Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Un test de migration à gratter rentable et adaptable

doi: 10.3791/61527 Published: June 30, 2020

Summary

Nous présentons une méthode rentable à l’essai de migration de rayures qui fournit une nouvelle approche pour déterminer la migration cellulaire sans l’utilisation de méthodes à forte intensité d’équipement. Bien que les fibroblastes aient été utilisés dans ce protocole, ils peuvent être adaptés et utilisés pour étudier d’autres types de cellules et influences sur la migration cellulaire.

Abstract

La migration cellulaire est un élément clé des événements physiologiques et pathologiques. La migration cellulaire normale est nécessaire pour les fonctions essentielles telles que le développement et le montage d’une réponse immunitaire. Lorsqu’un défaut ou une altération se produit avec le processus de migration cellulaire, il peut avoir des conséquences néfastes (c.-à-d. métastase du cancer, cicatrisation des plaies et formation de cicatrices). En raison de l’importance de la migration cellulaire, il est nécessaire d’avoir accès à un test de migration cellulaire abordable, adaptable et reproductible. En utilisant l’analyse commune de migration des rayures, nous avons développé une nouvelle approche pour analyser la migration cellulaire qui utilise l’équipement de laboratoire général. La méthode décrite utilise des marqueurs visuels qui permettent de reprendre des domaines d’intérêt spécifiques sans l’utilisation de la microscopie en accéléré. En outre, il offre une flexibilité dans la conception expérimentale, allant de la modification du substrat de la matrice de migration à l’ajout de modificateurs pharmacologiques. En outre, ce protocole décrit un moyen de rendre compte de la zone de migration cellulaire, qui n’est pas prise en compte par plusieurs méthodes lors de l’examen de la migration cellulaire. Cette nouvelle approche offre un test de migration à gratter à un public plus large et offrira aux chercheurs une plus grande occasion d’examiner l’impact physiologique et pathophysiologique de la migration cellulaire.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La migration cellulaire est cruciale pour de nombreux événements physiologiques et pathologiques. Il est nécessaire pendant le développement, pour monter une réponse immunitaire, et pour la guérison appropriée deblessure 1,2,3. Bon nombre de ces événements de migration cellulaire peuvent être déclenchés par des signaux physiques ou chimiques. Par exemple, au cours d’une réponse immunitaire, les leucocytes migreront vers un site de blessures en réponse à un chimioattractant2. En outre, les leucocytes libéreront également des cytokines pour induire la migration des cellules immunitaires additionneuses, aussi bien que d’autres types de cellules, tels que des fibroblastes, qui sont impliqués dans le processus de guérison de blessure, et ainsi, initiant une réponse multicellulaire4. La capacité des cellules à migrer est essentielle pour une fonction physiologique appropriée; cependant, quand la migration cellulaire passe inaperçue, elle peut avoir une réponse défavorable et contribuer aux événements pathologiques, tels que l’inflammation chronique, la maladie vasculaire, la métastase de cancer, et la guérison altérée deblessure 2,3,4,5,6,7. La cicatrisation altérée des plaies est une affection courante chez les diabétiques en raison de défauts dans la migration cellulaire, et si ces défauts ne sont pas pris en compte, elle pourrait entraîner d’autres complications (p. ex., amputation8,9). Cette étude, ainsi que d’autres, ont indiqué la nécessité de mieux comprendre le processus par lequel la migration cellulaire se produit, soit dans des conditions physiologiques ou pathologiques normales, et il est vital pour faire avancer ce domaine de recherche. Pour ce faire, il doit y avoir des analyses de migration disponibles qui sont à la fois accessibles et abordables pour les chercheurs, qui peuvent ne pas posséder l’équipement nécessaire pour effectuer ces analyses.

À l’heure actuelle, il existe une variété d’analyses migratoires disponibles pour examiner un large éventail de sujets concernant la migration cellulaire. Des modèles de migration 2D et 3D ont été développés, chacun ciblant des zones spécifiques impactant la migration cellulaire. Les modèles de migration 3D sont généralement associés à des études d’invasion cellulaire et évaluent l’impact de la matrice extracellulaire sur la migrationcellulaire 10,11,12, tandis que les tests de migration 2D ont une plus grande gamme d’application et sont principalement utilisés pour étudier la migration chimoactique, la cicatrisation des plaies et les changements fonctionnels pendant la migrationcellulaire 13,14,15,16. Plusieurs de ces analyses nécessitent de l’équipement supplémentaire, comme des chambres Boyden ou des anneaux d’exclusion, ce qui peut réduire la disponibilité de ces tests pour certains chercheurs. Un des analyses les plus rentables est l’analyse à gratter, qui est généralement utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies et les changements généraux dans la migrationcellulaire 14,17. Bien que la plupart des laboratoires soient équipés pour effectuer un test d’éraflure, l’équipement utilisé pour suivre la migration cellulaire a tendance à être indisponible ou trop coûteux à acheter. Cela inclut la microscopie en accéléré, qui nécessite un microscope inversé et un système d’imagerie en direct. Ces pièces d’équipement coûteuses ne sont pas couramment accessibles à tous les laboratoires. Par conséquent, cette observation souligne la nécessité d’un nouveau protocole qui permette l’évaluation de la migration cellulaire avec un équipement plus facilement disponible.

Le protocole présenté ici fournit un moyen nouveau et abordable d’évaluer la migration cellulaire. Cette méthode suit la même procédure associée aux essais à gratter, mais diffère dans l’analyse de l’examen de la migration cellulaire en utilisant l’équipement plus couramment disponible dans un laboratoire de sciences fondamentales. Ce protocole utilisant l’équipement commun permet une détermination plus précise de la migration cellulaire sans l’utilisation de la microscopie time-lapse. En plus de déterminer la migration, cette méthode explique également les facteurs variables dans la zone d’éraflure qui a été noté pour avoir un impact considérable sur la migration cellulaire. Dans l’ensemble, ce nouveau protocole d’analyse de la migration cellulaire offre à un plus grand nombre de laboratoires l’occasion d’explorer et de contribuer au domaine de la migration cellulaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Culture cellulaire générale

  1. Fibroblastes cardiaques de culture dans le milieu modifié d’aigles de Dulbecco (DMEM) contenant le glucose de 1 g/L, pyruvate de sodium, L-glutamine, et complété par 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 2% L-glutamine, et 0,02% réavant antimicrobien (voir tableau des matériaux) et maintenu dans l’incubateur de CO2 à 37 °C.
  2. Les fibroblastes cardiaques de culture jusqu’à 90-95% confluent est atteint au passage 0 (P0). À ce stade, les fibroblastes sont prêts à être divisés en une plaque de 48 puits, qui est utilisé pour l’analyse de migration.

2. Préparation de la plaque de migration

  1. Préparez une plaque de culture cellulaire de 48 puits en dessinant une ligne, à l’aide d’un marqueur permanent jaune ou de couleur claire, au centre du puits. Ensuite, dessinez trois marques de hachage qui divisent le puits en trois domaines d’intérêt distincts. Ces sections seront utilisées pour l’imagerie.
    REMARQUE : L’utilisation d’un marqueur permanent de couleur claire permettra une imagerie facile des cellules migrées. Les marqueurs foncés tels que le noir ou le bleu empêcheront la visualisation des cellules migrantes.
  2. Si vous évaluez la migration sur un substrat (p. ex., collagène), enduire le puits en ce moment en suivant les instructions et les concentrations utilisées pour le substrat spécifique.
  3. Plaque ~15.000-20.000 fibroblastes cardiaques, P1, dans chaque puits et cellules de culture, dans des conditions normales de culturisme (conditions énumérées dans la section précédente), jusqu’à ce qu’ils atteignent 90-95% confluency. La confluence doit être atteinte entre 24 et 48 heures.
    REMARQUE : Lors de la mise en place de la plaque de migration, assurez-vous d’inclure un contrôle positif (une cellule migratrice connue, comme les cellules 3T318),un contrôle négatif (cellules non sécrables) et un puits vierge.

3. Essai de migration de éraflure et fixation

  1. Une fois que les cellules atteignent la confluence de 90-95%, retirez le média et grattez le long de la ligne tracée à l’aide d’une pointe stérile de pipette P200.
    REMARQUE : Une pointe de pipette P200 est la pointe commune de pipette de taille employée avec l’essaid’égratignure 10,14,19. En outre, ne faire qu’une seule passe avec la pointe P200 que plus d’une tentative peut entraîner plusieurs lignes de rayures.
  2. Rincer le puits avec un faible sérum (1,5% FBS) pour enlever les fibroblastes cardiaques non attachés.
  3. Ajouter 500 μL de faible teneur en sérum à chaque puits. Si vous utilisez des agents pharmacologiques, ajoutez-les en ce moment.
    REMARQUE : Un faible média sérique est utilisé parce qu’il permet/favorise la migration cellulaire et empêche les fibroblastes de proliférer, ce qui pourrait fausser les résultats de l’analyse de migration20. Pour ce protocole, 1,5% FBS a été utilisé.
  4. Capturez des images de 0 h avant d’incuber les fibroblastes dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant 24 h.
    1. Capturez des images de 0 h à l’aide d’un microscope inversé avec un objectif 20x. Prenez deux images de 0 h par puits. Cela permettra une couverture plus complète de la ligne de migration.
    2. À l’aide des marques (ligne et tirets), placez le puits pour capturer la moitié supérieure de la ligne de rayures. Évitez d’imaginer le tiret du milieu pour vous assurer que la même zone de migration n’est pas photographiée deux fois, ce qui pourrait fausser les résultats.
    3. Utilisez un logicield’imagerie ( Tableau des matériaux) pour capturer 0 h d’image #1. Déplacez ensuite la plaque pour positionner la moitié inférieure du puits/ligne de rayures en vue de la caméra. Encore une fois, évitez de capturer le tiret du milieu. Une fois en place, capturez l’image de 0 h #2(figure 1).
      REMARQUE : Éviter le tiret du milieu dans les deux images de 0 h empêchera de capturer deux fois les zones de migration qui, si elles sont faites, pourraient produire des résultats répétés et fausser les données.
  5. Après avoir couvé pendant 24 h, retirez le média du puits et lavez le puits avec 1x PBS non stérile (désormais tous les 1x PBS utilisés sont non stériles).
  6. Dans le capot des vapeurs, ajouter 500 μL de paraformaldéhyde de 4 % au puits et incuber pendant 10 minutes à température ambiante (RT).
  7. Retirer le paraformaldéhyde et laver 3x avec 1x PBS pendant 5 min chacun à RT.
  8. Une fois les cellules lavées, procéder à la capture d’images de 24 h ou ajouter 1x PBS à chaque puits et placer à 4 °C jusqu’à une date ultérieure. Les cellules peuvent rester à 4 °C pendant 1 à 2 semaines jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être image.
    1. Perméabiliser les cellules en ajoutant 300 μL de solution permeabilizing (1x PBS et 0,01% triton X-100) à chaque puits. Incuber les cellules/plaque avec un basculement doux et continu pendant 30 min à RT.
    2. Retirer la solution perméabilisante et ajouter 1% coomassie brilliant blue tache (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% acide acétique, 45% méthanol, et 45% dH2O) pendant 10 min avec doux, basculement continu à RT.
      REMARQUE : Si les plaques sont recouvertes d’un substrat matriciel extracellulaire, assurez-vous de tester une plaque enduite de taches Coomassie avant d’effectuer un test de migration. La figure 2 démontre qu’un substrat matriciel peut être utilisé avec cet essai et ne pas avoir d’impact sur la visualisation des cellules.
    3. Laver les puits 3x avec 1x PBS à RT avec bascule continue pendant 5 min chacun.
    4. Après les lavages, ajouter 300 μL de 1x PBS et capturer des images de 24 h.
    5. Capturez des images à 24 h en alignant le puits dans la même position que celle utilisée pour capturer les images de 0 h. Pour ce faire, ouvrez les images de 0 h précédemment capturées et en utilisant le marquage effectué avec le marqueur permanent, alignez le puits dans la même position. La ligne au milieu et les marques de tiret supplémentaires devraient permettre un alignement étroit entre l’image de 24 h et l’image de 0 h (figure 1).

4. Préparation d’images de 0 h et 24 h

  1. Ouvrez des images de 0 h et 24 h prises du même puits et de la même position dans les logicielsd’imagerie ( Tableau des matériaux).
  2. Créez une nouvelle couche sur l’image de 0 h. Ensuite, cliquez sur la nouvelle couche et changez le nom de la couche en « couche de ligne » en cliquant deux fois sur le texte.
    REMARQUE : Cette couche sera appelée couche de ligne à partir de ce point.
  3. Cliquez sur l’outil Brush (icône brosse) et réglez la taille à 10 px et la couleur au rouge.
  4. Avec la couche de ligne sélectionnée, dessinez deux lignes distinctes qui décrivent la zone de l’égratignure. Les lignes ne doivent toucher aucune cellule en raison de ces lignes marquant la zone de migration.
  5. Cliquez sur l’outil Move (icône flèche) puis appuyez sur le bouton Ctrl et cliquez à la fois sur la ligne et les couches d’arrière-plan.
  6. Cliquez au centre de l’image de 0 h et faites glisser ces deux couches au milieu de l’image de 24 h.
  7. Maintenant, en utilisant l’image 24 h, cliquez sur la couche de fond de 0 h et de changer l’opacité à 50%.
  8. En tenant le bouton Ctrl, cliquez à la fois sur l’arrière-plan de 0 h et la couche de ligne, puis transformez librement les couches (Edit >Free Transform). En utilisant la transformation libre, alignez l’image de fond et de ligne de 0 h sur l’image de fond de 24 h. Cette étape se traduit par la superposition de l’image de 0 h et 24 h, ce qui est nécessaire pour positionner les lignes qui marquent la zone de migration dans la bonne position sur l’image de 24 h.
  9. Après avoir réussi à superposer les couches d’arrière-plan et de ligne de 0 h sur l’image de fond de 24 h, supprimez la couche d’arrière-plan de 0 h. Supprimer en cliquant sur la couche d’arrière-plan de 0 h, puis cliquez à droite, et cliquez sur supprimer la couche.
  10. La suppression de l’image de fond de 0 h ne laissera que la ligne et la couche d’arrière-plan de 24 h (maintenant appelée image de migration). La couche de ligne indiquera la zone de migration/égratignure sur l’image de 24 h et peut être utilisée pour déterminer le nombre de cellules migrantes.
  11. Enregistrer comme la nouvelle image de migration à la fois comme un fichier Photoshop et un TIFF / JPEG. REMARQUE : une figure représentative qui décrit ce processus est présentée à la figure 3.

5. Compter le nombre de cellules migrées

  1. Ouvrez l’image de migration. Cela peut être fait dans un programme qui accepte les fichiers TIFF / JPEG (Tableau des matériaux).
  2. Comptez le nombre de cellules qui se trouvent entre les deux et touchez les deux lignes rouges.
  3. Enregistrez le nombre de cellules migrantes par image. Il y aura deux images de migration par puits, et ces valeurs ne devraient pas être combinées avant que les valeurs aient été corrigées pour la zone de migration (détaillée dans la section suivante).

6. Déterminer la zone de migration

  1. Ouvrez l’image 24 h qui contient les lignes de migration dans le logiciel d’imagerie dans la section 5 (Tableau des matériaux).
  2. Enregistrer comme cette image comme « Image zone de migration ».
  3. Après avoir sauvé, cliquez sur la couche d’arrière-plan, cliquez à droite et cliquez sur supprimer la couche. Cela ne devrait laisser que les lignes de rayures sur l’image( Figure 3).
  4. À l’aide de l’outil brush (icône brosse) remplir la zone entre les lignes de rayures. Faire correspondre la couleur de la brosse avec la couleur utilisée pour tracer les lignes pour la migration.
  5. Changez l’image en une échelle grise pour générer une image en noir et blanc (Image >Mode>Grayscale) puis enregistrer l’image (Figure 4).
  6. Démarrez le logicield’analyse ( Tableau des matériaux) puis ouvrez le fichier « Zone de migration » dans le logiciel d’analyse.
  7. Pour déterminer la zone de la ligne de migration, cliquez sur Image>Adjust>Threshold. La zone de migration noire deviendra rouge et la zone en pourcentage sera indiquée dans la case Seuil. La zone sera signalée comme le pourcentage de la zone que couvre la ligne de migration par rapport à l’ensemble de la zone capturée dans l’image.
  8. Enregistrez la zone de pourcentage pour la ligne de migration et assurez-vous que cette valeur est jumelée avec le nombre de cellules migratives pour la même image.

7. Analyse des données

  1. Normalisez le nombre de cellules migrantes jusqu’à la zone en pourcentage de l’égratignure. Diviser le nombre de cellules migrateurs par la zone de pourcentage de la ligne de migration (# cellules migrées % Zone de migration). Faites ceci par image et non pas une moyenne basée sur la migration par puits.
  2. Après avoir normalisé les valeurs par image, ajoutez les valeurs des deux images, ce qui représente un puits individuel. Cette valeur sera utilisée pour l’analyse graphique et statistique. Si la conception expérimentale contenait plusieurs répliques. Valeurs moyennes de réplique avant analyse statistique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cette procédure documente une nouvelle approche de l’étude de la migration cellulaire qui est à la fois rentable et facilement adaptable pour la plupart des laboratoires. De nombreuses études ont utilisé la microscopie en accéléré pour évaluer la migration cellulaire, mais l’équipement nécessaire à cette méthode n’est pas facilement accessible à de nombreux laboratoires. Considérant que l’utilisation de lignes et de tirets pour la démarcation permet de récupérer des zones d’intérêt spécifiques à différents moments sans l’utilisation d’équipement coûteux (figure 1 et figure 3). Bien que l’utilisation de délimitations soit essentielle à cette nouvelle approche, de nombreux domaines de cette méthode peuvent être adaptés aux besoins individuels des chercheurs. Le protocole indiquait un point final de 24 h; toutefois, ce point de terminaison peut être prolongé en fonction des besoins d’un laboratoire individuel. L’ajustement du point final du protocole peut permettre une culture continue des cellules pour une utilisation plus continue. En outre, ce protocole permet la flexibilité de tester l’impact des modificateurs pharmacologiques ainsi que des substrats matriciels extracellulaires sur la migration. Enfin, le composant le plus coûteux de cette méthode est l’utilisation de logiciels d’imagerie, qui peuvent être des logiciels sous licence, mais l’utilisation de logiciels sous licence n’est pas la seule option. D’autres logiciels d’imagerie qui permettent la génération de lignes et la superposition d’images peuvent être utilisés avec cette méthode. En outre, à la nature rentable et adaptable de cette méthode, il présente une nouvelle approche à l’examen de la migration cellulaire en affaissant la zone de l’égratignure.

Cette nouvelle approche a été récemment utilisée dans Burr et coll. 2020 pour évaluer les différences dans la migration du fibroblaste cardiaque entre les cellules isolées des cœurs non diabétiques etdiabétiques 20. La figure 3 présente des images représentatives utilisées pour évaluer la migration des fibroblastes. À partir de ces images, il a été déterminé que 46 fibroblastes provenant de cœurs non diabétiques et 129 fibroblastes provenant de cœurs diabétiques avaient migré pendant la période de 24 h de l’expérience. Lors des comparaisons de groupe, le nombre de cellules provenant des cœurs diabétiques avait migré 2,8 fois plus que les cellules des cœurs non diabétiques (tableau 1). Bien que ces résultats indiquent que les cellules des cœurs diabétiques avaient migré davantage, les chiffres étaient trompeurs, parce que la zone de l’égratignure était différente pour chacun des deux groupes. La zone d’éraflure non diabétique était de 24,78 % de la superficie totale mesurée, tandis que l’égratignure de migration diabétique était de 16,77 % de la superficie totale mesurée. Lorsque la zone de l’égratignure a été considérée, il a fourni un rapport (numéro de cellule /% zone de rayures) indiquant que les fibroblastes des cœurs diabétiques effectivement migré 4,13 fois plus grand que les cellules des cœurs non diabétiques. Ces résultats ont mis en évidence l’importance d’examiner la zone de migration lors des essais migratoires.

La normalisation de la zone de migration fournit une évaluation meilleure et plus rigoureuse de la migration cellulaire et nie les erreurs humaines potentielles. Bien que la méthode décrite utilise une pointe de pipette P200, qui devrait fournir une égratignure uniforme et cohérente, des rayures inégales peuvent se produire en raison d’incohérences humaines. La figure 5 souligne l’importance d’tenir compte des différences dans la zone de rayures. Si l’on ne comparait que le nombre de fibroblastes migrateurs, cela montrerait que la figure 5A a deux fois plus de cellules migrées que la figure 5B. Considérant que lorsque la zone de l’égratignure est utilisée pour normaliser les données, elle indique que le rapport entre les fibroblastes et la zone de migration est similaire tant à la figure 5A qu’à la figure 5B. Pour cet exemple, nous avons utilisé des fibroblastes cardiaques non diabétiques non traités provenant de différents isolements fibroblastes; par conséquent, un ratio de migration similaire devrait être le résultat attendu en raison de la nature des cellules utilisées dans la figure 5. Si l’on ne présentait que le nombre de cellules migrées, ces résultats pourraient être faussement représentatifs si la zone rayée n’est pas uniforme et uniforme dans tous les échantillons. Par conséquent, il est important de tenir compte de la zone rayée avec cette méthode ainsi que d’autres analyses de migration de rayures. Ces résultats présentés à la figure 5 ont démontré comment la normalisation du nombre de cellules migrées vers la zone rayée peut présenter des données de migration précises, reproductibles et fiables.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme de la conception expérimentale de l’analyse de migration des rayures fibroblastes. Configuration: Avant de placage des cellules en bien, tracer une ligne et 3 marques de tiret sur le fond sur la plaque. 0 h : Cellules de culture jusqu’à 95 % de confluence et administrer une égratignure parallèle à la ligne représentée. Capturez des images de 0 h en sélectionnant une section au-dessus et au-dessous du tableau de bord du milieu. 24 h : Permettre aux cellules de migrer pendant 24 h avant de les fixer et de les colorer. Pour les images de 24 h, alignez-vous bien dans la même position que les images de 0 h pour capturer les cellules migrées. Analyse : Décrire la zone de migration sur l’image de 0 h, puis superposer l’image de 0 h sur l’image de 24 h pour générer des images de migration et de zone. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Les images représentatives qui montrent la coloration coomassie n’interfèrent pas avec la visualisation des cellules. Les fibroblastes cardiaques ont été plaqués sur aucun collagène (plat en plastique), collagène isolé des queues non diabétiques de souris, ou collagène isolé des queues diabétiques de souris. Les cellules ont été utilisées dans l’analyse de migration des rayures en suivant les méthodes décrites ici. Les cellules ont été tachées de 1% coomassie brilliant blue tache, puis des images de cellules migrantes ont été capturés. La barre d’échelle représentée sur l’image est de 100 μm. Les détails sur l’isolement de collagène et/ou la migration cellulaire sur le collagène sont présentés dans Burr et autres20. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Données représentatives démontrant la différence dans la migration du fibroblaste cardiaque entre les cellules non diabétiques et diabétiques. Images de 0 h et 24 h utilisées pour calculer le nombre de fibroblastes cardiaques migrés isolés de souris non diabétiques et diabétiques (la ligne rouge représente la zone de migration et les images prises à 20 x avec barre d’échelle = 100 μm). Les cellules cardiaques diabétiques ont eu 129 cellules migrent dans une zone de 16.77%, qui a produit un rapport de migration de 7.69. Les fibroblastes non diabétiques ont eu 46 cellules migrent avec une zone de 24.78% qui a mené à un rapport de 1.86. Les images présentées dans cette figure ont été utilisées dans les résultats présentés dans Burr et coll.20, mais les images représentées ici n’ont pas été montrées dans Burr et coll.20. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Diagramme qui représente la génération d’une zone d’image migratoire. Étape #1 : Image de migration ouverte qui contient des lignes de migration. Étape #2: L’image 24 h est supprimée, laissant sur les lignes de migration dans le champ d’image. Étape #3 : L’outil de broussailles a été utilisé pour remplir la zone de migration. Étape #4 : L’image est convertie en échelle grise, puis sauvegardée sous forme de nouvelle image. La barre d’échelle représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Un exemple de l’impact des différentes zones migratoires sur la migration des fibroblastes. Les fibroblastes cardiaques non diabétiques étaient plaqués sur des plats de culture en plastique et utilisés dans l’analyse de migration des rayures, tel que décrit ci-dessus (barre d’échelle = 100 μm). (A) 92 fibroblastes migrés avec une superficie de 35,4 % qui a entraîné un ratio de migration de 2,60. (B) 45 fibroblastes ont migré avec une superficie de 17,57% qui calcule un ratio de 2,56. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Type fibroblaste Nombre moyen de cellules migrées Superficie moyenne de l’égratignure Nombre de cellules au rapport zone rayée
Fibroblastes de coeurs non diabétiques 46 24.98k 1.86
Fibroblastes de Coeurs Diabétiques 129 16.77% 7.69

Tableau 1 : Données migratoires provenant de l’analyse à gratter de la migration à l’aide de fibroblastes cardiaques non diabétiques et diabétiques. Le nombre de fibroblastes non diabétiques et diabétiques qui ont migré a été déterminé à l’aide de la figure 3. La zone de pourcentage pour chaque image a été calculée à l’aide de méthodes décrites et d’ImageJ. Le ratio de migration a été calculé en divisant le nombre de fibroblastes migrateurs par la zone de migration en pourcentage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cette nouvelle approche de l’analyse de la migration des rayures offre aux chercheurs une méthode plus accessible pour examiner les changements dans la migration cellulaire. Bien que cet essai suive la même procédure pour administrer une égratignure semblable à d’autres analyses de rayures, il fournit une nouvelle méthode pour l’imagerie et l’analyse précise de la migration cellulaire10. Au lieu d’utiliser des méthodes intensives d’équipement de microscopie en accéléré et de chambres d’imagerie cellulaire vivante, cette méthode détaille l’utilisation de l’équipement de laboratoire couramment disponible. En utilisant un microscope et une caméra inversés généraux, on peut capturer des images de migration en même temps tout en maintenant des conditions de culture cohérentes. En outre, cette méthode fournit une imagerie précise de la même région d’intérêt sans l’utilisation d’équipements de pointe. La capture du même domaine de migration réduira les incohérences dans la détermination de la migration cellulaire et fournira une mesure plus rigoureuse et précise de la migration cellulaire. Enfin, cette méthode prend en compte la zone de l’égratignure. Bien que la prudence soit prise pour minimiser les variations humaines dans les rayures, des incohérences peuvent encore se produire, démontrant l’importance d’utiliser la zone comme facteur de normalisation dans l’analyse de la migration cellulaire. Dans l’ensemble, le protocole décrit ci-dessus fournit une nouvelle approche à un outil puissant couramment utilisé pour évaluer la migration cellulaire.

Le développement d’un test de migration adaptable offre de nouvelles voies de recherche. L’analyse migratoire présentée ici a la capacité d’être modifiée afin d’examiner des questions de recherche spécifiques. Des modifications peuvent être apportées concernant l’activation ou l’inhibition de protéines spécifiques d’intérêt. Les réavants tels que les modificateurs pharmacologiques (agonistes ou antagonistes) et les interférences arn peuvent être appliqués à l’analyse de migration avant, pendant ou même après la migration pour répondre aux questions sur la migration et les protéines spécifiques. Le petit volume du plat de 48 puits permet également d’ajouter des quantités plus faibles de modificateurs, ce qui est une autre méthode rentable. En outre, cet essai peut être modifié pour étudier l’impact des composants de matrice extracellulaire (ECM) sur la migration cellulaire. Récemment nous avons appliqué cette méthode, où les plaques de culture cellulaire ont été enduites avec le collagène isolé des souris diabétiques et non diabétiques pour évaluer l’impact de la matrice extracellulaire diabétique a sur la migration cardiaque de fibroblaste20. Tandis que cette étude a utilisé le collagène isolé, cette méthode peut être adaptée à d’autres composants extracellulaires qui peuvent être d’intérêt. La capacité d’évaluer l’impact de la migration ecm est très utile en raison de multiples études indiquant l’importance de l’ECM sur la migration20,21,22. Une complication potentielle qui peut se produire avec l’utilisation des protéines d’ECM et le revêtement des puits avec la solution fortement concentrée d’ECM est un impact sur la visualisation des cellules. Il est recommandé si l’utilisation de l’ECM, comme le collagène, pour enrober un puits et la tache de bleu Coomassie pour voir si l’ECM pourrait nuire visuellement à l’imagerie des cellules. Si l’ECM altère la visualisation des cellules, la dilution de la solution ECM améliorera ce problème et permettra de visualiser les cellules sur ECM.

Cette nouvelle approche d’une ancienne technique présente certaines limites. Cette méthode a été adaptée à une petite échelle (plaque de culture cellulaire de 48 puits) et peut ne pas passer facilement à de plus grandes plaques. En raison de la taille du puits et de la zone capturée dans les images, ce protocole peut documenter une grande partie de la zone de migration. Toutefois, l’élargissement de cette méthode à de plus grandes dimensions de puits peut entraîner la capture d’une partie inférieure de la zone de migration. Cela peut être résolu en augmentant le nombre d’images capturées, mais des méthodes supplémentaires peuvent devoir être appliquées pour s’assurer que la zone de migration image peut être reidentifié pour les images de 24 h. En outre, cette méthode est limitée aux cellules qui peuvent être utilisées dans un test de migration à gratter. Les cellules qui ne répondent pas dans un test traditionnel de migration des rayures peuvent ne pas être idéales pour l’approche présentée dans ce manuscrit. Bien qu’il y ait certaines limites à cette approche, la modification des méthodes détaillées dans ce manuscrit pourrait atténuer certaines des limites.

L’analyse de migration à gratter suit une approche simple, mais il ya quelques étapes critiques qui doivent être suivies pour produire un essai réussi. Une étape cruciale consiste à dessiner les marques indiquantes sur le fond du puits. Si les indicateurs ne sont pas dessinés sur les puits, il sera très difficile/impossible de différencier la zone qui doit être photographiée pour l’image de 24 h et d’empêcher la reprise de la même zone de migration. En outre, il est important de récupérer la même zone de migration dans l’image de 24 h qui a été capturée dans l’image de 0 h. Si la même zone n’est pas capturée à 24 h, il ne sera pas possible de superposer les images pour la migration. Sans images superposées, il ne sera pas possible de déterminer quelles cellules ont migré. Les images superposées sont essentielles à cette approche, car elles fournissent une détermination précise de la migration cellulaire. Comme la méthode de rayures ne fournit pas toujours des lignes de grattage droites, il est essentiel que les zones correctes soient imaged pour générer les images superposées. Les images superposées fournissent le fondement de l’exactitude de cet essai migratoire présenté dans ce manuscrit.

Une nouvelle adaptation de l’analyse de migration à gratter offre une approche plus accessible et flexible pour examiner la migration cellulaire. Des études antérieures sur la migration cellulaire ont utilisé des méthodes à forte intensité d’équipement qui ne sont pas couramment accessibles à tous les laboratoires. Il est essentiel d’indiquer que le développement d’un test migratoire qui a un plus large éventail d’accessibilités est essentiel. Ce manuscrit décrit une nouvelle approche d’une ancienne technique qui augmentera l’accessibilité aux chercheurs intéressés par la migration cellulaire. En outre, cette méthode permet de modifier l’environnement de culture cellulaire, que ce soit par l’intermédiaire de composants matriciels extracellulaires ou l’utilisation de modificateurs pharmacologiques, afin de déterminer l’impact qui a sur la migration cellulaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux sont appuyés par le Us Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, l’École de pharmacie de l’Université du Mississippi et le Département des sciences biomoléculaires.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe All Apps Adobe This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile MIDSCI AVR1 Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera Zeiss 426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher Scientific BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells Fisher Scientific 07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate Fisher Scientific MT10014CM
Image J NIH This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum Innovative Research IFBS-HU
Primocin InvivoGEN ant-pm-2 This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope Zeiss 491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software Zeiss software comes with camera purchase

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilbert, S. F. Developmental biology. Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
  2. Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
  3. Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281, (19), 13209-13216 (2006).
  4. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2, (4), (2012).
  5. Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
  6. Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1, (4), 171-175 (2007).
  7. Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7, (183), 1-9 (2014).
  8. Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340, (1), 117-126 (2010).
  9. Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 7 (2014).
  10. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752, (1), 10-24 (2013).
  11. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
  12. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
  13. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
  14. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2, (2), 329-333 (2007).
  15. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, (1), 107-124 (2011).
  16. Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316, (7), 1271-1281 (2010).
  17. Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 412-422 (2015).
  18. Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, (11), (1971).
  19. Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
  20. Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  21. Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
  22. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (39), 2595-2604 (2012).
Un test de migration à gratter rentable et adaptable
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).More

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter