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Biology

Um ensaio de migração de arranhões econômico e adaptável

doi: 10.3791/61527 Published: June 30, 2020

Summary

Apresentamos um método econômico para o ensaio de migração de arranhões que fornece uma nova abordagem para determinar a migração celular sem o uso de métodos intensivos em equipamentos. Embora os fibroblastos tenham sido usados neste protocolo, ele pode ser adaptado e utilizado para estudar tipos e influências adicionais de células na migração celular.

Abstract

A migração celular é um componente-chave em eventos fisiológicos e patológicos. A migração celular normal é necessária para funções essenciais, como o desenvolvimento e a montagem de uma resposta imune. Quando ocorre um defeito ou alteração com o processo de migração celular, ele pode ter desfechos prejudiciais (ou seja, metástase do câncer, cicatrização de feridas e formação de cicatrizes). Devido à importância da migração celular, é necessário ter acesso a um ensaio de migração celular acessível, adaptável e repetível. Utilizando o ensaio comum de migração de arranhões, desenvolvemos uma nova abordagem para analisar a migração celular que utiliza equipamentos de laboratório gerais. O método descrito utiliza marcadores visuais que permitem a recapturação de áreas específicas de interesse sem o uso de microscopia de lapso de tempo. Além disso, proporciona flexibilidade no design experimental, desde a alteração do substrato da matriz migratória até a adição de modificadores farmacológicos. Além disso, este protocolo descreve uma forma de explicar a área de migração celular, que não é considerada por vários métodos ao examinar a migração celular. Esta nova abordagem oferece um ensaio de migração de arranhões para um público maior e proporcionará maior oportunidade para os pesquisadores examinarem o impacto fisiológico e fisiofisiológico da migração celular.

Introduction

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A migração celular é crucial para muitos eventos fisiológicos e patológicos. É necessário durante o desenvolvimento, para a montagem de uma resposta imune, e para a cicatrização adequada da ferida1,2,3. Muitos desses eventos de migração celular podem ser desencadeados por sinais físicos ou químicos. Por exemplo, durante uma resposta imune, os leucócitos migrarão para um local de lesão em resposta a um quimioattractant2. Além disso, os leucócitos também liberarão citocinas para induzir a migração de células imunes adicionais, bem como outros tipos de células, como os fibroblastos, que estão envolvidos no processo de cicatrização da ferida, e assim, iniciando uma resposta multicelular4. A capacidade das células de migrar é essencial para uma função fisiológica adequada; no entanto, quando a migração celular passa descontrolada, pode ter uma resposta adversa e contribuir para eventos patológicos, como inflamação crônica, doença vascular, metástase do câncer e cicatrização de feridasprejudicadas 2,3,4,5,6,7. A cicatrização de feridas prejudicadas é uma aflição comum de diabéticos devido a defeitos na migração celular, e se esses defeitos não forem resolvidos, pode levar a complicações adicionais (por exemplo, amputação8,9). Este estudo, assim como outros, indicou a necessidade de compreender melhor o processo pelo qual ocorre a migração celular, seja em condições fisiológicas normais ou patológicas, e é vital para promover esse campo de pesquisa. Para isso, é preciso que haja ensaios migratórios disponíveis, acessíveis e acessíveis aos pesquisadores, que podem não possuir os equipamentos necessários para a realização desses ensaios.

Atualmente, há uma variedade de ensaios migratórios disponíveis para examinar uma ampla gama de tópicos sobre migração celular. Ambos os modelos de migração 2D e 3D foram desenvolvidos, cada um visando áreas específicas que impactam a migração celular. Modelos de migração 3D são tipicamente associados a estudos de invasão celular e avaliam o impacto da matriz extracelular na migração celular10,11,12, enquanto os ensaios de migração 2D têm uma maior gama de aplicações e são usados principalmente para estudar migração quimotactica, cicatrização de feridas e alterações funcionais durante a migração celular13,14,15,16. Vários desses ensaios exigem equipamentos adicionais, como câmaras de Boyden ou anéis de exclusão, o que pode reduzir a disponibilidade desses ensaios para certos pesquisadores. Um dos ensaios mais econômicos é o ensaio de arranhões, que é normalmente usado para avaliar a cicatrização de feridas e mudanças gerais na migração celular14,17. Embora a maioria dos laboratórios esteja equipada para realizar um ensaio de arranhões, os equipamentos usados para rastrear a migração celular tendem a ser indisponíveis ou muito caros para comprar. Isso inclui microscopia de lapso de tempo, que requer um microscópio invertido e um sistema de imagem ao vivo. Esses equipamentos caros não são comumente acessíveis a todos os laboratórios. Portanto, esta observação destaca a necessidade de um novo protocolo que permita a avaliação da migração celular com equipamentos mais facilmente disponíveis.

O protocolo aqui apresentado fornece uma nova e acessível maneira de avaliar a migração celular. Este método segue o mesmo procedimento associado a ensaios de risco, mas difere na análise da migração celular examinando utilizando equipamentos mais comumente disponíveis em um ambiente de laboratório de ciências básicas. Este protocolo usando equipamento comum permite uma determinação mais precisa da migração celular sem o uso de microscopia de lapso de tempo. Além de determinar a migração, esse método também contabiliza fatores variáveis na área de risco que tem sido notados como um impacto muito grande na migração celular. No geral, este novo protocolo de análise de migração celular oferece uma oportunidade para mais laboratórios explorarem e contribuirem para o campo da migração celular.

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Protocol

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1. Cultura geral de células

  1. Fibroblastos cardíacos de cultura no Meio de Águias Modificadas (DMEM) de Dulbecco contendo 1 g/L de glicose, Piruvato de sódio, L-glutamina, e suplementado com 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% de soro bovino fetal inativado térmico (FBS), 2% L-glutamina e 0,02% reagente antimicrobiano (ver Tabela de Materiais) e mantido na incubadora CO2 a 37 °C.
  2. Fibroblastos cardíacos de cultura até 90-95% de confluência é alcançado na passagem 0 (P0). Neste ponto, os fibroblastos estão prontos para serem divididos em uma placa de 48 poços, que é usada para o ensaio de migração.

2. Preparação da placa de migração

  1. Prepare uma placa de cultura celular de 48 poços desenhando uma linha, usando um marcador permanente amarelo ou de cor clara, no centro do poço. Em seguida, desenhe três hash marks dividindo o poço em três áreas de interesse separadas. Estas seções serão usadas para imagens.
    NOTA: O uso de um marcador permanente de cor clara permitirá uma imagem fácil das células migratórias. Marcadores escuros como preto ou azul impedirão a visualização de células migratórias.
  2. Se avaliar a migração em um substrato (por exemplo, colágeno), cubra o poço neste momento seguindo instruções e concentrações utilizadas para o substrato específico.
  3. Placa ~15.000-20.000 fibroblastos cardíacos, P1, em cada célula de poço e cultura, em condições normais de cultivo (condições listadas na seção anterior), até atingirem 90-95% de confluência. A confluência deve ser alcançada entre 24-48 horas.
    NOTA: Ao configurar a placa de migração certifique-se de incluir um controle positivo (uma célula migratória conhecida, como células 3T318),um controle negativo (células nãotched) e um poço em branco.

3. Ensaio e fixação de migração de arranhões

  1. Uma vez que as células atinjam 90-95% de confluência, remova a mídia e arranhe ao longo da linha desenhada usando uma ponta de pipeta P200 estéril.
    NOTA: Uma ponta de pipeta P200 é a ponta comum de pipeta usada com o ensaio de arranhão10,14,19. Além disso, apenas faça uma passagem com a ponta P200, pois mais de uma tentativa pode resultar em múltiplas linhas de arranhão.
  2. Enxágüe o poço com baixa mídia sárida (1,5% FBS) para remover quaisquer fibroblastos cardíacos não ligados.
  3. Adicione 500 μL de baixa mídia sármia a cada poço. Se usar algum agente farmacológico, adicione-os neste momento.
    NOTA: A baixa mídia sérico é usada porque permite/promove a migração celular e impede a proliferação de fibroblastos que podem distorcer os resultados do ensaio migratório20. Para este protocolo, foi utilizado 1,5% de FBS.
  4. Capture 0h imagens antes de incubar os fibroblastos em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C por 24 h.
    1. Capture imagens de 0 h usando um microscópio invertido com um objetivo de 20x. Tire duas imagens de 0 h por poço. Isso permitirá uma cobertura mais completa da linha de migração.
    2. Usando as marcas (linha e traços), posicione o poço para capturar a metade superior da linha de arranhão. Evite a imagem do painel do meio para garantir que a mesma área de migração não seja imagem duas vezes, o que pode distorcer os resultados.
    3. Use software de imagem(Tabela de Materiais) para capturar #1 de imagem de 0 h. Em seguida, mova a placa para posicionar a metade inferior do bem/linha de arranhão em vista da câmera. Novamente, evite capturar o traço do meio. Uma vez no lugar, capture 0h imagem #2(Figura 1).
      NOTA: Evitar o traço médio em ambas as imagens de 0h evitará capturar áreas de migração duas vezes que, se feitas, poderiam produzir resultados repetitivos e distorcer os dados.
  5. Depois de incubar por 24h, remova a mídia do poço e lave o poço com PBS 1x nonsterile (de agora em diante todos os 1x PBS usados não são téris).
  6. Na capa de fumaça, adicione 500 μL de 4% de paraformaldeído ao poço e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente (RT).
  7. Remova o paraformaldeído e lave 3x com 1x PBS por 5 min cada no RT.
  8. Uma vez lavadas as células, proceda à captura de imagens de 24 h ou adicione 1x PBS a cada poço e coloque a 4 °C até um horário posterior. As células podem ficar a 4 °C por 1-2 semanas até ficarem prontas para a imagem.
    1. Permeabilize as células adicionando 300 μL de solução permeabilizing (1x PBS e 0,01% triton X-100) a cada poço. Incubar células/placas com balanço suave e contínuo por 30 min no RT.
    2. Remova a solução de permeabilização e adicione 1% de corroma da corroísia brilhante azul (3% Coomassie Azul Brilhante, 10% ácido acético, 45% metanol e 45% dH2O) por 10 minutos com balanço suave e contínuo na RT.
      NOTA: Se as placas forem revestidas com um substrato de matriz extracelular, certifique-se de testar uma placa revestida com coloração coomassie antes de realizar o ensaio de migração. A Figura 2 demonstra que um substrato matricial pode ser usado com este ensaio e não com a visualização de impacto das células.
    3. Lave os poços 3x com 1x PBS no RT com balanço contínuo por 5 min cada.
    4. Após lavagens, adicione 300 μL de 1x PBS e capture imagens de 24h.
    5. Capture imagens de 24h alinhando o poço na mesma posição usada para capturar as imagens de 0h. Para isso, abra as imagens 0h anteriormente capturadas e usando a marcação feita com o marcador permanente, alinhe o poço na mesma posição. A linha abaixo das marcas de traço médio e adicional deve permitir um alinhamento próximo entre a imagem de 24h e a imagem de 0h(Figura 1).

4. Preparação de imagens de 0h e 24 h

  1. Abra 0h e 24h imagens tiradas do mesmo poço e posição em software de imagem(Tabela de Materiais).
  2. Crie uma nova camada na imagem de 0h. Em seguida, clique na nova camada e altere o nome da camada para "camada de linha" clicando duas vezes no texto.
    NOTA: Esta camada será referida como camada de linha a partir deste ponto.
  3. Clique na Ferramenta de escova (ícone de escova) e ajuste o tamanho em 10 px e a cor para vermelho.
  4. Com a camada de linha selecionada, desenhe duas linhas separadas que delineiam a área do arranhão. As linhas não devem tocar em nenhuma célula devido a essas linhas que marcam a área de migração.
  5. Clique na Ferramenta mover (ícone de seta) e pressione o botão Ctrl e clique nas camadas de linha e de fundo.
  6. Clique no centro da imagem de 0h e arraste ambas as camadas para o meio da imagem de 24h.
  7. Agora, usando a imagem de 24h, clique na camada de fundo de 0h e altere a opacidade para 50%.
  8. Segurando o botão Ctrl, clique na camada de fundo e linha de 0h e, em seguida, transforme livremente as camadas (Editar>Transformar Livre). Usando a transformação livre, alinhe o fundo 0h e a imagem da linha à imagem de fundo de 24 horas. Esta etapa resulta na sobreposição da imagem de 0h e 24h, necessária para posicionar as linhas que marcam a área de migração na posição correta na imagem de 24h.
  9. Após sobreposição bem sucedida do fundo de 0h e camadas de linha na imagem de fundo de 24 horas, exclua a camada de fundo de 0 h. Exclua clicando na camada de fundo de 0 h, em seguida, clique com o botão direito do mouse e clique em excluir camada.
  10. A exclusão da imagem de fundo de 0h deixará apenas a linha e a camada de fundo de 24h (agora chamada de imagem de migração). A camada de linha indicará a área de migração/arranhão na imagem de 24h e pode ser usada para determinar o número de células migratórias.
  11. Salve como a nova imagem de migração como um arquivo photoshop e um TIFF/JPEG. NOTA: uma figura representativa que retrata esse processo é apresentada na Figura 3.

5. Contando o número de células migratórias

  1. Abra a imagem de migração. Isso pode ser feito em um programa que aceita arquivos TIFF/JPEG(Tabela de Materiais).
  2. Conte o número de células que estão localizadas no meio, bem como toque as duas linhas vermelhas.
  3. Regisso o número de células migratórias por imagem. Haverá duas imagens migratórias por poço, e esses valores não devem ser combinados até que os valores tenham sido corrigidos para área de migração (detalhados na próxima seção).

6. Determinar a área de migração

  1. Abra a imagem de 24h que contém as linhas de migração no programa de software de imagem na seção 5 (Tabela de Materiais).
  2. Salve Como esta imagem como "Imagem da área de migração".
  3. Depois de salvar, clique na camada de fundo, clique com o botão direito do mouse e clique em excluir camada. Isso deve deixar apenas as linhas de arranhão na imagem(Figura 3).
  4. Utilizando a ferramenta de escova (ícone de escova) preencha a área entre as linhas de risco. Combine a cor do pincel com a cor usada para desenhar as linhas para migração.
  5. Mude a imagem para uma escala de cinza para gerar uma imagem em preto e branco(Image>Mode>Grayscale) e, em seguida, salvar a imagem(Figura 4).
  6. Inicie o software de análise (Tabela de Materiais) e, em seguida, abra o arquivo "Área de Migração" dentro do software de análise.
  7. Para determinar a área da linha de migração, clique em Imagem>Ajuste>Limiar. A área de migração preta ficará vermelha e a área percentual será indicada na caixa Limiar. A área será relatada como a porcentagem da área que a linha de migração cobre em comparação com toda a área capturada na imagem.
  8. Regiss qual é a área percentual para a linha de migração e certifique-se de que esse valor seja emparelhado com o número de células migratórias para a mesma imagem.

7. Análise de dados

  1. Normalizar o número de células migratórias para a área percentual do arranhão. Divida o número de células migratórias pela área percentual da linha de migração (# células migradas % Área de migração). Faça isso por imagem e não uma média baseada na migração por poço.
  2. Após normalizar valores por imagem, adicione os valores das duas imagens, o que representa um bem individual. Este valor será utilizado para análise gráfica e estatística. Se o projeto experimental contivesse várias réplicas. Valores médios de replicação antes da análise estatística.

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Representative Results

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Este procedimento documenta uma nova abordagem para estudar a migração celular que é ao mesmo tempo econômica e facilmente adaptável para a maioria dos laboratórios. Muitos estudos têm usado microscopia de lapso de tempo para avaliar a migração celular, mas o equipamento necessário para este método não está prontamente disponível para muitos laboratórios. Considerando que a utilização de linhas e traços para demarcação permite a capacidade de recapturar áreas específicas de interesse em diferentes pontos de tempo sem o uso de equipamentos caros (Figura 1 e Figura 3). Embora o uso de demarcações seja essencial para essa nova abordagem, existem muitas áreas desse método que podem ser adaptadas para atender às necessidades individuais dos pesquisadores. O protocolo indicava um ponto final de 24h; no entanto, esse ponto final pode ser estendido com base nas necessidades de um laboratório individual. Ajustar o ponto final do protocolo pode permitir a continuação da colheita das células para uso posterior. Além disso, este protocolo permite a flexibilidade para testar o impacto de modificadores farmacológicos, bem como substratos de matriz extracelular na migração. Por fim, o componente mais caro deste método é o uso de software de imagem, que pode ser software licenciado, mas o uso de software licenciado não é a única opção. Outros softwares de imagem que permitem a geração de linhas e imagens sobrepostas podem ser utilizados com este método. Além disso, à natureza econômica e adaptável deste método, apresenta uma nova abordagem para examinar a migração celular, fatorando a área do arranhão.

Esta nova abordagem foi recentemente utilizada em Burr et al. 2020 para avaliar diferenças na migração de fibroblastos cardíacos entre células isoladas de corações não diabéticos e diabéticos20. A Figura 3 apresenta imagens representativas utilizadas para avaliar a migração do fibroblasto. A partir dessas imagens, foi determinado que 46 fibroblastos de corações não diabéticos e 129 fibroblastos de corações diabéticos haviam migrado durante o período de 24h do experimento. Após comparações em grupo, o número de células dos corações diabéticos migrou 2,8x maior do que as células de corações não diabéticos(Tabela 1). Embora esses resultados indicassem que as células de corações diabéticos migraram mais, os números foram enganosos, pois a área do arranhão era diferente para cada um dos dois grupos. A área de risco não diabético foi de 24,78% da área total medida, enquanto o arranhão da migração diabética foi de 16,77% da área total medida. Quando a área do arranhão foi considerada, forneceu uma razão (número celular/% área de risco) indicando que os fibroblastos de corações diabéticos realmente migraram 4,13x maior do que as células de corações não diabéticos. Esses resultados destacaram a importância de considerar a área de migração na condução dos ensaios migratórios.

A normalização para a área de migração fornece uma avaliação melhor e mais rigorosa da migração celular e nega o potencial erro humano. Embora o método descrito use uma ponta de pipeta P200, que deve fornecer um arranhão uniforme e consistente, arranhões irregulares podem ocorrer devido a inconsistências humanas. A Figura 5 destaca a importância de fatorar diferenças na área do risco. Se fosse para comparar apenas o número de fibroblastos migrados, mostraria que a Figura 5A tem o dobro do número de células migradas em comparação com a Figura 5B. Considerando que quando a área do arranhão é usada para normalizar os dados, indica que a razão entre fibroblastos e área de migração é semelhante tanto na Figura 5A quanto na Figura 5B. Para este exemplo, usamos fibroblastos cardíacos não diabéticos não tratados de diferentes isolamentos de fibroblastos; portanto, uma razão de migração semelhante deve ser o resultado esperado devido à natureza das células utilizadas na Figura 5. Se alguém estivesse apresentando apenas o número de células migradas, esses achados poderiam ser deturpados se a área arranhada não for uniforme e consistente em todas as amostras. Portanto, é importante explicar a área arranhada com este método, bem como outros ensaios de migração de arranhões. Esses resultados representados apresentados na Figura 5 demonstraram como a normalização do número de células migradas para a área arranhada pode apresentar dados de migração precisos, repetíveis e confiáveis.

Figure 1
Figura 1: Diagrama do projeto experimental para o ensaio de migração de arranhões do fibroblasto. Configuração: Antes de emplacar as células em poço, desenhe uma linha e 3 marcas de traço na parte inferior da placa. 0 h: Células de cultura até 95% de confluência e administram um arranhão paralelamente à linha retratada. Capture imagens de 0h selecionando uma seção acima e abaixo do painel do meio. 24 h: Permitir que as células migrem por 24h antes de fixar e coloração. Para imagens de 24h, alinhe bem na mesma posição das imagens de 0h para capturar células migradas. Análise: Delineie a área de migração em imagem de 0h e, em seguida, sobreponha a imagem de 0h na imagem de 24h para gerar imagens de migração e área. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagens representativas que mostram a coloração de Coomassie não interferem na visualização das células. Os fibroblastos cardíacos foram banhados em colágeno (prato plástico), colágeno isolado de caudas de camundongos não diabéticos ou colágeno isolado de caudas de camundongos diabéticos. As células foram utilizadas no ensaio de migração de arranhões seguindo os métodos descritos aqui. As células foram manchadas com 1% de mancha Azul Brilhante Coomassie e, em seguida, imagens de células migratórias foram capturadas. A barra de escala retratada na imagem é de 100 μm. Detalhes sobre isolamento de colágeno e/ou migração celular no colágeno são apresentados em Burr et al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Dados representativos que demonstram a diferença na migração do fibroblasto cardíaco entre células não diabéticas e diabéticas. 0h e 24 h imagens utilizadas para calcular o número de fibroblastos cardíacos migrados isolados de camundongos não diabéticos e diabéticos (linha vermelha retrata a área de migração e imagens tiradas em 20x com barra de escala = 100 μm). As células cardíacas diabéticas tiveram 129 células migrando em uma área de 16,77%, o que produziu uma razão migratória de 7,69. Os fibroblastos não diabéticos tiveram 46 células migrando com uma área de 24,78% o que levou a uma razão de 1,86. As imagens apresentadas nesta figura foram utilizadas nos resultados apresentados em Burr et al.20, mas as imagens aqui retratadas não foram mostradas em Burr et al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Diagrama que retrata a geração da área de imagem migratória. Passo #1: Imagem de migração aberta que contém linhas de migração. Passo #2: A imagem de 24h é removida, deixando nas linhas de migração no campo de imagem. Passo #3: A ferramenta de pincel foi usada para preencher a área de migração. Passo #4: A imagem é convertida em escala de cinza e, em seguida, salva como uma nova imagem. A barra de escala representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Um exemplo do impacto das diferentes áreas migratórias na migração do fibroblasto. Os fibroblastos cardíacos não diabéticos foram banhados em pratos de cultura plástica e utilizados no ensaio de migração de arranhões, conforme descrito acima (barra de escala = 100 μm). (A) 92 migraram fibroblastos com uma área percentual de 35,4% o que resultou em uma razão migratória de 2,60. (B) 45 fibroblastos migraram com uma área de 17,57% que calcula uma razão de 2,56. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tipo de fibroblasto Número médio de células migradas Área Média do Arranhão Número de celular para razão de área arranhada
Fibroblastos de Corações Não Diabéticos 46 24.78% 1.86
Fibroblastos de Corações Diabéticos 129 16.77% 7.69

Tabela 1: Dados de migração do ensaio de risco de migração utilizando fibroblastos cardíacos não diabéticos e diabéticos. O número de fibroblastos não diabéticos e diabéticos que migraram foi determinado utilizando-se a Figura 3. A área percentual para cada imagem foi calculada utilizando-se métodos descritos e ImageJ. A razão de migração foi calculada dividindo-se o número de fibroblastos migrados pela área de migração percentual.

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Discussion

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Essa nova abordagem do ensaio de migração de arranhões fornece um método mais acessível para os pesquisadores examinarem as mudanças na migração celular. Embora este ensaio siga o mesmo procedimento para administrar um arranhão semelhante a outros ensaios de risco, ele fornece um novo método para imagem e análise precisa da migração celular10. Em vez de usar métodos intensivos em equipamentos de microscopia de lapso de tempo e câmaras de imagem de células vivas, este método detalha o uso de equipamentos de laboratório comumente disponíveis. Utilizando um microscópio e câmera invertidos em geral, pode-se capturar imagens de migração ao mesmo tempo, mantendo condições de cultura consistentes. Além disso, este método fornece uma imagem precisa da mesma região de interesse sem o uso de equipamentos avançados. Capturar a mesma área de migração reduzirá as inconsistências na determinação da migração celular e fornecerá uma medição mais rigorosa e precisa da migração celular. Por fim, este método leva em consideração a área do arranhão. Embora seja tomada cautela para minimizar as variações humanas nos arranhões, ainda podem ocorrer inconsistências, demonstrando a importância do uso da área como fator normalizador na análise da migração celular. No geral, o protocolo detalhado acima fornece uma nova abordagem para uma ferramenta poderosa comumente usada para avaliar a migração celular.

O desenvolvimento de um ensaio de migração adaptável fornece novos caminhos para a pesquisa. O ensaio migratório aqui apresentado tem a capacidade de ser modificado para examinar questões específicas de pesquisa. Modificações podem ser feitas em relação à ativação ou inibição de proteínas específicas de interesse. Reagentes como modificadores farmacológicos (agonistas ou antagonistas) e interferência de RNA podem ser aplicados ao ensaio migratório antes, durante ou mesmo após a migração para responder a questões sobre migração e proteínas específicas. O pequeno volume do prato de 48 poços também permite que quantidades mais baixas de modificadores sejam adicionadas, o que é outro método econômico. Além disso, este ensaio pode ser modificado para estudar o impacto dos componentes da matriz extracelular (ECM) na migração celular. Recentemente aplicamos este método, onde placas de cultura celular foram revestidas com colágeno isolado de camundongos diabéticos e não diabéticos para avaliar o impacto da matriz extracelular diabética na migração do fibroblasto cardíaco20. Embora este estudo tenha utilizado colágeno isolado, este método pode ser adaptado a outros componentes extracelulares que possam ser de interesse. A capacidade de avaliar o impacto da migração de ECM é muito útil devido a múltiplos estudos que indicam a importância do ECM na migração20,21,22. Uma complicação potencial que pode ocorrer com o uso de proteínas ECM e revestimento dos poços com solução ECM altamente concentrada é um impacto na visualização das células. Recomenda-se que o ECM, como o colágeno, cubra um poço e manche com azul Coomassie para ver se o ECM poderia prejudicar visualmente a imagem das células. Se o ECM prejudicar as células visualizadoras, a solução de ECM diluída melhorará esse problema e permitirá visualizar células em ECM.

Essa nova abordagem sobre uma técnica antiga apresenta algumas limitações. Este método foi adaptado para uma pequena escala (placa de cultura celular de 48 poços) e pode não fazer a transição para placas maiores facilmente. Devido ao tamanho do poço e da área capturada nas imagens este protocolo pode documentar grande parte da área de migração. No entanto, expandir esse método para dimensões de poços maiores pode resultar na captura de uma parcela menor da área de migração. Isso pode ser potencialmente resolvido aumentando o número de imagens capturadas, mas métodos adicionais podem precisar ser aplicados para garantir que a área de migração imagem possa ser reidentiada para as imagens de 24h. Além disso, este método é limitado a células que podem ser utilizadas em um ensaio de migração de arranhões. Células que não respondem em um ensaio tradicional de migração de arranhões podem não ser ideais para a abordagem apresentada neste manuscrito. Embora existam algumas limitações com essa abordagem, modificar os métodos detalhados neste manuscrito poderia aliviar algumas das limitações.

O ensaio de migração de arranhões segue uma abordagem simples, mas existem algumas etapas críticas que precisam ser seguidas para produzir um ensaio bem-sucedido. Um passo crucial é desenhar as marcas indicando na parte inferior do poço. Se os indicadores não forem desenhados nos poços será muito difícil/impossível diferenciar a área que precisa ser imagem para a imagem de 24h, bem como impedir a recaptura da mesma área de migração. Além disso, é importante recapturar a mesma área de migração na imagem de 24h que foi capturada na imagem 0h. Se a mesma área não for capturada às 24h, a sobreposição das imagens para migração não será viável. Sem imagens sobrepostas não será possível determinar quais células migraram. As imagens sobrepostas são fundamentais para essa abordagem, pois fornecem uma determinação precisa para a migração celular. Uma vez que o método de risco nem sempre fornece linhas retas de risco, é fundamental que as áreas corretas sejam imagens para gerar as imagens sobrepostas. As imagens sobrepostas fornecem a base para a precisão deste ensaio migratório apresentado neste manuscrito.

Uma nova adaptação do ensaio de migração de arranhões fornece uma abordagem mais acessível e flexível para examinar a migração celular. Estudos anteriores de migração celular usaram métodos intensivos em equipamentos que não são comumente disponíveis para todos os laboratórios. Indicando que o desenvolvimento de um ensaio migratório que tenha uma gama mais ampla de acessibilidade é essencial. Este manuscrito descreveu uma nova abordagem a uma técnica antiga que aumentará a acessibilidade aos pesquisadores interessados na migração celular. Além disso, este método fornece a capacidade de alterar o ambiente de cultura celular, seja através de componentes da matriz extracelular ou do uso de modificadores farmacológicos, para determinar o impacto que tem na migração celular.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado pelo Prêmio de Pesquisa Médica do Exército dos EUA #81XWH-16-1-0710, pela Faculdade de Farmácia da Universidade do Mississipi e pelo Departamento de Ciências Biomoleculares.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe All Apps Adobe This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile MIDSCI AVR1 Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera Zeiss 426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher Scientific BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells Fisher Scientific 07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate Fisher Scientific MT10014CM
Image J NIH This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum Innovative Research IFBS-HU
Primocin InvivoGEN ant-pm-2 This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope Zeiss 491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software Zeiss software comes with camera purchase

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Um ensaio de migração de arranhões econômico e adaptável
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Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).

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