehalten werden. Zu den häufigsten Kryoverletzungen gehören einige leicht am optischen Mikroskop zu beobachten (z. B. Cumuluszellverlust, Veränderung der zellulären Form und Größe), während andere nicht sichtbar sind und oft subzelluläre Strukturen beeinflussen (z.B. Zona-Pellucida-Härtung, oxidativer Stress, Zytoskelettschäden, meiotische Spindel und DNA-Änderungen)23,24. Obwohl sie meist lebensfähig sind, stellen COCs, die nach diesem Protokoll verglast sind, oft einige offensichtliche morphologische Anomalien nach der Erwärmung dar. Es gibt jedoch keinen Zusammenhang zwischen Morphologie und Lebensfähigkeit, die auch durch subzelluläre Schäden behindert werden könnte3,25, aber morphologische Veränderungen sind wahrscheinlich eine Folge von Kryoverletzungen und teilweise ein Grund für die in vitro Entwicklungsergebnisse von verglasten Oozyten, die ziemlich schlecht sind, wenn sie mit denen von frischen Eizellen verglichen werden. Die sorgfältige Vorbereitung der Verglasungsmedien und die genaue Beobachtung des Protokollzeitpunkts tragen dazu bei, eine gute Lebensfähigkeit nach der Erwärmung und eine morphologische Integrität zu erhalten, aber Verbesserungen bei der weiteren In-vitro-Reifung von Eizellen und der Embryoentwicklung sind noch erforderlich, da die Lebensfähigkeit während der folgenden Kultur oft abnimmt16.
Kältebedingte Verletzungen treten leider bei jeder Kryokonservierungsmethode24auf. Die in diesem Protokoll verwendete minimale Volumenverglasungsunterstützung wurde entwickelt, um das Verglasungsvolumen so weit wie möglich zu reduzieren, was zu besseren Kühl- und Erwärmungsraten im Vergleich zu anderen Kryokonservierungsgeräten führt (-23.000 °C/Minute bzw. 42.000 °C/Minute, gemäß den Herstellerspezifikationen). Infolgedessen sind in der Humanmedizin, wo klinische Studien zur Beurteilung sowohl der In-vitro-Studie (d. h. der Befruchtung und der Embryoentwicklung) als auch der In-vivo-Parameter (d. h. Schwangerschaftsraten und Lebendgeburten) verfügbar sind, die kleinste Volumenverglasung aufgrund ihrer unvergleichlichen Ergebnisse in Bezug auf das Überleben nach der Erwärmung und schließlich lebender Geburten12 von verglasten reifen menschlichen Oozyten die häufigste Wahl für die Nozytenkryokonservierung. Darüber hinaus ist die in diesem Protokoll verwendete Vitrifizierungsvorrichtung im Vergleich zu anderen Verglasungsgeräten einfacher zu bedienen und sicherer zu speichern12, da sie bequem zu handhaben ist und während der Lagerung durch eine Kappe geschützt ist. Zum Beispiel ist der Cryoloop auch eine effiziente Unterstützung, um das minimale Volumenziel zu erreichen, aber seine Struktur (eine Schleife, die einen Lösungsfilm unterstützt, auf dem die Eizellen geladen sind) ist zerbrechlich und anfällig für versehentliche Erwärmung12. Strohhalme (0,25 ml Volumen) oder offen gezogene Strohhalme (OPS) können auch verwendet werden, aber sie erlauben keine signifikante Verringerung des Verglasungsvolumens und sind auch schwierig zu füllen und zu leeren, da einige Eizellen verloren gehen könnten26. Viele andere Stützen wurden2entwickelt, aber jede von ihnen hat ihre Nachteile. Stattdessen, im Vergleich zum langsamen Einfrieren, das bisher die am häufigsten verwendete Kryokonservierungstechnik war, sind die Hauptvorteile der minimalen Volumenverglasung auf kommerziellen Stützen seine Machbarkeit und Geschwindigkeit. Wie bereits erwähnt, erfordert die Verglasung keine programmierbare Tiefkühltruhe, und während das langsame Einfrieren von Eizellen etwa anderthalb Stunden dauert, um25abgeschlossen zu werden, kann die Verglasung in etwa 17 Minuten nach dem vorliegenden Protokoll durchgeführt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Personalkenntnisse und die Standardisierung der Betreiber die anspruchsvollsten Anforderungen bei der Gründung einer verglasten Eizellenbank sein könnten, aber sie werden mit personalgeschulter Ausbildung erreicht. Dieses minimale Volumenverglasungsprotokoll für unreife Oozyten von Katzen liefert konsistente und wiederholbare Ergebnisse, wenn es von erfahrenen Operatoren durchgeführt wird. Es gibt jedoch immer noch Chancen auf eine Verbesserung der Oozytenentwicklungsraten, auch wenn die Lebensfähigkeit und Integrität nach der Erwärmung zufriedenstellend sind. Mit einer weiteren Optimierung könnte das vorliegende Protokoll auch unter Feldbedingungen für Wildfelide angewendet werden, für die veröffentlichte Daten zur Eizellenkryokonservierung noch knapp sind27. Eine Ausweitung der Anwendung dieser Methode würde nicht nur die Möglichkeit erhöhen, die Kryokonservierungsprotokolle zu verbessern, sondern auch die Einrichtung verglaster Eizellenbiobanken für die Fruchtbarkeit und die Erhaltung der biologischen Vielfalt in Feliden ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 und von der Université degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Wir danken auch Dr. MariaGiorgia Morselli für ihren Beitrag zu den hierdargestellten Experimenten und zur Bildaufnahme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
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