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Biology

비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석

doi: 10.3791/61527 Published: June 30, 2020

Summary

당사는 장비 집약적 방법을 사용하지 않고 세포 마이그레이션을 결정하는 새로운 접근 방식을 제공하는 스크래치 마이그레이션 분석법에 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 섬유아세포가 이 프로토콜에 사용되었지만, 세포 이동에 대한 추가 세포 유형과 영향을 연구하기 위해 적응하고 활용할 수 있습니다.

Abstract

세포 이동은 생리학적 및 병리학 적 사건의 핵심 구성 요소입니다. 면역 반응의 발달 및 장착과 같은 필수 기능에 는 정상적인 세포 이동이 필요합니다. 세포 이동 프로세스에 결함이나 변경이 발생하면 해로운 결과(즉, 암 전이, 상처 치유 및 흉터 형성)가 발생할 수 있습니다. 세포 마이그레이션의 중요성때문에, 저렴하고 적응가능하며 반복가능한 세포 마이그레이션 분석서에 접근할 필요가 있습니다. 일반적인 스크래치 마이그레이션 분석을 활용하여 일반 실험실 장비를 사용하는 세포 마이그레이션을 분석하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다. 설명된 방법은 시간 경과 현미경 검사를 사용하지 않고 관심있는 특정 영역을 다시 캡처 할 수있는 시각적 마커를 사용합니다. 또한, 이동 매트릭스 기판 변경에서 약리학적 수정제의 첨가에 이르기까지 실험 설계의 유연성을 제공한다. 또한 이 프로토콜은 셀 마이그레이션을 검사할 때 여러 가지 방법으로 간주되지 않는 셀 마이그레이션 영역을 설명하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 새로운 접근은 더 큰 청중에게 스크래치 이주 분석법을 제공하고 연구원이 세포 이동의 생리적 및 병리학적 영향을 검토 할 수있는 더 큰 기회를 제공 할 것입니다.

Introduction

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세포 이동은 많은 생리학적 뿐만 아니라 병리학적 사건에 매우 중요합니다. 개발 중, 면역 반응을 장착하고, 적절한 상처 치유1,2,3이필요합니다. 이러한 세포 마이그레이션 이벤트의 대부분은 물리적 또는 화학적 신호에 의해 트리거될 수 있습니다. 예를 들어, 면역 반응 중에 백혈구는 화학 요법2에대응하여 부상 부위로 이동합니다. 또한, 백혈구는 또한 상처 치유 과정에 관여하는 섬유아세포와 같은 다른 세포 유형뿐만 아니라 추가 면역 세포의 이동을 유도하기 위해 사이토카인을 방출하여 다세포 반응4를시작한다. 이동하는 세포의 능력은 적절한 생리적 기능에 필수적입니다. 그러나, 세포 이동이 확인되지 않을 때, 그것은 불리한 반응을 가질 수 있고 만성 염증, 혈관 질환, 암 전이 및손상된 상처 치유2,3,4,5,6,7과같은 병리학적 사건에 기여할 수 있다. 손상된 상처 치유는 세포 이동의 결함으로 인한 당뇨병 환자의 일반적인 고난이며, 이러한 결함이 해결되지 않으면 추가 합병증(예: 절단8,9)으로이어질 수 있습니다. 이 연구 결과는, 그 외, 세포 이주가 일어나는 과정을 추가로 이해하는 필요성을 표시했습니다, 일반적인 생리학 또는 병리학적인 조건의 밑에, 그리고 연구의 이 필드를 발전시키기위한 것이 중요합니다. 이를 달성하기 위해서는 이러한 조사를 수행하는 데 필요한 장비를 소지하지 않을 수 있는 연구자들에게 접근 가능하고 저렴한 마이그레이션 에세이가 있어야 합니다.

현재 셀 마이그레이션과 관련된 다양한 주제를 검사할 수 있는 다양한 마이그레이션 에세이가 있습니다. 각각 셀 마이그레이션에 영향을 미치는 특정 영역을 대상으로 2D 및 3D 마이그레이션 모델이 모두 개발되었습니다. 3D 마이그레이션 모델은 전형적으로 세포 침입 연구와 연관되고 세포 이동10,11,12에세포 외 매트릭스의 영향을 평가하는 반면, 2D 마이그레이션 소는 적용 범위가 크고 주로 세포 마이그레이션13,14, 15,16동안 화학 작용, 상처 치유 및 기능적 변화를 연구하는 데 사용된다. 이러한 소의 몇몇은 특정 연구원에게 이 사실의 가용성을 감소시킬 수 있는 보이든 챔버 또는 배제 반지와 같은 추가 장비가 필요합니다. 보다 비용 효율적인 분석 방법 중 하나는 일반적으로 상처 치유 및 세포 마이그레이션14,17의일반적인 변화를 평가하는 데 사용되는 스크래치 분석이다. 대부분의 실험실은 스크래치 분석기를 수행하도록 장착되어 있지만 셀 마이그레이션을 추적하는 데 사용되는 장비는 사용할 수 없거나 구매비용이 너무 많이 드는 경향이 있습니다. 이것은 반전된 현미경 및 살아있는 화상 진찰 시스템을 요구하는 시간 경과 현미경 검사를 포함합니다. 이러한 고가의 장비는 모든 실험실에서 일반적으로 접근할 수 없습니다. 따라서 이 관찰은 보다 쉽게 사용할 수 있는 장비로 세포 마이그레이션을 평가할 수 있는 새로운 프로토콜의 필요성을 강조합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 세포 마이그레이션을 평가하는 새롭고 저렴한 방법을 제공합니다. 이 방법은 스크래치 분석과 관련된 동일한 절차를 따르지만 기본 과학 실험실 환경에서 더 일반적으로 사용할 수있는 장비를 활용하여 세포 이동을 검사하는 분석에서 다릅니다. 일반적인 장비를 사용하는 이 프로토콜은 시간 경과 현미경 검사를 사용하지 않고도 세포 이동을 보다 정확하게 판단할 수 있습니다. 마이그레이션을 결정하는 것 외에도 이 메서드는 셀 마이그레이션에 큰 영향을 미치는 것으로 지적된 스크래치 영역의 가변 요인을 고려합니다. 전반적으로, 세포 마이그레이션 분석을 위한 이 새로운 프로토콜은 더 많은 실험실이 세포 마이그레이션 분야에 탐구하고 기여할 수 있는 기회를 제공합니다.

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Protocol

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1. 일반 세포 배양

  1. 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM)에서 1g/L 포도당을 함유한 배양 심장 섬유아세포, 나트륨 피루바테, L-글루타민, 14.2 mM NaHCO3,14.9 mM HEPES, 15% 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS), 2 % L-글루타민, 0.02 % 항균 시약 (재료의 표참조) 및 CO2에서 유지 보수37.
  2. 90-95%까지 배양 심장 섬유아세포는 통로 0 (P0)에서 도달합니다. 이 시점에서 섬유아세포는 마이그레이션 분석에 사용되는 48웰 플레이트로 나눌 준비가 되어 있습니다.

2. 이주 판 준비

  1. 48웰 세포 배양판을 선으로 그리고, 노란색 또는 밝은 색의 영구 마커를 사용하여, 우물의 중앙 아래로 준비한다. 그런 다음, 관심의 세 가지 별도 영역으로 우물을 분할 세 해시 마크를 그립니다. 이 단면도는 화상 진찰을 위해 이용될 것입니다.
    참고: 밝은 색상 영구 마커를 사용하면 마이그레이션 셀의 쉬운 이미징이 허용됩니다. 검은 색 또는 파란색과 같은 어두운 마커는 마이그레이션 셀의 시각화를 방지합니다.
  2. 기판(예를 들어, 콜라겐)에서 의 이주를 평가하는 경우, 특정 기판에 사용되는 지침과 농도에 따라 이 때 우물을 코팅한다.
  3. 플레이트 ~15,000-20,000 심장 섬유아세포, P1, 각 우물 및 배양 세포로, 정상적인 배양 조건 (이전 섹션에 나열된 조건)에 따라 90-95 %의 합류에 도달 할 때까지. 24~48시간 사이에 는 인플루엔자에 도달해야 합니다.
    참고: 마이그레이션 플레이트를 설정할 때 양수 제어(예: 3T3 셀18)및 음수 제어(긁지 않은 셀) 및 빈 우물을 포함해야 합니다.

3. 스크래치 마이그레이션 분석 및 고정

  1. 세포가 90-95%의 합류에 도달하면 멸균 P200 파이펫 팁을 사용하여 그려진 선을 따라 미디어와 스크래치를 제거합니다.
    참고 : P200 파이펫 팁은스크래치분석10,14,19와함께 사용되는 일반적인 파이펫 팁 크기입니다. 또한 P200 팁으로 한 번만 패스하면 두 번 이상의 시도가 여러 번 스크래치 라인을 초래할 수 있습니다.
  2. 낮은 혈청 미디어 (1.5 % FBS)로 우물을 헹구어 부착되지 않은 심장 섬유 아세포를 제거하십시오.
  3. 각 웰에 500 μL의 낮은 혈청 미디어를 추가합니다. 약리학 에이전트를 사용하는 경우, 이 시간에 그들을 추가합니다.
    참고: 낮은 혈청 매체는 세포 이동이 발생할 수 있도록 허용/촉진하고 마이그레이션 분석20의결과를 왜곡할 수 있는 섬유아세포가 확산되는 것을 방지하기 때문에 사용됩니다. 이 프로토콜의 경우 1.5%의 FBS가 사용되었습니다.
  4. 24시간 동안 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 섬유아세포를 배양하기 전에 0h 이미지를 캡처합니다.
    1. 20배 의 목표와 반전 된 현미경을 사용하여 0 h 이미지를 캡처합니다. 잘 당 두 개의 0 h 이미지를 가져 가라. 이렇게 하면 마이그레이션 줄에 대한 보다 완벽한 커버리지가 허용됩니다.
    2. 표시(선 및 대시)를 사용하여 우물을 배치하여 스크래치 라인의 위쪽 절반을 캡처합니다. 중간 대시를 이미징하지 말고 동일한 마이그레이션 영역이 두 번 이미지되지 않도록 하여 결과가 왜곡될 수 있습니다.
    3. 이미징소프트웨어(재료 표)를사용하여 #1 0h 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 카메라를 볼 때 플레이트를 이동하여 우물/스크래치 선의 하반부반을 배치합니다. 다시 말하지만 중간 대시를 캡처하지 마십시오. 일단 제자리에, 캡처 0 h 이미지 #2(그림 1).
      참고: 0h 이미지 모두에서 중간 대시를 피하면 마이그레이션 영역을 두 번 캡처할 수 없게 되어 반복 결과를 생성하고 데이터를 왜곡할 수 있습니다.
  5. 24시간 동안 배양한 후, 우물에서 미디어를 제거하고, 1x 비멸PBS로 우물을 씻는다(이제부터 는 모든 1x PBS가 사용되지 않습니다).
  6. 연기 후드에, 우물에 4 % 파라 포름 알데히드의 500 μL을 추가하고 실온 (RT)에서 10 분 동안 배양한다.
  7. 파라포름알데히드를 제거하고 RT에서 각각 5분 동안 1x PBS로 3배 세척합니다.
  8. 세포가 세척되면 24h 이미지를 캡처하거나 각 우물에 1x PBS를 추가하고 나중에 까지 4 °C에 배치하십시오. 세포는 이미지에 준비 될 때까지 1-2 주 동안 4 ° C에서 머물 수 있습니다.
    1. 각 웰에 300 μL의 퍼메아빌라이징 용액(1x PBS 및 0.01% 트리톤 X-100)을 추가하여 세포를 투과화한다. RT에서 30 분 동안 부드럽고 지속적인 흔들림으로 세포 / 접시를 배양하십시오.
    2. 퍼메아빌리징 용액을 제거하고 1% 쿠마시 브릴리언트 블루 스테인(쿠마시 브릴리언트 블루 3%, 아세트산 10%, 메탄올 45%, dH2O 45% 분)을 10분 동안 부드럽고 지속적인 흔들림으로 추가합니다.
      참고: 플레이트가 세포외 매트릭스 기판으로 코팅된 경우 마이그레이션 분석을 수행하기 전에 쿠마시 염색으로 코팅된 플레이트를 테스트해야 합니다. 도 2는 매트릭스 기판이 이 분석기와 함께 사용될 수 있으며 세포의 시각화에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다.
    3. RT에서 1x PBS로 3배 의 웰을 씻어 내고 5분 동안 계속 흔들리면 됩니다.
    4. 세차 후, 1x PBS의 300 μL을 추가하고 24시간 이미지를 캡처합니다.
    5. 0h 이미지를 캡처하는 데 사용된 동일한 위치에 웰을 정렬하여 24h 이미지를 캡처합니다. 이를 수행하기 위해 이전에 캡처한 0h 이미지를 열고 영구 마커로 만든 마킹을 사용하여 동일한 위치에 잘 정렬합니다. 가운데 및 추가 대시 마크 아래로 선은 24h 이미지와 0h이미지(그림 1)사이의긴밀한 정렬을 허용해야 합니다.

4. 0 h 및 24 h 이미지 의 준비

  1. 동일한 웰과 이미징 소프트웨어(재료 표)에서 동일한 우물과 위치의 촬영 된 0 h 및 24 h 이미지를 엽니다.
  2. 0h 이미지에 새 레이어를 만듭니다. 그런 다음 새 레이어를 클릭하고 텍스트를 두 번 클릭하여 레이어의 이름을 "줄 레이어"로 변경합니다.
    참고: 이 레이어를 이 시점부터 선 레이어라고 합니다.
  3. 브러시 도구(브러시 아이콘)를 클릭하고 크기를 10px로 설정하고 색상을 빨간색으로 설정합니다.
  4. 선 레이어를 선택하면 스크래치 영역을 설명하는 두 개의 별도의 선을 그립니다. 이 선이 마이그레이션 영역을 표시하는 이러한 선으로 인해 셀을 만지지 않아야 합니다.
  5. 이동 도구(화살표 아이콘)를 클릭한 다음 Ctrl 버튼을 누릅니다.
  6. 0h 이미지의 가운데를 클릭하고 이러한 레이어를 24h 이미지의 중간으로 드래그합니다.
  7. 이제 24h 이미지를 사용하여 0 h 배경 레이어를 클릭하고 불투명도를 50%로 변경합니다.
  8. Ctrl 버튼을 들고 0h 배경과 선 레이어를 모두 클릭한 다음 레이어를 자유롭게 변환합니다(편집>무료변환). 무료 변환을 사용하여 0h 배경 및 선 이미지를 24h 배경 이미지에 정렬합니다. 이 단계는 0h 및 24h 이미지를 오버레이하는 결과를 초래하며, 이는 24h 이미지에서 마이그레이션 영역을 표시하는 선을 위치시키는 데 필요합니다.
  9. 0h 배경 및 선 레이어를 24h 배경 이미지에 성공적으로 오버레이한 후 0h 배경 레이어를 삭제합니다. 0h 배경 레이어를 클릭한 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 레이어 삭제를 클릭하여 삭제합니다.
  10. 0h 배경 이미지를 삭제하면 선과 24h 배경 레이어(이제 마이그레이션 이미지라고 함)만 남게 됩니다. 선 레이어는 24h 이미지에서 마이그레이션/스크래치 영역을 나타내며 마이그레이션 셀 수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
  11. 포토샵 파일과 TIFF/JPEG로 새 마이그레이션 이미지로 저장합니다. 참고: 이 프로세스를 묘사하는 대표적인 그림은 그림 3에표시됩니다.

5. 마이그레이션 셀 수 계산

  1. 마이그레이션 이미지를 엽니다. 이것은 TIFF / JPEG 파일(재료의 표)를수락하는 프로그램에서 수행 할 수 있습니다.
  2. 두 개의 빨간색 선을 터치뿐만 아니라 사이에있는 셀수를 계산합니다.
  3. 이미지당 마이그레이션 셀 수를 기록합니다. 웰당 두 개의 마이그레이션 이미지가 있을 것이며, 이러한 값은 마이그레이션 영역에 대해 값을 수정한 후(다음 섹션에 자세히 설명)까지 결합해서는 안 됩니다.

6. 마이그레이션 영역 결정

  1. 제5항(자료표)에서 이미징 소프트웨어 프로그램에서 마이그레이션 라인을 포함하는 24h 이미지를엽니다.
  2. 이 이미지를 "마이그레이션 영역 이미지"로 저장합니다.
  3. 저장한 후 백그라운드 레이어를 클릭하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 레이어 삭제를 클릭합니다. 이렇게 하면 이미지에 스크래치 라인만 남게됩니다(그림 3).
  4. 브러시 도구(브러시 아이콘)를 사용하여 스크래치 선 사이의 영역을 채웁니다. 브러시의 색상을 마이그레이션의 선을 그리는 데 사용되는 색상과 일치합니다.
  5. 이미지를 회색으로 변경하여 흑백이미지(Image>Mode>Grayscale)를생성한 다음 이미지를저장합니다(그림 4).
  6. 분석소프트웨어(재료 표)를시작한 다음 분석 소프트웨어 내에서 "마이그레이션 영역" 파일을 엽니다.
  7. 마이그레이션 줄의 영역을 확인하려면 이미지>Adjust>임계값을 클릭합니다. 검은색 마이그레이션 영역은 빨간색으로 바뀌고 백분율 영역은 임계값 상자에 표시됩니다. 이 영역은 이미지에서 캡처한 전체 영역에 비해 마이그레이션 라인이 커버하는 영역의 백분율로 보고됩니다.
  8. 마이그레이션 줄의 백분율 영역을 기록하고 이 값이 동일한 이미지에 대한 마이그레이션 셀 수와 페어링되는지 확인합니다.

7. 데이터 분석

  1. 마이그레이션셀 수를 스크래치의 백분율 영역으로 정규화합니다. 마이그레이션 셀 수를 마이그레이션 줄의 백분율 영역(#마이그레이션된 셀 % 마이그레이션 영역)으로 나눕니다. 이미지당 이 작업을 수행하며, 웰당 마이그레이션을 기반으로 평균이 아닙니다.
  2. 이미지당 값을 정규화한 후 두 이미지의 값을 추가하여 개별을 잘 나타냅니다. 이 값은 그래픽 및 통계 분석에 사용됩니다. 실험 설계에 여러 복제가 포함되어 있는 경우. 통계 분석 전에 평균 복제 값입니다.

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Representative Results

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이 절차는 대부분의 실험실에서 비용 효율적이고 쉽게 적응할 수 있는 세포 마이그레이션을 연구하는 새로운 접근 방식을 문서화합니다. 많은 연구는 세포 이동을 평가하기 위하여 시간 경과 현미경 검사를 사용했습니다, 그러나 이 방법에 필요한 장비는 많은 실험실에서 쉽게 유효하지 않습니다. 경계에 대한 라인과 대시를 활용하면 고가의 장비를 사용하지 않고 다른 시점에서 특정 관심 영역을 탈환 할 수 있습니다(그림 1도 3). 경계의 사용은이 새로운 접근 방식에 필수적이지만, 개별 연구원의 요구에 맞게 적응 할 수있는이 방법의 많은 영역이 있다. 프로토콜은 24h 끝점을 나타냈다. 그러나 개별 랩의 요구에 따라 해당 끝점을 확장할 수 있습니다. 프로토콜의 끝점을 조정하면 추가 사용을 위해 세포의 지속적인 배양이 가능합니다. 또한 이 프로토콜은 약리학적 수정자뿐만 아니라 세포외 매트릭스 기판이 마이그레이션에 미치는 영향을 테스트할 수 있는 유연성을 허용합니다. 마지막으로, 이 방법의 가장 비용이 많이 드는 구성 요소는 소프트웨어 라이센스가 부여될 수 있는 이미징 소프트웨어를 사용하는 것이지만 라이센스가 부여된 소프트웨어를 사용하는 것이 유일한 옵션은 아닙니다. 이러한 방법으로 라인 생성 및 오버레이 이미지를 허용하는 다른 이미징 소프트웨어를 활용할 수 있습니다. 또한, 이 방법의 비용 효과적이고 적응가능한 특성에, 스크래치 영역을 고려하여 세포 이동을 검사하는 새로운 접근법을 제시한다.

이 새로운 접근법은 최근에 비 당뇨병과 당뇨병 심혼 (20)에서 분리된 세포 사이 심장 섬유아세포 이동에 있는 다름을 평가하기 위하여 Burr 외.2020에서최근에 이용되었습니다. 그림 3은 섬유아세포 이동을 평가하는 데 사용되는 대표적인 이미지를 제공합니다. 이러한 이미지에서, 그것은 결정 되었다 46 비 당뇨병 심장에서 섬유 아 세포와 당뇨병 심장에서 129 섬유 아 세포 실험의 시간 동안 마이그레이션 했다. 그룹 비교시, 당뇨병 심혼에서 세포의 수는 비 당뇨병 심혼에서 세포보다는 2.8배 더 큰 이동하였다(표 1). 이 결과는 당뇨병 심혼에서 세포가 더 많은 이동했다는 것을 표시하는 동안, 스크래치의 영역이 두 그룹의 각각에 대해 달랐기 때문에 숫자는 오해의 소지가 있었습니다. 비당뇨병 스크래치 영역은 측정된 전체 면적의 24.78%였으며, 당뇨병 이동 스크래치는 측정된 전체 면적의 16.77%였다. 스크래치 영역이 고려되었을 때, 당뇨병 심혼에서 섬유아세포가 실제로 비 당뇨병 심혼에서 세포보다 4.13배 더 많이 이주했음을 나타내는 비율(세포 수/% 스크래치 영역)을 제공했습니다. 이러한 결과는 마이그레이션 에세이를 수행할 때 마이그레이션 영역을 고려하는 것이 중요하다는 점을 강조했습니다.

마이그레이션 영역으로 정규화하면 세포 마이그레이션에 대한 더 나은 엄격한 평가를 제공하고 잠재적인 인적 오류를 무효화합니다. 설명된 방법은 균일하고 일관된 스크래치를 제공해야 하는 P200 파이펫 팁을 사용하지만, 인간의 불일치로 인해 고르지 않은 스크래치가 발생할 수 있습니다. 그림 5는 스크래치 영역의 차이를 고려하는 것의 중요성을 강조합니다. 이동된 섬유아세포 수만 비교하면 그림 5A가 도 5B에비해 마이그레이션된 셀의 수가 두 배임을 보여 준다. 스크래치 영역이 데이터를 정규화하는 데 사용되는 반면, 마이그레이션 영역에 대한 섬유아세포의 비율이 도 5A 및 도 5B모두에서 유사하다는 것을 나타낸다. 이 예를 들어, 우리는 다른 섬유아세포 격리에서 치료되지 않은 당뇨병 심장 섬유아를 사용했습니다. 따라서 그림 5에사용되는 셀의 특성으로 인해 유사한 마이그레이션 비율이 예상된 결과여야 합니다. 하나는 마이그레이션 된 세포의 수만 제시하는 경우, 긁힌 영역이 모든 샘플에 걸쳐 균일하고 일치하지 않는 경우 이러한 발견은 잘못된 대표 가 될 수 있습니다. 따라서 이 메서드뿐만 아니라 다른 스크래치 마이그레이션 에세이를 사용하여 긁힌 영역을 설명하는 것이 중요합니다. 그림 5에 제시된 이러한 표현된 결과는 긁힌 영역으로 마이그레이션된 셀 수를 정규화하면 정확하고 반복 가능하며 신뢰할 수 있는 마이그레이션 데이터를 제시할 수 있는 방법을 보여 주었다.

Figure 1
도 1: 섬유아세포 스크래치 마이그레이션 분석용 실험 설계의 다이어그램입니다. 설정: 세포를 잘 도금하기 전에 접시의 하단에 선과 3 개의 대시 마크를 그립니다. 0 h: 95%의 수렴성까지 배양 세포와 묘사된 선을 평행하게 하는 스크래치를 관리한다. 중간 대시 위와 아래 섹션을 선택하여 0h 이미지를 캡처합니다. 24 h: 셀이 고정 및 염색하기 전에 24시간 동안 마이그레이션되도록 허용합니다. 24h 이미지의 경우 0h 이미지와 동일한 위치에 잘 정렬하여 마이그레이션된 셀을 캡처합니다. 분석: 0h 이미지에서 마이그레이션 영역을 윤곽을 그리은 다음 0h 이미지를 24h 이미지에 오버레이하여 마이그레이션 및 영역 이미지를 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: Coomassie 염색을 보여주는 대표적인 이미지는 셀의 시각화를 방해하지 않습니다. 심장 섬유아세포는 콜라겐(플라스틱 접시), 비당뇨병 마우스 꼬리로부터 분리된 콜라겐 또는 당뇨병 생쥐 꼬리로부터 분리된 콜라겐에 도금되었다. 세포는 여기에 설명된 방법에 따라 스크래치 마이그레이션 분석서에 사용되었다. 세포는 1% 쿠마시 브릴리언트 블루 얼룩으로 염색되었고, 그 후 이주하는 세포의 이미지가 포착되었다. 이미지에 묘사된 스케일 바는 100μm입니다. 콜라겐 에 콜라겐 격리 및/또는 세포 이동에 대한 세부 사항은 Burr 외20에제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 비 당뇨병 세포와 당뇨병 세포 사이 심장 섬유아세포 이동에 있는 다름을 보여주는 대표적인 데이터. 0 h 및 24h 이미지는 비 당뇨병 및 당뇨병 마우스로부터 분리된 이동된 심장 섬유아세포 수를 계산하는 데 사용됩니다(레드 라인은 스케일 바 = 100 μm으로 20배에서 촬영한 이동 및 이미지의 영역을 묘사합니다). 당뇨병 심장 세포는 129개의 세포가 16.77%의 영역에서 이주하여 7.69의 이주율을 생성했습니다. 비 당뇨병 섬유아세포는 1.86의 비율로 이끌어 온 24.78%의 지역으로 46개의 세포가 이주했습니다. 이 그림에 제시된 이미지는 Burr 외20에 제시된 결과에 사용되었지만 여기에 묘사된 이미지는 Burr 외20에표시되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 마이그레이션 이미지 영역의 생성을 묘사하는 다이어그램입니다. #1 단계: 마이그레이션 줄이 포함된 마이그레이션 이미지를 엽니다. #2 단계: 24h 이미지가 제거되어 이미지 필드의 마이그레이션 줄에 남습니다. #3 단계: 브러시 도구가 마이그레이션 영역을 채우는 데 사용되었습니다. #4 단계: 이미지가 회색 크기로 변환된 다음 새 이미지로 저장됩니다. 배율 막대는 100 μm을 나타냅니다.

Figure 5
그림 5: 다른 마이그레이션 영역이 섬유아세포 마이그레이션에 미치는 영향의 예입니다. 비 당뇨병 심장 섬유아세포는 플라스틱 배양 접시에 도금되어 위에서 설명한 바와 같이 스크래치 마이그레이션 분석에서 사용되었다(스케일 바 = 100 μm). (A)92의 이동 섬유아세포는 35.4%의 백분율 면적을 가지며 2.60의 이주율을 기록했다. (B)45 섬유아세포는 2.56의 비율을 계산하는 17.57%의 영역으로 마이그레이션하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

섬유아세포 타입 마이그레이션된 셀의 평균 수 스크래치의 평균 영역 셀 수에서 긁힌 영역 비율까지
비 당뇨병 심혼에서 섬유아세포 46 24.78% 1.86
당뇨병 심장에서 섬유 아세포 129 16.77% 7.69

표 1: 비 당뇨병 및 당뇨병 심장 섬유아제를 사용하여 마이그레이션 스크래치 분석에서 마이그레이션 데이터. 이동한 비당뇨병 및 당뇨 섬유아세포의 수는 도 3를사용하여 결정되었다. 각 이미지의 백분율 영역은 설명된 메서드 및 ImageJ를 사용하여 계산되었습니다. 마이그레이션 비율은 마이그레이션된 섬유아세포 수를 백분율 마이그레이션 영역으로 나누어 계산했습니다.

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Discussion

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스크래치 마이그레이션 분석법에 대한 이 새로운 접근 법은 연구원이 세포 마이그레이션의 변화를 검사하는 데 보다 접근 가능한 방법을 제공합니다. 이 분석은 다른 스크래치 분석법과 유사한 스크래치를 투여하기 위한 동일한 절차를 따르지만, 세포이동(10)의이미징 및 정확한 분석을 위한 새로운 방법을 제공한다. 이 방법은 장비 집약적인 시간 경과 현미경 검사법과 라이브 세포 이미징 챔버를 사용하는 대신 일반적으로 사용 가능한 실험실 장비의 사용을 자세히 설명합니다. 일반적인 반전 현미경 과 카메라를 활용, 하나는 일관된 문화 조건을 유지하면서 동시에 마이그레이션 이미지를 캡처 할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 고급 장비를 사용하지 않고 동일한 관심 영역의 정확한 이미징을 제공한다. 동일한 마이그레이션 영역을 캡처하면 셀 마이그레이션을 결정하는 불일치가 줄어들고 셀 마이그레이션을 보다 엄격하고 정확하게 측정할 수 있습니다. 마지막으로 이 메서드는 스크래치 영역을 고려합니다. 스크래치의 인간의 변화를 최소화하기 위해 주의를 기울이는 동안, 불일치는 여전히 발생할 수 있으며, 세포 이동 분석에 대한 정상화 요인으로 영역을 사용하는 것의 중요성을 입증합니다. 전반적으로 위에서 자세히 설명한 프로토콜은 세포 마이그레이션을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 강력한 도구에 대한 새로운 접근 방식을 제공합니다.

적응형 마이그레이션 분석서를 개발하면 연구를 위한 새로운 방법이 제공됩니다. 여기에 제시된 마이그레이션 분석은 특정 연구 질문을 검토하기 위해 수정할 수 있습니다. 특정 단백질의 활성화 또는 억제에 관한 수정이 이루어질 수 있습니다. 약리학적 수정자 (작용제 또는 길항제) 및 RNA 간섭과 같은 시약은 이주 및 특정 단백질에 대한 질문을 해결하기 위해 마이그레이션 전, 도중 또는 심지어 마이그레이션 후에 마이그레이션 분석에 적용 될 수 있습니다. 48 웰 디쉬의 소량은 또한 다른 비용 효율적인 방법입니다 수정자의 낮은 양을 추가 할 수 있습니다. 또한, 이러한 분석은 세포 외 매트릭스 구성 요소(ECM)가 세포 이동에 미치는 영향을 연구하도록 수정될 수 있다. 최근에는 당뇨병 외세포 매트릭스가 심장 섬유아세포이동(20)에미치는 영향을 평가하기 위해 당뇨병 및 비당뇨병 마우스로부터 분리된 콜라겐으로 세포 배양 판을 코팅한 이 방법을 적용하였다. 이 연구는 고립 된 콜라겐을 활용 하는 동안, 이 방법은 관심 있을 수 있는 다른 세포 외 구성 요소에 적응될 수 있습니다. ECM 마이그레이션의 영향을 평가하는 능력은마이그레이션20,21,22에ECM의 중요성을 나타내는 여러 연구로 인해 매우 유용합니다. ECM 단백질을 사용하여 발생할 수 있는 잠재적인 합병증과 고농축 ECM 용액으로 우물을 코팅하는 것은 세포의 시각화에 영향을 미칩니다. ECM이 세포의 이미징을 시각적으로 손상시킬 수 있는지 확인하기 위해 콜라겐과 같은 ECM을 사용하여 쿠마시 블루로 잘 코팅하고 얼룩을 두는 것이 좋습니다. ECM이 시각화 셀을 손상시키면 ECM 솔루션을 희석하면 이 문제가 개선되고 ECM에서 셀을 시각화할 수 있습니다.

이전 기술에 대한 이 새로운 접근 방식은 몇 가지 제한을 제시합니다. 이 방법은 작은 규모(48웰 세포 배양판)에 적응되어 있으며 더 큰 플레이트로 쉽게 전환되지 않을 수 있다. 웰의 크기와 이미지에서 캡처된 영역으로 인해 이 프로토콜은 마이그레이션 영역의 상당 부분을 문서화할 수 있습니다. 그러나 이 메서드를 더 큰 음차원으로 확장하면 마이그레이션 영역의 하위 부분을 캡처할 수 있습니다. 캡처된 이미지 수를 늘려 서 잠재적으로 해결할 수 있지만, 24h 이미지에 대해 이미지된 마이그레이션 영역을 다시 식별하려면 추가 메서드를 적용해야 할 수 있습니다. 또한, 이러한 방법은 스크래치 마이그레이션 분석에서 활용할 수 있는 세포로 제한됩니다. 전통적인 스크래치 마이그레이션 분석에서 반응하지 않는 셀은 이 원고 내에 제시된 접근 방식에 이상적이지 않을 수 있습니다. 이 방법에는 몇 가지 제한이 있지만 이 원고에 자세히 설명된 메서드를 수정하면 몇 가지 제한 사항이 완화될 수 있습니다.

스크래치 마이그레이션 분석법은 간단한 접근 방식을 따르지만 성공적인 분석기를 생성하기 위해 따라야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 중요한 단계는 우물 의 바닥에 표시 마크를 그리는 것입니다. 지표가 우물에 그려지지 않으면 24h 이미지에 대해 이미지화해야 하는 영역을 차별화하고 동일한 마이그레이션 영역을 다시 캡처하는 것을 방지하는 것은 매우 어렵고 불가능합니다. 또한 0h 이미지에서 캡처된 24h 이미지에서 동일한 마이그레이션 영역을 다시 캡처하는 것이 중요합니다. 동일한 영역이 24h에서 캡처되지 않으면 마이그레이션을 위해 이미지를 오버레이하는 것이 불가능합니다. 오버레이 된 이미지가 없으면 마이그레이션된 셀을 확인할 수 없습니다. 오버레이 된 이미지는 셀 마이그레이션에 대한 정확한 측정을 제공하기 때문에이 접근 방식에 중요합니다. 스크래치 메서드가 항상 직선 스크래치 라인을 제공하지는 않으므로 오버레이 이미지를 생성하기 위해 올바른 영역을 이미지화하는 것이 중요합니다. 오버레이 이미지는 이 원고 내에 제시된 이 마이그레이션 분석의 정확성을 위한 토대를 제공합니다.

스크래치 마이그레이션 분석의 새로운 적응은 세포 마이그레이션을 검사하는 데 보다 접근가능하고 유연한 접근 방식을 제공합니다. 이전 세포 마이그레이션 연구는 모든 실험실에서 일반적으로 사용할 수 없는 장비 집약적인 방법을 사용 했습니다. 접근성범위가 넓어지는 마이그레이션 분석의 개발이 필수적임을 나타냅니다. 이 원고는 세포 이동에 관심이있는 연구진에게 접근성을 증가시킬 오래된 기술에 대한 새로운 접근 방식을 설명했습니다. 또한, 이 방법은 세포 외 매트릭스 구성 요소 또는 약리학적 수정제의 사용 여부에 관계없이 세포 배양 환경을 변화시키는 기능을 제공하여 세포 이동에 미치는 영향을 결정합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 미국 육군 의학 연구 상 #81XWH-16-1-0710, 미시시피 대학 약국 및 생물 분자 과학부에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe All Apps Adobe This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile MIDSCI AVR1 Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera Zeiss 426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher Scientific BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells Fisher Scientific 07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate Fisher Scientific MT10014CM
Image J NIH This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum Innovative Research IFBS-HU
Primocin InvivoGEN ant-pm-2 This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope Zeiss 491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software Zeiss software comes with camera purchase

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References

  1. Gilbert, S. F. Developmental biology. Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
  2. Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
  3. Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281, (19), 13209-13216 (2006).
  4. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2, (4), (2012).
  5. Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
  6. Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1, (4), 171-175 (2007).
  7. Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7, (183), 1-9 (2014).
  8. Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340, (1), 117-126 (2010).
  9. Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 7 (2014).
  10. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752, (1), 10-24 (2013).
  11. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
  12. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
  13. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
  14. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2, (2), 329-333 (2007).
  15. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, (1), 107-124 (2011).
  16. Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316, (7), 1271-1281 (2010).
  17. Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 412-422 (2015).
  18. Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, (11), (1971).
  19. Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
  20. Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  21. Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
  22. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (39), 2595-2604 (2012).
비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석
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Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).More

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).

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