Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En omkostningseffektiv og fleksibel Scratch Migration Assay

doi: 10.3791/61527 Published: June 30, 2020

Summary

Vi præsenterer en omkostningseffektiv metode til scratch migration assay, der giver en ny tilgang til bestemmelse af celle migration uden brug af udstyr-intensive metoder. Mens fibroblaster blev brugt i denne protokol, Det kan tilpasses og udnyttes til at studere yderligere celletyper og påvirkninger på celle migration.

Abstract

Cellemigration er en vigtig komponent i både fysiologiske og patologiske hændelser. Normal cellemigration er nødvendig for væsentlige funktioner såsom udvikling og montering af et immunrespons. Når en defekt eller ændring sker med celle migration proces, det kan have skadelige resultater (dvs. kræft metastase, sårheling, og ardannelse). På grund af vigtigheden af cellemigrering er det nødvendigt at have adgang til en cellemigreringsanalyse, der er overkommelig, fleksibel og repeterbar. Ved hjælp af den fælles scratch migration analyse, har vi udviklet en ny tilgang til at analysere celle migration, der bruger generelle laboratorieudstyr. Den beskrevne metode anvender visuelle markører, der gør det muligt at generobre bestemte områder af interesse uden brug af tidsforskænde mikroskopi. Desuden giver det fleksibilitet i forsøgsdesignet, lige fra ændring af migrationsmatrixunderlaget til tilsætning af farmakologiske modifikatorer. Desuden skitserer denne protokol en måde at tage højde for området cellemigrering på, hvilket ikke betragtes ved flere metoder, når cellemigrering undersøges. Denne nye tilgang giver en ridse migration assay til et større publikum og vil give større mulighed for forskere til at undersøge de fysiologiske og patofysiologiske virkninger af celle migration.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cellemigration er afgørende for mange fysiologiske såvel som patologiske hændelser. Det er nødvendigt under udvikling, for montering af en immunrespons, og for korrekt sårheling1,2,3. Mange af disse cellemigrationshændelser kan udløses af fysiske eller kemiske signaler. For eksempel, under en immunrespons, leukocytter vil migrere mod et sted for skade som reaktion på en chemoattractant2. Derudover vil leukocytter også frigive cytokiner for at fremkalde migration af yderligere immunceller samt andre celletyper, såsom fibroblaster, som er involveret i sårhelingsprocessen, og dermed indlede en flercellet respons4. Cellernes evne til at migrere er afgørende for korrekt fysiologisk funktion; men når cellemigration går ukontrolleret, kan det have en negativ respons og bidrage til patologiske hændelser, såsom kronisk inflammation, vaskulær sygdom, kræftmetastase, og nedsat sårheling2,3,4,5,6,7. Nedsat sårheling er en almindelig lidelse af diabetikere på grund af fejl i cellemigration, og hvis disse defekter ikke er rettet, kan det føre til yderligere komplikationer (f.eks amputation8,9). Denne undersøgelse, såvel som andre, har vist behovet for yderligere at forstå den proces, hvorefter celle migration opstår, enten under normale fysiologiske eller patologiske forhold, og det er afgørende for at fremme dette forskningsområde. For at opnå dette, der skal være migration analyser til rådighed, der er både tilgængelige og overkommelige for de forskere, der måske ikke besidder det nødvendige udstyr til at udføre disse analyser.

I øjeblikket er der en række migrationsanalyser til rådighed for at undersøge en bred vifte af emner vedrørende cellemigrering. Der er udviklet både 2D- og 3D-migreringsmodeller, som hver især er rettet mod specifikke områder, der påvirker cellemigrering. 3D-migrationsmodeller er typisk forbundet med celleinvasionsundersøgelser og vurderer virkningen af ekstracellulær matrix på cellemigration10,11,12, mens 2D-migrationsanalyser har en større vifte af anvendelses- og primært anvendes til at studere kemisk migration, sårheling og funktionelle ændringer under cellemigration13,14,15,16. Flere af disse analyser kræver ekstra udstyr, såsom Boyden kamre eller udelukkelse ringe, som kan reducere tilgængeligheden af disse analyser til visse forskere. En af de mere omkostningseffektive analyser er ridseanalysen, som typisk bruges til at vurdere sårheling og generelle ændringer i cellemigration14,17. Mens de fleste laboratorier er udstyret til at foretage en ridse analyse, det udstyr, der anvendes til at spore celle migration tendens til enten at være utilgængelige eller for dyrt at købe. Dette omfatter time-lapse mikroskopi, som kræver en omvendt mikroskop og en levende billeddannelse system. Disse dyre stykker udstyr er ikke almindeligt tilgængelige for alle laboratorr. Derfor understreger denne observation behovet for en ny protokol, der gør det muligt at vurdere cellemigration med lettere tilgængeligt udstyr.

Den protokol, der præsenteres her, giver en ny og økonomisk overkommelig måde at vurdere cellemigrering på. Denne metode følger den samme procedure forbundet med ridse analyser, men adskiller sig i analysen af at undersøge celle migration ved at udnytte udstyr mere almindeligt tilgængelige i en grundlæggende videnskaber laboratorium indstilling. Denne protokol ved hjælp af fælles udstyr giver mulighed for en mere præcis bestemmelse af cellemigrering uden brug af time-lapse mikroskopi. Ud over at bestemme migrering tager denne metode også hensyn til variable faktorer i arbejdsområdet, som er blevet bemærket for at påvirke cellemigrering betydeligt. Samlet set giver denne nye protokol til cellemigreringsanalyse flere laboratorier mulighed for at udforske og bidrage til cellemigreringsområdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Generel cellekultur

  1. Kultur hjertefibroblaster i Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM), der indeholder 1 g/l-glukose, natriumpyruvat, L-glutamin, suppleret med 14,2 mM NaHCO3,14,9 mM HEPES, 15% varmeinaktiveret føtalt kvægserum (FBS), 2% L-glutamin og 0,02% antimikrobiel reagens (se tabel over materialer) og opbevares i CO2 inkubator ved 37 °C.
  2. Kultur hjertefibroblaster indtil 90-95% sammenløbet er nået ved passage 0 (P0). På dette tidspunkt fibroblaster er klar til at blive opdelt i en 48-brønd plade, som bruges til migration assay.

2. Fremstilling af migrationspladen

  1. Forbered en 48-brønd celle kultur plade ved at tegne en linje, ved hjælp af en gul eller lyse permanent markør, ned i midten af brønden. Træk derefter tre hash-mærker, der deler brønden i tre separate interesseområder. Disse afsnit vil blive brugt til billedbehandling.
    BEMÆRK: Brug af en lys farve permanent markør vil give mulighed for nem billeddannelse af migrerende celler. Mørke mærker som sort eller blå vil forhindre visualisering af migrerende celler.
  2. Hvis migrationen vurderes på et underlag (f.eks. kollagen), skal brønden på dette tidspunkt anvendes efter instruktioner og koncentrationer, der anvendes til det specifikke substrat.
  3. Plade ~ 15.000-20.000 hjertefibroblaster, P1, i hver brønd og kulturceller, under normale dyrkning betingelser (betingelser, der er anført i foregående afsnit), indtil de når 90-95% sammenløb. Sammenløbet skal nås mellem 24-48 timer.
    BEMÆRK: Når du konfigurerer migreringspladen, skal du sørge for at inkludere en positiv kontrol (en kendt trækcelle, såsom 3T3 celler18),en negativ kontrol (afsklæde celler) og en tom brønd.

3. Scratch migration assay & fiksering

  1. Når cellerne når 90-95% sammenløb, skal du fjerne mediet og ridse langs den tegnede linje ved hjælp af en steril P200 pipettespids.
    BEMÆRK: En P200 pipettespids er den fælles pipettespidsstørrelse, der anvendes sammen medridseanalysen 10,14,19. Også, kun gøre en pass med P200 tip som mere end ét forsøg kan resultere i flere ridser linjer.
  2. Skyl brønden med lave serummedier (1,5% FBS) for at fjerne eventuelle uindsatte hjertefibroblaster.
  3. Der tilsættes 500 μL lave serummedier til hver brønd. Hvis du bruger nogen farmakologiske midler, tilføje dem på dette tidspunkt.
    BEMÆRK: Lav serum medier anvendes, fordi det tillader / fremmer celle migration at forekomme og forhindrer fibroblaster i at formere sig, som kunne skævvride resultaterne af migration assay20. Til denne protokol blev der anvendt 1,5 % FBS.
  4. Optag 0 h billeder, før du inkuberer fibroblasterne i en 5% CO2-inkubator ved 37 °C i 24 timer.
    1. Optag 0 h billeder ved hjælp af et omvendt mikroskop med en 20x mål. Tag to 0 h billeder per brønd. Dette vil give mulighed for en mere fuldstændig dækning af migrationslinjen.
    2. Brug markeringerne (streger og streger) til at placere brønden for at fange den øverste halvdel af bunden. Undgå at afbilde den midterste streg for at sikre, at det samme migrationsområde ikke afbildes to gange, hvilket kan skævvride resultaterne.
    3. Brug billedbehandlingssoftware (Materialetabel )til at optage 0 h #1. Flyt derefter pladen til at placere den nederste halvdel af brønden / linjen af bunden i betragtning af kameraet. Igen, undgå at fange den midterste bindestreg. Når den er på plads, skal du tage 0 h #2 (Figur 1).
      BEMÆRK: Undgå den midterste bindestreg i begge 0 h billeder vil forhindre optagelse områder af migration to gange, som hvis det gøres kunne producere gentagne resultater og skæve data.
  5. Efter inkubering i 24 timer fjernes mediet fra brønden, og brønden vaskes med 1x nonsterile PBS (fremover er alle 1x PBS anvendes nonsterile).
  6. I røghætten tilsættes 500 μL 4% paraformaldehyd til brønden og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
  7. Fjern paraformaldehyd og vask 3x med 1x PBS i 5 min hver på RT.
  8. Når cellerne er vasket, fortsætte med at fange 24 h billeder eller tilføje 1x PBS til hver brønd og sted ved 4 °C indtil et senere tidspunkt. Celler kan blive ved 4 °C i 1-2 uger, indtil de er klar til billedet.
    1. Permeabilize cellerne ved at tilføje 300 μL permeabilizing opløsning (1x PBS og 0,01% triton X-100) til hver brønd. Inkuber celler/plade med blid, kontinuerlig rokkende i 30 minutter ved RT.
    2. Fjern permeabilizing løsning og tilsæt 1% Coomassie Brilliant Blue plet (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% eddikesyre, 45% methanol, og 45% dH2O) i 10 min med blid, kontinuerlig vuggende på RT.
      BEMÆRK: Hvis pladerne er belagt med et ekstracellulært matrixunderlag, skal du sørge for at teste en belagt plade med Coomassie-farvning, før der udføres migrationsanalyse. Figur 2 viser, at et matrixunderlag kan anvendes sammen med denne analyse og ikke påvirke visualiseringen af celler.
    3. Vask brønde 3x med 1x PBS på RT med løbende rokkende i 5 min hver.
    4. Efter vask, tilsat 300 μL af 1x PBS og fange 24 h billeder.
    5. Optag 24 h billeder ved at justere brønden i samme position, der blev brugt til at fange 0 h billeder. For at opnå dette skal du åbne de tidligere optagne 0 h billeder og ved hjælp af mærkningen lavet med den permanente markør, justere godt i samme position. Linjen ned i midten og yderligere bindestreg mærker bør give mulighed for tæt justering mellem 24 h billedet og 0 h billede (Figur 1).

4. Forberedelse af 0 h og 24 timer billeder

  1. Åbn 0 h og 24 h billeder taget af samme godt og position i billedbehandling software (Tabel over materialer).
  2. Opret et nyt lag på 0 h-billedet. Klik derefter på det nye lag, og skift navnet på laget til "linjelag" ved at dobbeltklikke på teksten.
    BEMÆRK: Dette lag kaldes linjelag fra dette punkt og frem.
  3. Klik på Penselværktøjet (penselikonet), og angiv størrelsen til 10 px og farven til rød.
  4. Når streglaget er markeret, skal du tegne to, separate linjer, der skitserer arbejdsområdet. Linjerne må ikke berøre celler på grund af disse linjer, der markerer migrationsområdet.
  5. Klik på flytteværktøjet (pileikonet), og tryk derefter på Ctrl-knappen, og klik på både linje- og baggrundslagene.
  6. Klik i midten af 0 h billedet og træk begge disse lag til midten af 24 h billedet.
  7. Nu bruger 24 h billede, skal du klikke på 0 h baggrundslag og ændre opacitet til 50%.
  8. Hold Ctrl-knappen nede, klik på både 0 h baggrund og linje lag og derefter fri omdanne lagene(Edit>Free Transform). Ved hjælp af fri transformation skal du justere 0 h-baggrunds- og linjebilledet til 24 timers baggrundsbilledet. Dette trin resulterer i overlejring af 0 h og 24 h billede, som er nødvendig for at placere de linjer, der markerer migrationsområdet i den korrekte position på 24 h billedet.
  9. Når du har overlejret 0 h baggrunden og linjelagene på baggrundsbilledet på 24 h, skal du slette baggrundslaget på 0 h. Slet ved at klikke på 0 h baggrundslaget, højreklik, og klik på Slet lag.
  10. Hvis du sletter baggrundsbilledet på 0 h, efterlades det kun linjen og baggrundslaget på 24 timer (nu kaldet overførselsbillede). Linjelaget angiver migrations-/ridseområdet på 24 h-billedet og kan bruges til at bestemme antallet af migrerende celler.
  11. Gem som det nye overførselsbillede som både en Photoshop-fil og en TIFF/JPEG. BEMÆRK: En repræsentativ figur, der viser denne proces, præsenteres i figur 3.

5. Optælling af antallet af migrerende celler

  1. Åbn overførselsbilledet. Dette kan gøres i et program, der accepterer TIFF / JPEG-filer (Tabel over Materialer).
  2. Tæl antallet af celler, der er placeret i mellem, samt røre ved de to røde linjer.
  3. Post antallet af overtrerende celler pr. billede. Der vil være to migrerende billeder pr. brønd, og disse værdier bør ikke kombineres, før værdierne er blevet korrigeret for migrationsområdet (beskrevet i næste afsnit).

6. Fastgør migrationsområdet

  1. Åbn det 24 h-billede, der indeholder de linjer for migrering i billedbehandlingsprogrammet i afsnit 5 (Tabel over materialer).
  2. Gem som dette billede som "Billede af overførselsområde".
  3. Når du har gemt, skal du klikke på baggrundslaget, højreklikke og klikke på Slet lag. Dette bør kun efterlade ridselinjerne på billedet (Figur 3).
  4. Brug af penselværktøjet (penselikonet) udfyld området mellem ridselinjerne. Tilpas farven på penslen med den farve, der bruges til at tegne linjerne for overflytning.
  5. Skift billedet til en gråtoneskala for at generere etsort-hvidt billede (Billede>Tilstand>Gråtoneskala), og gem derefter billedet (Figur 4).
  6. Start analysesoftwaren (Tabel over Materialer), og åbn derefter filen "Område for migrering" i analysesoftwaren.
  7. Hvis du vil bestemme området for overflytningslinjen, skal du klikke på Billede>Juster>Tærskelværdi. Det sorte overførselsområde bliver rødt, og procentområdet vises i feltet Tærskel. Området vil blive rapporteret som den procentdel af området, som migrationslinjen dækker, sammenlignet med hele det område, der er optaget i billedet.
  8. Post procentområdet for overflytningslinjen, og sørg for, at denne værdi er parret med antallet af overflytningsceller for det samme billede.

