Summary
Wir präsentieren eine kostengünstige Methode zum Scratch-Migrationstest, die einen neuen Ansatz zur Bestimmung der Zellmigration ohne den Einsatz geräteintensiver Methoden bietet. Während Fibroblasten in diesem Protokoll verwendet wurden, kann es angepasst und verwendet werden, um zusätzliche Zelltypen und Einflüsse auf die Zellmigration zu untersuchen.
Abstract
Die Zellmigration ist eine Schlüsselkomponente sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Ereignissen. Normale Zellmigration ist für wesentliche Funktionen wie Entwicklung und Diemontage einer Immunantwort erforderlich. Wenn ein Defekt oder eine Veränderung mit dem Zellmigrationsprozess auftritt, kann es zu schädlichen Folgen kommen (d. h. Krebsmetastasen, Wundheilung und Narbenbildung). Aufgrund der Bedeutung der Zellmigration ist es notwendig, Zugang zu einem Zellmigrationstest zu haben, der erschwinglich, anpassungsfähig und wiederholbar ist. Unter Verwendung des gemeinsamen Scratch-Migration-Assays haben wir einen neuen Ansatz zur Analyse der Zellmigration entwickelt, bei dem allgemeine Laborgeräte verwendet werden. Die beschriebene Methode verwendet visuelle Marker, die es ermöglichen, bestimmte Interessenbereiche ohne Zeitraffermikroskopie zurückzuerobern. Darüber hinaus bietet es Flexibilität im experimentellen Design, von der Änderung des Migrationsmatrixsubstrats bis hin zur Zugabe von pharmakologischen Modifikatoren. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine Möglichkeit, den Bereich der Zellmigration zu berücksichtigen, der bei der Untersuchung der Zellmigration nicht von mehreren Methoden berücksichtigt wird. Dieser neue Ansatz bietet einem größeren Publikum einen Scratch-Migrationstest und bietet Forschern mehr Möglichkeiten, die physiologischen und pathophysiologischen Auswirkungen der Zellmigration zu untersuchen.
Introduction
Die Zellmigration ist für viele physiologische und pathologische Ereignisse von entscheidender Bedeutung. Es wird während der Entwicklung, für die Montage einer Immunantwort, und für die richtige Wundheilung1,2,3erforderlich. Viele dieser Zellmigrationsereignisse können durch physikalische oder chemische Signale ausgelöst werden. Zum Beispiel, während einer Immunantwort, Leukozyten wandern in Richtung einer Stelle der Verletzung als Reaktion auf ein Chemoattractant2. Darüber hinaus werden Leukozyten auch Zytokine freisetzen, um die Migration von zusätzlichen Immunzellen sowie anderer Zelltypen, wie Z. B. Fibroblasten, die am Wundheilungsprozess beteiligt sind, zu induzieren und somit eine mehrzellige Reaktion zu ingangsetzen4. Die Fähigkeit der Zellen zu migrieren ist wichtig für die richtige physiologische Funktion; Wenn jedoch die Zellmigration unkontrolliert bleibt, kann sie eine unerwünschte Reaktion haben und zu pathologischen Ereignissen wie chronischen Entzündungen, Gefäßerkrankungen, Krebsmetastasen und beeinträchtigter Wundheilung2,3,4,5,6,7beitragen. Beeinträchtigte Wundheilung ist eine häufige Beleidung von Diabetikern aufgrund von Defekten bei der Zellmigration, und wenn diese Defekte nicht behoben werden, kann dies zu weiteren Komplikationen führen (z.B. Amputation8,9). Diese Studie und andere haben die Notwendigkeit gezeigt, den Prozess, durch den die Zellmigration stattfindet, entweder unter normalen physiologischen oder pathologischen Bedingungen weiter zu verstehen, und es ist entscheidend für die Förderung dieses Forschungsfeldes. Um dies zu erreichen, müssen Migrationstests verfügbar sein, die sowohl zugänglich als auch erschwinglich für diejenigen Forscher sind, die möglicherweise nicht über die Ausrüstung verfügen, die für die Durchführung dieser Assays benötigt wird.
Derzeit stehen eine Vielzahl von Migrationstests zur Verfügung, um eine Vielzahl von Themen zur Zellmigration zu untersuchen. Es wurden sowohl 2D- als auch 3D-Migrationsmodelle entwickelt, die jeweils auf bestimmte Bereiche abzielen, die sich auf die Zellmigration auswirken. 3D-Migrationsmodelle werden in der Regel mit Zellinvasionsstudien in Verbindung gebracht und bewerten die Auswirkungen der extrazellulären Matrix auf die Zellmigration10,11,12, während 2D-Migrationsassays einen größeren Anwendungsbereich haben und in erster Linie zur Untersuchung von chemotaktischen Migration, Wundheilung und funktionellen Veränderungen während der Zellmigration13,14,15,16verwendet werden. Einige dieser Assays erfordern zusätzliche Ausrüstung, wie Boyden-Kammern oder Ausschlussringe, die die Verfügbarkeit dieser Assays für bestimmte Forscher reduzieren können. Einer der kosteneffizienteren Assays ist der Scratch-Assay, der typischerweise zur Beurteilung der Wundheilung und allgemeiner Veränderungen der Zellmigration14,17verwendet wird. Während die meisten Laboratorien für die Durchführung eines Kratzer-Assays ausgestattet sind, sind die Geräte, die zur Verfolgung der Zellmigration verwendet werden, in der Regel entweder nicht verfügbar oder zu teuer für den Kauf. Dazu gehört auch die Zeitraffermikroskopie, die ein invertiertes Mikroskop und ein Live-Bildgebungssystem erfordert. Diese teuren Geräte sind nicht für jedes Labor allgemein zugänglich. Daher unterstreicht diese Beobachtung die Notwendigkeit eines neuen Protokolls, das eine Bewertung der Zellmigration mit leichter verfügbaren Geräten ermöglicht.
Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine neue und kostengünstige Möglichkeit, die Zellmigration zu bewerten. Diese Methode folgt dem gleichen Verfahren, das mit Scratch-Assays verbunden ist, unterscheidet sich jedoch in der Analyse der Untersuchung der Zellmigration, indem Geräte verwendet werden, die in einem grundlegenden wissenschaftlichen Labor verfügbar sind. Dieses Protokoll mit gängigen Geräten ermöglicht eine genauere Bestimmung der Zellmigration ohne den Einsatz von Zeitraffermikroskopie. Neben der Bestimmung der Migration berücksichtigt diese Methode auch variable Faktoren im Scratch-Bereich, die sich stark auf die Zellmigration auswirken. Insgesamt bietet dieses neue Protokoll für die Zellmigrationsanalyse mehr Laboratorien die Möglichkeit, den Bereich der Zellmigration zu erforschen und dazu beizutragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allgemeine Zellkultur
- Kultur-Herz-Fibroblasten in Dulbecco es Modified Eagles Medium (DMEM) mit 1 g/L Glukose, Natriumpyruvat, L-Glutamin und ergänzt mit 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 2% L-Glutamin und 0,02% antimikrobiellem Reagenz (siehe Materialtabelle) und imCO2-Inkubator bei 37 °C gehalten.
- Kultur-Herz-Fibroblasten bis 90-95% Konfluenz wird bei Durchgang 0 (P0) erreicht. An dieser Stelle sind die Fibroblasten bereit, in eine 48-Well-Platte aufgeteilt zu werden, die für den Migrationstest verwendet wird.
2. Vorbereitung der Migrationsplatte
- Bereiten Sie eine 48-Well-Zellkulturplatte vor, indem Sie eine Linie mit einem gelben oder hellen permanenten Marker in der Mitte des Brunnens zeichnen. Zeichnen Sie dann drei Hash-Markierungen, die den Brunnen in drei separate Interessenbereiche unterteilen. Diese Abschnitte werden für die Bildgebung verwendet.
HINWEIS: Die Verwendung eines permanenten Lichtfarbmarkers ermöglicht eine einfache Abbildung migrierender Zellen. Dunkle Markierungen wie Schwarz oder Blau verhindern die Visualisierung migrierender Zellen. - Bei der Beurteilung der Migration auf einem Substrat (z. B. Kollagen), beschichten Sie den Brunnen zu diesem Zeitpunkt nach Anweisungen und Konzentrationen, die für das spezifische Substrat verwendet werden.
- Platte 15.000-20.000 Herzfibroblasten, P1, in jeden Brunnen und Kulturzellen, unter normalen Kultivierungsbedingungen (Bedingungen im vorherigen Abschnitt aufgeführt), bis sie 90-95% Konfluenz erreichen. Die Konfluenz sollte zwischen 24-48 Stunden erreicht werden.
HINWEIS: Achten Sie beim Einrichten der Migrationsplatte darauf, eine positive Steuerung (eine bekannte Migrationszelle, z. B. 3T3-Zellen18), eine negative Kontrolle (ungerrubbte Zellen) und einen leeren Brunnen einzuschließen.
3. Scratch Migration Assay & Fixierung
- Sobald die Zellen 90-95% Koninfluenza erreichen, entfernen Sie die Medien und kratzen Sie entlang der gezeichneten Linie mit einer sterilen P200 Pipettenspitze.
HINWEIS: Eine P200 Pipettenspitze ist die übliche Pipettenspitze, die mit dem Kratzer-Assay10,14,19verwendet wird. Machen Sie auch nur einen Durchgang mit der P200-Spitze, da mehr als ein Versuch zu mehreren Kratzerlinien führen kann. - Spülen Sie den Brunnen mit niedrigen Serummedien (1,5% FBS), um alle nicht angeschlossenen Herzfibroblasten zu entfernen.
- Fügen Sie jedem Brunnen 500 L mit niedrigem Serummedium hinzu. Wenn Sie pharmakologische Mittel verwenden, fügen Sie sie zu diesem Zeitpunkt hinzu.
HINWEIS: Niedrige Serummedien werden verwendet, weil sie die Zellmigration ermöglichen/fördern und verhindert, dass sich Fibroblasten ausbreiten, was die Ergebnisse des Migrationsassays20verzerren könnte. Für dieses Protokoll wurden 1,5% FBS verwendet. - Erfassen Sie 0 h-Bilder, bevor Sie die Fibroblasten in einem 5% CO2-Inkubator bei 37 °C für 24 h inkubieren.
- Erfassen Sie 0 h-Bilder mit einem invertierten Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv. Nehmen Sie zwei 0 h Bilder pro Brunnen. Dies wird eine vollständigere Abdeckung der Migrationslinie ermöglichen.
- Positionieren Sie den Brunnen mit den Markierungen (Linie und Striche), um die obere Hälfte der Kratzlinie zu erfassen. Vermeiden Sie die Abbildung des mittleren Bindestrichs, um sicherzustellen, dass derselbe Migrationsbereich nicht zweimal abgebildet wird, was die Ergebnisse verzerren könnte.
- Verwenden Sie Bildgebungssoftware (Tabelle der Materialien), um 0 h Bild #1 zu erfassen. Bewegen Sie dann die Platte, um die untere Hälfte des Brunnens/der Kratzerlinie in Sichtweite der Kamera zu positionieren. Vermeiden Sie es erneut, den mittleren Strich einzufangen. Sobald Sie an Ort und Stelle sind, erfassen Sie 0 h Bild #2 (Abbildung 1).
HINWEIS: Wenn Sie den mittleren Strich in beiden 0-h-Bildern vermeiden, wird verhindert, dass Migrationsbereiche doppelt erfasst werden, was, wenn dies geschieht, zu wiederholten Ergebnissen führen und die Daten verzerren könnte.
- Nach der Inkubation für 24 h, entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen, und waschen Sie den Brunnen mit 1x nichtsterilen PBS (fortan sind alle 1x PBS verwendet, ist nicht steril).
- In der Dunstabzugshaube 500 l 4% Paraformaldehyd in den Brunnen geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) brüten.
- Paraformaldehyd entfernen und 3x mit 1x PBS für je 5 min bei RT waschen.
- Sobald die Zellen gewaschen sind, nehmen Sie 24-stunden-Bilder auf oder fügen Sie jedem Brunnen 1x PBS hinzu und platzieren Sie sie bis zu einem späteren Zeitpunkt bei 4 °C. Die Zellen können 1-2 Wochen bei 4 °C bleiben, bis sie bildbereit sind.
- Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie jedem Brunnen 300 L permeabilisierende Lösung (1x PBS und 0,01 % Triton X-100) hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen/Platte mit sanftem, kontinuierlichem Schaukeln für 30 min bei RT.
- Entfernen Sie die Permeabilisizing-Lösung und fügen Sie 1% Coomassie Brilliant Blue Fleck (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% Essigsäure, 45% Methanol und 45% dH2O) für 10 min mit sanftem, kontinuierlichem Schaukeln bei RT hinzu.
HINWEIS: Wenn Platten mit einem extrazellulären Matrixsubstrat beschichtet sind, sollten Sie eine beschichtete Platte mit Coomassie-Färbung testen, bevor Sie einen Migrationstest durchführen. Abbildung 2 zeigt, dass ein Matrixsubstrat mit diesem Test verwendet werden kann und keine Auswirkungen auf die Visualisierung von Zellen. - Waschen Sie Die Brunnen 3x mit 1x PBS bei RT mit kontinuierlichem Schaukeln für jeweils 5 min.
- Nach dem Einwälten 300 l 1x PBS hinzugefügt und 24 h-Bilder aufnehmen.
- Erfassen Sie 24-h-Bilder, indem Sie den Brunnen an der gleichen Position ausrichten, die zum Erfassen der 0-h-Bilder verwendet wurde. Um dies zu erreichen, öffnen Sie die zuvor erfassten 0 h-Bilder und richten Sie die Markierung mit dem permanenten Marker an der gleichen Position aus. Die Linie in der Mitte und zusätzliche Strichmarken sollten eine enge Ausrichtung zwischen dem 24-h-Bild und dem 0-h-Bild ermöglichen (Abbildung 1).
4. Erstellung von 0 h und 24 h Bildern
- Öffnen Sie 0 h und 24 h Bilder, die vom gleichen Brunnen und Position in der Bildverarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien) aufgenommen wurden.
- Erstellen Sie eine neue Ebene auf dem 0-h-Bild. Klicken Sie dann auf die neue Ebene, und ändern Sie den Namen des Layers in "Linienebene", indem Sie auf den Text doppelklicken.
HINWEIS: Dieser Layer wird von diesem Punkt an als Linien-Layer bezeichnet. - Klicken Sie auf das Pinselwerkzeug (Pinselsymbol) und legen Sie die Größe auf 10 px und die Farbe auf Rot fest.
- Zeichnen Sie mit dem ausgewählten Linien-Layer zwei separate Linien, die den Bereich des Kratzers umreißen. Die Linien sollten keine Zellen berühren, da diese Linien den Migrationsbereich markieren.
- Klicken Sie auf das Werkzeug verschieben (Pfeilsymbol), und drücken Sie dann die Strg-Taste nach unten, und klicken Sie auf die Linien- und Hintergrund-Layer.
- Klicken Sie in die Mitte des 0-h-Bildes und ziehen Sie beide Ebenen in die Mitte des 24-H-Bildes.
- Klicken Sie nun mit dem 24-Stunden-Bild auf die 0 h-Hintergrundebene und ändern Sie die Deckkraft auf 50 %.
- Halten Sie die Strg-Taste gedrückt, klicken Sie sowohl auf den 0 h Hintergrund- als auch auf den Linien-Layer, und transformieren Sie dann die Layer (Bearbeiten>Freie Transformation). Richten Sie mit der freien Transformation den 0 h-Hintergrund und das Linienbild am 24-stunden-Hintergrundbild aus. Dieser Schritt führt zur Überlagerung des Bildes 0 h und 24 h, die notwendig ist, um die Linien, die den Bereich der Migration markieren, in der richtigen Position auf dem 24-h-Bild zu positionieren.
- Löschen Sie nach erfolgreicher Überlagerung der 0 h-Hintergrund- und Linienebenen auf das 24-h-Hintergrundbild die 0 h-Hintergrundebene. Löschen Sie, indem Sie auf die 0 h-Hintergrundebene klicken, dann mit der rechten Maustaste klicken und auf Layer löschen klicken.
- Wenn Sie das 0 h-Hintergrundbild löschen, bleibt nur die Linie und die 24-h-Hintergrundebene (jetzt als Migrationsbild bezeichnet). Der Linien-Layer gibt den Bereich Migration/Scratch auf dem 24-Stunden-Bild an und kann zum Bestimmen der Anzahl der migrierenden Zellen verwendet werden.
- Speichern als neues Migrationsbild als Photoshop-Datei und Als TIFF/JPEG. ANMERKUNG: Eine repräsentative Abbildung, die diesen Prozess darstellt, ist in Abbildung 3dargestellt.
5. Zählen der Anzahl der migrierenden Zellen
- Öffnen Sie das Migrationsbild. Dies kann in einem Programm erfolgen, das TIFF/JPEG-Dateien akzeptiert (Tabelle der Materialien).
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die sich dazwischen befinden, und berühren Sie die beiden roten Linien.
- Zeichnen Sie die Anzahl der migrierenden Zellen pro Bild auf. Es gibt zwei migrierende Bilder pro Brunnen, und diese Werte sollten erst kombiniert werden, nachdem die Werte für den Migrationsbereich korrigiert wurden (im nächsten Abschnitt beschrieben).
6. Bestimmen des Migrationsbereichs
7. Datenanalyse
- Normalisieren Sie die Anzahl der migrierenden Zellen in den prozentualen Bereich des Kratzers. Teilen Sie die Anzahl der migrierenden Zellen durch den prozentualen Bereich der Migrationslinie (- migrierte Zellen % Migrationsbereich). Führen Sie dies pro Bild und nicht einen Durchschnitt basierend auf der Migration pro Brunnen aus.
- Fügen Sie nach der Normalisierung der Werte pro Bild die Werte der beiden Bilder hinzu, die einen einzelnen Brunnen darstellen. Dieser Wert wird für grafische und statistische Analysen verwendet. Wenn der experimentelle Entwurf mehrere Replikationen enthielt. Durchschnittliche Replikationswerte vor der statistischen Analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieses Verfahren dokumentiert einen neuen Ansatz zum Untersuchen der Zellmigration, der sowohl kostengünstig als auch für die meisten Labore leicht anpassungsfähig ist. Viele Studien haben Zeitraffermikroskopie verwendet, um die Zellmigration zu bewerten, aber die für diese Methode erforderliche Ausrüstung ist vielen Laboratorien nicht ohne weiteres zugänglich. Die Verwendung von Linien und Bindestrichen für die Abgrenzung ermöglicht die Möglichkeit, bestimmte Interessengebiete zu unterschiedlichen Zeitpunkten ohne den Einsatz teurer Ausrüstung zurückzuerobern (Abbildung 1 & Abbildung 3). Während die Verwendung von Abgrenzungen für diesen neuen Ansatz unerlässlich ist, gibt es viele Bereiche dieser Methode, die an die individuellen Bedürfnisse der Forscher angepasst werden können. Das Protokoll zeigte einen 24-h-Endpunkt an; Dieser Endpunkt kann jedoch basierend auf den Anforderungen eines einzelnen Labors erweitert werden. Das Anpassen des Endpunkts des Protokolls kann eine kontinuierliche Kultivierung von Zellen für die weitere Verwendung ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Flexibilität, die Auswirkungen von pharmakologischen Modifikatoren sowie extrazellulären Matrixsubstraten auf die Migration zu testen. Schließlich ist die teuerste Komponente dieser Methode die Verwendung von Imaging-Software, die lizenzierte Software sein kann, aber die Verwendung von lizenzierter Software ist nicht die einzige Option. Andere Bildverarbeitungssoftware, die die Erzeugung von Linien und das Überlagern von Bildern ermöglicht, kann mit dieser Methode verwendet werden. Darüber hinaus stellt sie einen neuen Ansatz zur Untersuchung der Zellmigration durch Berücksichtigung des Kratzerbereichs dar.
Dieser neue Ansatz wurde vor kurzem in Burr et al. 2020 verwendet, um Unterschiede in der kardialen Fibroblastenmigration zwischen Zellen zu bewerten, die von nicht-diabetischen und diabetischen Herzen isoliert sind20. Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder zur Bewertung der Fibroblastenmigration. Aus diesen Bildern wurde festgestellt, dass 46 Fibroblasten aus nicht-diabetischen Herzen und 129 Fibroblasten aus diabetischen Herzen während des 24-Stunden-Zeitraums des Experiments ausgewandert waren. Bei Gruppenvergleichen war die Anzahl der Zellen aus den diabetischen Herzen 2,8x größer als Zellen aus nicht-diabetischen Herzen (Tabelle 1). Während diese Ergebnisse darauf hindeuteten, dass Zellen aus diabetischen Herzen mehr migriert hatten, waren die Zahlen irreführend, da der Bereich des Kratzers für jede der beiden Gruppen unterschiedlich war. Die nicht-diabetische Kratzfläche betrug 24,78 % der gesamtgemessenen Fläche, während der diabeteswanderungskratzte 16,77 % der gesamtgemessenen Fläche betrug. Wenn der Bereich des Kratzers berücksichtigt wurde, lieferte es ein Verhältnis (Zellzahl/% Kratzfläche), das darauf hindeutet, dass Fibroblasten von diabetischen Herzen tatsächlich 4,13x größer migrierten als Zellen aus nicht-diabetischen Herzen. Diese Ergebnisse haben deutlich gemacht, wie wichtig es ist, den Migrationsbereich bei der Durchführung von Migrationstests zu berücksichtigen.
Die Normalisierung auf den Bereich der Migration ermöglicht eine bessere und strengere Bewertung der Zellmigration und negiert potenzielle menschliche Fehler. Während die beschriebene Methode eine P200 Pipettenspitze verwendet, die einen gleichmäßigen und konsistenten Kratzer bieten sollte, können ungleichmäßige Kratzer aufgrund menschlicher Inkonsistenzen auftreten. Abbildung 5 zeigt, wie wichtig es ist, Unterschiede im Kratzbereich zu berücksichtigen. Wenn man nur die Anzahl der migrierten Fibroblasten vergleichen würde, würde dies zeigen, dass Abbildung 5A doppelt so viele migrierte Zellen hat wie Abbildung 5B. Wenn der Kratzerbereich zur Normalisierung der Daten verwendet wird, zeigt dies an, dass das Verhältnis von Fibroblasten zum Migrationsbereich sowohl in Abbildung 5A als auch in Abbildung 5Bähnlich ist. Für dieses Beispiel verwendeten wir unbehandelte nicht-diabetische Herzfibroblasten aus verschiedenen Fibroblastenisolationen; Daher sollte ein ähnliches Migrationsverhältnis aufgrund der Art der in Abbildung 5verwendeten Zellen das erwartete Ergebnis sein. Wenn man nur die Anzahl der migrierten Zellen anzeigt, könnte diese Feststellung falsch repräsentativ sein, wenn der zerkratzte Bereich nicht gleichmäßig und konsistent über alle Stichproben hinweg ist. Daher ist es wichtig, den zerkratzten Bereich mit dieser Methode sowie andere Scratch-Migrationstests zu berücksichtigen. Diese dargestellten Ergebnisse in Abbildung 5 zeigten, wie die Normalisierung der Anzahl der migrierten Zellen in den zerkratzten Bereich genaue, wiederholbare und zuverlässige Migrationsdaten darstellen kann.
Abbildung 1: Diagramm des experimentellen Designs für den Fibroblasten-Migration-Assay. Setup: Bevor Sie Zellen in Gut plattieren, zeichnen Sie eine Linie und 3 Strichspuren auf der Unterseite auf der Platte. 0 h: Kulturzellen bis 95% Konfluenz und verabreichen einen Kratzer parallel zur dargestellten Linie. Erfassen Sie 0 h-Bilder, indem Sie einen Abschnitt über und unter dem mittleren Strich auswählen. 24 h: Zellen 24 h migrieren lassen, bevor sie fixiert und gefärbt werden. Richten Sie bei 24-h-Bildern die gleiche Position wie 0 h-Bilder aus, um migrierte Zellen zu erfassen. Analyse: Skizzieren Sie den Migrationsbereich auf dem 0-h-Bild und überlagern Sie dann das 0-h-Bild auf das 24-h-Bild, um Migrations- und Flächenbilder zu generieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder, die Coomassie-Färbung zeigen, stören die Visualisierung von Zellen nicht. Herzfibroblasten wurden entweder auf kein Kollagen (Plastikschale), Kollagen isoliert von nicht-diabetischen Mäuseschwänzen oder Kollagen aus diabetischen Mäuseschwänzen plattiert. Die Zellen wurden im Scratch-Migration-Assay nach den hier beschriebenen Methoden verwendet. Die Zellen wurden mit 1% Coomassie Brilliant Blue Fleck gefärbt und dann wurden Bilder von wandernden Zellen aufgenommen. Die auf dem Bild abgebildete Maßstabsleiste beträgt 100 m. Details zur Kollagenisolation und/oder Zellmigration auf Kollagen finden Sie in Burr et al.20. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Daten, die den Unterschied bei der Migration von Herzfibroblasten zwischen nicht-diabetischen und diabetischen Zellen belegen. 0 h und 24 h Bilder zur Berechnung der Anzahl der migrierten Herzfibroblasten, die von nicht-diabetischen und diabetischen Mäusen isoliert wurden (rote Linie zeigt den Migrationsbereich und Bilder, die bei 20x mit Skalenbalken = 100 m aufgenommen wurden). Diabetische Herzzellen ließen 129 Zellen in einem Bereich von 16,77 % migrieren, was zu einem Migrationsverhältnis von 7,69 führte. Nicht-diabetische Fibroblasten hatten 46 Zellen mit einer Fläche von 24,78% migrieren, was zu einem Verhältnis von 1,86 führte. Die in dieser Abbildung dargestellten Bilder wurden in den in Burr et al.20 präsentierten Ergebnissen verwendet, aber die hier dargestellten Bilder wurden nicht in Burr et al.20gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Diagramm, das die Generierung des Bereichs des Migrationsbildes darstellt. Schritt #1: Öffnen Sie das Migrationsbild, das Migrationszeilen enthält. Schritt #2: Das 24-Stunden-Bild wird entfernt, sodass die Migrationszeilen im Bildfeld belassen werden. Schritt #3: Das Pinselwerkzeug wurde verwendet, um den Bereich der Migration auszufüllen. Schritt #4: Das Bild wird in Graustufen konvertiert und dann als neues Bild gespeichert. Die Maßstabsleiste steht für 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Ein Beispiel für die Auswirkungen verschiedener Migrationsgebiete auf die Fibroblastenmigration. Nicht-diabetische Herzfibroblasten wurden auf Plastikkulturgeschirr plattiert und im Scratch-Migration-Assay verwendet, wie oben beschrieben (Skala bar = 100 m). (A) 92 migrierte Fibroblasten mit einer prozentualen Fläche von 35,4 %, was zu einer Migrationsquote von 2,60 führte. (B) 45 Fibroblasten wanderten mit einer Fläche von 17,57 %, die ein Verhältnis von 2,56 berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Fibroblasten-Typ | Durchschnittliche Anzahl der migrierten Zellen | Durchschnittliche Fläche des Kratzers | Zellenzahl zu Scratched Area Ratio |
| Fibroblasten von nicht-diabetischen Herzen | 46 | 24.78% | 1.86 |
| Fibroblasten von diabetischen Herzen | 129 | 16.77% | 7.69 |
Tabelle 1: Migrationsdaten aus Demmigration-Scratch-Assay mit nicht-diabetischen und diabetischen Herzfibroblasten. Die Anzahl der migrierten nichtdiabetischen und diabetischen Fibroblasten wurde mit Abbildung 3bestimmt. Die Prozentfläche für jedes Bild wurde mit beschriebenen Methoden und ImageJ berechnet. Das Migrationsverhältnis wurde berechnet, indem die Anzahl der migrierten Fibroblasten durch das prozentuale Migrationsgebiet dividiert wurde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieser neue Ansatz für den Scratch-Migration-Assay bietet Forschern eine leichter zugängliche Methode, um Veränderungen in der Zellmigration zu untersuchen. Während dieser Test dem gleichen Verfahren für die Verabreichung eines Kratzers ähnlich wie andere Scratch-Assays folgt, bietet er eine neue Methode für die Bildgebung und genaue Analyse der Zellmigration10. Anstatt geräteintensive Methoden der Zeitraffermikroskopie und Live-Zell-Bildgebungskammern zu verwenden, beschreibt diese Methode den Einsatz allgemein verfügbarer Laborgeräte. Mit einem allgemeinen invertierten Mikroskop und einer Kamera kann man Migrationsbilder gleichzeitig erfassen und dabei konsistente Kulturbedingungen beibehalten. Darüber hinaus bietet diese Methode eine präzise Abbildung der gleichen Region von Interesse ohne den Einsatz von fortschrittlichen Geräten. Durch die Erfassung desselben Migrationsbereichs werden die Inkonsistenzen bei der Bestimmung der Zellmigration verringert und eine strengere und genauere Messung der Zellmigration ermöglichen. Schließlich berücksichtigt diese Methode den Bereich des Kratzers. Während Vorsicht geboten ist, um menschliche Abweichungen bei Kratzern zu minimieren, können immer noch Inkonsistenzen auftreten, was zeigt, wie wichtig es ist, Flächen als Normalisierungsfaktor für die Analyse der Zellmigration zu verwenden. Insgesamt bietet das oben beschriebene Protokoll einen neuen Ansatz für ein leistungsstarkes Tool, das häufig zur Bewertung der Zellmigration verwendet wird.
Die Entwicklung eines anpassungsfähigen Migrations-Assays bietet neue Wege für die Forschung. Der hier vorgestellte Migrationstest kann modifiziert werden, um spezifische Forschungsfragen zu untersuchen. Änderungen können in Bezug auf die Aktivierung oder Hemmung bestimmter Proteine von Interesse vorgenommen werden. Reagenzien wie pharmakologische Modifikatoren (Agonisten oder Antagonisten) und RNA-Interferenzen können vor, während oder sogar nach der Migration auf Migrations-Assay angewendet werden, um Fragen zur Migration und zu bestimmten Proteinen zu beantworten. Das geringe Volumen der 48-Well-Schale ermöglicht auch die Zulage geringerer Mengen an Modifikatoren, was eine weitere kostengünstige Methode ist. Darüber hinaus kann dieser Test geändert werden, um die Auswirkungen von extrazellulären Matrixkomponenten (ECM) auf die Zellmigration zu untersuchen. Kürzlich haben wir diese Methode angewendet, bei der Zellkulturplatten mit Kollagen beschichtet wurden, das von diabetischen und nicht-diabetischen Mäusen isoliert wurde, um die Auswirkungen der diabetischen extrazellulären Matrix auf die Kardial-Fibroblastenmigration zu bewerten20. Während diese Studie isoliertes Kollagen verwendet, Diese Methode kann an andere extrazelluläre Komponenten angepasst werden, die von Interesse sein können. Die Möglichkeit, die Auswirkungen der ECM-Migration zu bewerten, ist aufgrund mehrerer Studien, die die Bedeutung von ECM für die Migration20,21,22anzeigen, sehr nützlich. Eine mögliche Komplikation, die bei der Verwendung von ECM-Proteinen und der Beschichtung der Brunnen mit hochkonzentrierter ECM-Lösung auftreten kann, wirkt sich auf die Visualisierung von Zellen aus. Es wird empfohlen, wenn ECM, wie Kollagen, verwendet wird, um einen Brunnen und Flecken mit Coomassie blau zu beschichten, um zu sehen, ob das ECM die Bildgebung von Zellen visuell beeinträchtigen könnte. Wenn ECM die Visualisierung von Zellen beeinträchtigt, wird die Verdünnung der ECM-Lösung dieses Problem verbessern und die Visualisierung von Zellen auf ECM ermöglichen.
Dieser neue Ansatz für eine alte Technik bietet einige Einschränkungen. Diese Methode wurde an eine kleine Skala (48-Well-Zellkulturplatte) angepasst und kann nicht leicht auf größere Platten übergehen. Aufgrund der Größe des Brunnens und des in den Bildern erfassten Bereichs kann dieses Protokoll einen großen Teil des Migrationsbereichs dokumentieren. Die Erweiterung dieser Methode auf größere Brunnendimensionen kann jedoch dazu führen, dass ein niedrigerer Teil des Migrationsbereichs erfasst wird. Dies kann möglicherweise durch eine Erhöhung der Anzahl der aufgenommenen Bilder behoben werden, aber möglicherweise müssen zusätzliche Methoden angewendet werden, um sicherzustellen, dass der Bereich der Migration, der abgebildet wurde, für die 24-Stunden-Bilder neu identifiziert werden kann. Darüber hinaus ist diese Methode auf Zellen beschränkt, die in einem Scratch-Migrationstest verwendet werden können. Zellen, die nicht in einem traditionellen Scratch-Migration-Assay reagieren, sind möglicherweise nicht ideal für den in diesem Manuskript dargestellten Ansatz. Obwohl es einige Einschränkungen bei diesem Ansatz gibt, könnte die Änderung der in diesem Manuskript beschriebenen Methoden einige der Einschränkungen lindern.
Der Scratch-Migration-Assay folgt einem einfachen Ansatz, aber es gibt einige kritische Schritte, die befolgt werden müssen, um einen erfolgreichen Test zu erstellen. Ein entscheidender Schritt ist es, die Anzeigemarken auf der Unterseite des Brunnens zu zeichnen. Wenn die Indikatoren nicht auf den Brunnen gezeichnet werden, wird es sehr schwierig/unmöglich sein, den Bereich zu unterscheiden, der für das 24-Stunden-Bild abgebildet werden muss, sowie die Rückeroberung desselben Migrationsbereichs zu verhindern. Außerdem ist es wichtig, den gleichen Migrationsbereich im 24-Stunden-Bild zurückzuerobern, das im 0-h-Bild aufgenommen wurde. Wenn der gleiche Bereich nicht bei 24 h erfasst wird, ist eine Überlagerung der Bilder für die Migration nicht möglich. Ohne überlagerte Bilder wird es nicht möglich sein, zu bestimmen, welche Zellen migriert wurden. Die überlagerten Bilder sind für diesen Ansatz von entscheidender Bedeutung, da sie eine genaue Bestimmung für die Zellmigration bieten. Da die Scratch-Methode nicht immer gerade Kratzlinien bietet, ist es wichtig, dass die richtigen Bereiche abgebildet werden, um die überlagerten Bilder zu generieren. Die überlagerten Bilder bilden die Grundlage für die Genauigkeit dieses Migrations-Assays, der in diesem Manuskript präsentiert wird.
Eine neue Anpassung des Scratch-Migration-Assays bietet einen leichter zugänglichen und flexibleren Ansatz zur Untersuchung der Zellmigration. Frühere Zellmigrationsstudien verwendeten geräteintensive Methoden, die nicht für jedes Labor allgemein verfügbar sind. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die Entwicklung eines Migrations-Assays mit einem breiteren Spektrum an Zugänglichkeit von entscheidender Bedeutung ist. Dieses Manuskript beschrieb einen neuen Ansatz für eine alte Technik, die den Zugang zu Forschern, die an Zellmigration interessiert sind, verbessern wird. Darüber hinaus bietet diese Methode die Möglichkeit, die Zellkulturumgebung zu verändern, sei es über extrazelluläre Matrixkomponenten oder den Einsatz pharmakologischer Modifikatoren, um die Auswirkungen auf die Zellmigration zu bestimmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch den US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, die University of Mississippi School of Pharmacy und das Department of BioMolecular Sciences unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
