Summary
Este manuscrito descreve um protocolo para a vitrificação de volume mínimo de oócitos imaturos de gatos com mídias de laboratório sobre suportes comerciais. Abrange cada passo desde o isolamento oócito desde gônias ex vivo até vitrificação e aquecimento.
Abstract
Nos programas de conservação de animais silvestres, o gamete banking é crucial para salvaguardar os recursos genéticos de indivíduos valiosos e espécies raras e promover a preservação da biodiversidade. Em felids, a maioria das espécies está ameaçada de extinção, e raças domésticas são usadas como modelo para aumentar a eficiência dos protocolos para o banco de germoplasma. Entre as técnicas de criopreservação oócito, a vitrificação é cada vez mais popular na reprodução assistida humana e veterinária. A vitrificação crioto, que foi inicialmente desenvolvida para oócitos e embriões humanos, demonstrou ser adequada para oócitos de gatos. Este método oferece diversas vantagens, como a viabilidade em condições de campo e a velocidade do procedimento, que pode ser útil quando várias amostras precisam ser processadas. No entanto, a eficiência depende fortemente das habilidades do operador, sendo necessária a padronização intra e interseção de laboratório, bem como o treinamento de pessoal. Este protocolo descreve a vitrificação de volume mínimo de oócitos felinos imaturos em um suporte comercial em um protocolo passo a passo amigável ao campo, da coleta de oócitos ao aquecimento. Seguindo o protocolo, preservação da integridade do oócito e viabilidade no aquecimento (até 90%) pode-se esperar, embora ainda haja espaço para melhorias no amadurecimento pós-aquecimento e resultados de desenvolvimento embrionário.
Introduction
A criopreservação tornou-se um passo fundamental das técnicas de reprodução assistida (ARTs). Em humanos, permite a preservação da fertilidade ou adiamento da paternidade por razões médicas ou pessoais. Em animais, é necessário superar a distância e o tempo em acasalamentos planejados, especialmente em animais de fazenda e animais de estimação, ou preservar material genético de indivíduos valiosos em programas de conservação, particularmente em espécies selvagens ameaçadas de extinção. A criopreservação gamete é a melhor escolha quando os indivíduos a serem criados ainda não foram escolhidos ou a fim de evitar questões éticas associadas ao congelamento de embriões, especialmente na medicina humana1. Espermatozoides são relativamente fáceis de preservar e dar resultados satisfatórios após o descongelamento, mas os oócitos, devido às suas características estruturais, podem ser mais complexos de armazenar. De fato, a baixa relação superfície/volume, bem como a presença da zona pellucida em torno do ooplasma, limita o movimento dos crioprotetores e da água através da célula2. Além disso, em animais domésticos, incluindo felídeos, eles são caracterizados por um citoplasma rico em lipídios, que é pensado para torná-los mais sensíveis à criopreservação3.
A maioria dos felídeos estão ameaçados, e o gato doméstico é usado como modelo para desenvolver protocolos de preservação de germoplasma graças à disponibilidade de gôndas da ovariectomia de rotina. Em animais selvagens, as gônadas podem ser obtidas após cirurgias eletivas ou (mais frequentemente) pós-mortem, e gametas imaturos (vesícula germinal) podem ser recuperados. A estimulação hormonal destinada à obtenção de oócitos maduros (metafase II) não é tão comum quanto nos ARTs humanos devido às questões éticas e à resposta específica da espécie e individual aos tratamentos4.
Portanto, o desenvolvimento de estratégias de criopreservação tem focado em gametas imaturos, que geralmente podem ser recuperados após a morte inesperada ou súbita de indivíduos raros. Do ponto de vista biológico, há algumas diferenças na criopreservação de gametas imaturos ou maduros, cada um tendo suas vantagens. Em primeiro lugar, o DNA é mais protegido em oócitos imaturos, cuja vesícula germinal contém cromossomos cercados por uma membrana nuclear, enquanto o fuso meiotic de oócitos metafase II poderia ser mais vulnerável aos crioinjuutos5. Em segundo lugar, os danos causados pelo citoesqueleto induzido a frio podem afetar a rotação do fuso, extrusão do corpo polar, migração pronuclear e citocinese, que podem ter diferentes impactos de acordo com a fase de desenvolvimento do oócito, influenciando a progressão da meiose ou eventos pós-fertilização. Finalmente, e talvez o mais importante, enquanto os oócitos maduros estão prontos para serem fertilizados, os gametas imaturos contam com o apoio das células cumulus circundantes para passar pela maturação nuclear e citoplasmática6, e esta é a razão pela qual todos os complexos cumulus-oócitos (COCs) são criopreservados. No entanto, a perda de células cumulus e/ou a perda de conexão funcional entre o gamete e as células somáticas circundantes são provavelmente o efeito mais prejudicial da criopreservação de COCs imaturos.
Entre as técnicas de criopreservação, a vitrificação é uma que pode ser aplicada mais facilmente em condições de campo. Em comparação com o congelamento lento (ou taxa controlada), a vitrificação é mais rápida e não requer equipamentos específicos, como um freezer programável. Para satisfazer os três princípios fundamentais da vitrificação (ou seja, alta viscosidade, ligada à alta concentração crioprotetora, pequenos volumes e diminuição da temperatura ultrarrápida), vários meios de comunicação e suportes têm sido desenvolvidos e usados especialmente em gatos para oócitos imaturos e maduros. Começando com canudossimples 7, os dispositivos foram então desenvolvidos para atingir a meta de "volume mínimo". Cryoloop8, canudos abertos puxados (OPS)9,calhas plásticas (palha modificada)10 e criotubos11 foram utilizados, até que um dispositivo mais eficiente (ou seja, Cryotop) foi empregado11, melhorando a sobrevivência e a retomada da meiase. Cryotop (Figura Suplementar 1) é um suporte comercialmente disponível que se tornou o sistema aberto eletivo para vitrificação. Desenvolvido para a vitrificação de oócitos e embriões humanos, consiste em uma pequena tira de filme presa a um suporte plástico duro, protegido por uma tampa de tubo de plástico durante o armazenamento12. Graças à sua usabilidade e à redução extrema do volume de vitrificação (apenas 0,1 μL), o que também leva a taxas de resfriamento e aquecimento extremamente rápidas, esse suporte de vitrificação tem sido cada vez mais aplicado em várias espécies, incluindo o gato doméstico, no qual tem sido usado com uma variedade de mídia13,14,,15,,16,,17.
O objetivo deste manuscrito é descrever um protocolo de coleta-vitrificação-aquecimento, com pequenas modificações daquela originalmente desenvolvida para oócitos humanos, que emprega mídias de laboratório e suportes comerciais para vitrificação de volume mínimo e pode ser facilmente aplicada em condições de campo para a criopreservação de COCs felinos imaturos.
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Protocol
Os procedimentos por este meio descritos não passaram por aprovação ética, uma vez que os ovários dos gatos foram coletados em clínicas veterinárias como subprodutos da ovariectomia de rotina ou ovariohisterectomia solicitada pelo proprietário.
1. Coleção Oócito
- Antes de iniciar os experimentos, prepare soluções para coleta de ovário e oócito. Prepare a solução de coleta de ovário com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) com uma mistura de antibióticos e antimicóticos (100 UI/mL de sódio penicilina G, 0,1 mg/mL de sulfato de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotônio B). Preparar solução de coleta de oócito (ou seja, PBS/PVA) com PBS com 100 UI/mL de sódio penicilina G, 0,1 mg/mL de sulfato de estreptomicina e 0,1% (w/v) álcool polivinyl (PVA).
- Armazene soluções para coleta de ovário e oócito a 4 °C até o uso.
- No dia do spaying das rainhas, poucas horas antes de processar as amostras, pegue parte das soluções de coleta de ovário e oócito e deixe-as aquecer à temperatura ambiente (RT; 25 ± 2 °C).
- Quando as amostras chegam ao laboratório, isole os ovários do tecido conjuntivo circundante e do oviduto e lave-os em meio de coleta de ovário fresco em uma placa de Petri.
- Encha uma placa de Petri de 35 mm para cada rainha com cerca de 3 mL de RT PBS/PVA, e mais uma placa para coletar os oócitos.
- Coloque um par de ovários em uma placa de Petri e pique o córtex com um bisturi cirúrgico. Certifique-se de que todos os folículos foram quebrados com a ajuda de um estereomicroscópio (ampliação 8x).
- Colete COCs com uma pipeta e mova-os em PBS/PVA fresco na placa de Petri alocada. Selecione cocs de boas qualidades, com um citoplasma vergestêm e escuro e cercado por várias camadas compactas de células cumulus (grau I18).
2. Vitrificação
- Prepare os meios de equilíbrio e vitrificação.
- Prepare a solução de equilíbrio (ES) com 7,5% (v/v) glicol de etileno (EG) e 7,5% (v/v) dimetilsulphoxida (DMSO) em Médio 199, com 20% de soro bovino fetal (FBS).
- Prepare a solução de vitrificação (VS) com 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO e 0,5 M de sacarose no Medium 199, com 20% de FBS (modificado a partir de 19).
- Deixe o ES e o VS aquecer em RT antes de usar.
NOTA: Os crioprotetores (por exemplo, EG, DMSO) são conhecidos por serem citotóxicos. Uma estratégia para combater sua toxicidade é reduzir a temperatura em que as células são expostas a elas20, e os oócitos são geralmente expostos a crioprotetores em RT. Assim, todo o procedimento, desde a coleta de oócito até a vitrificação, é realizado na RT neste protocolo para evitar flutuações de temperatura.
- Prepare o prato de vitrificação (ou seja, um prato especial composto por seis poços cônicos divididos em duas linhas, conhecidos como "placa repro"). Prepare uma linha (três poços) para cada suporte de vitrificação.
- Adicione 20 μL de ES na parte inferior do primeiro poço.
- Adicione 300 μL de VS na parte inferior do segundo (ou seja, 1VS) e terceiro (ou seja, 2VS).
- CoCs de equilíbrio em ES.
- Com uma pipeta de furo pequeno (por exemplo, uma pipeta Pasteur puxada em um bico bunsen para torná-lo mais fino – diâmetro deve ser de pelo menos 200 μm), transferir um (ou mais) COC(s) na parte inferior do primeiro poço.
NOTA: Escolha o tamanho da pipeta de acordo com o número de camadas de células cumulus ao redor dos oócitos, de modo às dimensões dos COCs, visando reduzir o máximo possível o volume de mídia que é transferido com COCs em cada etapa. Com o protocolo atual, os operadores treinados podem vitrify com sucesso até oito COCs felinos por cada suporte de vitrificação. - Adicione lentamente 20 μL de ES na borda da queda. Espere por 3 minutos.
- Adicione lentamente outros 20 μL de ES na borda da queda. Espere por 3 minutos.
- Adicione lentamente 240 μL de ES na borda da queda. Espere por 9 minutos.
- Enquanto espera, prepare uma caixa com nitrogênio líquido (LN2),rotule um suporte de vitrificação com o código de identificação de experimento/gato e deixe-o aberto. Coloque ambos perto do estereóscópio, para que possam ser facilmente alcançáveis durante o trabalho.
Cuidado! Use equipamentos de proteção individual ao manusear LN2. - Alternativamente, se vários COCs tiverem que ser vitrificados, inicie a primeira etapa de equilíbrio (ver passo 2.3.1 - 2.3.2) para outro grupo de COCs (que será carregado em um novo suporte de vitrificação).
- Com uma pipeta de furo pequeno (por exemplo, uma pipeta Pasteur puxada em um bico bunsen para torná-lo mais fino – diâmetro deve ser de pelo menos 200 μm), transferir um (ou mais) COC(s) na parte inferior do primeiro poço.
- CoCs vitrify em VS em menos de 90 segundos.
- Usando a mesma pipeta de furo pequeno, preencha-a com 1VS, pegue os COCs da parte inferior do primeiro poço (ES) e mova-os para a superfície do segundo poço (1VS).
- Lave a pipeta com 1VS.
- Pegue os COCs e mova-os em outra área (na parte inferior) do poço; misturar o meio ao seu redor com a pipeta.
- Encha a pipeta com 1VS em outra área do poço, pegue os COCs, mova-os e misture o meio ao seu redor com a pipeta.
- Repita o passo 2.4.4.
- Lave a pipeta com 2VS.
- Pegue os COCs e mova-os para o fundo do terceiro poço (2VS); misturar o meio ao seu redor com a pipeta.
- Encha a pipeta com 2VS em outra área do poço, pegue os COCs, mova-os e misture o meio ao seu redor com a pipeta.
- Repita o passo 2.4.8.
- Encha a pipeta com 2VS em outra área do poço, pegue os COCs e carregue-os na faixa do suporte de vitrificação, o mais perto possível da ponta. Aspirar o excesso médio para reduzir o volume de VS tanto quanto possível.
- Mergulhe imediatamente o suporte de vitrificação na LN2,movendo-a. Feche-o com a ajuda de alguns grampos, certificando-se de que ele sempre permanece imerso na LN2.
NOTA: Manter o tempo certo é crucial devido à toxicidade celular crioprotetora. Devido à sua alta concentração nos meios de vitrificação, a exposição celular precisa ser controlada, também pela execução impecável da técnica21. Se as amostras forem abundantes, considere dividi-las para processá-las mais rapidamente e minimizar a quantidade de tempo desde a coleta de oócito até a vitrificação.
- Armazene os suportes de vitrificação carregados em um cálice e mantenha-os em um tanque LN2 de armazenamento até o aquecimento.
NOTA: Todas as etapas anteriores do protocolo também podem ser aplicadas em condições de campo se a LN2 estiver disponível. Um navio seco será necessário para transportar as amostras para o laboratório com segurança e, em seguida, prosseguir lá com as seguintes fases.
3. Aquecimento
- Prepare a mídia de aquecimento.
- Prepare a solução de descongelamento (TS) com 1 M de sacarose no Medium 199, com 20% de FBS.
- Prepare a solução de diluição (DS) com sacarose de 0,5 M no Médio 199, com 20% de FBS.
- Prepare a solução de lavagem (WS) com o Medium 199 com 20% de FBS.
- Antes de usar, aqueça TS a 38 °C e DS e WS na RT.
- Se necessário, prepare o meio de cultura para o uso subsequente de COCs aquecidos (por exemplo, maturação in vitro, IVM).
- Coloque o estágio de aquecimento perto do estereóscópio e ligue-o (38 °C). Coloque a tampa de uma placa de Petri para aquecer.
- Quando tudo estiver pronto, transfira os suportes de vitrificação que devem ser aquecidos do tanque de armazenamento para uma caixa com LN2, e coloque a caixa perto do estereóscópio.
- Prepare a "placa Repro". Prepare uma linha para cada suporte de vitrificação que tem que ser aquecido.
- Adicione 300 μL de DS na parte inferior do primeiro poço.
- Adicione 300 μL de WS na parte inferior do segundo (ou seja, 1WS) e terceiro (ou seja, 2WS).
- Faça uma gota de TS (100 μL) na tampa da placa de Petri.
- Com grampos, abra um suporte de vitrificação na LN2.
- Coloque a gota TS sob o estereótipo e com um movimento rápido pegue o suporte de vitrificação da LN2 e mergulhe sua tira na gota, movendo-a até que todos os COCs se desprendem. Remova o suporte da queda assim que estiver vazio, mas deixe os COCs em TS por 1 minuto no total (da imersão até a etapa seguinte).
- Pegue uma pipeta semelhante à usada para vitrificação e preencha-a com DS. Pegue os COCs da gota (TS) e mova-os para o fundo do primeiro poço (DS). Espere por 3 minutos.
- Lave a pipeta com 1WS. Pegue os COCs e mova-os para o fundo do segundo poço (1WS). Espere por 5 minutos.
- Lave a pipeta com 2WS. Pegue os COCs e mova-os na superfície do terceiro poço (2WS). Espere que eles toquem no fundo do poço.
- Repita o passo 3.11 usando outra área do poço.
- Lave a pipeta com meio de cultura e mova os oócitos para o prato de cultura para o seguinte uso (por exemplo, IVM).
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Representative Results
Seguindo a vitrificação e o aquecimento do oócito do gato de acordo com o presente protocolo (Figura 1 e Figura Suplementar 1), a grande maioria dos gametas sobrevivem. Após a vitrificação, entre outras técnicas, a viabilidade pode ser avaliada no microscópio óptico como integridade morfológica22 ou com o uso de manchas vitais. Um deles é o diacetato/dióceta de fluoresceína/iodeto de propídio (FDA/PI), que permite a identificação de células viáveis (fluorescência verde brilhante) e células mortas (fluorescência vermelha). A Figura 2 mostra uma imagem representativa de COCs de gato aquecidos vitrificados manchados com FDA/PI logo após o aquecimento. Os dados dos experimentos que mostram a porcentagem de sobrevivência após a vitrificação são relatados na Tabela 1, que retrata dados pós-aquecimento de oócitos destinados à maturação in vitro17 ou produção de embriões in vitro16. No geral, nos dois experimentos utilizados como exemplos aqui16,17, 395 dos 435 oócitos sobreviveram, marcando uma viabilidade global de 90,8% pós-aquecimento.
No entanto, algumas alterações morfológicas podem ser notadas após o aquecimento(Figura 3). Em gametas vitrified-aquecidos seguindo este protocolo, as anormalidades morfológicas mais frequentes são alterações na forma e granulação do ooplasma, perda parcial (ou, raramente, total) de células cumulus e (raramente) fraturas de zona pellucida. Por outro lado, como relatado em nossos trabalhos anteriores sobre vitrificação de volume mínimo com o mesmo suporte, esses COCs vitrificados podem amadurecer17 e desenvolver-se em embriões in vitro16, mesmo que a taxas mais baixas do que cocs frescos. Além disso, eles não costumam apresentar o endurecimento da zona pellucida (que é outra consequência bem conhecida da criopreservação), uma vez que a fertilização in vitro (FIV) é bem sucedida16.
Figura 1: Representação esquemática do protocolo de vitrificação oócito.
Consulte o texto do manuscrito para obter indicações completas. CoCs= complexos cumulus-oócitos; ES=solução de equilíbrio; SOLUÇÃO VS=vitrificação; Solução de descongelamento TS=; Solução de diluição DS=; Solução ws=lavagem; LN2=nitrogênio líquido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Viabilidade de oócitos de gato vitrificado após o aquecimento.
Os complexos de cumulus-oócito vitrificados manchados com diacetato de fluoresceína/iodeto propidium (FDA/PI) apresentam fluorescência verde quando viáveis(A) ou fluorescência vermelha ou fraca quando mortos(B). Comprimentos de onda de excitação/emissão: 495 nm/517 nm para FDA; 538 nm/617 nm para PI. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Micrografias leves de oócitos de gato frescos e vitrificados.
(A) Complexos frescos de cumulus-oócito após a coleta, antes da vitrificação. (B) Complexos de cumulus-oócito vitrificados após o aquecimento, mostrando algumas lesões induzidas por vitrificação (mudanças de forma e perda de células cumulus, seta preta). Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Experiência | Grupo | Oócitos aquecidos (n) | Oócitos viáveis (n) | Viabilidade (%) | Viabilidade (média % ± SD) |
| 1† | 1 | 13 | 12 | 92.31 | 91,54 ± 3,66 |
| 2 | 47 | 44 | 93.62 | ||
| 3 | 52 | 45 | 86.54 | ||
| 4 | 26 | 24 | 92.31 | ||
| 5 | 41 | 40 | 97.56 | ||
| 6 | 21 | 19 | 90.48 | ||
| 7 | 50 | 44 | 88.00 | ||
| 2‡ | 1 | 17 | 17 | 100.00 | 91,51 ± 9,16 |
| 2 | 17 | 17 | 100.00 | ||
| 3 | 9 | 8 | 88.89 | ||
| 4 | 21 | 21 | 100.00 | ||
| 5 | 30 | 23 | 76.67 | ||
| 6 | 26 | 23 | 88.46 | ||
| 7 | 17 | 13 | 76.47 | ||
| 8 | 10 | 10 | 100.00 | ||
| 9 | 15 | 14 | 93.33 | ||
| 10 | 23 | 21 | 91.30 |
Tabela 1: Resultados representativos de viabilidade em oócitos aquecidos por gatos. Dados de †Colombo et al. 201916 e ‡ Colombo et al. 202017.
Figura Suplementar 1: Imagem representativa dos suportes utilizados para vitrificação de oócitos. O suporte comercial mede 13 cm e é fácil de manusear e armazenar. Os ocitos devem ser carregados na fina tira de plástico na parte superior do dispositivo, o mais perto possível da marca preta perto da ponta. Direitos autorais: Kitazato Corporation. Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
A criopreservação de oócito é uma técnica crucial de conservação do germoplasma, especialmente em taxas onde muitas espécies estão ameaçadas de extinção, como a família Felidae. Neste manuscrito, foi apresentado um protocolo simples e amigável para a vitrificação de oócitos imaturos de gatos. Os meios de comunicação laboratoriais, suportes mínimos de vitrificação de volume e pessoal treinado são os fatores-chave para o sucesso deste método, o que permite a obtenção de oócitos viáveis de forma consistente e repetida, como mostram os resultados representativos relatados.
Começando com a preparação da mídia, o protocolo deve ser seguido com precisão para garantir os melhores resultados, mas as habilidades do operador são o principal problema. Os meios de comunicação devem ser preparados no mesmo dia do procedimento de vitrificação, ou, se isso não for possível, devem ser preparados no dia anterior e armazenados a 4 °C. De qualquer forma, antes do processamento da amostra, deve-se ter tempo suficiente para permitir que as soluções se aqueçam à coleta de Oócitos e à seleção de COCs são procedimentos rápidos e simples que são rotineiramente realizados por todos os laboratórios de ARTs. No entanto, a criopreservação é o procedimento mais delicado. Embora o procedimento de aquecimento não seja tão crítico, se o protocolo e os tempos forem seguidos, a vitrificação pode ser mais complexa. Após o equilíbrio, no qual deve ser tomado cuidado apenas no respeito aos tempos, a fase mais desafiadora provavelmente será a etapa de vitrificação (ver 2.4. do presente protocolo). De fato, as transferências de oócitos e as lavagens de pipetas precisam ser bem cronometrados e, todos juntos, realizados em menos de 90 segundos. Para iniciantes, é aconselhável cronometrar o procedimento com um cronômetro durante o treinamento, enquanto também para indivíduos treinados pode ser útil ter um temporizador apitando após 60 segundos como um alerta de que o tempo está se esgotando. Além disso, isso permitiria uma maior padronização, uma vez que os operadores que vitrificam grupos de 6-8 COCs devem estar próximos da transferência dos oócitos do segundo para o terceiro poço da placa Repro (ver passo 2.4.7 do protocolo atual) quando o alarme disparar. Esperamos que, com o auxílio deste artigo, possa ser alcançada uma maior padronização entre indivíduos e entre laboratórios.
As principais limitações do protocolo continuam sendo as características intrínsecas dos próprios procedimentos criopreservadores. Como observado anteriormente, a vitrificação expõe oócitos a condições não fisiológicas e potencialmente prejudiciais, mesmo que seja realizada de forma impecável. A incubação com crioprotetores e a diminuição da temperatura são os eventos mais críticos20 e precisam ser mantidos sob controle rigoroso. Entre os crioinjuus mais comuns, alguns são facilmente observáveis no microscópio óptico (por exemplo, perda de célula cumulus, alteração da forma e tamanho celular), enquanto outros não são visíveis e frequentemente afetam estruturas subcelulares (por exemplo, endurecimento da zona pellucida, estresse oxidativo, danos ao citoesqueleto, fuso meiotico e alterações de DNA)23,24. Embora mais viável, os COCs vitrificados seguindo este protocolo frequentemente apresentam algumas anomalias morfológicas evidentes após o aquecimento. No entanto, não há correlação entre morfologia e viabilidade, que também pode ser dificultada por causa de danos subcelulares3,25, mas alterações morfológicas são provavelmente uma consequência de crioinjuries e parcialmente uma razão para os desfechos in vitro de desenvolvimento de oócitos vitrificados, que são bastante pobres se comparados com os de oócitos frescos. A preparação cuidadosa dos meios vitrificação e a observação precisa do tempo de protocolo contribuem para obter uma boa viabilidade pós-aquecimento e integridade morfológica, mas ainda são necessárias melhorias na maturação in vitro de oócitos e desenvolvimento de embriões, uma vez que a viabilidade muitas vezes diminui durante a culturaseguinte 16.
Lesões induzidas a frio infelizmente ocorrem a cada método de criopreservação24. O suporte mínimo de vitrificação de volume utilizado neste protocolo foi desenvolvido para reduzir o volume de vitrificação o máximo possível, resultando em melhores taxas de resfriamento e aquecimento em comparação com outros dispositivos criopreservadores (-23.000 °C/minuto e 42.000 °C/minuto, respectivamente, de acordo com as especificações do fabricante). Como consequência, na medicina humana, onde estudos clínicos que avaliam tanto in vitro (ou seja, fertilização e desenvolvimento de embriões) quanto parâmetros in vivo (ou seja, taxas de gravidez e nascidos vivos) estão disponíveis, a vitrificação de volume mínimo é a escolha mais comum para a criopreservação de oócitos devido aos seus resultados incomparáveis em termos de sobrevivência pós-aquecimento e, finalmente, nascidos vivos12 de oocessidade maduras vitrificadas. Além disso, em comparação com outros dispositivos de vitrificação, o usado neste protocolo é mais fácil de usar e mais seguro de armazenar12, já que é confortável de manusear e é protegido por uma tampa durante o armazenamento. Por exemplo, o Cryoloop também é um suporte eficiente para atingir a meta de volume mínimo, mas sua estrutura (um loop que suporta um filme de solução em que os oócitos são carregados) é frágil e propensa ao aquecimento acidental12. Canudos (volume de 0,25 mL) ou canudos puxados abertos (OPS) também podem ser usados, mas não permitem uma redução significativa no volume de vitrificação e também são desafiadores para encher e esvaziar, pois alguns oócitos podem ser perdidos26. Muitos outros suportes foram desenvolvidos2,mas cada um deles tem suas desvantagens. Em vez disso, em comparação com o congelamento lento, que anteriormente era a técnica de criopreservação mais utilizada, as principais vantagens da vitrificação de volume mínimo em suportes comerciais são sua viabilidade e velocidade. Como mencionado anteriormente, a vitrificação não requer um freezer programável para ser realizado, e enquanto o congelamento lento de oócitos leva cerca de uma hora e meia para ser concluído25, a vitrificação pode ser realizada em cerca de 17 minutos após o presente protocolo.
Em conclusão, as habilidades de pessoal e a padronização entre operadores podem ser os requisitos mais desafiadores ao iniciar um banco de oócitos vitrificado, mas serão alcançados com treinamento de pessoal. Este protocolo de vitrificação de volume mínimo para oócitos imaturos de gatos dá resultados consistentes e repetíveis quando realizados por operadores experientes. No entanto, ainda há chances de melhoria nas taxas de desenvolvimento de oócitos, mesmo que a viabilidade e a integridade pós-aquecimento sejam satisfatórias. Com maior otimização, o presente protocolo também poderia ser aplicado em condições de campo para felídeos selvagens, para os quais os dados publicados sobre criopreservação oócito ainda são escassos27. Ampliar a aplicação desse método não só aumentaria a possibilidade de melhorar os protocolos de criopreservação, mas também permitiria estabelecer biobancos oócitos vitrificados para a fertilidade e preservação da biodiversidade em felídeos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 e pela Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Também queremos agradecer à Dra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
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