7. Dataanalyse

  1. Normalgør antallet af migrerende celler til bundens område. Divider antallet af overflytningsceller med procentområdet for migrationslinjen (# overflyttede celler % Migrationsområde). Gør dette pr billede og ikke et gennemsnit baseret på migration pr brønd.
  2. Når du har normaliseret værdier pr. billede, skal du tilføje værdierne for de to billeder, som repræsenterer en individuel brønd. Denne værdi bruges til grafisk og statistisk analyse. Hvis det eksperimentelle design indeholdt flere replikater. Gennemsnitlige replikerede værdier før statistisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne procedure dokumenterer en ny tilgang til at studere cellemigrering, der både er omkostningseffektiv og let at tilpasse til de fleste laboratorier. Mange undersøgelser har brugt time-lapse mikroskopi til at vurdere celle migration, men det nødvendige udstyr til denne metode er ikke let tilgængelige for mange laboratorier. ud fra følgende betragtninger: Ved hjælp af linjer og streger til afgrænsning kan der genindbetegnes bestemte interesseområder på forskellige tidspunkter uden anvendelse af dyrt udstyr (figur 1 og figur 3). Selv om brugen af afgrænsninger er afgørende for denne nye tilgang, er der mange områder af denne metode, der kan tilpasses de enkelte forskeres behov. Protokollen indikerede et slutpunkt på 24 timer. dette slutpunkt kan dog udvides baseret på et individuelt laboratoriums behov. Justering af protokollens endepunkt kan give mulighed for fortsat dyrkning af celler til videre brug. Desuden giver denne protokol mulighed for fleksibilitet til at teste virkningen af farmakologiske modifikatorer samt ekstracellulære matrixunderlag på migration. Endelig er den dyreste komponent i denne metode brugen af billedbehandlingssoftware, som kan være licenseret software, men brugen af licenseret software er ikke den eneste mulighed. Andre billedbehandlingssoftware, der tillader generering af linjer og overlejring af billeder, kan udnyttes med denne metode. Ud over den omkostningseffektive og fleksible karakter af denne metode præsenterer den desuden en ny tilgang til undersøgelse af cellemigration ved at indregne bundens område.

Denne nye tilgang blev for nylig brugt i Burr et al. 2020 til at vurdere forskelle i hjertefibroblast migration mellem celler isoleret fra ikke-diabetisk og diabetisk hjerter20. Figur 3 viser repræsentative billeder, der bruges til at vurdere fibroblastmigration. Fra disse billeder, blev det fastslået, at 46 fibroblaster fra ikke-diabetisk hjerter og 129 fibroblaster fra diabetisk hjerter havde migreret i løbet af 24 timer af forsøget. Ved gruppesammenligninger havde antallet af celler fra diabetisk hjerter migreret 2,8 x større end celler fra ikke-diabetiske hjerter (Tabel 1). Mens disse resultater viste celler fra diabetisk hjerter havde migreret mere, tallene var vildledende, fordi området af bunden var forskellig for hver af de to grupper. Det ikke-diabetiske arbejdsområde var 24,78% af det samlede målte areal, mens diabetisk migrationskrab var 16,77% af det samlede målte areal. Når området af bunden blev overvejet, det gav et forhold (celle nummer /% bunden område), der angiver, at fibroblaster fra diabetisk hjerter faktisk migreret 4.13x større end celler fra ikke-diabetiske hjerter. Disse resultater understregede betydningen af at overveje migrationsområde, når der gennemføres migrationsanalyser.

Normalisering til migrationsområdet giver en bedre og mere stringent vurdering af cellemigration og ophæver potentielle menneskelige fejl. Mens den beskrevne metode bruger en P200 pipette spids, som bør give en ensartet og konsekvent ridser, ujævne ridser kan forekomme på grund af menneskelige uoverensstemmelser. Figur 5 fremhæver vigtigheden af at indregne forskelle i arbejdsområdet. Hvis man kun sammenlignede antallet af migrerede fibroblaster, ville det vise, at figur 5A har dobbelt så mange migrerede celler sammenlignet med figur 5B. Mens bundens areal anvendes til at normalisere dataene, indikerer det, at forholdet mellem fibroblaster og migrationsområdet er ens i både figur 5A og figur 5B. For dette eksempel, vi brugte ubehandlet ikke-diabetisk hjerte fibroblaster fra forskellige fibroblast isolationer; Derfor bør en lignende migrationsgrad være det forventede resultat på grund af arten af de celler, der anvendes i figur 5. Hvis man kun præsenterede antallet af migrerede celler, kunne disse fund være misvisende, hvis det ridsede område ikke er ensartet og ensartet på tværs af alle prøver. Derfor er det vigtigt at tage højde for det ridsede område med denne metode samt andre ridser migration assays. Disse repræsenterede resultater i figur 5 viste, hvordan en normalisering af antallet af migrerede celler til det ridsede område kan præsentere nøjagtige, repeterbare og pålidelige migrationsdata.

Figure 1
Figur 1: Diagram over det eksperimentelle design for fibroblast scratch migration assay. Opsætning: Før plating celler i godt, tegne en linje og 3 dash mærker på bunden på pladen. 0 h: Kulturceller indtil 95% sammenløb og administrere en ridse parallelt med den afbildede linje. Tag 0 h billeder ved at vælge en sektion over og under den midterste streg. 24 timer: Lad cellerne migrere i 24 timer, før de repareres og farves. I 24 timer store billeder skal du justere et godt stykke i samme position som 0 h-billeder for at optage overflyttede celler. Analyse: Konstér migrationsområdet på 0 h-billede, og overlejr derefter 0 h-billedet på 24-timers billedet for at generere migrations- og områdebilleder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder, der viser, at Coomassie-farvning ikke forstyrrer visualiseringen af celler. Hjerte fibroblaster blev belagt på enten ingen kollagen (plast fad), kollagen isoleret fra ikke-diabetiske mus haler, eller kollagen isoleret fra diabetisk mus haler. Cellerne blev brugt i bunden migration assay efter de metoder, der er beskrevet her. Celler blev plettet med 1% Coomassie Brilliant Blue plet og derefter billeder af migrerende celler blev fanget. Skalalinjen, der er afbildet på billedet, er 100 μm. Nærmere oplysninger om kollagenisolering og/eller cellemigration på kollagen præsenteres i Burr et al.20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative data, der viser forskellen i hjertefibroblastmigration mellem ikke-diabetiske og diabetiske celler. 0 h og 24 h billeder, der anvendes til at beregne antallet af migrerede hjertefibroblaster isoleret fra ikke-diabetiske og diabetiske mus (rød linje viser migrationsområdet og billeder taget ved 20x med skala bar = 100 μm). Diabetiske hjerteceller havde 129 celler migrere i et område på 16,77%, som producerede en migration ratio på 7,69. Ikke-diabetisk fibroblaster havde 46 celler migrere med et areal på 24,78%, som førte til et forhold på 1,86. Billederne i dette tal blev brugt i resultaterne præsenteret i Burr et al.20, men billederne afbildet her blev ikke vist i Burr et al.20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Diagram, der viser generering af område af migrationsbillede. Trin #1: Åbn overførselsbillede, der indeholder overflytningslinjer. Trin #2: 24 h billedet er fjernet, forlader på linjerne for migration i billedfeltet. Trin #3: Penselværktøjet blev brugt til at udfylde migrationsområdet. Trin #4: Billedet konverteres til gråtoneskala og gemmes derefter som et nyt billede. Skalalinjen repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Et eksempel på forskellige migrationsområders indvirkning på fibroblastmigration. Ikke-diabetisk hjertefibroblaster blev belagt på plastkulturretter og brugt i ridsemigrationsanalysen, som beskrevet ovenfor (skalabar = 100 μm). A) 92 migrerede fibroblaster med et procentareal på 35,4 pct., hvilket resulterede i et migrationsforhold på 2,60. (B) 45 fibroblaster migreret med et areal på 17,57%, der beregner et forhold på 2,56. Klik her for at se en større version af dette tal.

Fibroblast Type Gennemsnitligt antal overflyttede celler Gennemsnitligt område af bunden Celletal til ridset områdeforhold
Fibroblaster fra ikke-diabetiske hjerter 46 24.78% 1.86
Fibroblaster fra diabetisk hjerter 129 16.77% 7.69

Tabel 1: Migrationsdata fra migrations scratch-analyse ved hjælp af ikke-diabetisk og diabetisk hjertefiblæst. Antallet af ikke-diabetiske og diabetiske fibroblaster, der migrerede, blev bestemt ved hjælp af figur 3. Procentområdet for hvert billede blev beregnet ved hjælp af beskrevne metoder og ImageJ. Forholdet mellem migration blev beregnet ved at dividere antallet af migrerede fibroblaster med procentvis migrationsområdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne nye tilgang til scratch migration assay giver en mere tilgængelig metode for forskere til at undersøge ændringer i celle migration. Mens denne analyse følger den samme procedure for administration af en ridse svarende til andre ridser, det giver en ny metode til billeddannelse og nøjagtig analyse af celle migration10. I stedet for at bruge udstyrsintensive metoder til time-lapse-mikroskopi og levende cellebilleddannelseskamre beskriver denne metode brugen af almindeligt tilgængeligt laboratorieudstyr. Ved hjælp af en generel omvendt mikroskop og kamera, kan man fange migration billeder på samme tid og samtidig opretholde konsekvent kultur betingelser. Desuden giver denne metode en præcis billeddannelse af samme interesseregion uden brug af avanceret udstyr. Hvis du registrerer det samme migrationsområde, reduceres uoverensstemmelserne ved bestemmelse af cellemigrering, og det giver en strengere og mere nøjagtig måling af cellemigrering. Endelig tager denne metode hensyn til bundens område. Mens forsigtighed er taget for at minimere menneskelige variationer i ridser, uoverensstemmelser stadig kan forekomme, viser betydningen af at bruge området som en normaliserende faktor i analysen af celle migration. Samlet set indeholder protokollen ovenfor en ny tilgang til et effektivt værktøj, der almindeligvis anvendes til at vurdere cellemigrering.

Udvikling af en fleksibel migrationsanalyse giver nye muligheder for forskning. Den migrationsanalyse, der præsenteres her, har evnen til at blive ændret for at undersøge specifikke forskningsspørgsmål. Der kan foretages ændringer med hensyn til aktivering eller hæmning af specifikke proteiner af interesse. Reagenser såsom farmakologiske modifikatorer (agonister eller antagonister) og RNA-interferens kan anvendes på migrationsanalyse før, under eller endda efter migration for at behandle spørgsmål om migration og specifikke proteiner. Den lille mængde af de 48 godt fad giver også mulighed for lavere mængder af modifikatorer, der skal tilføjes, hvilket er en anden omkostningseffektiv metode. Desuden kan denne analyse ændres for at undersøge virkningen af ekstracellulære matrixkomponenter (ECM) på cellemigration. For nylig har vi anvendt denne metode, hvor cellekultur plader blev belagt med kollagen isoleret fra diabetisk og ikke-diabetisk mus til at vurdere virkningen af diabetisk ekstracellulære matrix har på hjertefibroblast migration20. Mens denne undersøgelse udnyttet isoleret kollagen, denne metode kan tilpasses til andre ekstracellulære komponenter, der kan være af interesse. Evnen til at vurdere virkningen af ECM-migration er meget nyttig på grund af flere undersøgelser , der viser, hvor vigtig ECM har for migration20,21,22. En potentiel komplikation, der kan opstå ved brug af ECM-proteiner og belægning af brønde med stærkt koncentreret ECM-opløsning, er en indvirkning på visualiseringen af celler. Det anbefales, hvis du bruger ECM, som kollagen, at pels en brønd og plet med Coomassie blå for at se, om ECM kunne svagtse billeddannelse af celler. Hvis ECM forringer visualiseringsceller, vil fortynding af ECM-løsning forbedre dette problem og gøre det muligt at visualisere celler på ECM.

Denne nye tilgang til en gammel teknik præsenterer nogle begrænsninger. Denne metode er blevet tilpasset til en lille skala (48-godt cellekultur plade) og kan ikke skifte til større plader let. På grund af størrelsen af brønden og det område, der er taget i billederne, kan denne protokol dokumentere en stor del af migrationsområdet. Hvis du udvider denne metode til større brønddimensioner, kan det dog medføre, at der hentes en lavere del af overførselsområdet. Dette kan potentielt løses ved at øge antallet af optagne billeder, men der kan være behov for yderligere metoder til at sikre, at området med billeder af migrer kan identificeres igen for de 24 h-billeder. Desuden er denne metode begrænset til celler, der kan udnyttes i en ridse migration assay. Celler, der ikke reagerer i en traditionel ridse migration assay kan ikke være ideel til den tilgang, der præsenteres i dette manuskript. Selv om der er nogle begrænsninger med denne tilgang, kan en ændring af de metoder, der er beskrevet i dette manuskript, afhjælpe nogle af begrænsningerne.

Den ridse migration assay følger en simpel tilgang, men der er nogle kritiske skridt, der skal følges for at producere en vellykket analyse. Et afgørende skridt er at trække de angivende mærker på bunden af brønden. Hvis indikatorerne ikke trækkes på brøndene, vil det være meget vanskeligt/umuligt at skelne det område, der skal afbildes for 24-timers billedet, samt forhindre, at det samme migrationsområde generobres. Det er også vigtigt at generobre det samme migrationsområde i det 24 h-billede, der blev taget i 0 h-billedet. Hvis det samme område ikke er fanget ved 24 timer, vil det ikke være muligt at overlejre billederne for migrering. Uden overlejrede billeder vil det ikke være muligt at afgøre, hvilke celler der er migreret. De overlejrede billeder er afgørende for denne fremgangsmåde, fordi de giver en nøjagtig bestemmelse for cellemigrering. Da scratch-metoden ikke altid giver lige ridser, er det afgørende, at de korrekte områder afbildes for at generere de overlejrede billeder. De overlejrede billeder danner grundlaget for nøjagtigheden af denne migrationsanalyse, der præsenteres i dette manuskript.

En ny tilpasning af scratch migration assay giver en mere tilgængelig og fleksibel tilgang til at undersøge celle migration. Tidligere celle migration undersøgelser har brugt udstyr-intensive metoder, der ikke er almindeligt tilgængelige for alle laboratorium. Det er vigtigt at angive, at udviklingen af en migrationsanalyse, der har en bredere vifte af tilgængelighed, er afgørende. Dette manuskript beskrev en ny tilgang til en gammel teknik, der vil øge tilgængeligheden for forskere interesseret i cellemigration. Desuden giver denne metode mulighed for at ændre cellekulturmiljøet, enten via ekstracellulære matrixkomponenter eller brug af farmakologiske modifikatorer, for at bestemme den indvirkning, det har på cellemigration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af den amerikanske hær Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, University of Mississippi School of Pharmacy og Institut for BioMolekyrkulære Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe All Apps Adobe This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile MIDSCI AVR1 Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera Zeiss 426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher Scientific BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells Fisher Scientific 07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate Fisher Scientific MT10014CM
Image J NIH This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum Innovative Research IFBS-HU
Primocin InvivoGEN ant-pm-2 This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope Zeiss 491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software Zeiss software comes with camera purchase

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilbert, S. F. Developmental biology. Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
  2. Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
  3. Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281, (19), 13209-13216 (2006).
  4. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2, (4), (2012).
  5. Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
  6. Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1, (4), 171-175 (2007).
  7. Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7, (183), 1-9 (2014).
  8. Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340, (1), 117-126 (2010).
  9. Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 7 (2014).
  10. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752, (1), 10-24 (2013).
  11. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
  12. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
  13. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
  14. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2, (2), 329-333 (2007).
  15. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, (1), 107-124 (2011).
  16. Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316, (7), 1271-1281 (2010).
  17. Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 412-422 (2015).
  18. Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, (11), (1971).
  19. Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
  20. Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  21. Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
  22. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (39), 2595-2604 (2012).
En omkostningseffektiv og fleksibel Scratch Migration Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).More

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter