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Biology

コスト効率と適応性のあるスクラッチ移行アッセイ

doi: 10.3791/61527 Published: June 30, 2020

Summary

また、機器を多用する方法を用いずに細胞移動を決定する新しい手法を提供する、スクラッチ移行アッセイにコスト効率の高い方法を提示します。線維芽細胞はこのプロトコルで使用されたが、それは適応され、細胞の移動に影響を追加の細胞タイプおよび影響を研究するために利用することができる。

Abstract

細胞の移動は、生理学的および病理学的事象の両方において重要な要素である。正常な細胞移動は、免疫応答の開発や取り付けなどの重要な機能に必要です。細胞の移動過程で欠損または変化が起こると、有害な結果(すなわち、癌転移、創傷治癒、瘢痕形成)を有する可能性がある。細胞移動の重要性のために、手頃な価格、適応性、反復可能な細胞移動アッセイへのアクセスが必要です。一般的なスクラッチ移行アッセイを利用して、一般的な実験室機器を用いた細胞移動解析の新しい手法を開発しました。説明された方法は、タイムラプス顕微鏡を使用せずに関心のある特定の領域を再キャプチャすることを可能にする視覚的なマーカーを使用しています。さらに、移行マトリックス基質の変更から薬理学的修飾剤の添加に至るまで、実験計画において柔軟性を提供します。さらに、このプロトコルは、細胞の移動を調べる際にいくつかの方法では考慮されない、細胞の移動の領域を説明する方法を概説します。この新しいアプローチは、より多くの聴衆にスクラッチ移行アッセイを提供し、研究者が細胞移動の生理学的および病理生理学的影響を調べるより大きな機会を提供する。

Introduction

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細胞の移動は、多くの生理学的事象および病理学的事象にとって極めて重要である。それは、開発中に、免疫応答を取り付けるために、および適切な創傷治癒1、2、3のために必要される。これらの細胞移動イベントの多くは、物理的または化学的な信号によって引き起こされる可能性があります。例えば、免疫応答中に、白血球は化学誘引剤2に応答して傷害部位に向かって移行する。さらに、白血球はまた、追加の免疫細胞の移動を誘導するためにサイトカインを放出し、ならびに創傷治癒過程に関与する線維芽細胞などの他の細胞タイプ、およびしたがって、多細胞応答4を始動する。細胞の移行能力は、適切な生理機能のために不可欠です。しかし、細胞の移動が未チェックになると、それは有害な反応を有し、慢性炎症、血管疾患、癌転移、および傷害治癒障害2、3、4、5、6、7などの病理学的事象に寄与する可能性がある。傷の治癒障害は、細胞移動の欠陥による糖尿病患者の一般的な苦痛であり、これらの欠陥に対処しなければ、さらなる合併症(例えば、切断8、9)につながる可能性がある。この研究は、他の研究と同様に、正常な生理学的または病理学的状態下で細胞移動が起こるプロセスをさらに理解する必要性を示しており、この研究分野を進めるために不可欠である。これを達成するためには、これらのアッセイを行うために必要な機器を持っていない可能性のある研究者がアクセス可能で手頃な価格の移行アッセイを利用する必要があります。

現在、細胞移動に関する幅広いトピックを検討するために利用可能な様々な移行アッセイがあります。2D と 3D の両方の移行モデルが開発されており、それぞれがセル移行に影響を与える特定の領域を対象としています。3D移行モデルは、通常、細胞浸潤研究に関連しており、細胞外マトリックスが細胞移動及ぼす影響を評価する10,11,12であり、2D移行アッセイは応用範囲が広く、主に細胞移動中の化学学的移動、創傷治癒、および機能的変化を研究するために使用される13、14、15、16。これらのアッセイのいくつかは、特定の研究者にこれらのアッセイの可用性を減らすことができるボイデンチャンバーや除外リングなどの追加の機器を必要とします。よりコスト効率の高いアッセイの1つは、創傷治癒および細胞移動14,17における一般的な変化を評価するために典型的に使用されるスクラッチアッセイである。ほとんどの研究所はスクラッチアッセイを実施するために装備されていますが、細胞の移動を追跡するために使用される機器は、利用できないか、購入するには高価すぎる傾向があります。これには、逆顕微鏡とライブイメージングシステムを必要とするタイムラプス顕微鏡が含まれます。これらの高価な機器は、すべての実験室に一般的にアクセスできるわけではありません。したがって、この観察は、より容易に入手可能な機器で細胞移動の評価を可能にする新しいプロトコルの必要性を強調する。

ここで示すプロトコルは、セルの移行を評価する新しい手頃な方法を提供します。この方法は、スクラッチアッセイに関連する同じ手順に従いますが、基礎科学の実験室で一般的に入手可能な機器を利用して細胞移動を調べる分析において異なります。共通の装置を使用するこのプロトコルはタイムラプス顕微鏡法を使用しないで細胞の移動のより正確な決定を可能にする。この方法は、移行の決定に加えて、セルの移行に大きな影響を与えるスクラッチ領域の可変要因も考慮します。全体として、細胞移動解析のためのこの新しいプロトコルは、より多くの研究室が細胞移動の分野を探索し、貢献する機会を提供します。

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Protocol

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1. 一般的な細胞培養

  1. 1 g/L グルコースを含むダルベックコの修飾イーグルス培地 (DMEM) の培養心臓線維芽細胞、 ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、および14.2 mM NaHCO 3、14.9 mM HEPES、15%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、2%L-グルタミン、および0.02%の抗菌試薬(材料表を参照)を補い、37°CでCO2インキュベーターで維持した。
  2. 90〜95%の合流まで培養心臓線維芽細胞は、通過0(P0)で到達する。この時点で線維芽細胞は、移行アッセイに使用される48ウェルプレートに分割する準備ができています。

2. 移行プレートの準備

  1. 黄色または明るい色の永久マーカーを使用して、ウェルの中心を下に、線を引くことによって48ウェル細胞培養プレートを準備します。次に、ウェルを 3 つの別々の対象領域に分割する 3 つのハッシュマークを描画します。これらのセクションは、イメージングに使用されます。
    注:ライトカラーの永久マーカーを使用すると、移動セルのイメージングが容易になります。黒や青などの暗いマーカーは、移動セルの視覚化を防ぎます。
  2. 基質(例えば、コラーゲン)上の移動を評価する場合は、特定の基質に使用される指示および濃度に従って、この時点でウェルをコーティングする。
  3. プレート〜15,000-20,000心線維芽細胞、P1は、各ウェルおよび培養細胞に、正常な培養条件(前のセクションに記載された条件)の下で、90〜95%の合流に達するまで。合流は24-48時間の間に達する必要があります。
    注: 移行プレートを設定する場合は、正のコントロール (3T3 セル18など、既知の移動セル)、負のコントロール (傷なしのセル) と空白のウェルを含める必要があります。

3. スクラッチ移行アッセイと固定

  1. 細胞が90-95%の合流度に達したら、滅菌P200ピペットチップを使用して、描かれた線に沿ってメディアとスクラッチを取り除きます。
    注:P200ピペットチップは、スクラッチアッセイ10、14、19で使用される一般的なピペットチップサイズです。また、複数の試行が複数のスクラッチラインになる可能性があるため、P200 チップを使用して 1 回のパスのみを行います。
  2. 低血清培地(1.5%FBS)でウェルをすすい、未接続の心臓線維芽細胞を除去します。
  3. 各ウェルに低血清培地500μLを加えます。薬理学的薬剤を使用する場合は、この時点でそれらを追加します。
    注:低血清培地は、細胞の移動を可能/促進し、線維芽細胞が増殖するのを防ぎ、移行アッセイ20の結果をゆがめる可能性があるために使用されます。このプロトコルでは、1.5% FBS が使用されました。
  4. 37°Cで5%CO2インキュベーターで24時間、線維芽細胞をインキュベートする前に0時間の画像をキャプチャします。
    1. 20倍の目的で反転した顕微鏡を使用して0時間画像をキャプチャします。井戸ごとに2つの0時間の画像を撮ります。これにより、移行のラインをより完全にカバーできます。
    2. マーキング(ラインとダッシュ)を使用して、井戸を配置してスクラッチラインの上半分をキャプチャします。中間ダッシュのイメージングを避けて、同じ移行領域が 2 回イメージ化されないようにして、結果が歪む可能性があります。
    3. イメージングソフトウェア(材料表)を使用して、0 hの画像#1をキャプチャします。次に、プレートを動かして、カメラの視界にスクラッチのウェル/ラインの下半分を配置します。ここでも、中央ダッシュのキャプチャは避けてください。所定の位置に入ると、0 h イメージ #2をキャプチャします (図 1)。
      注: 0 時間の両方のイメージで中間ダッシュを回避すると、移行の領域を 2 回キャプチャできなくなります。
  5. 24時間インキュベートした後、ウェルから培地を取り出し、1x無菌PBSでウェルを洗浄する(今後、使用される1xPBSはすべて無菌である)。
  6. ヒュームフードに4%パラホルムアルデヒド500 μLを加え、室温(RT)で10分間インキュベートします。
  7. パラホルムアルデヒドを取り除き、RTでそれぞれ5分間1倍PBSで3倍洗います。
  8. 細胞を洗浄したら、24時間画像を取り込むか、1xPBSを各ウェルに加え、後で4°Cに置きます。細胞は、画像の準備ができるまで、1〜2週間4°Cにとどまることができます。
    1. 300 μLの透過性溶液(1x PBSおよび0.01%トリトン X-100)を各ウェルに加えて細胞を透過させます。RTで30分間穏やかで絶えず揺れる細胞/プレートをインキュベートします。
    2. パーメビライジング溶液を取り除き、1%クマシーブリリアントブルーステイン(3%クマシーブリリアントブルー、10%酢酸、45%メタノール、45%dH2 O)を10分間、RTで穏やかで絶え間ない揺れを加えます。
      注:プレートが細胞外マトリックス基板でコーティングされている場合は、移行アッセイを行う前に、クーマシー染色でコーティングされたプレートをテストしてください。 図2 は、マトリックス基板がこのアッセイと共に使用でき、細胞の可視化に影響を与えないことを示しています。
    3. RTで1x PBSで3倍の井戸を洗浄し、それぞれ5分間連続して揺れ動きます。
    4. 1x PBSの300 μLを加え、24時間画像をキャプチャした後。
    5. 0 h 画像をキャプチャするために使用したのと同じ位置にウェルを揃えて 24 時間画像をキャプチャします。これを達成するために、以前にキャプチャした0 h画像を開き、永久マーカーで作られたマーキングを使用して、井戸を同じ位置に整列させます。中央の線と追加のダッシュマークを使用すると、24 h イメージと 0 h イメージの間で近い位置に配置できます (図 1)。

0時間と24時間の画像の準備

  1. 0時間と24時間の画像をイメージングソフトウェアで同じ井戸と位置で撮影した画像を開く(材料表)。
  2. 0 h イメージに新しいレイヤーを作成します。次に、新しいレイヤーをクリックし、テキストをダブルクリックしてレイヤーの名前を「線画」に変更します。
    注: このレイヤーは、この時点からライン レイヤーと呼ばれます。
  3. ブラシツール( ブラシ アイコン)をクリックし、サイズを10 px、色を赤に設定します。
  4. 線レイヤーを選択した状態で、スクラッチ領域の輪郭を描く 2 本の別々の線を描画します。これらの線が移動領域を示しているため、線はセルに接触してはいけません。
  5. 移動ツール(矢印アイコン)をクリックし、Ctrlボタンを押しながら、ラインレイヤーと背景レイヤーの両方をクリックします。
  6. 0 h 画像の中央をクリックし、24 時間の画像の中央に両方のレイヤーをドラッグします。
  7. 今24 h画像を使用して、0 hの背景レイヤーをクリックし、不透明度を50%に変更します。
  8. Ctrl ボタンを押 したまま 、0 h の背景とライン レイヤーの両方をクリックし、レイヤーを自由に変換します (編集 >自由変換)。自由な変換を使用して、0 時間の背景と線の画像を 24 時間の背景イメージに合わせます。このステップは、0 h および 24 h イメージのオーバーレイを生じ、24 h イメージ上の正しい位置に移行領域をマークする線を配置する必要があります。
  9. 24時間背景画像に0時間の背景とラインレイヤーを正常にオーバーレイした後、0 hの背景レイヤーを削除します。0 h 背景レイヤーをクリックして削除し、右クリックしてレイヤーの削除 をクリックします。
  10. 0 h の背景画像を削除すると、線と 24 時間の背景レイヤー (現在は移行イメージと呼ばれます) が残ります。ライン レイヤーは、24 時間画像上の移動/スクラッチ領域を示し、移動セルの数を決定するために使用できます。
  11. 新しい移行イメージとしてフォトショップ ファイルと TIFF/JPEG の両方として保存します。注 : このプロセスを示す代表的な図を 図 3に示します。

5. 移動するセルの数をカウントする

  1. 移行イメージを開きます。これは、TIFF/JPEG ファイルを受け入れるプログラム (資料一覧) で実行できます。
  2. 2 本の赤い線に触れるだけでなく、その間に位置するセルの数をカウントします。
  3. イメージあたりの移動セル数を記録します。ウェルごとに 2 つのマイグレーション・イメージが存在し、これらの値は、マイグレーション領域の値が修正されるまで組み合わせるべきではありません (次のセクションで詳しく説明します)。

6. 移行の領域を決定する

  1. セクション 5 ( 資料一覧) のイメージング ソフトウェア プログラムで移行ラインを含む 24 時間イメージを開きます。
  2. この画像として保存する「マイグレーションエリア画像」として保存します。
  3. 保存後、背景レイヤーをクリックし、右クリックして[レイヤーの削除]をクリックします。これは画像にスクラッチ線のみを残すはずです(図3)。
  4. ブラシツール(ブラシアイコン)を使用すると、スクラッチの行間の領域を塗りつぶします。ブラシの色と、移行の線を描画するために使用する色を一致させます。
  5. イメージをグレースケールに変更して白黒のイメージを生成し(Image>Mode>グレースケール)、イメージを保存します (図 4)。
  6. 解析ソフトウェア (資料一覧) を起動し、解析ソフトウェア内の 「移行領域」ファイルを開きます。
  7. 移行ラインの領域を決定するには、[ イメージ]-[調整]→[しきい値] をクリックします。黒の移行領域が赤になり、パーセント領域が [しきい値] ボックスに表示されます。この領域は、画像でキャプチャされた領域全体と比較して、移行ラインがカバーする領域の割合として報告されます。
  8. 移行ラインのパーセンテージ領域を記録し、この値が同じイメージの移動セルの数とペアになっていることを確認します。

7. データ分析

  1. 移動するセルの数をスクラッチのパーセント領域に正規化します。移行するセルの数を、移行ラインのパーセント領域で割ります (移行されたセルの割合 ( 移行されたセルの割合 ) 。ウェルごとの移行に基づく平均ではなく、イメージごとにこれを行います。
  2. イメージごとの値を正規化した後、個々のウェルを表す 2 つのイメージの値を追加します。この値は、グラフィカルおよび統計分析に使用されます。実験計画に複数の反復が含まれていた場合。統計分析前の平均反復値。

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Representative Results

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この手順は、ほとんどのラボで費用対効果が高く、容易に適応可能な、細胞移動を研究するための新しいアプローチを文書化しています。多くの研究では、細胞の移動を評価するためにタイムラプス顕微鏡を使用してきましたが、この方法に必要な機器は多くの研究室で容易に入手できません。線やダッシュを使用して境界を使用すると、高価な機器を使用せずに、異なる時点で特定の対象領域を取り戻すことができます(図1&図3)。この新しいアプローチには境界の使用が不可欠ですが、この方法には、個々の研究者のニーズに合わせて適応できる多くの分野があります。プロトコルは 24 時間のエンドポイントを示しました。ただし、個々のラボのニーズに基づいてエンドポイントを拡張できます。プロトコルのエンドポイントを調整することで、細胞の培養を継続して、さらに使用することができます。さらに、このプロトコルは、移動に対する細胞外マトリックス基質と同様に薬理学的修飾剤の影響をテストする柔軟性を可能にする。最後に、この方法の最もコストのかかるコンポーネントは、ライセンスを受けたソフトウェアであるイメージングソフトウェアの使用ですが、ライセンスされたソフトウェアの使用だけがオプションではありません。この方法では、線の生成と画像のオーバーレイを可能にする他のイメージングソフトウェアを利用することができます。さらに、この方法の費用対効果が高く、適応性に優れ、スクラッチ領域を考慮して細胞移動を調べる新しいアプローチを提示する。

この新しいアプローチは、最近、非糖尿病および糖尿病の心臓20から分離された細胞間の心臓線維芽細胞の移動の違いを評価するためにBurrら2020で使用された。 図3 は、線維芽細胞の移動を評価するために使用される代表的な画像を示しています。これらの画像から、実験の24時間の間に、非糖尿病心から46個の線維芽細胞と糖尿病心から129個の線維芽細胞が移行したと判断した。グループ比較の結果、糖尿病の心臓からの細胞の数は、非糖尿病の心臓からの細胞よりも2.8倍大きく移行した(表1)。これらの結果は、糖尿病性心臓からの細胞がより多く移行したことを示したが、傷の領域は2つのグループのそれぞれ異なっていたので、数字は誤解を招く。非糖尿病の傷領域は測定された全面積の24.78%であったのに対し、糖尿病移動スクラッチは測定された全面積の16.77%であった。スクラッチ領域を考慮すると、糖尿病性心臓からの線維芽細胞が実際に非糖尿病の心臓から細胞よりも4.13倍大きく移行したことを示す比率(細胞数/%スクラッチ領域)を提供した。これらの結果は、移行アッセイを実施する際に移行領域を考慮することの重要性を強調した。

移行領域に正規化することで、細胞移動をより適切かつ厳格に評価し、潜在的な人為的ミスを否定できます。説明した方法は、均一かつ一貫したスクラッチを提供する必要があるP200ピペットチップを使用していますが、人間の不整合のために不均一な傷が発生する可能性があります。図 5は、スクラッチ領域のファクタリングの違いの重要性を示しています。もし、移行した線維芽細胞の数のみを比較する場合、図5Aは、図5Bと比較して、移行した細胞の数が2倍あることを示している。一方、スクラッチ領域がデータの正規化に使用される場合、移行領域に対する線維芽細胞の比率が図5Aおよび図5Bの両方で類似していることを示している。この例では、異なる線維芽細胞分離から未治療の非糖尿病心線維芽細胞を使用しました。したがって、図 5で使用するセルの性質上、同様の移行率が期待される結果になるはずです。移行された細胞の数のみを提示している場合、傷領域が均一で、すべてのサンプルで一貫していない場合、これらの発見は誤って表現される可能性があります。したがって、この方法と他のスクラッチ移行アッセイで傷領域を考慮することが重要です。図 5に示すこれらの結果は、スクラッチ領域への移行セル数を正規化することで、正確で再現可能で信頼性の高い移行データを提示する方法を示しています。

Figure 1
図1:線維芽細胞のスクラッチ移行アッセイの実験計画の図。設定: セルをめっきする前に、プレートの底部に線と3つの破線マークを描きます。0時間:培養細胞は95%まで合流し、描線に平行なスクラッチを投与する。中央のダッシュの上下のセクションを選択して 0 h 画像をキャプチャします。24時間:細胞を24時間移行させてから、固定して染色する。24時間画像の場合、0h画像と同じ位置にうまく整列して、移動したセルをキャプチャします。分析: 0 h イメージ上の移行領域の概要を示し、0 h イメージを 24 h イメージにオーバーレイして、移行イメージとエリア イメージを生成します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:クマシー染色を示す代表的な画像は、細胞の可視化を妨げない。心臓線維芽細胞は、コラーゲンなし(プラスチック皿)、非糖尿病マウス尾から単離されたコラーゲン、または糖尿病マウスの尾から単離されたコラーゲンのいずれにもメッキされた。細胞を、ここで説明する方法に従ってスクラッチ移行アッセイに用いた。細胞を1%クマシーブリリアントブルー染色で染色し、次いで細胞を移動させる画像を撮影した。画像に描かれているスケールバーは100 μmです。コラーゲンの単離や細胞の移行についての詳細は、Burr et al.20に記載されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:非糖尿病細胞と糖尿病細胞の心筋線維芽細胞移動の違いを示す代表的なデータ。0時間および24時間画像は、非糖尿病および糖尿病マウスから分離された移動した心臓線維芽細胞の数を計算するために使用される(赤線は、移動の領域を示し、スケールバー= 100μmで20倍で撮影した画像)。糖尿病性心細胞は16.77%の領域で129個の細胞が移動し、7.69%の移動率を生み出した。非糖尿病線維芽細胞は46個の細胞が24.78%の面積で移動し、1.86の比率につながった。この図に示した画像は、Burr et al.20 で示された結果で使用されましたが、ここで示した画像は Burr ら20に示されていませんでした。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: マイグレーション・イメージの領域の生成を示す図。ステップ#1: 移行行を含むマイグレーション・イメージを開きます。ステップ#2: 24 時間イメージが削除され、イメージ フィールドの移行ラインに残ります。ステップ#3: マイグレーションの領域を埋めるためにブラシツールを使用しました。ステップ #4: イメージがグレースケールに変換され、新しい画像として保存されます。スケールバーは100 μmを表します

Figure 5
図5:異なる移行領域が線維芽細胞移動に及ぼす影響の例。非糖尿病心筋線維芽細胞は、プラスチック培養皿にメッキされ、上記のようにスクラッチ移行アッセイで使用された(スケールバー= 100μm)。(A) 92は、35.4%の割合で線維芽細胞を移動し、その結果、移行比率は2.60であった。(B)45線維芽細胞は、2.56の比率を計算する17.57%の面積で移行した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

線維芽細胞型 移行されたセルの平均数 スクラッチの平均面積 セル番号から傷つき領域の比率
非糖尿病性心からの線維芽細胞 46 24.78% 1.86
糖尿病性心からの線維芽細胞 129 16.77% 7.69

表1:非糖尿病および糖尿病性心筋線維芽細胞を用いた移行スクラッチアッセイからの移行データ。 移行した非糖尿病および糖尿病性線維芽細胞の数を 図3を用いて決定した。各画像のパーセント面積は、説明方法と ImageJ を用いて計算した。移行の比率は、移行した線維芽細胞の数を割合の移行領域で割ることによって計算した。

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Discussion

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スクラッチ移行アッセイに対するこの新しいアプローチは、研究者が細胞移動の変化を調べるためのよりアクセスしやすい方法を提供します。このアッセイは、他のスクラッチアッセイと同様のスクラッチを投与するための同じ手順に従うが、細胞移動10のイメージングおよび正確な分析のための新しい方法を提供する。この方法は、タイムラプス顕微鏡とライブセルイメージングチャンバの機器集約的な方法を使用する代わりに、一般的に利用可能なラボ機器の使用を詳述します。一般的な反転顕微鏡とカメラを利用して、一貫した培養条件を維持しながら、同時に移動画像をキャプチャすることができます。また、この方法は、高度な機器を使用することなく、同じ関心領域の正確なイメージングを提供します。同じ移行領域をキャプチャすることで、細胞移動の決定における不整合が軽減され、より厳密で正確な細胞移動の測定が可能になります。最後に、この方法はスクラッチの領域を考慮に入れます。傷の人間の変動を最小限に抑えるために注意が払われますが、不整合は依然として発生する可能性があります。全体的に見て、上記のプロトコルは、セルの移行を評価するために一般的に使用される強力なツールへの新しいアプローチを提供します。

適応可能な移行アッセイを開発することは、研究のための新しい道を提供します。ここで提示される移行アッセイは、特定の研究問題を調べるために変更される能力を有する。目的の特定のタンパク質の活性化または阻害に関する修飾を行うことができます。薬理学的修飾剤(アゴニストまたはアンタゴニスト)やRNA干渉などの試薬は、移行前、移動中、または移行後の移行アッセイに適用され、移行や特定のタンパク質に関する質問に対処することができます。48ウェルディッシュの少量はまた、別の費用対効果の高い方法である、より少ない量のモディファイアを加えることを可能にする。さらに、このアッセイは、細胞外マトリックス成分(ECM)が細胞移動に及ぼす影響を調べるように改変することができる。最近、我々は、この方法を適用し、糖尿病および非糖尿病マウスから単離されたコラーゲンで細胞培養プレートをコーティングし、糖尿病性細胞外マトリックスが心臓線維芽細胞移行20に及ぼす影響を評価する。この研究は単離されたコラーゲンを利用したが、この方法は、関心のある他の細胞外成分に適応することができる。ECM 移行の影響を評価する機能は、移行に ECM の重要性を示す複数の調査に非常に便利です20、2122。ECMタンパク質を使用して、高濃度ECM溶液でウェルをコーティングすることにより起こり得る合併症は、細胞の可視化に影響を与えます。ECMが細胞のイメージングを視覚的に損なう可能性があるかどうかを確認するために、コラーゲンのようなECMを使用してよくコーティングし、クマシーブルーで染色する場合に推奨されます。ECMが細胞の可視化を損なう場合、ECM溶液を希釈するとこの問題が改善され、ECM上の細胞を視覚化できるようになります。

古い手法に対するこの新しいアプローチには、いくつかの制限があります。この方法は、小規模(48ウェル細胞培養板)に適合しており、より大きなプレートに容易に移行しない場合があります。井戸のサイズと画像にキャプチャされた領域のために、このプロトコルは、移行の領域の大部分を文書化することができます。ただし、この方法を大きなウェル ディメンションに拡張すると、移行領域の下部がキャプチャされる可能性があります。キャプチャしたイメージの数を増やすことで解決できる可能性がありますが、24 時間のイメージに対して移行イメージの領域を再確認するために追加の方法を適用する必要があります。また、この方法は、スクラッチ移行アッセイで利用できる細胞に限定される。従来のスクラッチ移行アッセイで反応しない細胞は、この原稿内で提示されるアプローチには理想的ではない可能性があります。この方法にはいくつか制限がありますが、この原稿で詳細に説明されている方法を変更すると、いくつかの制限が緩和される可能性があります。

スクラッチ移行アッセイは簡単なアプローチに従いますが、アッセイを成功させるためには、いくつかの重要なステップが必要です。重要なステップは、ウェルの底に示すマークを描く方法です。指標がウェルに描画されていない場合、24時間画像に対して画像化する必要がある領域を区別し、同じ移行領域を再キャプチャするのを防ぐことは非常に困難です。また、0 h 画像でキャプチャされた 24 時間画像の同じ領域の移行を再取得することも重要です。同じ領域が 24 時間でキャプチャされない場合、マイグレーションのためにイメージをオーバーレイすることは不可能です。オーバーレイされた画像がない場合、どのセルが移行されたかを判断することはできません。オーバーレイされたイメージは、セルの移行に正確な判断を与えるため、このアプローチでは重要です。スクラッチ法では必ずしも直線が得られるとは限らないため、オーバーレイされた画像を生成するためには、正しい領域を画像化することが重要です。オーバーレイされた画像は、この原稿内に提示されたこの移行アッセイの正確さの基礎を提供する。

スクラッチ移行アッセイの新しい適応により、細胞移動を調べる、よりアクセスしやすく柔軟なアプローチが提供されます。以前の細胞移動研究では、すべての実験室で一般的に利用できない機器集約的な方法を使用してきました。より広い範囲のアクセシビリティを有する移行アッセイの開発が不可欠であることを示す。この原稿は、細胞の移動に興味を持つ研究者へのアクセスを増やす古い技術への新しいアプローチを説明しました。さらに、この方法は、細胞外マトリックス成分または薬理修飾剤の使用を介して、細胞遊動に及ぼす影響を決定するために、細胞培養環境を変化させる能力を提供する。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この研究は、米国陸軍医学研究賞#81XWH-16-1-0710、ミシシッピ大学薬学部、生体分子科学科によって支援されています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe All Apps Adobe This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile MIDSCI AVR1 Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera Zeiss 426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher Scientific BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells Fisher Scientific 07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate Fisher Scientific MT10014CM
Image J NIH This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum Innovative Research IFBS-HU
Primocin InvivoGEN ant-pm-2 This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope Zeiss 491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software Zeiss software comes with camera purchase

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilbert, S. F. Developmental biology. Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
  2. Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
  3. Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281, (19), 13209-13216 (2006).
  4. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2, (4), (2012).
  5. Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
  6. Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1, (4), 171-175 (2007).
  7. Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7, (183), 1-9 (2014).
  8. Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340, (1), 117-126 (2010).
  9. Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 7 (2014).
  10. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752, (1), 10-24 (2013).
  11. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
  12. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
  13. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
  14. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2, (2), 329-333 (2007).
  15. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, (1), 107-124 (2011).
  16. Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316, (7), 1271-1281 (2010).
  17. Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 412-422 (2015).
  18. Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, (11), (1971).
  19. Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
  20. Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  21. Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
  22. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (39), 2595-2604 (2012).
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Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).More

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).

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