Summary
我们为划痕迁移分析提供了一种经济高效的方法，它提供了一种无需使用设备密集型方法即可确定细胞迁移的新方法。虽然本协议使用了成纤维细胞，但它可以被改编并用于研究其他细胞类型和对细胞迁移的影响。
Abstract
细胞迁移是生理和病理事件的关键组成部分。正常细胞迁移是基本功能（如开发和安装免疫反应）所需的。当细胞迁移过程中发生缺陷或改变时，它可能会产生有害的结果（即癌症转移、伤口愈合和疤痕形成）。由于细胞迁移的重要性，有必要获得经济实惠、适应性强且可重复的细胞迁移检测。利用常见的划痕迁移测定，我们开发了一种使用一般实验室设备分析细胞迁移的新方法。所述方法使用视觉标记，无需使用延时显微镜即可重述特定感兴趣的区域。此外，它还在实验设计中提供了灵活性，从改变迁移基质基质到添加药理修饰剂。此外，此协议概述了一种解释单元格迁移区域的方法，在检查单元格迁移时，有几种方法没有考虑该区域。这种新方法为更多的受众提供了划痕迁移分析，并将为研究人员提供更大的机会来研究细胞迁移的生理和病理生理影响。
Introduction
细胞迁移对于许多生理和病理事件都至关重要。这是需要在开发过程中，安装免疫反应，并适当的伤口愈合1，2，3。许多这些细胞迁移事件可能由物理或化学信号触发。例如，在免疫反应期间，白细胞会因化疗2而向损伤发生地迁移。此外，白细胞也将释放细胞因子，诱导其他免疫细胞的迁移，以及其他细胞类型，如成纤维细胞，参与伤口愈合过程，从而启动多细胞反应4。细胞的迁移能力对适当的生理功能至关重要;然而，当细胞迁移不加控制时，它可以有不良反应，并促成病理事件，如慢性炎症，血管疾病，癌症转移，和受损的伤口愈合2，3，4，5，6，7。受损的伤口愈合是糖尿病患者常见的疾病，由于细胞迁移的缺陷，如果这些缺陷不得到解决，它可能导致进一步的并发症（例如，截肢8，9）。这项研究，以及其他人，已经表明需要进一步了解细胞迁移的过程，无论是正常的生理或病理条件下，这对于推进这一领域的研究至关重要。为了做到这一点，需要提供迁移测定，这些研究人员可能不具备进行这些测定所需的设备，而且能够负担得起。
目前，有多种迁移分析可用于检查有关细胞迁移的广泛主题。已开发 2D 和 3D 迁移模型，每个模型都针对影响单元迁移的特定区域。3D迁移模型通常与细胞入侵研究相关，并评估细胞外基质对细胞迁移10、11、12的影响，而2D迁移分析具有更大的应用范围，主要用于研究细胞迁移过程中的化疗迁移、伤口愈合和功能变化。其中一些检测需要额外的设备，如博伊登室或排除环，这可以降低这些测定的可用性，某些研究人员。一个更经济效率的检测是划痕分析，它通常用于评估伤口愈合和细胞迁移的一般变化14，17。虽然大多数实验室都配备进行划痕检测，但用于跟踪细胞迁移的设备往往不可用或过于昂贵，无法购买。这包括延时显微镜，这需要倒置显微镜和实时成像系统。这些昂贵的设备通常不是每个实验室都能接触到的。因此，这一观察突出了需要一个新的协议，允许评估细胞迁移与更容易获得的设备。
此处介绍的协议提供了一种新的且经济实惠的方法来评估单元迁移。此方法遵循与划痕测定相关的相同过程，但在利用基础科学实验室环境中更常见的设备来检查细胞迁移的分析中有所不同。该协议使用通用设备，无需使用延时显微镜即可更准确地确定细胞迁移。除了确定迁移之外，此方法还考虑到划痕区域中的可变因素，这些因素已注意到对单元迁移产生很大影响。总体而言，这一新的细胞迁移分析协议为更多的实验室提供了探索和贡献细胞迁移领域的机会。
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Protocol
1. 一般细胞培养
- Dulbecco 的改性鹰介质 （DMEM） 中的培养性心脏成纤维细胞，含有 1 g/L 葡萄糖， 丙酮酸钠、L-谷氨酰胺，并辅以14.2 mM NaHCO 3、14.9 mM HEPES、15%热灭活胎儿牛血清（FBS）、2%L-谷氨酰胺和0.02%抗菌试剂（见材料表），并在37°C的CO2培养箱中保存。
- 培养心脏成纤维细胞，直到90-95%汇合到达通道0（P0）。此时，成纤维细胞已准备好被分割成一个48井板，用于迁移测定。
2. 准备迁移板
- 在井中心向下绘制一条线，使用黄色或浅色永久标记，准备一个 48 井的细胞培养板。然后，绘制三个哈希标记，将井划分为三个独立的感兴趣区域。这些部分将用于成像。
注：使用浅色永久标记可轻松成像迁移细胞。黑色或蓝色等深色标记将阻止迁移单元格的可视化。 - 如果评估基材（如胶原蛋白）的迁移，请按照特定基材的指令和浓度，此时涂覆井。
- 板 +15，000-20，000 心脏成纤维细胞，P1，进入每个井和培养细胞，在正常培养条件下（前一节所列条件），直到它们达到90-95%的汇合。应在 24-48 小时内到达汇合。
注：设置迁移板时，请确保包括正对照（已知迁移细胞，如 3T3 细胞18）、负对照（未刮接的细胞）和空白井。
3. 划痕迁移检测和固定
- 一旦细胞达到90-95%的汇合，用无菌P200移液器尖端去除介质并沿绘制的线划段。
注：P200移液器尖端是用于划痕测定10、14、19的常用移液器尖端。此外，使用 P200 尖端仅进行一次通过，因为多次尝试可能会导致多条划痕线。 - 用低血清介质（1.5% FBS）冲洗井，以去除任何未连接的心脏成纤维细胞。
- 在每个井中加入500μL的低血清介质。如果使用任何药理剂，此时添加它们。
注：使用低血清介质是因为它允许/促进细胞迁移发生，并防止成纤维细胞增殖，这可能扭曲迁移测定结果20。对于此协议，使用了 1.5% FBS。 - 在 37 °C 的 5% CO2 培养箱中孵化成纤维细胞之前，捕获 0 小时图像，24 小时。
- 使用 20 倍目标的倒置显微镜捕获 0 小时图像。每井拍摄两张 0 小时图像。这将允许更全面地覆盖迁移线。
- 使用标记（线条和破折号）定位井以捕获划痕线的上半部分。避免对中间破折号进行成像，以确保相同的迁移区域不会成像两次，这可能会扭曲结果。
- 使用成像软件 （材料表） 捕获 0 小时图像#1.然后移动板，在摄像机的视野中定位井/划痕线的下半部分。同样，避免捕获中间破折号。一旦到位，捕获 0 小时图像#2（图 1）。
注意：避免两个 0 h 图像的中间破折号将阻止捕获迁移区域两次，如果这样做可能会产生重复的结果和扭曲数据。
- 孵育24小时后，从井中去除介质，用1x非无菌PBS清洗井（因此，使用的所有1x PBS都是非无菌的）。
- 在烟罩中，向井中加入 500 μL 的 4% 对甲醛，并在室温 （RT） 下孵育 10 分钟。
- 去除甲醛，用1x PBS清洗3倍，在RT下各洗5分钟。
- 一旦细胞被洗净，继续捕捉24小时图像或添加1xPBS到每个井，并放在4°C，直到以后的时间。细胞可以在4°C下停留1-2周，直到准备好成像。
- 通过向每井添加300μL的渗透溶液（1x PBS和0.01%三吨X-100），使细胞渗透。在RT下，用温和、持续摇动的细胞/板孵育细胞/板30分钟。
- 去除渗透溶液，加入1%的库马西辉煌蓝色污渍（3%库马西辉煌蓝，10%醋酸，45%甲醇，和45%dH2O）10分钟，在RT温和，持续摇摆。
注：如果板涂有细胞外基质基板，在进行迁移检测之前，请务必用库马西染色测试涂层板。 图2 演示了基质基板可用于此测定，而不是影响细胞的可视化。 - 在RT下用1x PBS清洗井3倍，每次连续摇动5分钟。
- 洗涤后，添加300μL的1xPBS，并捕获24小时图像。
- 通过将井对齐到用于捕获 0 小时图像的相同位置，捕获 24 小时图像。为此，打开以前捕获的 0 h 图像并使用永久标记的标记，将井对齐到同一位置。中间的线和附加的破折号应允许在 24 小时图像和 0 h 图像之间保持紧密对齐（图 1）。
4. 准备 0 小时和 24 小时图像
- 打开 0 小时和 24 小时拍摄的相同井和成像软件位置的图像 （材料表） 。
- 在 0 h 图像上创建新图层。然后，单击新图层，通过双击文本将图层名称更改为"线图层"。
注：从这个角度看，此图层将称为线层。 - 单击画笔 工具 （画笔图标），将大小设置为 10 px，将颜色设置为红色。
- 选择线图层后，绘制两条单独的线，以勾勒出划痕区域的轮廓。由于这些线标记迁移区域，因此这些线不应接触任何单元格。
- 单击 "移动 工具"（箭头图标），然后按下 Ctrl 按钮，然后单击线条和背景图层。
- 单击 0 小时图像的中心，然后将两个图层拖动到 24 小时图像的中间。
- 现在使用 24 小时图像，单击 0 小时背景图层，将不透明度更改为 50%。
- 按住 Ctrl 按钮 ，单击 0 小时背景层和线图层，然后自由变换图层（编辑>自由变换）。使用自由变换，将 0 小时背景和线条图像与 24 小时背景图像对齐。此步骤导致覆盖 0 h 和 24 h 图像，这是将标记迁移区域的线条定位在 24 h 图像上的正确位置所必需的。
- 在成功将 0 小时背景和线图层叠加到 24 小时背景图像上后，删除 0 小时背景图层。通过单击 0 小时背景图层删除，然后右键单击，然后单击删除图层。
- 删除 0 h 背景图像将只留下线条和 24 小时背景图层（现在称为迁移图像）。线层将指示 24 h 图像上的迁移/刮擦区域，并可用于确定迁移单元的数量。
- 作为新的迁移图像保存为照片店文件和 TIFF/JPEG。注：图 3 中介绍了描述此过程 的代表性图。
5. 计算迁移单元格的数量
- 打开迁移映像。这可以在接受TIFF/JPEG文件的程序中完成（材料表）。
- 计算位于两者之间的单元格数，以及触摸两条红线。
- 记录每个图像的迁移单元格数。每个井将有两个迁移映像，这些值应在迁移区域的修正后合并（详见下一节）。
6. 确定移徙区域
- 打开第 5 节（材料表）中包含成像软件程序中的迁移线的 24 小时图像。
- 保存为此图像为"迁移区域图像"。
- 保存后，单击背景图层，右键单击，然后单击删除图层。这应该只留下图像上的暂行（图 3）。
- 使用画笔工具（画笔图标）填充划痕线之间的区域。将画笔的颜色与用于绘制迁移线条的颜色相匹配。
- 将图像更改为灰度以生成黑白图像（图像>Mode>灰度），然后保存图像（图 4）。
- 启动分析软件（材料表），然后在分析软件中打开"迁移区域"文件。
- 要确定迁移行的面积，请单击"图像 >调整"和"阈值"。黑色迁移区域将变红，百分比区域将在"阈值"框中指示。与图像中捕获的整个区域相比，该区域将报告为迁移行覆盖的区域的百分比。
- 记录迁移行的百分比区域，并确保此值与同一图像的迁移单元格数配对。
7. 数据分析
- 将迁移单元格的数量规范化为划痕的百分比区域。将迁移单元格的数量除以迁移行的百分比区域（# 迁移单元格% 迁移区域）。按图像执行此工作，而不是根据每个井的迁移进行平均值。
- 对每个图像的值进行规范化后，添加两个图像的值，这表示单个井。此值将用于图形和统计分析。如果实验设计包含多个复制。统计分析前的平均复制值。
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Representative Results
此过程记录了研究细胞迁移的新方法，这种方法对大多数实验室来说既经济高效又易于适应。许多研究都使用延时显微镜来评估细胞迁移，但许多实验室都不容易获得这种方法所需的设备。而利用线和破折号进行标界，可以重新获得不同时间点的特定感兴趣区域，而无需使用昂贵的设备（图1 和 图3）。虽然使用标界对于这一新方法至关重要，但这种方法的许多领域可以加以调整，以适应个别研究人员的需要。协议指示 24 小时端点;但是，可以根据单个实验室的需求扩展该终结点。调整协议的端点可以允许继续培养细胞供进一步使用。此外，该协议允许灵活测试药理修饰剂以及细胞外基质基质对迁移的影响。最后，此方法最昂贵的组件是使用映像软件，这可能是许可软件，但使用许可软件并不是唯一的选择。其他允许生成线条和叠加图像的成像软件可用于此方法。此外，为了具有成本效益和适应性，该方法还提出了一种通过考虑划痕区域来检查细胞迁移的新方法。
这种新方法最近在Burr等人2020年用于评估从非糖尿病和糖尿病心脏分离的细胞之间心脏成纤维细胞迁移的差异20。图 3提供了用于评估成纤维细胞迁移的代表性图像。根据这些图像，确定在实验的24小时期间，来自非糖尿病心脏的46个成纤维细胞和来自糖尿病心脏的129个成纤维细胞迁移。根据小组比较，糖尿病心脏的细胞迁移数量比非糖尿病心脏的细胞数量大2.8倍（表1）。虽然这些结果表明，来自糖尿病心脏的细胞迁移更多，但数字具有误导性，因为两组患者的划痕区域不同。非糖尿病划痕面积占测量总面积的24.78%，糖尿病迁移划痕占测量总面积的16.77%。当考虑划痕面积时，它提供了一个比率（细胞数/%划痕面积），表明来自糖尿病心脏的成纤维细胞实际迁移的4.13倍于非糖尿病心脏的细胞。这些结果突出了在进行移徙分析时考虑移徙领域的重要性。
规范化到迁移区域可以更好、更严格地评估单元格迁移，并否定潜在的人为错误。虽然所述方法使用 P200 移液器尖端，该尖端应提供均匀且一致的划痕，但由于人类不一致，可能会发生不均匀的划痕。 图 5 强调了在划痕区域中考虑差异的重要性。如果只比较迁移的成纤维细胞的数量，则显示图 5A 的迁移细胞数是图 5B 的两倍。当划痕区域用于使数据规范化时，它表示在图 5A 和图 5B 中，成纤维细胞与迁移 区域的比率相似。对于本示例，我们使用不同成纤维细胞分离的未经治疗的非糖尿病心脏成纤维细胞;因此，由于图 5 中使用的单元格的性质，类似的迁移比率应该是 预期的结果。如果只显示迁移的细胞数量，如果刮伤区域在所有样本中不统一且一致，这些发现可能是歪曲的。因此，使用此方法以及其他划痕迁移分析来考虑划痕区域非常重要。图 5 中显示的 这些表示结果演示了将迁移的细胞数规范化到划痕区域如何呈现准确、可重复和可靠的迁移数据。
图1：成纤维细胞划痕迁移测定实验设计图。设置：在将电池电镀井之前，在板的底部绘制一条线和 3 个破折号。0 h： 培养细胞， 直到 95% 的汇合， 并管理平行描绘的线的划痕。通过选择中间破折号上方和下方的部分，捕获 0 小时图像。24 h：在固定和染色之前，允许细胞迁移24小时。对于 24 小时图像，将对齐到与 0 小时图像相同的位置以捕获迁移的单元格。分析：在 0 h 图像上概述迁移区域，然后将 0 小时图像叠加到 24 小时图像上以生成迁移和区域图像。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：显示库马西染色的代表性图像不会干扰细胞的可视化。心脏成纤维细胞被镀在没有胶原蛋白（塑料盘），从非糖尿病小鼠尾巴分离的胶原蛋白，或从糖尿病小鼠尾巴分离的胶原蛋白。这些细胞按照此处描述的方法用于划痕迁移分析。细胞被染上1%的库马西辉煌蓝色污渍，然后迁移细胞的图像被捕获。图像上描绘的刻度栏为 100 μm。关于胶原蛋白分离和/或胶原蛋白细胞迁移的详细信息，请于Bur等人20中介绍。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：代表性数据，证明非糖尿病细胞和糖尿病细胞之间心脏成纤维细胞迁移的差异。0 小时和 24 小时图像用于计算从非糖尿病和糖尿病小鼠分离的迁移心脏成纤维细胞的数量（红线描绘了迁移区域和在 20 倍时拍摄的图像，比例杆 = 100 μm）。糖尿病心脏细胞有129个细胞在16.77%的面积迁移，产生7.69的迁移率。非糖尿病成纤维细胞有46个细胞迁移，面积24.78%，导致1.86的比例。图中显示的图像用于伯尔等人20 日的结果，但此处描述的图像没有在伯尔等人20中显示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 4：描述迁移图像区域的生成图。步骤#1：打开包含迁移行的迁移映像。步骤#2：24 小时图像将被删除，留在图像字段中的迁移行上。步骤#3：画笔工具用于填充迁移区域。步骤#4：图像转换为灰度，然后保存为新图像。比例线表示 100 μm 。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：不同迁移区对成纤维细胞迁移的影响示例。非糖尿病心脏成纤维细胞镀在塑料培养皿上，用于划痕迁移测定，如上所述（比例杆 = 100 μm）。（A） 92个迁移的成纤维细胞，百分比为35.4%，迁移比例为2.60。（B） 45个成纤维细胞迁移，面积17.57%，计算比率为2.56。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 成纤维细胞类型 | 迁移单元格的平均数量 | 划痕的平均面积 | 单元格数与划痕面积比率 |
| 非糖尿病心脏的纤维细胞 | 46 | 24.78% | 1.86 |
| 来自糖尿病红心的成纤维细胞 | 129 | 16.77% | 7.69 |
表1：使用非糖尿病和糖尿病心脏成纤维细胞进行迁移划痕检测的迁移数据。 迁移的非糖尿病和糖尿病成纤维细胞的数量是使用图3 确定的。使用描述的方法和 ImageJ 计算每个图像的百分比区域。迁移比率的计算方法是将迁移的成纤维细胞数量除以迁移区域的百分比。
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Discussion
这种新的划痕迁移测定方法为研究人员提供了一种更容易访问的方法，可以检查细胞迁移的变化。虽然此测定遵循与其他划痕测定类似的划痕相同的过程，但它确实为细胞迁移10的成像和准确分析提供了一种新方法。这种方法没有使用设备密集型的延时显微镜和活细胞成像室方法，而是详细介绍了常用实验室设备的使用情况。利用一般的倒置显微镜和照相机，可以同时捕获迁移图像，同时保持一致的培养条件。此外，此方法提供对同一感兴趣区域的精确成像，而无需使用先进设备。捕获相同的迁移区域将减少确定单元迁移中的不一致，并提供更严格、更准确的细胞迁移测量。最后，此方法考虑了暂存区域。虽然需要谨慎，以尽量减少人类在划痕的变化，不一致仍然可能发生，表明使用面积作为规范化因素在细胞迁移分析的重要性。总体而言，上面详述的协议为通常用于评估单元迁移的强大工具提供了一种新方法。
开发适应性迁移测定为研究提供了新的途径。此处介绍的迁移分析具有修改能力，以便检查特定的研究问题。可以修改激活或抑制感兴趣的特定蛋白质。试剂，如药理修饰剂（激动剂或拮抗剂）和RNA干扰，可应用于迁移检测之前、期间，甚至迁移后，以解决有关迁移和特定蛋白质的问题。48井盘体积小，还允许添加少量的改性剂，这是另一种经济高效的方法。此外，还可以修改此测定法，以研究细胞外基质成分 （ECM） 对细胞迁移的影响。最近我们应用了这种方法，其中细胞培养板涂有从糖尿病和非糖尿病小鼠中分离出的胶原蛋白，以评估糖尿病细胞外基质对心脏成纤维细胞迁移的影响20。虽然本研究利用了分离的胶原蛋白，但这种方法可以适应其他可能感兴趣的细胞外成分。评估 ECM 迁移的影响的能力非常有用，因为多项研究表明 ECM 对迁移20、21、22的重要性。使用 ECM 蛋白和用高度浓缩 ECM 溶液涂覆油井时可能发生的潜在并发症对细胞的可视化有影响。如果使用 ECM（如胶原蛋白）涂上井，并涂上 Coomassie 蓝色污渍，以查看 ECM 是否视觉上损害细胞的成像。如果 ECM 损害可视化单元，稀释 ECM 解决方案将改善此问题，并允许在 ECM 上可视化电池。
这种关于旧技术的新方法确实存在一些限制。这种方法已适应小规模（48孔细胞培养板），可能无法轻易过渡到较大的板。由于井的大小和图像中捕获的区域，此协议可以记录迁移区域的大部分。但是，将此方法扩展到更大的井尺寸可能会导致捕获迁移区域的较低部分。这可以通过增加捕获的图像数量来解决，但可能需要应用其他方法，以确保 24 h 图像的迁移区域可以重新标识。此外，此方法仅限于可用于划痕迁移测定的细胞。在传统的划痕迁移检测中没有反应的细胞可能不适合本手稿中介绍的方法。虽然这种方法有一些限制，但修改本手稿中详述的方法可以减轻一些限制。
划痕迁移检测遵循一个简单的方法，但需要遵循一些关键步骤才能产生成功的检测。关键的一步是在井底画出指示标记。如果不在油井上绘制指标，将很难/不可能区分需要为 24 小时图像成像的区域，并防止重新捕获相同的迁移区域。此外，在 0 h 图像中捕获的 24 小时图像中重新捕获相同的迁移区域也很重要。如果在 24 小时未捕获同一区域，则叠加图像进行迁移将不可行。如果没有叠加的图像，将无法确定哪些单元格已迁移。叠加的图像对于此方法至关重要，因为它们为细胞迁移提供了准确的确定。由于划痕方法并不总是提供直线划痕线，因此对正确的区域进行成像以生成叠加图像至关重要。叠加的图像为本手稿中呈现的迁移测定的准确性提供了基础。
划痕迁移检测的新调整为检查细胞迁移提供了一种更方便、更灵活的方法。先前的细胞迁移研究都使用了设备密集型方法，但并不是每个实验室都常用的方法。指出必须开发具有更广泛可访问性范围的迁移分析。这份手稿描述了一种旧技术的新方法，它将增加对细胞迁移感兴趣的研究人员的可访问性。此外，此方法提供通过细胞外基质组件或使用药理修饰剂来改变细胞培养环境的能力，以确定对细胞迁移的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国陆军医学研究奖#81XWH-16-1-0710，密西西比大学药学院和生物分子科学系的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
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