Summary
我们展示人类诱导多能干细胞 （hiPSC） 培养物的自动化和与自动成像和分析相容的神经元分化。
Abstract
人类诱导多能干细胞（hiPSC）的手动培养和分化方案难以标准化，表现出高变异性，容易自发分化成不需要的细胞类型。这些方法是劳动密集型的，不容易进行大规模实验。为了克服这些限制，我们开发了一个自动化细胞培养系统，与高通量成像系统相结合，并实施了用于保持多条 hiPSC 线并行和神经元分化的协议。我们描述了使用 Neurogenin-2 （NGN2） 过度表达在 6\u20128 天内生成 hiPSC 衍生皮质神经元的短期分化协议的自动化，以及实施长期分化协议在 65 天内生成 hiPSC 衍生的中脑多巴胺 （mDA） 神经元。此外，我们应用NGN2方法，使用GPC扁病毒转导的小分子衍生神经前体细胞（smNPC），并建立了活细胞自动神经细胞生长测定。我们提出了一个自动化系统，其协议适用于常规hiPSC培养和分化到皮质神经元和多巴胺神经元。我们的平台适用于长期免提培养和高含量/高通量基于 hiPSC 的化合物、RNAi 和 CRISPR/Cas9 筛查，以识别新的疾病机制和药物靶点。
Introduction
人类诱导多能干细胞（hiPSC）是自我更新的，几乎可以在任何成人细胞类型中分化。这些特性使hiPSC成为基础研究和药物发现中疾病建模的有用工具。人类 iPSC 保留供体遗传背景，允许衍生出在疾病过程中受影响/参与最多的疾病相关细胞类型，例如，神经退行性疾病的不同神经元亚型2，3。此外，hiPSC通过模拟人类背景中的疾病和生理蛋白表达水平，克服了动物和细胞过度表达模型的一些局限性，并证明在模拟单源性疾病、复杂疾病和表观遗传性疾病以及晚发性疾病等疾病方面具有宝贵的价值。
尽管有这些好处和机会，但 hiPSC 的一些局限性仍需要解决。目前的 hiPSC 培养和差异化协议不具有成本效益，难以标准化，且是劳动密集型的。手动培养步骤可能导致产量和表型的高变异性，由于生长差异和 hiPSC 的自发分化。因此，需要通过实施更标准化的处理技术和简化可以使用自动化5实现的协议来减少实验者依赖型的变异。自动 hiPSC 培养和分化协议的建立将为学术和工业研究项目制定共同标准，并允许生成与生物学相关的疾病模型和更多可重复的结果。
先前的工作曾尝试自动化hiPSC培养物6，7，8，但他们的协议已仅限于特定的细胞培养板格式取决于系统，缺乏适应不同的测定格式。这种系统在细胞膨胀中很有用，但可能不适合自动分化成所需的细胞类型、疾病表型和筛选目的。此外，一个大型的成纤维细胞衍生、hiPSC生成和分化自动化平台被描述为9，但规模只能由专用于生产线生产的高通量实验室实现，这些生产线看起来很吸引人，但对于许多学术实验室来说却无法支付。
我们开发了基于高效颗粒空气 （HEPA） 过滤环境中液体处理站的全自动细胞培养系统，并结合大容量 CO2 培养箱、亮场成像细胞仪和用于板运输的机械臂。这些组件为稳定和可重复的 hiPSC 培养和差异化提供了基础。我们为该系统提供用于化合物或病毒存储的自动化-20°C存储系统以及高速旋转磁盘共合活细胞成像器。生成了定制协议，允许自动细胞播种、介质变化、汇合检查、细胞膨胀和检测板生成，并配有样品处理和板成像，使系统与高含量/高通量筛选兼容。使用控制软件和定制的图形用户界面（GUI）操作自动化细胞培养和成像系统。GUI 允许用户导入包含方法执行所需的单元格行特定参数的 CSV 文件。此外，GUI 还能够使用内置日历视图按任何顺序安排大量实验，从而可以完全控制每个方法开始的时间。
我们的自动化细胞培养系统采用标准化移液速度、传递时间、汇合阈值、播种密度和中量，具有多种板格式（96、48-、24-、12-、6-或1-well板格式）培养细胞的灵活性。我们改编了最近发表的短期分化协议，将hiPSC转化为神经元，可以在6天10，11中产生图巴3阳性神经元。我们还建立了小分子神经前体细胞（smNPC）的自动分化和成像，形成在EF1a促进子作用12下表达GPC的神经元，将icSPC转化为中脑多巴胺（mDA）神经元，适应先前发布的双SMAD抑制协议13，在65天内产生mDA神经元。
Protocol
1. 细胞培养和成像自动化的基本程序
- 加载新的培养板和提示
- 打开 GUI 并单击资源 /仪器流程视图 按钮。要运行任何资源/仪器进程，请选择资源/仪器进程，然后单击" 运行仪器"进程 按钮。
- 运行资源进程 RunHepaHood 并重新加载（请参阅 步骤 1.1.1）。打开门，将细胞培养板和一次性尖端加载到相应的位置，如控制 PC 上的弹出式图像所示。
- 用 70% 乙醇擦拭门以进行净化并关闭。运行仪器过程 从 GUI 中去 污（参见步骤 1.1.1）。该系统被紫外线照射30分钟。
- 重新填充培养培养剂和/或分离试剂
- 执行仪器步骤 RunHepahood（ 参见步骤 1.1.1）。打开液体处理站的前门。用 70% 乙醇对储液罐（包含介质、PBS 和/或分离试剂）进行净化，并把它们放在甲板上，以分配的负值（如 cfg .csv 中定义）。去盖储液罐。
- 用70%乙醇净化门，然后关闭它。通过运行 GUI 的资源/仪器进程"InitHepaHood"关闭 HEPA 发动机罩。
- 在 GUI 中创建新的"单元行"和项目
- 创建/修改用户定义的"单元格行"文件，这些文件由 Config （*.cfg.csv）、导入 （*.imp.csv）、资源 （*.rsv.csv） 和工作流 （*.wfl.csv） 文件组成。
- 单击"单元格行编辑器"视图中的"添加单元格行 "按钮， 打开 GUI 并创建新的"单元格行"。将打开一个向导，其中需要选择 Config 文件，并且需要输入具有简短描述的项目名称。
- 使用绿色箭头浏览此向导，并通过单击绿色复选标记确认设置。通过单击"添加项目"按钮，为生成的"单元格行 "创建新 项目。
- 输入项目名称和说明，并定义将在 GUI 的日历视图中可见的项目颜色。单击箭头导航到向导的下一页。
- 通过单击"添加批次"按钮 并在弹出窗口 中提供简短名称和说明来创建新批次。选择所有流程步骤，并安排每个流程步骤的开始时间。单击"确定"关闭 窗口。
- 使用 GUI 执行自动化方法
- 转到 GUI 的日历视图，然后单击"添加 流程步骤" 按钮。
- 选择 单元格行 ，导航到向导的下一页后选择项目。标记要使用的批处理，然后单击指向右侧的箭头。根据使用的方法，批次必须为空（用于接收新板），或包含培养板或检测板（所有其他过程）。
- 导航到向导的下一页，然后选择要执行的过程步骤。转到此向导的最后一页并安排实验。在"参数详细信息"部分中，可以修改运行该方法所需的变量。通过单击"确定" 进行确认。
- 将培养物和检测板加载到CO2培养箱 中
注：1孔板被定义为培养板，因为它们通常用于体积细胞。所有多孔板都定义为检测板。- 执行从 GUI 执行仪器过程"RunHepaHood"，如步骤 1.1.1 中所述。打开机械臂前面的门
- 如果装有用于自动成像的检测板，用 70% 乙醇和无绒组织擦拭检测板的底部。将培养板或检测板放在左侧的架子上。确保板的方向正确。对于检测板，A1 必须指向机械臂，而培养板的边缘必须指向右侧。
- 用 70% 乙醇擦拭门以进行净化并关闭。
- 执行"装载培养板"的方法，用于导入1孔板或"装载检测板"，用于导入步骤1.4中所述的多孔板。使用空批处理运行这两种方法。如果此批次中已存在板条形码，则通过单击复选框取消选择它们。
- 使用机械臂将单个板从搁板运送到 CO2孵化器平台。内置板式穿梭站可取回板，并将它们储存在 CO2培养箱的机架中。细胞维持在37°C和5%CO2。
- 从 CO2 培养箱卸载板
- 执行方法"卸载板"（参见步骤 1.4）。选择包含需要导出的板的批次。单个板可以通过条形码进行选择。
- 使用机械臂将板从 CO2 培养箱运送到左侧架子。
- 使用步骤 1.1.1 中所述的仪器过程"RunHepaHood"启动 HEPA 发动机罩。打开机械臂前面的门拆下板，在关闭后用 70% 乙醇对门进行净化，然后关闭 HEPA 发动机罩。
2. 自动化协议
- 从管子中播种板
- 通过执行仪器过程 RunHepaHood 启动 HEPA 发动机罩（参见步骤 1.1.1）。打开液体处理站前面的门。输入包含电池悬架的 50 mL 管，然后去盖管。
- 打开机械臂前面的门，并装载涂层培养板，用于接收架子上的电池。净化并关闭两扇门。执行"从管中播种板"的方法（参见步骤1.4）。
- 使用直接细胞计数功能计算亮场成像细胞仪的细胞。对于细胞计数，使用 16 孔作为 384 孔板格式的复制。
- 使用机械臂通过转盘将 384 井计数板从甲板运送到亮场成像细胞仪，然后开始成像过程。细胞仪自动确定每毫升的细胞数。使用机械臂将计数板放回原始位置。
- 使用机械臂将涂层培养基或检测板从搁板运送到移液台。删除用户定义的编号中的涂层和种子单元，以及适合板格式的体积（参见 表 1）。在 500 rpm 转速下将板移动到甲板上摇床 10 秒，用于细胞分配并转移到 CO2 培养箱 。
- 自动汇合评估
- 执行步骤 1.4 中描述的方法"检查汇合"。选择至少包含一个培养板和没有检测板的批次。在"参数详细信息"部分中输入iPSCf_2020图像采集和成像分析设置的"图像"。
- 使用机械臂通过转盘将第一个板从 CO2 培养箱运送到光明场成像细胞仪。
- 在亮场成像细胞仪中执行细胞成像，用于对 hiPSC 菌落进行汇合检查。使用"汇合"应用程序和图像 13 字段的 1 井馅饼，并自动计算细胞占用的平均面积。
- 使用机械臂将板运回 CO2 培养箱。重复步骤 2.2.2。到 2.2.4。其余的盘子。
- 培养板或检测板的介质变化
- 执行步骤 1.4 中所述的方法"培养板的介质更改"。并选择仅包含区域性板的批次。设置变量，指示是否将提示或针头用于"参数详细信息"部分中的移液步骤。对于任何多孔板的介质更换，执行"检测板介质更换"的方法，并选择包含检测板的批次。
- 使用机械臂将单个板从 CO2 培养箱运送到甲板上，然后将板解盖。自动倾斜板并吸气旧介质，然后丢弃到废物收集模块中。添加 12 mL 的新鲜介质。重新盖上板，然后使用机械臂将板运回 CO2 培养箱。
- 子培养
注：执行仪器过程"RunHepaHood"从GUI，如1.1.1所述。打开液体处理站的前门在所需位置加载介质和分离试剂（参见步骤 1.2）。如果需要重新填充提示，请使用步骤 1.1 中所述的"重新加载"。输入 50 mL 管，用于接收电池悬架并去盖管。- 执行方法"粘附细胞的亚化"（参见步骤1.4）。选择包含需要子培养的培养板的批次。
- 使用机械臂将板从 CO2 培养箱运送到甲板上，然后将板解盖。自动倾斜板并拆下旧介质并将其丢弃到废物收集模块中。用 8 mL 的 PBS 清洗细胞一次。添加 8 mL 的 0.5 mM EDTA，用于基于团的传递。在甲板上孵育8分钟。
- 从板中去除 EDTA 溶液，并将其丢弃到废物收集模块中。加入 12 mL 的新鲜介质，将板运输到摇床中。在 2000 rpm 时摇动 1 分钟，以驱逐殖民地。
- 将细胞悬浮液三角化五个循环的移液，将 iPSC 菌落分解成更小的尺寸（±50°u201280 μm）。将电池悬浮液转移到甲板上的 50 mL 管中。种子细胞自动如步骤2.1.5所述，使用1比7的分割比。
注：可选的单细胞传递。使用单细胞分离试剂生成单细胞悬浮液（参见 材料表）。而不是步骤2.4.2中的0.5 mM EDTA，使用8 mL的单细胞分离试剂，并在37°C下孵育20分钟。 将细胞悬浮液收集到 50 mL 管中，并添加等量的介质。使用单细胞分离试剂进行分离需要手动步骤来对细胞进行颗粒化。300 x g 的离心 电池，3 分钟。取出上流液，在所需介质的12 mL中重新暂停细胞颗粒，然后继续"从管中播种板"（见步骤2.1）。使用单细胞悬浮的hiPSCs时，在播种当天用2μM硫酮补充介质。
- 自动化高内容、高吞吐量成像
注：测量设置必须可用（请参阅补充文件1：步骤 1.1）。要成像的检测板可在培养箱中提供。- 执行方法"成像"（参见步骤 1.4）。选择至少包含一个检测板且无培养板的批次。在"参数详细信息"部分中，输入板类型、板定义（对于标准 96 孔成像板："板-96-20170918113842"）和测量设置的名称。
- 使用机械臂将检测板通过转盘运送到自动共合显微镜，以启动成像过程。从显微镜上回收成像端的板，然后运回 CO2 培养箱。重复批次中剩余板的过程。
3. hiPSC 的自动维护和扩展
-
自动汇合检查、介质更改和子培养的顺序
- 使用"从管中播种板"方法在一孔板上的种子细胞（见步骤2.1）。或者，使用"装载培养板"方法手动导入 1 孔板（参见步骤 1.5）。
- 每天安排自动汇合检查，以监测 iPSC 培养的第 1 天至第 6 天的菌落增长（参见步骤 2.2）。
- 使用"培养板的介质更换"方法每两天刷新一次媒体（参见步骤 2.3）。每板使用12 mL的介质。
- 第 6 天，开始"分类"过程（参见步骤 2.4）。
4. 自动差异化
- 人类 iPSC 到皮质 NGN2 神经元
注：手动 hiPSC 准备。该协议涉及使用扁病毒载体进行传递的NGN2过度表达。以 1：2 的比例（> ±107 TU/mL）用 NGN2 到 rTTA3 扁家病毒进行转导 hiPSC。然后为一条带0.5μg/mL紫霉素的通道选择细胞。用于生成稳定 hiPSC-NGN2 行的详细协议在补充文件 1： 步骤 2 中。- 继续使用步骤2.4.4所述的单细胞分离试剂进行"亚培养"过程。当 hipsc 达到 70\u201280% 汇合时
- 去除上一提液，在含有2.5μg/mL多氧环素（dox）和2μM硫磷的NGN2介质（材料表）的12 mL中重新暂停细胞颗粒。
- 使用"从管中播种板"方法开始分化 （见步骤2.1）。将 iPSC 所需的播种密度设置为 30，000/cm2（ 见表 1）。iPSC 镀在预涂层板上，镀有 0.1 mg/mL 聚-L-苯乙烯 （PLO） 和 5 μg/mL 层氨。
注：1孔板是RNA和蛋白质组学研究的首选，而96孔板格式是成像实验的首选。也可以使用其他检测板格式，如 48-、24-、12 或 6 孔板。 - 在差异化的第一天， 使用NGN2介质刷新介质"检测板介质变化（见步骤2.3），辅以2.5μg/mL dox和10μM N-+2S-（3，5-二氟苯基）乙酰-L-丙氨酸-2-苯基-甘氨酸，1，1-二甲基乙酯（DAPT）。每 2\u20123 天继续介质更改，直到所需的差异化日（参见步骤 2.3）。
- 在分化的第 4 天，使用 NGN2 介质辅以 10 ng/mL 脑源神经营养因子 （BDNF）、10 ng/mL 胶质细胞衍生神经营养因子 （GDNF） 和 10 ng/mL 神经营养因子 3 （NT-3）进行另一个介质更改（参见步骤 2.3.）以增强成熟。在实验结束时，从系统中导出培养板以进行下游实验（参见步骤 1.6）。
- 小分子神经前体细胞（smNPC）到NGN2神经元
注意：根据已发布协议12 的改编版本派生 smNPC（请参阅 补充文件 1：步骤 5）。使用NGN2和rTTA3病毒修改smNPC（参见 补充文件1：步骤2）。一轮NGN2和rTTA转导足以产生稳定的种群。使用 pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 伦比病毒进一步修改 smNPC，允许进行活细胞监测。10 的多种感染 （MOI） 用于 GFP 扁病毒转导。- 使用单细胞分离试剂到达汇合时通过 smNPC，如步骤 2.4 所述。注意。
- 使用细胞密度为50，000/cm2 的自动细胞培养系统的种子细胞，使用"从管中播种板"方法（见步骤2.1.）对预涂层板，0.1毫克/mL PLO，NGN2介质中5μg/mL层蛋白，辅以2.5微克/mL dox。
- 第 3 天，使用含有 2.5 μg/mL dox 和 10 μM DAPT 的新鲜 NGN2 介质执行介质更换（参见步骤 1.3.）。第 3 天后，每三天使用含有 2.5 μg/mL dox、BDNF、GDNF 和 NT-3 的新鲜 NGN2 介质，每台 10 ng/mL 执行介质变化。
- 图像细胞每天使用"自动高含量、高吞吐量成像"方法（见步骤2.5）使用 GFP 作为神经外生长的读出来监测分化状态。将激光功率设置为 80%，使用 30 ms 的曝光时间。使用 20 倍目标获取大量字段（例如 25 个字段）。
- 批处理图像分析
- 使用图像分析软件1执行图像分析，使用神经外生长模板。
- 打开软件。选择"数据"选项并浏览到成像数据文件夹，单击 "确定 "以加载要分析的数据。单击 " 打开"，从顶部菜单栏 中选择 协议，从 应用程序菜单中选择神经增长。转到"算法"，并使用"488"通道定义细胞核、细胞体和神经素。调整每个阈值参数。
- 选择要用于图像分析的井。在右下角单击 链接 并选择要分析的要素，如单元格计数平均值、骨架总长度总计。继续"预分析"，后跟"预览"。
- 检查预览设置是否可接受，并在批处理模式下开始分析。结果在父文件夹中以"报告".csv Excel 格式打开。
注：应要求提供图像分析脚本。 - 绘制按总 neurite 长度获得的平均值 neurite 长度，该长度与细胞数规范化。
5. hiPSC自动分化为中脑多巴胺（mDA）神经元
- 手动 hiPSC 制备
- 使用单细胞分离试剂将 70\u201280% 的入联 hiPSC 分离到单细胞中。简言之，用单细胞分离试剂（100μL/cm2）孵育细胞，在37°C下30分钟，将细胞悬浮液收集到锥形管中，在200 x g 下离心5分钟，并在 iPSC 培养基中重新悬浮细胞颗粒。
- 种子 200，000 细胞/厘米2 在细胞外基质涂层 1 孔板和 iPSC 培养介质上辅以 10 μM Y-27632。培养细胞在37°C和5%CO2过夜。
- 自动差异化：第 1 阶段
- 准备步骤 1.1+u20121.2 中所述的自动化培养系统。
- 将包含细胞的培养板加载到自动化培养系统的 CO2 培养箱中（参见步骤 1.5）。
- 准备 KSR 介质（ 参见材料表），并补充分化第 0天所需的小分子（见表 2）。仅使用具有小分子和生长因子的新鲜准备介质。
- 执行培养板的介质变化，如区分的第 0 天和第 1 天步骤 2.3 所述，然后每隔第二天执行一次，直到第 25 天。
- 从第5天开始，逐渐改变介质配方，如表 3中所述。
- 第11天，添加mDA神经元分化介质，辅以CHIR（直到第13天）、BDNF、AA1、GDNF、db-cAMP、TGF+3和DAPT（ 参见材料表）。
- 第 25 天，卸载板（参见步骤 1.6。
- 手动重放 1
- 使用单细胞分离试剂将第25 mDA前体分离成单细胞。简言之，在37°C下，用单细胞分离试剂（100μL/cm2）孵育细胞40分钟，将细胞悬浮液收集到锥形管中，在200 x g下离心5分钟，并在mDA神经元分化介质中重新悬浮细胞颗粒。
- 种子 400，000 细胞/厘米2 在 1 孔培养板预先涂覆 0.1 mg/mL PLO， 10 μg/mL 层压素和 2 μg/mL 纤维素在 mDA 神经元分化介质中辅以 10 μM Y-27632 （直到第 26 天） 和小分子和 生长因子在表 2 中描述.培养细胞在37°C和5%CO2过夜。
- 自动差异化：第 2 阶段
- 将含有 mDA 神经元的培养板加载到自动培养系统的 CO2 培养箱中，如步骤 1.5 所述
- 准备 mDA 神经元分化介质（ 参见材料表），并辅以小分子和生长因子，从第 26 天开始进行最终分化（见 表 2）。
- 执行培养板的介质变化，如第 2.3 步第 26 天的区别，然后每 3\u20124 天，直到第 65 天所述。
注：出于高通量成像目的，建议在分化的第 32 天以低密度对 96 孔板中的 mDA 神经元进行重新镀板，如步骤 5.5 中所述。
- 手动重放 2
- 卸载步骤 1.6 中所述的培养板。如步骤5.3.1所述，将第32 mDA神经元分离成单细胞。
- 种子 100，000 细胞/厘米2 在 96 孔板预涂与 0.1 mg/mL PLO， 10 μg/mL 层丁和 2 μg/mL 纤维素在 mDA 神经元分化介质中辅以 10 μM Y-27632 （直到第 33 天） 和小分子和生长因子 （见 表 2）. ）.培养细胞在37°C和5%CO2过夜。
- 第33天，用新鲜准备好的DA神经元分化介质代替介质，辅以小分子和生长因子（无Y-27632）。每 3\u20124 天手动更换一次介质，直到第 65 天。
6. 免疫控制、自动化高通量图像采集和分析
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荧光染色
- 执行荧光免疫，如补充文件 1：步骤4所述。
- 补充文件 1 中 描述的图像单元格：步骤 1.2。
- 将成像系统生成的成像文件上传到图像分析软件 2（参见 材料表），以进行进一步的图像分析，如步骤 6.2 中所述。
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使用图像分析软件进行图像分析2
- 在图像分析软件2中上传成像文件后，转到"图像分析"功能，并使用下拉菜单构建分析算法。
- 使用任务"查找核"选择核，该任务检测属于细胞核的图像上的区域（此处沾有 Hoechst）。通过设置核区域或直径的阈值，从死细胞（核核）中排除核。
- 使用任务"查找细胞质"选择细胞细胞质。此任务检测属于细胞细胞质的核周围的区域。仅包括分段良好的单元格。排除线粒体、凋亡和严重分段细胞。删除接触图像边框的单元格。
- 添加任务"计算形态属性"和"计算强度属性"。形态参数包括形态属性的计算，如感兴趣区域的区域。强度参数包括强度属性的计算，如感兴趣区域（如神经元的细胞质）的均值强度。
- 使用一个或多个条件、形态和/或强度选择输入群（如TH阳性神经元）的亚群（如TH阳性神经元）。
注：通常，神经元的强度选择。基于负对，可以定义神经元的强度阈值高于哪个阈值，这些神经元对 TH 呈正。 - 定义输出结果。这是每个分析的最后一个构建基块。它定义培养板每口井的测定读出值（每井的结果）。
- 运行批处理分析并导出结果。将正细胞的数量标准化为核总数，并表示数据为正细胞的百分比。
7. 定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）
- 执行 qRT-PCR 协议，如补充文件 1中所述：步骤 3。
Representative Results
我们的自动细胞培养和成像系统旨在最大限度地减少人为干预，使我们能够标准化 hiPSC 的培养，并分化成不同的细胞类型，如皮质或中脑多巴胺 （mDA） 神经元。图1描述了我们具有集成成像设备的自动化细胞培养系统的 示意图概述。首次将细胞培养引入这种自动化细胞培养系统，可以通过从50 mL管中自动播种细胞，或使用"培养板加载"或"检测板加载"方法进口培养物或检测板。我们系统的核心组件是液体处理站，在该站执行所有液体输送步骤，如介质变化或子培养。液体处理器的定制甲板布局如图 2所示。液体处理站配有四个位置。最多四个板可以从培养箱转移到甲板上，允许平行介质变化。由于在亚培养方法中，父系和子文化板必须放在甲板上，因此并行处理的培养板的最大数量限制为两个。液体处理站的一个重要特点是有可能在介质更换期间倾斜板，以完全去除细胞培养上清液。此外，液体处理站还配备了摇床，用于在执行子培养协议期间有利于细胞的酶分离。我们的自动化培养系统还配备了两个成像系统：用于进行细胞计数和汇合检查的明亮场成像细胞仪，因此，可监测细胞的一段时间生长，以及用于快速、高含量和高分辨率细胞成像的双旋转磁盘共声显微镜。
hiPSC 培养物每天在光明场成像细胞仪上监测生长情况，并分析汇合百分比。左侧面板和右侧面板中的亮场图像是分析使用圆量计获得的亮场图像的绿色蒙版（图 3A）。一段时间观察到均匀的 hiPSC 生长，如两条 hiPSC 线（n = 4 板）的汇合百分比所示，该百分比并行生长，并接受从第 1 天到第 6 天的汇合检查（图 3B）。达到设定的阈值后，hiPSC 将通过。细胞系是手动培养的（m）或自动化（a）系统，并观察用于维持典型的干细胞形态至少两个通道，具有代表性的光明场图像（图4A）。hiPSC 手动培养（未显示）或在自动化系统中显示典型的干细胞标记 OCT4（红色）和 SSEA4（绿色），如免疫荧光测定（图4B 所示）。通过qRT-PCR对多能性标记OT4、NANOG和REX1的表达也进行了mRNA水平评估（图4C）。使用从手动（m）和自动培养系统（a）中重复（复制1和2）中收集的样本进行相对定量。在自动培养系统中培养的复制中，所有三个多能标记的表达水平与手动培养后标记表达式类似。在第8天（D8），在皮质神经元中，与hiPSC区分（Diff）中不存在多能标记的表达。
自动化培养系统的一个重要应用是将hiPSC分化成不同的细胞类型，包括神经元。在这里，我们显示hiPSC分化为神经元使用NGN2策略，产生一个纯粹的皮质神经元培养在很短的时间（约6天）。在自动培养系统中区分的神经元 （a） 呈现与手动培养的神经元相似的形态和神经元网络组织 （图5A）。自动分化皮质神经元对 TUBB3（神经元特异性 III 类 β-tubulin，红色）和 BRN2（上皮质层标记，绿色）（图 5B）呈阳性，可与手动分化神经元（未显示数据）相媲美。神经元标记的表达，包括微管相关蛋白2（MAP2），神经细胞粘附分子（NCAM1）和Synapsin-1（SYN1），以及皮质神经元标记BULN2和CUX1（上皮质层）在神经元的分化第8天（D8）中丰富（图5C）。在 hiPSC 中观察到这些标记的非常低或没有表达。使用从手动（m）和自动培养系统（a）中重复（复制1和2）中收集的样本进行相对定量。复制中的表达式级别显示手动和自动区分之间的类似差异。
自动化文化系统的集成成像功能允许为文化的健康进行免提数据收集，从而能够长期自动采集表型读数。利用NGN2方法对用GPC扁病毒转导的小分子衍生神经前体（smNPC）线进行检测，我们建立了活细胞自动神经素生成测定，在11天的分化中测量了神经石长度，无需任何人工干预。神经石的复杂性随着时间的推移而增加，如第1天、第3天和11日所占据的中性区域、GFP表达和分析中的蒙版图像（图6A、B） 所示。从分化的第1天到第11天，神经土长度的增加被量化，并显示出不同油井的类似发展。为了简单起见，在代表性图中描绘了仅3列的数据，其中每根96孔板有6口井，尽管所有内部60孔都进行了分析（图6C）。
此处所示的自动化培养系统的另一个应用是 hiPSC 分化为 mDA 神经元。这种区分基于预先建立的协议后介质更改，并在第 0 天到 65 天对自动培养系统执行。自动介质更改不会导致细胞分离或任何其他视觉上可检测到的分化变化。在分化结束时，在第65天，mDA神经元显示细胞组织和形态（球状索马、长和尖状树突）可与手动分化（图7A，B）在mRNA水平上，在自动培养系统中分化的mDA神经元分别显示神经元和mDA标记、MAP2和TH（酪氨酸羟基酶）的表达（图7C）。这两种分化都产生了大量的TH和 MAP2 阳性神经元（图 7D）。
图1：自动化细胞培养和成像平台的示意图概述。
该系统采用聚碳酸酯外壳和两个 HEPA 罩 （A 和 B） 设计，配备四盏紫外灯，确保电池培养应用的无菌环境。细胞培养板被装在机械臂前的架子上，可通过前门 （C） 访问。板被加载到容量为 456 板的 CO2 培养箱 （D）。在亚培养例程中，亮场细胞计（E）用于汇合检查和细胞计数。液体处理站位于 HEPA 发动机罩 （B） 以下。图2 中描述了液体处理程序的 甲板布局。液体处理站的移液臂具有 96 通道移液头、8 个 1 mL 移液通道和 4 个 5 mL 移液通道。对于 1 mL 移液通道，用于液体传输的尖端或针头。为进行筛选，在检测板中播种的细胞可以在第二个培养箱（G）中解冻这些样品后，用储存在-20°C自动-20°C储存系统（F）中的样品进行处理。高通量成像在自动共声显微镜 （H） 中执行，可使用两个旋转圆盘或荧光模式在共声模式下获取图像。集成在显微镜中的活细胞室允许对培养细胞进行长期成像。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：液体处理站的甲板布局。
提示位置由 50 μL 尖端的"50 μL"表示，300 μL 尖端的"标准"，1 mL 尖端的"高"和 5 mL 提示的"5 mL"表示。甲板组件： （A） 四个加热摇床位置（最大转速：2500 rpm），可用于任何培养板或检测板格式。摇床位置配有可夹紧的夹持器，在运送到甲板后也用于板对齐。此外，在液体输送步骤中，摇床位置可用作板的盖驻车位置。出于代表性，所有摇床位置都由 96 个井检测板占据。（B） 四个倾斜模块，用于同时处理任何格式的四个板位于顶部。最低位置标志着培养和测定板的废物收集室以及96通道移液头。出于代表性，所有倾斜模块都由 96 孔检测板占用。（C） 在顶部位置，384井板用于细胞计数的位置。下面是两个位置，用于 96 孔板作为代表性用途占用的板和四个 50 mL 和四个 15 mL 管的机架。最低位置由 5 mL 尖端占据。（D） 三条介质线，带介质储层位置。介质管路具有液位传感器，可自动填充高达 250 mL 的介质介质介质。（E） 两个带有源排放的液体废物模块基于顶部，位于温度控制模块下方，该模块的位置为一个容器（白色）和一个 5 mL 尖端机架。（F） 1 mL 尖端的五个位置。（G） 两个温度控制模块位于底部，并放置一个位置，用于将其中一个盖子放在顶部。（H） 顶部两个 50 μL 嵌套尖端机架 （NTR） 的位置，然后是单通道和 96 通道拾取 300 μL 尖端的两个位置，底部为 5 mL 尖端机架。（I） 顶部为 384 孔计数板的堆叠器，后跟三个 300 μL NTR 和底部的 5 mL 尖端机架。（J） 三套八根可重复使用的金属1 mL针的储存和清洗站。（K） 1 mL 和 5 mL 移液通道的浪费位置和空 NTR（灰色）以及用于甲板运输步骤的 1 和 5 mL 通道（白色）的夹持器块。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 3：hiPSC 的自动汇合检查。
（A） 由细胞细胞仪（左）和自动汇合分析（右）拍摄的hiPSC的代表性亮场（BF）图像，指示以绿色表示细胞所占用的比例区域;（B） 从培养的第一天到第6天从两条hiPSC线（iPS #1和#2）记录的汇合百分比，n = 每个细胞系4个1孔板。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：hiPSC的传递。
（A） 一个hiPSC线手动（左）和使用自动培养系统（右）的BF图像。图像拍摄于第二次传传后6天;（B） hiPSC 的代表性图像染色为多能标记 OCT4 和 SSEA4，并反染色与 Hoechst 33342 （核）;（C） 多能标记OCT4、NANOG和REX1的 qRT-PCR 结果在一个 hiPSC 线中培养在重复 （1 和 2） 手动 （m） 和自动培养系统 （a） 中，以及区分的第 8 天 （D8） 中各自的 hiPSC 衍生皮质神经元 （Diff）。 数据表示为相对数量 （RQ），iPS_a_1作为参考样本。误差条表示 qRT-PCR 反应的 3 个技术复制的标准偏差 （SD）。GAPDH、RPL13A1和RPLPO被用作家政基因。 比例线： 100 μm.请单击此处查看此图的较大版本。
图5：人类 iPSC 衍生皮质神经元。
（A） 第6天的光明场图像，手动（m）和自动（a）显示相似神经元网络的分化皮质神经元;（B） 分化第 8 天为 TUBB3（泛神经元）、BRN2（皮质神经元）和 Hoechst 33342（核）染色的细胞的代表性图像;（C） 皮质神经元标记基因的qRT-PCR结果（MAP2、BRN2、CUX2、NCAM1和SYN1）在分化的第8天（D8）中丰富。 数据表示为相对数量 （RQ），iPS_a_1作为参考样本。错误条表示 qRT-PCR 反应的 3 个技术复制的 SD。GAPDH、RPL13A1和RPLPO被用作家政基因。 比例线： 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：神经土生长的高通量测定。
（A） GFP在分化的第1天、第3天和11天表达细胞的代表性图像;（B） 在分化的第1天、第3天和11天中具有中性的代表性二元图像。使用高含量图像分析软件1对神经土菌生长进行量化，表示为神经学长度;（B） 图形显示NPC衍生NGN2神经元中神经土长度的增加和密集网络的形成。对内60孔有细胞的3个96孔板进行成像。为简单起见，每个 96 孔板仅显示三列井，每个孔的 n = 6 孔。平均每井分析1308个细胞。错误条表示均值的标准误差 （S.E.M。比例线 = 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：人类 iPSC 衍生的 mDA 神经元。
中脑DA神经元手动分化（m）和在自动（a）培养系统中。（A， B）为酪氨酸羟基酶（TH，mDA神经元标记;绿色）、MAP2（神经元标记;红色）和 Hoechst 33342（核;蓝色）染色的mDA神经元的代表性荧光图像;（C） mDA神经元标记基因的代表性 qRT-PCR 结果在手动和自动培养系统中进行分化。 TH 和 MAP2 表达水平表示为相对数量 （RQ） 规范化到家政基因（OAZ1 和 GAPDH）;（D） 手动和自动分化产生的TH和 MAP2正神经元的百分比。误差条表示使用两条不同的 iPSC 线（两条和两条）执行的两#1的 SD #2）。比例线 = 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
| 单元格类型 | 目的 | 协议步骤 | 细胞密度 | 板格式 | 细胞号/井 |
| NGN2 分化 | |||||
| ipsc | NGN2 稳定线路生成 | S.2.3. | 30，000个细胞/厘米2 | 12 井 | 1,17,000 |
| ipsc | NGN2 神经元分化 | 3.1.3. | 30，000个细胞/厘米2 | 1 井 | 25,20,000 |
| ipsc | NGN2 神经元分化 | 3.1.3. | 30，000个细胞/厘米2 | 96 井 | 9,600 |
| smnpc 生成 | |||||
| smpc | 重放第 12 天和第 16 天 | S5.9. 和 S5.11. | 70，000个细胞/厘米2 | 6 井 | 6,72,000 |
| smpc | 从第 5 段重新进行 | 5.11. | 50，000个细胞/厘米2 | 6 井 | 4,80,000 |
| smpc | smnpc 到 Ngn2 神经元 | 3.2.2 | 50，000个细胞/厘米2 | 96 井 | 16,000 |
| mDA 差异化 | |||||
| ipsc | mDA 神经元分化 | 4.1.2. | 200，000个细胞/厘米2 | 1 井 | 1,68,00,000 |
| 达神经元 | 第 25 天重放 | 4.3.2. | 400，000个细胞/厘米2 | 1 井 | 3,36,00,000 |
| 达神经元 | 第 25 天重放 | 4.5.2. | 100，000个细胞/厘米2 | 96 井 | 32,000 |
| 涂层 | 目的 | 协议步骤 | 浓度/ 稀释 |
板格式 | 涂层细节 |
| ips 文化 | |||||
| 细胞外矩阵 | iPSC，NGN2 线路， mDA 神经元 |
1.5.7. 和 S2.3. | 1 等分号*; 25 mL DMEM/F-12 |
1-/12-井 | 8/0.5 mL/井;1 小时在 Rt |
| NGN2 分化 | |||||
| 聚-L-奥尼辛 | NGN2 神经元分化 | 3.1.3. 和 3.2.2. | 0.1毫克/毫克;Pbs | 1-/96-井 | 8/0.1 mL/井;37°C 时 12 小时; 3x PBS 洗涤 |
| 层 粘连 蛋白 | NGN2 神经元分化 | 3.1.3. 和 3.2.2. | 5 μg/mL;Pbs | 1-/96-井 | 8/0.1 mL/井;37°C 时 4 小时 |
| smnpc 生成 | |||||
| 细胞外矩阵 | smnpc 生成和文化 | S5.6.， S5.9.， S5.11. |
1 等分号*; 25 mL DMEM/F-12 |
6 井 | 1 mL;2 小时在 Rt |
| mDA 差异化 | |||||
| 细胞外矩阵 | mDA 差异化 | 4.1.2. | 1 等分号*; 25 mL DMEM/F-12 |
1 井 | 12 mL;37°C 时 12 小时 |
| 聚-L-奥尼辛 | mDA 差异化 | 4.3.2. 和 4.5.2. | 0.1毫克/毫克;Pbs | 1-/96-井 | 12/0.1 mL/井; 37°C 时 12 小时;3x PBS 洗涤 |
| 层 粘连 蛋白 | mDA 差异化 | 4.3.2. 和 4.5.2. | 10 μg/mL;Pbs | 1-/96-井 | 12/0.1 mL/井;37°C 时 12 小时 |
| 菲布罗内辛 | mDA 差异化 | 4.3.2. 和 4.5.2. | 2 μg/mL;Pbs | 1-/96-井 | 12/0.1 mL/井;37°C 时 12 小时 |
| *细胞外基质等分定义为本产品分析证书中的稀释因子（以μL为单位）。 | |||||
表1：种子细胞密度和涂层分别以板格式。
| 一天 | 试剂 | ||
| 第 0 天 - 1 日 | 100 nM LDN193189， 10 μM SB431542 | ||
| 第 1 天 - 第 3 天 | 100 nM LDN193189，10 μM SB431542，1 mM SHH，2 mM 纯胺， 100ng/mL FGF-8b |
||
| 第3天 - 第5天 | 100 nM LDN193189，10 μM SB431542，1 mM SHH，2 mM 纯胺， 100ng/mL FGF-8b，3 μM CHIR99021 |
||
| 第5天 - 第7天 | 100 nM LDN193189，1 mM SHH，2 mM 纯胺，100ng/mLFGF-8b， 3 μM CHIR99021 |
||
| 第7天 - 第9天 | 100 nM LDN193189，1 mM SHH，3 μM CHIR99021 | ||
| 第9天 - 11日 | 100 nM LDN193189，1 mM SHH，3 μM CHIR99021 | ||
| 第11天 - 13日 | 3 μM CHIR99021， 20 纳克/mL BDNF， 0.2 mM L-抗坏血酸 （AA1）， 20 纳克/mL GDNF， 1 mM db-camp， 1 ng/mL TGF+3， 10 μM DAPT |
||
| 第13天 - 65 | 20纳克/mL BDNF，0.2 mM L-抗坏血酸 （AA1），20 纳克/mL GDNF，1 mM db-cAMP， 1 ng/mL TGF+3，10 μM DAPT |
||
表2：小分子添加多巴胺神经分化。
| 一天 | KSR 介质 | N2 介质 | 差异化介质 |
| 第 0 天 - 1 日 | 100% | 0 | 0 |
| 第 1 天 - 第 3 天 | 100% | 0 | 0 |
| 第3天 - 第5天 | 100% | 0 | 0 |
| 第5天 - 第7天 | 75% | 25% | 0 |
| 第7天 - 第9天 | 50% | 50% | 0 |
| 第9天 - 11日 | 25% | 75% | 0 |
| 第11天 - 13日 | 0 | 0 | 100% |
| 第13天 - 65 | 0 | 0 | 100% |
表3：多巴胺神经元分化的介质梯度。
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Discussion
我们引进了具有集成成像功能的自动化细胞培养系统，用于 hiPSC 培养和神经元分化的标准化。由于用户干预最少，实验变异性低，确保细胞表型在分化期间的可重复性。基于日历的调度程序支持实验的组织和并行化，并允许在进行实验时具有高度的灵活性。现有方法易于调整，可增加可用方法的频谱。此外，可以使用大量的检测板格式来增加该系统的灵活性。最小的系统包括CO2 培养箱、机械臂、亮田细胞细胞计和液体处理站，构成了hiPSC培养和差异化所需的基本单元，学术研究实验室的成本低廉。自动细胞培养系统与用于储存化合物的自动-20°C存储系统、RNAi 库或CRISPR/Cas9库相结合，并集成了高含量/高通量显微镜，可执行表型筛选。
在目前的研究中，自动细胞培养系统使用一次性提示，将培养基点手动填充到储液罐中，从而限制了液体处理站对介质变化和其他培养过程的使用，尤其是在夜间。为了规避这一限制，可以调整方法，以针使用，而不是一次性提示，并在安装管连接介质线和存储在冰箱中的介质袋之间后，介质储液罐可以自动重新填充由加热器元件预热的新鲜介质。这将减少手动重新填充提示、培养媒体和储层交换造成的用户干扰。
我们的自动化细胞培养系统具有若干优点。一个是条形码跟踪系统。系统中加载的板由唯一的条形码标识，由系统读取和保存，允许在方法执行期间和之后跟踪样品。另一个优点是可以创建用户特定的项目。在这里，系统中加载的培养板可以分配给特定项目并分组。由于无需选择单独的板材，因此分批进行结构可简化对特定批次的所有板材执行相同程序的过程。此外，液体类编辑器允许调整移液速度和高度，以及每个液体转移步骤的吸气和点胶参数。每个过程都记录在日志文件中，允许回溯为给定区域性或检测板执行的任务。
从人类诱导多能干细胞（hiPSC）中提取的神经元和其他细胞类型是有用的体外工具，用于研究特定患者群体中神经退行性疾病的机制（例如帕金森病多巴胺神经元），为个性化药物筛查提供了可能性。培养 hiPSC 非常时间密集，需要训练有素的人员执行复杂的差异化协议，通常仅限于小规模生产。我们调整了hiPSC的无馈器培养，实现了一种自动化培养，并实施了两种神经元分化协议，一种基于NGN2过度表达的快速皮质神经元分化协议，以及一种用于生成中脑多巴胺（mDA）神经元13的长期小分子协议。手动培养和差异化协议的直接传输和可重复性使自动化培养系统非常有用。在自动化细胞培养系统中培养的人类 iPSC 表现出一致的干细胞形态，并表达重要的多能性标记，在独立实验之间可重复。此外，hiPSC 培养协议的自动化有利于并行培养和扩展大量细胞系。计划夜间执行的自动汇合检查节省了一天中系统在用户在实验室中执行的下游流程步骤（例如，采集细胞或手动重放以进行分化）时，无需使用系统。在达到用户定义的汇合阈值时，细胞被通过并重新镀入自动细胞培养系统的堆叠器上可用的细胞外基质涂层板。每个通道大约需要 70 分钟，从一个母板生成四个 1 孔板，这相当于一天 20 个通道的容量。
NGN2分化协议的自动化工作已经成功完成，并允许在不同的通道上生成一个均匀的神经元细胞群体，与手动分化相媲美。此外，由于快速分化，涉及多个细胞系的大规模筛选研究或具有数千种测试条件/化合物的筛选实验的实验成本将降低。成本效益高的高通量读数，包括活细胞神经素生长测量可以很容易地开发，实现，并用作疾病建模的表型读数，如前面所示的14，15，16。因此，我们使用小分子衍生神经前体（smNPC）细胞进一步调整了NGN2协议，这些细胞构成过度表达GPC。smNPC 细胞提供进一步的优势，包括降低培养培养器的成本（iPSC 培养器成本的三分之一）和扩展实验所需的时间。smNPC 的细胞产量比使用 iPSC 获得的细胞产量高 7 到 10 倍。区分神经元使用全自动成像过程成功监测和成像数天，无需手动抗体染色或化学标记，从而节省了包括成像本身在内的手动程序所需的成本和时间。当前对96孔板内60孔的成像，每板成像25个场时，每板约16分钟，这意味着可以在一天内采集和分析1000种化合物的基于成像的筛选数据。今后，该读出可用于化合物筛选研究，以挽救神经石生长缺陷。
此外，我们还演示了从 iPSC 生成中脑多巴胺 （mDA） 神经元的手动分化协议的转移。这种基于分子的小分子分化协议需要65天，由于多次重排步骤和频繁的介质变化，大多数每2天，这限制了mDA神经元的生产，同时少量的 iPSC 线， 劳动密集型。自动 mDA 差异化协议具有将差异化扩展到数十条 iPSC 生产线的很大优势。可并行区分多达 30 个细胞系。由于分化主要基于媒体的变化，因此几乎整个分化过程都可以在没有人为干扰的情况下进行。使用自动化系统的基于日历的调度程序，我们可以根据差异化步骤规划介质更改。处理如此大量的细胞系和培养板的一个限制是不可能进行隔夜介质更改。主要原因是，我们的系统是使用一次性提示和手动重新填充培养媒体，要求实验室中的用户执行此手动步骤。为了便于介质更换过程，系统中加载的板被分配到一个项目，并分组成批。然后，根据可用的一次性提示和数量调整批处理大小。如上所述，通过实施可重复使用/可洗针和自动重新填充介质，可以很容易地克服这一限制。细胞的自动传传/重放（如 iPSC 所示）是我们的自动细胞培养系统提供的便利之一。我们已经在分化的第25天测试了mDA神经元的自动重放。然而，mDA神经元的分离需要更长（40分钟）孵育与分离酶比 iPSC （8分钟）延长自动重排过程到超过1小时每个细胞系。因此，在同一天自动重放30个细胞系变得不可能。在自动重新传输（运输板、移液）和使系统适应针头和介质线的使用时加快其他步骤，可以解决此限制。尽管有缺点，我们可以成功地将手动协议转移到产生大量 MAP2（神经元）和 TH（mDA 神经元）阳性细胞的 mDA 神经元的自动分化。
在研究神经退行性疾病（包括帕金森病）的分子机制的项目中，同时区分数十条iPSC细胞系是两大项目非常感兴趣的。但是，以更少的错误和更少的成本更快地完成任务是一个很大的挑战。由于此处介绍的协议（iPSC、smNPC 和 mDA 神经元）的自动化，我们可以加快速度、降低成本并提高项目中的可重复性。像SININ-PD（https://www.foundinpd.org/wp/）这样的项目，涉及数百个患者细胞系，表明需要自动化培养和分化协议。我们的未来观点包括将手动三维 （3D） 细胞培养模型转移到自动化系统中。在板定义设置和适配器的使用中稍作调整将允许使用 3D 培养机构所需的商业或定制板和微流体室。此外，实现自动无标签成像模型将使我们能够实时跟踪神经元生长，并将神经素生长、神经元组织和细胞死亡的变化转化为对疾病机制的更好理解。
Disclosures
我们没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感激地感谢为这项研究贡献生物材料的患者及其家属。研究中使用的细胞线来自与罗格斯（ND41865作为 iPS#1）和蒂洛·库纳特博士（iPS#2）的实验室的NINDS集合。这项工作部分得到NOMIS基金会（PH）、RiMod-FTD、欧盟联合方案-神经退行性疾病研究（JPND）的支持;DZNE I2A倡议（AD）;PD-Strat，ERA-Net ERACoSysMed资助的项目（PH）和帕金森病基础数据倡议（FOUNDIN-PD）（PH，EB）。FOUNDIN-PD 是迈克尔·福克斯基金会路径到 PD 计划的一部分。作者感谢史蒂文·芬克贝纳和梅兰妮·科布（格拉德斯通研究所）为建立手动mDA神经元分化协议和铃木（Yokogawa电气公司）协助神经生长分析设置做出贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Distributor | Catalog Number | Dilution |
| iPSC pluripotency marker | |||
| Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 to 33 |
| Rabbit anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 to 200 |
| NGN2 neuron markers | |||
| Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 to 500 |
| Rabbit anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 to 1,000 |
| mDA neuron markers | |||
| Chicken anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 to 750 |
| Mouse anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 to 750 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 to 2,000 |
| Nuclei counterstaining | |||
| Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 to 8,000 |
| Instruments | Distributor | Catalog Number | Description/Application |
| Agilent TapeStation system | Agilent technologies | 4200 | Automated electrophoresis for DNA and RNA samples |
| Automated -20 °C storage system | Hamilton Storage Technologies |
Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series) |
Storage of reagents |
| Barcode reader | Honeywell | Barcode Reader Orbit | Barcode scanner |
| Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo | Confluence check and cell counting |
| CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Automated confocal microscope |
| Cytomat for cell cultures | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates) |
| Cytomat for thawing samples | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit) |
2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates) |
| HEPA filters | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Modified by Hamilton Robotics |
| Liquid handling station | Hamilton Robotics | Microlab Star | Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH |
| Media reservoir | Hamilton Robotics | 188211APE | Media/reagents reservoir |
| Pure water system | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Provides pure water for needle wash station |
| QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System |
Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Real-time PCR machine |
| Robotic arm | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport of plates |
| Turn table | Hamilton Robotics | Turn Table | Adjust plate orientiation |
| Uninterruptible power supply | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply |
Backup power supply |
| VIAFLO-pipettes | Integra | 4500 | Electronic pipette |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4453545 | Real-time PCR machine |
| Materials | Distributor | Catalog Number | Notes |
| 1-well culture plate (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
| 6-well culture plates (9.6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC treated with lid |
| 12-well culture plate (3.9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC treated with lid |
| 96-well culture plate (0.32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Black plate |
| Tips, 50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL tips |
| Tips, 300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL tips |
| Tips, 1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL tips |
| Tips, 5-mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL tips |
| Tubes, 15-mL | Greiner Bio-One | 188271 | 15-mL tubes |
| Tubes, 50-mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL tubes |
| Nalgene cryogenic 2.0 mL vials | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
| Plasmids | Distributor | Catalog Number | Notes |
| pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
| Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
| iPSC pluripotency | |||
| OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
| NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
| REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
| NGN2 neurons | |||
| MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
| BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
| CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
| NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
| SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
| mDA neurons | |||
| TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
| MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
| Housekeeping genes | |||
| GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
| OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
| RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
| RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI primer-BLAST |
| Media and Reagents | Distributor | Catalog Number | Use concentration |
| Coating matrix | |||
| Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μg/mL |
| Fibronectin | Corning | 356008 | 2 μg/mL |
| Laminin | Sigma | L2020 | 5 - 10 μg/mL |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
| Culture media | |||
| iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium) |
Gibco | A2858501 | |
| NGN2 neurons - NGN2 medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.909 mL (50 µM) |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL ( 2 mM) |
| Insulin | Sigma | I9278 | 0.25 mL (2.5 µg/mL) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (0.5%) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (0.5%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| mDA neurons - SRM medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.5 mL (55 µM) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
| Knockout serum replacement (serum replacement) |
Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| mDA neurons - N2 medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 475 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
| mDA neurons - Differentiation medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| NGN2 neurons - Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 2 μM |
| Doxycyline (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2) |
Sigma | A8960 | 64 mg/L |
| Neurotrophic factor-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
| Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
| Thiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μM |
| mDA neurons - Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 3 μM |
| DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
| Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
| Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
| L-ascorbic acid (AA1) | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
| LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
| Purmorphamine (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μM |
| Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) |
R&D | 1845-SH | 100 ng/mL |
| SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μM |
| Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3) |
R&D | 243-B3 | 1 ng/mL |
| Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
| Dissociation reagents | |||
| Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase) |
Gibco | A1110501 | 1x |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
| RNA isolation and cDNA kit | |||
| RNA isolation kit | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
| RNA lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer) |
| Reverse transcriptase (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transcriptase |
| Software | Company | Catalog Number | Description/Application |
| Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI) |
Hamilton Robotics | Custom-made | User interface for the automated system |
| CellPathFinder software (image analysis software 1) |
Yokogawa | CellPathfinder HCS Software | Image analysis tool |
| CellVoyager Measurement System | Yokogawa | Included with CellVoyager 7000 |
Microscope controlling software |
| Columbus software (image analysis software 2) |
Perkin Elmer | Columbus | Image analysis tool |
| Cloud based qPCR app | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher cloud | Analysis software for qRT-PCR data |
| Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software |
Controlling software for the automated system |
References
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- Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
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