Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה

Published: June 30, 2020 doi: 10.3791/61527
Automatic Translation
1, 1
1Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi

Summary

אנו מציגים שיטה חסכונית לגיירת השריטות המספקת גישה חדשה לקביעת העברת תאים ללא שימוש בשיטות עתירות ציוד. בעוד פיברובלסטים שימשו בפרוטוקול זה, זה יכול להיות מותאם ומנוצל כדי ללמוד סוגי תאים נוספים והשפעות על העברת תאים.

Abstract

העברת תאים היא מרכיב מרכזי הן באירועים פיזיולוגיים והן באירועים פתולוגיים. העברת תאים רגילה נדרשת עבור פונקציות חיוניות כגון פיתוח והרכבה של תגובה חיסונית. כאשר מתרחש פגם או שינוי עם תהליך העברת התא, זה יכול להיות תוצאות מזיקות (כלומר, גרורות סרטן, ריפוי הפצע, היווצרות צלקת). בשל החשיבות של העברת תאים, יש צורך בגישה להעברה סלולרית, הניתנת להתאמה ותוכלית לחזרה. תוך שימוש בהגידת השריטות הנפוצה, פיתחנו גישה חדשה לניתוח נדידת תאים המשתמשת בציוד מעבדה כללי. השיטה המתוארת משתמשת בסמנים חזותיים המאפשרים לכידת אזורים מסוימים בעלי עניין ללא שימוש במיקרוסקופ זמן-לשגות. בנוסף, היא מספקת גמישות בעיצוב הניסיוני, החל משינוי המטריצת הנדידה ועד לתוספת של משנה תרופתי. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר דרך לתת דין וחשבון על האזור של העברת תאים, אשר אינו נחשב על-ידי מספר שיטות בעת בדיקת העברת תאים. גישה חדשה זו מציעה אסיא הגירה שריטה לקהל גדול יותר ותספק הזדמנות גדולה יותר לחוקרים לבחון את ההשפעה הפיזיולוגית והפתופיזיולוגית של העברת תאים.

Introduction

העברת תאים היא חיונית עבור אירועים פיזיולוגיים רבים, כמו גם פתולוגיים. הוא נדרש במהלך הפיתוח, להרכבת תגובה חיסונית, ולריפויפצעים נאותים 1,2,3. רבים מאירועי העברת תאים אלה יכולים להיות מופעלים על ידי אותות פיזיקליים או כימיים. לדוגמה, במהלך תגובה חיסונית, leukocytes לנדדו לעבר אתר של פציעה בתגובה כימותרפיה2. בנוסף, leukocytes גם לשחרר ציטוקינות כדי לגרום הגירה של תאים חיסוניים נוספים, כמו גם סוגי תאים אחרים, כגון פיברובלסטים, אשר מעורבים בתהליך ריפוי הפצע, ובכך, ייזום תגובה רבתאית 4. היכולת של תאים לנדוד חיונית לתפקוד פיזיולוגי תקין; עם זאת, כאשר נדידת תאים עוברת ללא בדיקה, זה יכול להיות תגובה שלילית ולתרום לאירועים פתולוגיים, כגון דלקת כרונית, מחלת כלי דם, גרורות סרטן, וריפוי פצעלקוי 2,3,4,5,6,7. ריפוי פצעים לקויים הוא סבל נפוץ של חולי סוכרת עקב פגמים בנדידה לתאים, ואם פגמים אלה אינם מטופלים, זה יכול להוביל לסיבוכים נוספים (למשל,קטיעה 8,9). מחקר זה, כמו גם אחרים, הצביעו על הצורך להבין עוד יותר את התהליך שבו מתרחשת נדידת תאים, בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים רגילים, והוא חיוני גם להם לאורך תחום מחקר זה. כדי להשיג זאת, צריך להיות הגירה זמין כי הם נגישים ובמחיר סביר עבור אותם חוקרים, מי לא יכול להיות בעל הציוד הדרוש כדי לנהל את ההתאסות האלה.

נכון לכך, קיימים מגוון של העברות הזמינות לבחינת מגוון רחב של נושאים הנוגעים להעברה של תאים. פותחו מודלים של העברה תלת-מיתית ותלת-מיוד, שכל אחד מהם מתמקד באזורים ספציפיים המשפיעים על העברת תאים. מודלים נדידת 3D קשורים בדרך כלל מחקרים פלישת תאים ולהעריך את ההשפעה של מטריצהחוץ תאיתעל נדידת תאים 10,11,12, בעוד 2D הגירה יש מגוון גדול יותר של יישום והם משמשים בעיקר כדי ללמוד הגירה chemotactic, ריפוי פצעים, ושינויים פונקציונלייםבמהלך נדידת תאים 13,14,15,16. חלק מהאסמים הללו דורשים ציוד נוסף, כגון תאי ביידן או טבעות הדרה, מה שיכול להפחית את הזמינות של בדיקות אלה לחוקרים מסוימים. אחד האברים חסכוניים יותר הוא אחסון השריטות, המשמש בדרך כלל להערכת ריפוי פצעים ושינויים כללייםבהדחת תאים 14,17. בעוד רוב המעבדות מצוידות לנהל אחסון שריטה, הציוד המשמש למעקב אחר העברת תאים נוטים להיות גם לא זמין או יקר מדי לרכישה. זה כולל מיקרוסקופ זמן לשגות, אשר דורש מיקרוסקופ הפוך ומערכת הדמיה חיה. פריטי ציוד יקרים אלה אינם נגישים בדרך כלל לכל מעבדה. לכן, תצפית זו מדגישה את הצורך בפרוטוקול חדש המאפשר הערכה של העברת תאים עם ציוד זמין יותר.

הפרוטוקול המוצג כאן מספק דרך חדשה ובמחיר סביר להעריך את העברת התאים. שיטה זו פועלת על פי אותו הליך המשויך לבדיקות שריטה אך שונה בניתוח של בדיקת העברת תאים על-ידי שימוש בציוד הזמין בדרך כלל בהגדרת מעבדה בסיסית במדעים. פרוטוקול זה באמצעות ציוד משותף מאפשר קביעה מדויקת יותר של העברת תאים ללא שימוש במיקרוסקופ זמן-לשגות. בנוסף לקביעת ההעברה, שיטה זו מהווה גם גורמים משתנים באזור השריטה אשר הונו להשפיע מאוד על העברת תאים. בסך הכל, פרוטוקול חדש זה לניתוח העברת תאים מספק הזדמנות למעבדות נוספות לחקור ולתרום לתחום העברת התאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות תאים כללית

  1. פיברובלסטים לבביים תרבותיים במדיום הנשרים המותאם (DMEM) של דולבקו המכילים 1 גרם/ל גלוקוז, נתרן פירובלט, L-גלוטמין, בתוספת עם 14.2 mM NaHCO3, 14.9 mM HEPES, 15% סרום חום לא פעיל של צופר עוברי (FBS), 2% L-גלוטמין, ו 0.02% מיקרוגנט מיקרוביאלי (ראה טבלת חומרים)ומתוחזק בחממה CO2 ב 37 °C.
  2. פיברובלסט לב תרבות עד 90-95% confluency הוא הגיע במעבר 0 (P0). בשלב זה הפיברובלסטים מוכנים להתחלק לצלחת של 48 בארות, המשמשת להעברה.

2. הכנת לוחית ההעברה

  1. הכן לוח תרבות תא 48 באר על ידי ציור קו, באמצעות סמן קבוע צהוב או בהיר, במורד מרכז הבאר. לאחר מכן, צייר שלושה סימני Hash המפרקים את הבאר לשלושה תחומי עניין נפרדים. מקטעים אלה ישמשו להדמיה.
    הערה: שימוש בסמן קבוע בצבע בהיר יאפשר הדמיה קלה של תאים נודדים. סמנים כהים כגון שחור או כחול ימנעו הדמיה חזותית של תאים נודדים.
  2. אם בוחנים הגירה בצוללת (לדוגמה, קולגן), תחפו את הבאר בשלב זה בעקבות הוראות וריכוזים המשמשים לצוע הספציפי.
  3. צלחת ~ 15,000-20,000 פיברובלסטים לב, P1, לתוך כל באר ותאי תרבות, בתנאי culturing נורמליים (תנאים המפורטים בסעיף הקודם), עד שהם מגיעים 90-95% confluency. יש להגיע לשלב בין השעות 24-48.
    הערה: בעת הגדרת לוח ההעברה הקפד לכלול פקד חיובי (תא העברה ידוע, כגון תאי 3T318), פקד שלילי (תאים לא מרוטים) ובאר ריקה.

3. העברה לגרד העברה & קיבעון

  1. ברגע שהתאים מגיעים ל-90-95% קונפלואנציות, הסר את המדיה וגרד לאורך הקו המצויר באמצעות קצה פיפט P200 סטרילי.
    הערה: קצה פיפטה P200 הוא קצה פיפטה נפוץ בגודל בשימוש עם אחסוןהשריטה 10,14,19. כמו כן, לבצע רק מעבר אחד עם קצה P200 כמו יותר מניסיון אחד עלול לגרום קווי שריטה מרובים.
  2. לשטוף את הבאר עם מדיית סרום נמוכה (1.5% FBS) כדי להסיר את כל פיברובלסט לב לא מחובר.
  3. הוסף 500 μL של מדיית סרום נמוכה לכל באר. אם משתמשים בחומרים תרופתיים כלשהם, הוסיפו אותם כעת.
    הערה: נעשה שימוש למדיית סרום נמוכה מכיוון שהיא מאפשרת/מקדמת העברת תאים ומונעת פיברובלסטים מהתרבות אשר עלול להטות את התוצאות של העברה assay20. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש ב- 1.5% FBS.
  4. צלם תמונות של 0 שעות לפני דגירה של הפיברובלסטים ב-5% אינקובטור CO2 ב-37°C למשך 24 שעות.
    1. צלם תמונות של 0 שעות באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם מטרה של 20x. קח שתי תמונות של 0 שעות לבאר. פעולה זו תאפשר כיסוי מלא יותר של קו ההעברה.
    2. באמצעות הסימונים (קו ומקפים), מקם את הבאר כדי ללכוד את החצי העליון של קו השריטה. הימנע מהדמיה של המקף האמצעי כדי להבטיח שאותו אזור העברה לא יצוין פעמיים, דבר שיכול להטות את התוצאות.
    3. השתמש תוכנת הדמיה (טבלת חומרים) כדי ללכוד 0 שעות #1. לאחר מכן הזז את הלוח כדי למקם את החצי התחתון של באר / קו שריטה מול המצלמה. שוב, הימנע מלכידת המקף האמצעי. לאחר המקום, ללכוד 0 שעות תמונה #2 (איור 1).
      הערה: הימנעות מקף האמצע בשתי תמונות 0 שעות תמנע לכידת אזורי העברה פעמיים אשר אם נעשה יכול לייצר תוצאות חוזרות ולהטות את הנתונים.
  5. לאחר הדגירה במשך 24 שעות, הסר את המדיה מהבאר, ושטוף את הבאר עם PBS לא סטרילי אחד (מעתה ואילך כל 1x PBS בשימוש אינו סטרילי).
  6. בכסה המנוע אדים, להוסיף 500 μL של 4% paraformaldehyde לבאר דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  7. הסר את paraformaldehyde ושטוף פי 3 עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחד ב-RT.
  8. לאחר שטיפה של תאים, המשך ללכידת תמונות של 24 שעות או הוסף PBS אחד לכל באר והמקם ב-4°C עד לשעה מאוחרת יותר. תאים יכולים להישאר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות עד מוכן לתמונה.
    1. לחלחל את התאים על ידי הוספת 300 μL של פתרון permeabilizing (1 x PBS ו 0.01% triton X-100) לכל באר. דגירה תאים / צלחת עם עדין, נדנדה מתמשכת במשך 30 דקות ב RT.
    2. הסר פתרון permeabilizing ולהוסיף 1% כתם כחול מבריק Coomassie (3% Coomassie כחול מבריק, 10% חומצה אצטית, 45% מתנול, ו 45% dH2O) במשך 10 דקות עם עדין, נדנדה מתמדת ב RT.
      הערה: אם לוחות מצופים במצע מטריצה חוץ-תאי, הקפד לבדוק צלחת מצופה עם כתמי Coomassie לפני ביצוע אסימת הגירה. איור 2 מדגים שניתן להשתמש במטע מטריצה עם תרגום זה ולא להשפיע על הדמיה של תאים.
    3. לשטוף בארות 3x עם 1 pBS ב RT עם נדנדה מתמדת במשך 5 דקות כל אחד.
    4. לאחר שטיפה, הוסיף 300 μL של 1x PBS וללכוד 24 שעות תמונות.
    5. ללכוד תמונות 24 שעות על-ידי יישור הבאר לאותה מיקום ששימש ללכידת תמונות 0 שעות. כדי להשיג זאת, פתח את התמונות שנלכדו בעבר 0 שעות ובשימוש בסימון שנעשה עם הסמן הקבוע, יישר את הבאר לאותה תנוחה. הקו במהלך האמצע וסימנים נוספים של מקף אמורים לאפשר יישור קרוב בין התמונה של 24 שעות לתמונה של 0 שעות(איור 1).

4. הכנת תמונות של 0 שעות ו-24 שעות

  1. פתח 0 שעות ו-24 שעות שצולמו באותה באר ומיקום בתוכנה להדמיה(טבלת חומרים).
  2. צור שכבה חדשה בתמונה של 0 שעות. לאחר מכן, לחצו על השכבה החדשה ושנו את שם השכבה ל"שכבת קו" על-ידי לחיצה כפולה על הטקסט.
    הערה: שכבה זו תיקרא שכבת קו מנקודות אלה ואילך.
  3. לחצו על הכלי מברשת (סמל מברשת) והגדירו את הגודל ב- 10 px ואת הצבע לאדום.
  4. כאשר שכבת הקו נבחרת, צייר שני קווים נפרדים המתארים את אזור השריטה. הקווים אינם אמורים לגעת בתאים עקב שורות אלה המציינות את אזור ההעברה.
  5. לחץ על הכלי הזזה (סמל חץ) ולאחר מכן לחץ על לחצן Ctrl לחוץ ולחץ הן על שכבות הקו והן על שכבות הרקע.
  6. לחצו במרכז התמונה של 0 שעות וגררו את שתי השכבות הללו לאמצע התמונה של 24 שעות.
  7. כעת, באמצעות התמונה 24 שעות, לחץ על שכבת הרקע של 0 שעות ושנה את האטימות ל- 50%.
  8. החזקת לחצן Ctrl, לחץ על שניהם 0 h רקע שכבת קו ולאחר מכן חינם להפוך את השכבות (עריכה>שינוי צורה חינם). באמצעות שינוי צורה חופשי, ישר את הרקע 0 שעות ותדמית הקו לתדמית הרקע של 24 שעות. שלב זה תוצאה של שכבת-על של התמונה 0 h ו- 24 h, אשר יש צורך למקם את הקווים הסמן את אזור ההעברה במיקום הנכון בתמונה 24 שעות.
  9. לאחר שכבת-על מוצלחת של שכבות הרקע והקו של 0 שעות על תמונת הרקע של 24 שעות, מחק את שכבת הרקע של 0 שעות. מחק על-ידי לחיצה על שכבת הרקע של 0 שעות ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית ולחץ על מחק שכבה.
  10. מחיקת תמונת הרקע של 0 שעות תשאיר רק את הקו ואת שכבת הרקע של 24 שעות (המכונה כעת תמונת העברה). שכבת הקו תציין את אזור ההעברה/שריטה בתמונה של 24 שעות ותו לא תאפק לקביעת מספר התאים הנודדים.
  11. שמור כתדמית ההעברה החדשה הן כקובץ photoshop והן כתוכת TIFF/JPEG. הערה: דמות מייצגת המתארת תהליך זה מוצגת באות 3.

5. ספירת מספר התאים הנודדים

  1. פתח את תמונת ההעברה. ניתן לעשות זאת בתוכנית המקבלת קבצי TIFF/JPEG (טבלת חומרים).
  2. ספור את מספר התאים הממוקמים בין לבין ולגעת בשני הקווים האדומים.
  3. רמת מספר התאים הנודדים לכל תמונה. יהיו שתי תמונות נודדות לבאר, ואין לשלב ערכים אלה עד לאחר תיקון הערכים עבור אזור ההעברה (מפורט בסעיף הבא).

6. קביעת אזור ההעברה

  1. פתח את התמונה 24 שעות המכילה את שורות ההעברה בתוכנית ההדמיה בסעיף 5(טבלת חומרים).
  2. שמור כתמונה זו כ"תמונת אזור העברה".
  3. לאחר השמירה, לחצו על שכבת הרקע, לחצו לחיצה ימנית ולחצו על 'מחק שכבה'. פעולה זו אמורה להשאיר רק את קווי השריטה בתמונה (איור 3).
  4. בעזרת הכלי מברשת (סמל מברשת) למלא את האזור בין קווי השריטה. התאם את צבע המברשת לצבע המשמש לצימורה של הקווים להעברה.
  5. שנה את התמונה לגווני אפור כדי ליצור תמונה בשחור-לבן (תמונה>מצב>גווני אפור)ולאחר מכן שמור את התמונה (איור 4).
  6. הפעל את תוכנת הניתוח (טבלת חומרים) ולאחר מכן פתח את הקובץ "אזור ההעברה" בתוכנת ניתוח.
  7. כדי לקבוע את אזור קו ההעברה, לחץ על תמונה>כוונן>סף. אזור ההעברה השחור יהפוך לאדום ואזור האחוזים יצוין בתיבה סף. האזור ידווח כעוצב שטח שקו הנדידה מכסה בהשוואה לאזור כולו שנלכד בתמונה.
  8. רשם את אזור האחוזים עבור שורת ההעברה וודא שערך זה מזווג למספר התאים הנודדים עבור אותה תמונה.

7. ניתוח נתונים

  1. נרמל את מספר התאים הנודדים לאזור האחוזים של השריטה. חלק את מספר התאים ההעברה לפי אחוז ים של קו ההעברה (# תאים שהועברו % אזור ההעברה). עשה זאת לכל תמונה ולא ממוצע המבוסס על העברה לבאר.
  2. לאחר נרמול ערכים לכל תמונה, הוסף את הערכים של שתי התמונות, המייצגות באר בודדת. ערך זה ישמש לניתוח גרפי וסטטיסטי. אם העיצוב הניסיוני הכיל העתקים מרובים. שכפול ערכים ממוצע לפני ניתוח סטטיסטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הליך זה מתעד גישה חדשה לחקר העברת תאים שהיא גם חסכונית וגם ניתנת להתאמה עבור רוב המעבדות. מחקרים רבים השתמשו במיקרוסקופ זמן לשגות כדי להעריך את העברת תאים, אבל הציוד הדרוש לשיטה זו אינו זמין בקלות למעבדות רבות. בעוד ניצול קווים ומקפים לתיכור מאפשר את היכולת ללכוד מחדש תחומי עניין ספציפיים בנקודות זמן שונות ללא שימוש בציוד יקר(איור 1 & איור 3). בעוד השימוש בתימרים חיוני לגישה חדשה זו, ישנם תחומים רבים בשיטה זו שניתן להתאים לצרכי החוקר הפרט. הפרוטוקול הצביע על נקודת קצה של 24 שעות; עם זאת, ניתן להרחיב נקודת קצה זו בהתבסס על צרכי מעבדה בודדת. התאמת נקודת הקצה של הפרוטוקול יכולה לאפשר המשך תפירה של תאים לשימוש נוסף. בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר את הגמישות לבחון את ההשפעה של משנה תרופתי, כמו גם מצעי מטריצה חוץ תאית על הגירה. לבסוף, הרכיב היקר ביותר של שיטה זו הוא השימוש בתוכנה הדמיה, אשר עשוי להיות תוכנה מורשה, אבל השימוש בתוכנה מורשה היא לא האפשרות היחידה. ניתן להשתמש בתוכנה אחרת להדמיה המאפשרת יצירת קווים ותמונות שכבת-על בשיטה זו. בנוסף, לאופי העלות-יעילה והניתנת להתאמה של שיטה זו, היא מציגה גישה חדשה לבדיקת העברת תאים על ידי פקטורינג אזור השריטה.

גישה חדשה זו שימשה לאחרונה ב Burr et al. 2020 כדי להעריך את ההבדלים בהגירה פיברובלסט לב בין תאים מבודדים מלב סוכרתי וסוסוכרתי 20. איור 3 מציג תמונות מייצגות המשמשות להערכת העברת פיברובלסט. מתמונות אלה, נקבע כי 46 פיברובלסטים מלבבות שאינם סוכרתיים ו-129 פיברובלסטים מלבבות סוכרתיים נדדו במהלך פרק הזמן של 24 שעות של הניסוי. בהשוואות קבוצתיות, מספר התאים מלב הסוכרתי נדד פי 2.8 מתאים מלבבות שאינם סוכרתיים(טבלה 1). בעוד שתוצאות אלה הצביעו על תאים מלבבות סוכרתיים נדדו יותר, המספרים היו מטעים, כי האזור של השריטה היה שונה עבור כל אחת משתי הקבוצות. אזור השריטות הלא סוכרתי היה 24.78% מכלל האזור שנמדד, ואילו שריטה של נדידה סוכרתית הייתה 16.77% מכלל האזור שנמדד. כאשר אזור השריטה נשקל, הוא סיפק יחס (מספר תא /% אזור שריטה) המציין כי פיברובלסטים מלבבות סוכרתיים למעשה נדדו 4.13x גדול יותר מאשר תאים מלבבות שאינם סוכרתיים. תוצאות אלה הדגישו את החשיבות של לשקול את אזור ההעברה בעת ביצוע בדיקות הגירה.

נרמול לאזור ההגירה מספק הערכה טובה וקפדנית יותר של העברת תאים ופוגל טעות אנוש אפשרית. בעוד השיטה המתוארת משתמשת קצה פיפטה P200, אשר אמור לספק שריטה אחידה ועקבית, שריטות לא אחידות עלולות להתרחש עקב חוסר עקביות אנושי. איור 5 מדגיש את החשיבות של פקטורינג הבדלים באזור השריטה. אם אחד היה להשוות רק את מספר פיברובלסטים שהועברו, זה יראה כי איור 5A יש מספר כפול של תאים שהועברו לעומת איור 5B. בעוד שכאשר אזור השריטה משמש לנרמל את הנתונים, הוא מציין שהיחס בין פיברובלסטים לאזור ההעברה דומה הן באיחות 5A והן באיחות 5B. כך, השתמשנו בפיברובלסטים לב שאינם מטופלים שאינם סוכרתיים מבידודים פיברובלסט שונים; לכן, יחס העברה דומה צריך להיות התוצאה הצפויה בשל אופי התאים המשמשים באות 5. אם אחד מהם הציג רק את מספר התאים הנסגים, ממצאים אלה יכולים להיות מצג שווא אם האזור השריט אינו אחיד ועקבי בכל הדגימות. לכן, חשוב לתת דין וחשבון על האזור שרוט בשיטה זו, כמו גם אחרים לגרד הגירה. תוצאות מיוצגות אלה המוצגות באות 5 הדגימו כיצד נרמול מספר התאים שהועברו לאזור השריט יכול להציג נתוני העברה מדויקים, ניתנים לחזרה ואמינים.

Figure 1
איור 1: דיאגרמה של העיצוב הניסיוני עבור תסא נדידת השריטות פיברובלסט. התקנה: לפני ציפוי תאים לתוך באר, לצייר קו ו 3 סימני מקף בתחתית הלוח. 0 שעה: תאי תרבות עד 95% confluency ולנהל שריטה מקבילה הקו המתואר. ללכוד תמונות 0 שעות על-ידי בחירת מקטע מעל ומתחת למקף האמצעי. 24 שעות: לאפשר לתאים לעבור במשך 24 שעות לפני תיקון וכתמים. עבור תמונות של 24 שעות, יש ליישר היטב באותה מיקום של תמונות 0 שעות כדי ללכוד תאים שהועברו. ניתוח: מתאר את אזור ההעברה בתמונה של 0 שעות ולאחר מכן שכב את התמונה 0 h לתמונה של 24 שעות כדי ליצור תמונות העברה ואיזור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תמונות מייצגות המוצגות כתמי Coomassie אינו מפריע להדמיה חזותית של תאים. פיברובלסטים לב היו מצופה על או לא קולגן (צלחת פלסטיק), קולגן מבודד זנבות עכברים שאינם סוכרתיים, או קולגן מבודד זנבות עכברים סוכרתיים. התאים שימשו בהסדה של העברת השריטות כתוצאה מהשיטות המתוארות כאן. תאים היו מוכתמים עם 1% כתם כחול מבריק Coomassie ולאחר מכן תמונות של תאים נודדים נתפסו. סרגל קנה המידה המתואר בתמונה הוא 100 μm. פרטים על בידוד קולגן ו/או נדידת תאים על קולגן מוצגים ב Burr ואח'. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: נתונים מייצגים הממחישים את ההבדל בהגירה פיברובלסט לב בין תאים שאינם סוכרתיים וסו סוכרתיים. תמונות של 0 שעות ו-24 שעות המשמשות לחישוב מספר פיברובלסטים לביים שהועברו המבודדים מעכברים לא סוכרתיים וסורתים (הקו האדום מתאר את אזור הנדידה והתמונות שצולמו ב- 20x עם סרגל קנה מידה = 100 μm). תאי לב סוכרתיים היו 129 תאים לנדוד באזור של 16.77%, אשר הפיק יחס הגירה של 7.69. פיברובלסטים שאינם סוכרתיים היו 46 תאים לנדוד עם שטח של 24.78% מה שהוביל ליחס של 1.86. התמונות המוצגות בדמות זו שימשו בתוצאות שהוצגו ב-Burr et al.20, אך התמונות המתוארות כאן לא הוצגו ב-Burr et al.20. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: דיאגרמה המתארת את יצירת אזור תמונת ההעברה. שלב #1: פתח תמונת העברה המכילה שורות העברה. שלב #2: התמונה 24 שעות מוסרת, ומשאירה בשורות ההעברה בשדה התמונה. שלב #3: כלי המברשת שימש למילוי אזור ההעברה. שלב #4: התמונה מומרת לגווני אפור ולאחר מכן נשמרת כתמונה חדשה. סרגל קנה מידה מייצג 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 5
איור 5: דוגמה להשפעה של אזורי העברה שונים על העברה פיברובלסט. פיברובלסטים לב שאינם סוכרתיים היו מצופה על מנות תרבות פלסטיק בשימוש במאכל נדידת השריטות, כמתואר לעיל (סרגל קנה מידה = 100 μm). (A) 92 פיברובלסטים נדים עם אחוז שטח של 35.4% אשר הביא יחס הגירה של 2.60. (ב)45 פיברובלסטים נדדו עם שטח של 17.57% שמחשב יחס של 2.56. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

סוג פיברובלסט מספר ממוצע של תאים שהועברו האזור הממוצע של השריטה יחס מספר תא לאזור שרוט
פיברובלסטים מלבבות לא סוכרתיים 46 24.78% 1.86
פיברובלסטים מלבבות סוכרתיים 129 16.77% 7.69

טבלה 1: נתוני הגירה מאחסון של שריטה בהעברה באמצעות פיברובלסטים לב שאינם סוכרתיים וסו סוכרתיים. מספר הפיברובלסטים שאינם סוכרתיים וסו סוכרתיים שהיגרו נקבעו באמצעות איור 3. אזור האחוזים עבור כל תמונה חושב באמצעות שיטות המתוארות ו- ImageJ. יחס ההעברה חושב על-ידי חלוקת מספר הפיברובלסטים שהועברו לפי אזור ההעברה באחוזים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גישה חדשה זו לבחינת העברת השריטות מספקת שיטה נגישה יותר לחוקרים לבחון שינויים בהדברת תאים. בעוד הודעה זו פועלת על פי אותו הליך לניהול שריטה דומה למאגרים אחרים של שריטה, היא מספקת שיטה חדשה להדמיה וניתוח מדויק של העברת תאים10. במקום להשתמש בשיטות עתירות ציוד של מיקרוסקופית זמן-לשגות ותאי הדמיה של תאים חיים, שיטה זו מפרטת את השימוש בציוד מעבדה זמין בדרך כלל. תוך שימוש במיקרוסקופ ומצלמה הפוכים כלליים, ניתן ללכוד תמונות הגירה בו-זמנית תוך שמירה על תנאי תרבות עקביים. בנוסף, שיטה זו מספקת הדמיה מדויקת של אותו אזור עניין ללא שימוש בציוד מתקדם. לכידת אותו אזור העברה תפחית את חוסר העקביות בקביעת העברת תאים ותספק מדידה קפדנית ומדויקת יותר של העברת תאים. לבסוף, שיטה זו לוקחת בחשבון את אזור השריטה. בעוד זהירות נלקחת כדי למזער וריאציות אנושיות שריטות, חוסר עקביות עדיין יכול להתרחש, מדגים את החשיבות של שימוש באזור כגורם נרמול לניתוח של העברת תאים. בסך הכל, הפרוטוקול המפורט לעיל מספק גישה חדשה לכלי רב עוצמה המשמש בדרך כלל להערכת העברת תאים.

פיתוח תסה הגירה הניתנת להתאמה מספק דרכים חדשות למחקר. לתסוואי ההגירה המוצג כאן יש את היכולת להשתנות על מנת לבחון שאלות מחקר ספציפיות. שינויים יכולים לבוצעו לגבי הפעלה או עיכוב חלבונים ספציפיים של עניין. ניתן להחיל ריגנטים כגון משנה תרופתי (אגוניסטים או אנטגוניסטים) והפרעות RNA על העברה לפני, במהלך או אפילו לאחר ההגירה כדי לענות על שאלות על הגירה וחלבונים ספציפיים. הנפח הקטן של 48 צלחת באר גם מאפשר כמויות נמוכות יותר של משנה להתווסף, שהוא עוד שיטה חסכונית. בנוסף, ניתן לשנות תס"א זה כדי ללמוד את ההשפעה של רכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM) על העברת תאים. לאחרונה יישם שיטה זו, שבו צלחות תרבות התא היו מצופים קולגן מבודד מעכברים סוכרתיים ולא סוכרתיים כדי להעריך את ההשפעה של מטריצה חוץ תאית סוכרתית יש על נדידת פיברובלסטלב 20. בעוד מחקר זה השתמש קולגן מבודד, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לרכיבים חוץ תאיים אחרים שעשויים להיות מעניינים. היכולת להעריך את ההשפעה של העברת ECM שימושית מאוד עקב מחקרים מרובים המציינים את החשיבות של ECM עלהגירה 20,21,22. סיבוך פוטנציאלי שעלול להתרחש עם השימוש בחלבונים ECM וציפוי הבארים עם פתרון ECM מרוכז מאוד היא השפעה על הדמיה של תאים. מומלץ אם באמצעות ECM, כמו קולגן, כדי לכסות באר וכתם עם כחול Coomassie כדי לראות אם ECM יכול לפגוע מבחינה חזותית את ההדמיה של תאים. אם ECM פוגע בתאי תצוגה חזותיים, דילול פתרון ECM ישפר בעיה זו ויאפשר הדמיה של תאים ב- ECM.

גישה חדשה זו על טכניקה ישנה מציגה כמה מגבלות. שיטה זו הותאמה בקנה מידה קטן (צלחת תרבות תא 48 בארות) ולא יכול לעבור צלחות גדולות יותר בקלות. בשל גודל הבאר והסביבה שנלכדה בתמונות פרוטוקול זה יכול לתעד חלק גדול של אזור ההעברה. עם זאת, הרחבת שיטה זו לממדים גדולים יותר של באר עלולה לגרום ללכידת חלק נמוך יותר של אזור ההעברה. ניתן לפתור זאת באופן פוטנציאלי על-ידי הגדלת מספר התמונות שנלכדו, אך ייתכן שיהיה צורך להחיל שיטות נוספות כדי להבטיח שניתן יהיה לזהות מחדש את אזור ההעברה התמונה עבור תמונות 24 שעות. בנוסף, שיטה זו מוגבלת לתאים שניתן להשתמש בה בהגידה של שריטה. תאים שלא מגיבים בהסדה מסורתית של שריטה אינם אידיאליים לגישה המוצגת בכתב יד זה. אמנם יש כמה מגבלות עם גישה זו, שינוי השיטות המפורטות בכתב יד זה יכול להקל על חלק מהמגבלות.

ההסדה שריטה בעקבות גישה פשוטה אבל יש כמה צעדים קריטיים שיש לעקוב אחרי כדי לייצר תסריט מוצלח. צעד מכריע הוא לצייר את הסימנים המציין בתחתית הבאר. אם האינדיקטורים אינם נמשכים על בארות זה יהיה קשה מאוד / בלתי אפשרי להבדיל את האזור שיש לדמיין עבור התמונה 24 שעות, כמו גם מניעת לכידת אותו אזור של הגירה. כמו כן, חשוב ללכוד מחדש את אותו אזור הגירה בתמונה 24 שעות שנתפסה בתמונה 0 h. אם אותו אזור לא נלכד ב- 24 שעות, כיסוי התמונות להעברה לא יהיה אפשרי. ללא תמונות מכוסות, לא ניתן יהיה לקבוע אילו תאים הועברו. התמונות היסתות הן קריטיות עבור גישה זו, מכיוון שהן מספקות קביעה מדויקת עבור העברת תאים. מאחר ששיטת השריטה לא תמיד מספקת קווי שריטה ישרים, חשוב שהאזומים הנכונים יהיו בתמונה כדי ליצור את התמונות המחסות. התמונות המודגנות מספקות את הבסיס לדיוק של העברה זו המוצגת בכתב יד זה.

התאמה חדשה של אחסון ההעברה לשריטות מספקת גישה נגישה וגמישה יותר לבדיקת העברת תאים. מחקרים קודמים של העברת תאים השתמשו בשיטות עתירות ציוד, שלא זמינות בדרך כלל לכל מעבדה. המציין כי פיתוח של העברה יש מגוון רחב יותר של נגישות הוא חיוני. כתב יד זה תיאר גישה חדשה לטכניקה ישנה שתגביר את הנגישות לחוקרים המעוניינים בהגירת תאים. בנוסף, שיטה זו מספקת את היכולת לשנות את סביבת תרבות התא, בין אם באמצעות רכיבי מטריצה חוץ-תאיים או שימוש במשנה תרופתי, כדי לקבוע את ההשפעה שיש לה על העברת תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי פרס המחקר הרפואי של צבא ארה"ב #81XWH-16-1-0710, בית הספר לרוקחות של אוניברסיטת מיסיסיפי והמחלקה למדעים ביו-מולקולריים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe All Apps Adobe This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile MIDSCI AVR1 Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera Zeiss 426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher Scientific BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells Fisher Scientific 07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate Fisher Scientific MT10014CM
Image J NIH This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum Innovative Research IFBS-HU
Primocin InvivoGEN ant-pm-2 This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope Zeiss 491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software Zeiss software comes with camera purchase

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
  2. Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
  3. Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
  4. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
  5. Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
  6. Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
  7. Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
  8. Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
  9. Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
  10. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  11. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
  12. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
  13. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
  14. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  15. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  16. Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
  17. Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
  18. Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
  19. Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
  20. Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  21. Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
  22. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).

Tags

ביולוגיה גיליון 160 העברה בשם אחסון הגירה לגרד פיברובלסטים מטריצה חוץ-תאית תסה הגירה ניתנת להתאמה תסכלת הגירה חסכונית
תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A… More

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter