Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Een chronisch slaapfragmentatiemodel met trillende orbitale rotor om cognitieve tekorten en angstachtig gedrag op te wekken bij jonge wilde muizen

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61531

Summary

Hier gepresenteerd is een protocol voor chronische slaapfragmentatie (CSF) model bereikt door een elektrisch bestuurde orbitale rotor, die bevestigde cognitieve tekorten en angst-achtig gedrag bij jonge wilde muizen zou kunnen induceren. Dit model kan worden toegepast om de pathogenese van chronische slaapstoornissen en gerelateerde aandoeningen te onderzoeken.

Abstract

Slaapstoornissen komen over het algemeen vaak voor bij populaties als een chronische ziekte of een geklaagde gebeurtenis. Chronische slaapstoornissen worden voorgesteld om nauw verbonden te zijn met de pathogenese van ziekten, met name neurodegeneratieve ziekten. We ontdekten onlangs dat 2 maanden slaapfragmentatie de ziekte van Alzheimer (AD)-achtige gedrags- en pathologische veranderingen in jonge wilde muizen initieerde. Hierin presenteren we een gestandaardiseerd protocol om chronische slaapfragmentatie (CSF) te bereiken. Kortom, CSF werd geïnduceerd door een orbitale rotor die trilde bij 110 tpm en werkte met een repetitieve cyclus van 10 s-on, 110 s-off, tijdens light-ON fase (8:00 AM-8:00 PM) continu gedurende maximaal 2 maanden. Beperkingen van ruimtelijk leren en geheugen, angstachtig maar niet depressie-achtig gedrag bij muizen als gevolgen van CSF-modellering, werden geëvalueerd met Morris waterdoolhof (MWM), Nieuwe objectherkenning (NOR), Open veldtest (OFT) en Geforceerde zwemtest (FST). In vergelijking met andere slaapmanipulaties minimaliseert dit protocol de hanteringsarbeid en maximaliseert het de modelleringsefficiëntie. Het produceert stabiele fenotypen bij jonge wilde muizen en kan mogelijk worden gegenereerd voor verschillende onderzoeksdoeleinden.

Introduction

Slaapstoornissen komen steeds vaker voor, zowel bij patiënten met slaapverstoortende aandoeningen als bij gezonde mensen met slaapverstoortende voorvallen. Er is waargenomen dat patiënten met neurodegeneratieve ziekten, chronische pijn, emotionele stress, aandoeningen van het ademhalingssysteem, urinewegaandoeningen, enz., meestal klagen over onaangename slaapervaringen1,2,3,4,5. Obstructieve slaapapneu (OSA), periodieke bewegingen van ledematen in de slaap (PLMS), slaapbehoud slapeloosheid onder andere slaapstoornissen zijn de meest voorkomende oorzaken, die slaapfragmentatie veroorzaken6,7. In ontwikkelde landen heeft OSA een prevalentie van meer dan 5% tot 9% in de volwassen bevolking en 2% in de kinderpopulatie8,9,10. Ondertussen is er een toenemend deel van de gezonde bevolking die slaapstoornissen ervaart als gevolg van overmatig gebruik van smartphones, onregelmatige slaapgewoonten, vervelende geluiden en werktaken, zoals nachtdiensten voor zorgverleners. Slaap wordt erkend als belangrijk voor de opruiming van hersenafval11,12,geheugenconsolidatie13,14,metabole balans15,16, naast vele andere fysiologische processen. Toch blijft het grotendeels onbekend of langdurige slaapstoornissen aanleiding geven tot onomkeerbare pathogeneseveranderingen bij gezonde mensen, en of het de etiologie is of een bijdragende factor voor het ontwikkelen van ziekten van het centrale zenuwstelsel, zoals neurodegeneratieve ziekten in een paar jaar later. Ons doel is om een experimenteel model te rapporteren dat stabiel en duidelijk cognitief tekort en angstachtig gedrag genereert bij jonge wilde muizen na een slaapfragmentatiebehandeling van 2 maanden. Dit model zou worden toegepast voor het beantwoorden van de hierboven genoemde wetenschappelijke vragen.

Slaapstoornissen worden vermeld als een potentiële risicofactor voor het ontwikkelen van de ziekte van Alzheimer (AD) of dementie. Kang et al. vonden en beschreven voor het eerst de exacerbatie van AD-pathologie met 6 uur acuut slaaptekort17. Daarna meldden vele andere studies dat slaaptekort of fragmentatie pathogenese in transgene AD-muizenmodellen18,19,20zou kunnen verergeren . Zeer weinig onderzoekers hebben echter het gevolg van slaapstoornissen bij jonge wilde muizen bestudeerd; dat wil zeggen, of slaapstoornissen aanleiding geven tot AD-achtig gedrag of pathologische veranderingen bij jonge wilde muizen. In onze recente publicatie meldden we dat 2 maanden slaapfragmentatie een duidelijk ruimtelijk geheugentekort en angstachtig gedrag veroorzaakte, evenals verhoogde intracellulaire Amyloid-β (Aβ) accumulatie zowel in cortex als hippocampus bij 2-3 maanden oude wilde muizen21. We hebben ook gewijzigde expressieniveaus van endosome-autophagosome-lysosome pathway markers en microglia activatie waargenomen, wat vergelijkbaar was met de pathologische veranderingen gerapporteerd in APP/PS1 muizen21,22.

Dit gepresenteerde slaapfragmentatieprotocol (SF) werd gevalideerd door Sinton et al.23 en gewijzigd door Li et al.24. Kortom, een orbitale rotor die trilt bij 110 tpm onderbreekt de slaap gedurende 10 s elke 2 minuten tijdens de light-ON fase (8:00-20:00 uur). Verandering van de slaapstructuur in dit model werd eerder gekenmerkt door elektrofysiologische slaapopnamen en gerapporteerd door Li et al.24, wat wijst op een significante toename van de waaktijd en afname van de snelle oogbeweging (REM) slaap tijdens de light-ON fase, waarbij de totale slaap - en waaktijden (in 24 uur) na meer dan 4 weken modelleren niet werden beïnvloed24. Momenteel zijn totale slaap of gedeeltelijk slaaptekort de meest gebruikte slaapmanipulatiemodellen. Totale slaaptekort wordt meestal uitgevoerd door langdurig zacht te hanteren of het dier bloot te stellen aan nieuwe objecten, als alternatief door continu een staaf of een lopende loopband te draaien25,26,27,28,29. Om ethische redenen is het totale slaaptekort meestal korter dan 24 uur. Het meest toegepaste gedeeltelijke slaaptekortmodel is de waterplatformmethode, die voornamelijk remslaap30,31,32afneemt. Andere benaderingen met behulp van een loopband of een staaf die langs de bodem van de kooi veegt , kunnen slaapfragmentatie veroorzaken wanneer deze met vaste intervallen wordt ingesteld33,34,35,36,37,38. Het is opmerkelijk dat SF de slaap onderbreekt en met tussenpozen opwinding veroorzaakt in alle slaapfasen24. Een van de prominente voordelen van dit CSF-model dat orbitale rotor toepast, is dat het maandenlang continu kan worden uitgevoerd, automatisch bestuurd door machines, waardoor frequente verwerkingsarbeid dagelijks wordt vermeden, behalve voor regelmatige monitoring. Bovendien zou het apparaat het mogelijk maken om tegelijkertijd meerdere kooien muizen te modelleren onder geüniformeerde interventies. Tijdens hele modelleringssessies worden muizen gehuisvest in hun huiskooien met gebruikelijke beddengoed en nestmaterialen, terwijl sommige andere methoden blootstelling aan gediversifieerde omgevingen en onvermijdelijke stress vereisen.

Slaapfragmentatie werd eerder gekenmerkt door de slaapmanipulatiemethode, die frequente opwindingen nabootst tijdens de slaapfase en aanzienlijke slaaprebound tijdens de waakfase. In sommige literatuur werd CSF beschouwd als het diermodel voor OSA39,40. In deze studie is de reden van de gekozen frequentie van opwinding 30 keer per uur gebaseerd op de observatie van opwindingsindexcijfers bij patiënten met matige tot ernstige slaapapneu. Er werd waargenomen dat 4 weken slaapfragmentatie de hypercapnische opwindingslatentie en de tactiele opwindingsdrempel aanzienlijk verhoogde, die ten minste 2 weken na herstel kon duren24. Dit fenotype werd verklaard door het onthullen van c-fos activering vermindering van noradrenerge, orexinergic, histaminergic, en cholinerge wake-actieve neuronen in reactie op hypercapnie, evenals verminderde catecholaminergic en orexinergic projecties in de cingulate cortex24. Het is echter noodzakelijk op te merken dat het belangrijkste kenmerk in OSA hypoxie is veroorzaakt door luchtwegobstructie, wat resulteert in slaapverstoring41,42. Slaapstoornissen en herhaalde hypoxie interageren wederkerig met elkaar in OSA pathogenese. Daarom kan slaapfragmentatie alleen mogelijk niet alle belangrijke kenmerken van OSA bij muizen volledig aantonen.

Hierin presenteren we een gestandaardiseerd protocol om chronische slaapfragmentatie bij jonge wilde muizen te modelleren. Cognitieve tekorten en angst-achtige evenals depressie-achtige gedragingen na CSF behandeling werden geëvalueerd door Morris water doolhof, Nieuwe objectherkenning, Open veld test, en Gedwongen zwemmen test. Het is belangrijk op te merken dat dit model als een geheel moet worden genomen dat fenotypen van gereguleerd slaappatroon, cognitief tekort en angstachtig gedrag genereert. Het huidige model kan mogelijk worden toegepast, maar niet beperkt tot, tot de volgende doeleinden: 1) Verder onderzoek van de functionele of moleculaire pathogenesemechanismen veroorzaakt door chronische slaapstoornissen bij jonge muizen zonder genetische aanleg, 2) Het identificeren van de directe route die leidt tot neurodegeneratie geïnitieerd door slaapstoornissen, 3) Het verkennen van de therapieën voor het verbeteren van fenotypen veroorzaakt door chronische slaapstoornissen, 4) Het bestuderen van de intrinsieke beschermende / compenserende mechanismen bij wilde muizen bij chronische slaapstoornissen, 5) Toe te passen voor het bestuderen van slaap-waakregulatie en staatsovergangsmechanismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology.

1. Muizenscreening en voorbereiding op het experiment

  1. Selecteer wilde volwassen (8-10 weken oude) mannelijke muizen met een gewicht van 20-28 g voor het hele experiment.
    OPMERKING: Wilde type C57BL/6 muizen worden verkregen van het Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China.
  2. Wijs willekeurig alle muizen toe aan het CSF en de controlegroep. Huis 3-5 muizen in elke kooi om sociale isolatiestress te voorkomen. Het aantal muizen dat in de controlekooien is gehuisvest, komt overeen met het aantal muizen in de gekoppelde CSF-kooien.
    OPMERKING: Muizen in dezelfde groepskooien worden samengevoegd om vervolggedragsexperimenten uit te voeren.
  3. Lokaliseer de controlekooien in dezelfde ruimte met de CSF-kooien om de omgeving en arbeidseffecten identiek te houden.
  4. Nummer en markeer de muizen in elke groep op hun oren met behulp van een oormerk voor bewakingsdoeleinden.
  5. Houd de omgevingstemperatuur en luchtvochtigheid tussen 21–23 °C en 35%–60 % aan.
  6. Behoud de omgeving in een licht-donkercyclus van 12 uur (08:00-20:00 uur light-ON, 20:00-08:00 uur light-OFF), om bevooroordeeld effect op het normale slaapritme bij muizen te voorkomen.
  7. Minimaliseer het geluid en de interferentie terwijl de onderzoeker aanwezig is in de modelleringsruimte.
  8. Voorzie muizen van voldoende voedsel en water. Gebruik lange nozzles met kogelkraanpunten op waterflessen om waterlekkage op de platformbewegingen te voorkomen. Bevestig de waterfles bovenop de kooi met een veer om de ontwrichting van de fles tijdens het draaien van de rotor te voorkomen.

2. Voorbereiding en instelling van de orbitale rotor

  1. Bereid een elektrisch geregelde orbitale rotor voor met vergroot platform (67 cm x 110 cm), waarop hooguit 10 kooien kunnen worden geplaatst.
  2. Stel de orbitale rotor in tijdens de light-ON-fase (08:00-20:00 uur) die wordt bestuurd door een programmatimer, de tijd waarin muizen het grootste deel van hun dagelijkse slaap vertonen.
  3. Stel de orbitale rotor in met een snelheid van 110 tpm en een repetitieve cyclus van 10 s-on, 110 s-off bestuurd met een solid-state timer.
    OPMERKING: Het laadvermogen van het platform is 50 kg. De vaste amplitude van het trillen van de rotorhorizon is 2,5 cm.
  4. Bevestig de CSF-kooien bovenop het rotorplatform door dikke veren om ontwrichting van kooien bij platformrotaties te voorkomen.

3. Chronische slaapfragmentatie modellering en monitoring

  1. Plaats kooien van het CSF en de controlemuizen een week voorafgaand aan experimenten in de modelleringsruimte om muizen zich aan te laten passen aan de omgeving.
  2. Zorg er aan het begin van de modellering voor dat alle muizen gratis toegang hebben tot voedsel en water tijdens orbitale rotaties.
  3. Neem aan het begin van de modellering ten minste 1 uur in acht om ervoor te zorgen dat de orbitale rotor in de versnelling werkt.
  4. Controleer tijdens het modelleren of de orbitale rotor goed werkt en dat muizen om de 2 dagen in staat zijn om ervoor te zorgen dat muizen voldoende voedsel en water hebben. Verander beddengoed van kooien wekelijks.
  5. Weeg tijdens de modelleringsperiode de muizen wekelijks om 08:00 uur bij het verschonen van het beddengoed. Verwijder de muizen met aanzienlijk gewichtsverlies uit de modellering, en ook uit de experimentele groepen.
    OPMERKING: Significant gewichtsverlies wordt gedefinieerd als een gewicht van minder dan 20 g gedurende 2 weken.
  6. Verwijder tijdens de hele modelleringssessies de eventuele agressor uit de kooi en ook uit de experimentele groepen.
  7. Na het beëindigen van het modelleren, blijf de muizen in de oorspronkelijke kamer onderhouden en voeden.

4. Morris waterdoolhof (MWM) test

  1. Voorbereiding op de test
    1. Bereid het apparaat voor van een cirkelvormige tank gevuld met warm water (20-23 °C).
    2. Hang vier borden met verschillende vormen en kleuren op het gordijn rondom de tank in vier kwadrantenrichtingen als de verre visiereferentie. Laat het water ondoorzichtig lijken door toevoeging van poedermelk.
    3. Zoek een platform in het midden van het zuidwestelijke kwadrant.
  2. De trainingstest
    1. Onderwerp muizen aan vier opeenvolgende proeven tussen 08:00 en 00:00 uur elke dag gedurende een trainingsperiode van 5 dagen.
    2. Laat elke muis in het water met uitzicht op de zijwand in een van de vier kwadranten in vier proeven. Laat de muis in elke proef 60 s zwemmen om het platform te vinden. Als de muis niet binnen 60 s op het platform kan aankomen, leid hem dan naar het platform en blijf daar 15 s.
    3. Gebruik een videotrackingsysteem om automatisch de ontsnappingslatentie van muizen op te nemen om het verborgen platform te vinden.
  3. De sondetest
    1. Voer de sondetest uit op de zesde dag na 5 trainingsdagen.
    2. Verwijder het platform. Laat elke muis los van het noordoostelijke kwadrant en laat hem 60 s zwemmen
    3. Gebruik een videotrackingsysteem om automatisch de trackgegevens van muizen op te nemen.

5. Nieuwe objectherkenningstest (NOR)

  1. De vertrouwde fase
    1. Plaats muizen in een tank (lengte 30 cm, breedte 28 cm, hoogte 35 cm) in volgorde, die twee kopieën van objecten bevat (A1 en A2). Laat de muizen vrij verkennen (10 minuten per proef).
    2. Gebruik een videotrackingsysteem om automatisch de trackgegevens van muizen op te nemen.
  2. De testfase
    1. Voer de testtest uit na een vertraging van 1 uur van de bekende fase. Vervang een van de originele objecten door een nieuw object ("roman") in de tank, waardoor het andere object ongewijzigd blijft. Breng de muizen terug naar de tank en laat hem 5 minuten per proef verkennen.
    2. Gebruik een videotrackingsysteem om automatisch de tijd vast te leggen die elke muis besteedt aan het verkennen van elk object.
      OPMERKING: De verkenning van het object wordt bepaald door vibrissae te likken, snuiven, kauwen of bewegen terwijl de neus naar en minder dan 1 cm van het object wordt gericht. De Discriminatie Index (DI) wordt berekend met de vergelijking (TN − TF)/(TN + TF), waarbij TN = tijd besteed aan het verkennen van het "nieuwe" object en TF = tijd besteed aan het verkennen van het "bekende" object.

6. Open veldtest (OFT)

  1. Bereid het apparaat van een tank voor (30 cm x 28 cm x 35 cm).
  2. Plaats tijdens de test elke muis in het midden van de tank en laat hem 5 minuten vrij verkennen. Reinig de tank na elke proef met 75% ethanol om de resteffecten van de vorige muis te voorkomen.
  3. Gebruik een videotrackingsysteem om automatisch de trackgegevens van muizen op te nemen.

7. Geforceerde zwemtest (FST)

  1. Bereid het apparaat voor van een open cilindrisch vat, dat water (20-23 °C) bevat dat 15 cm diep is.
  2. Plaats tijdens de test elke muis in de cilinder en laat hem daar 6 minuten staan.
  3. Gebruik een videotracksysteem om automatisch de immobiliteitstijd tijdens de laatste 4 minuten van de test door elke muis op te nemen.
    OPMERKING: De muis is vastbesloten om onbeweeglijk te zijn wanneer hij stopt met worstelen en in het water drijft, waardoor hij alleen bewegingen maakt die nodig zijn om zijn hoofd boven water te houden.

8. Gegevensanalyse

  1. Analyseer gegevens met behulp van statistische analysesoftware (bijv. GraphPad Prism 6.0).
  2. Druk alle gegevens uit als het gemiddelde ± SEM.
  3. Vergelijk de escape latency in MWM test tussen twee groepen met behulp van tweerichtings ANOVA met herhaalde metingen gevolgd door Bonferroni posttests. Andere vergelijkingen tussen het CB en de controlegroepen worden bepaald door middel van ongepaarde t-tests.
  4. Houd rekening met verschillen die significant zijn als P < 0,05 in alle tests.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle representatieve resultaten en cijfers zijn overgenomen uit onze recente publicatie21. Het hergebruik van de cijfers werd toegestaan door het oorspronkelijke tijdschrift.

Het volledige experimentele ontwerp wordt geïllustreerd in de volgorde van de tijd, wat de timing van CSF-modellering, gedragstests van MWM, NOR, OFT en FST (figuur 1A) aangeeft. We kregen elke week gewichten van muizen van het CSF en de controlegroepen, om hun algemene omstandigheden tijdens de modelleringssessies te controleren. Er werd geen duidelijk verschil gevonden in de gewichtstoename van muizen tussen twee groepen tijdens de modellering (figuur 1B).

Om de effecten van CSF op ruimtelijk leren en geheugenprestaties te evalueren, hebben we MWM-gedragsonderzoek43,44uitgevoerd. De CSF-groep vertoonde slechtere ontsnappingscapaciteiten om het platform gedurende 5 trainingsdagen te vinden in vergelijking met de controlegroep (figuur 2A). In de sondetest brachten de CSF-muizen aanzienlijk minder tijdsverhouding door in het beoogde kwadrant en kruisten ze de vorige platformlocatie minder vaak (figuur 2B, C), zonder zwemsnelheidsverschil ( figuur2D). Deze bovenstaande resultaten gaven aan dat de mogelijkheden voor ruimtelijk leren en geheugen ophalen van muizen werden verminderd na CSF.

We hebben ook NOR-test uitgevoerd om objectherkenning en werkgeheugen op korte termijn na CSF45te beoordelen. In de bekende fase was er geen significant verschil in de totale exploratietijd tussen het CB en de controlegroep (figuur 3A). Dienovereenkomstig werden er geen verschillen gevonden in de exploratietijd tussen objecten A1 en A2, respectievelijk in twee groepen (figuur 3B). De bovenstaande resultaten garanderen dat er geen verschillen waren in de mogelijkheden van de muizen voor exploratie en voorkeuren voor locatie. In de testfase werd de discriminatie-index (DI) van de CSF-muizen aanzienlijk verlaagd ten opzichte van controles (figuur 3C), wat duidelijk wijst op tekorten in objectherkenning en werkgeheugen op korte termijn na CSF.

We hebben verder OFT en FST uitgevoerd, respectievelijk om angst- en depressie-achtig gedrag van muizen46,47te onderzoeken. Interessant is dat in de OFT werd vastgesteld dat de CSF-groep minder tijd in de centrale zone doorbracht dan de controlegroep (figuur 4A), wat illustreerde dat slaapfragmentatie tot op zekere hoogte angstachtig gedrag kon veroorzaken. Bovendien vertoonden CSF-muizen een langere totale afstand die in de tank werd verplaatst(figuur 4B),wat wijst op verhoogde spontane activiteit na het modelleren. Niettemin kon deze CSF-modellering geen depressief gedrag veroorzaken, geverifieerd door een niet-significant verschil in de immobiliteitstijd tussen twee groepen die aan de FST werden onderworpen (figuur 4C).

Figure 1
Figuur 1: Het stroomdiagram van de experimentele ontwerpprocedure. (A) De experimentele ontwerpprocedure die het tijdstip van CSF-modellering en gedragstests aangeeft (d.w.z. MWM, NOR, OFT en FST). (B) Lichaamsgewichtcurves van het CB en de controlemuizen gedurende de eerste maand na de vaststelling van het CB-model. Deze figuur is gewijzigd van Xie et al.21Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: CSF verminderde ruimtelijke leer- en geheugencapaciteiten geëvalueerd door MWM-test. (A) De CSF-muizen voerden tijdens de 5-daagse trainingstest een langere escape latentie uit in vergelijking met de controlemuizen. **p < 0,01. (B) In de sondetest vertoonden de CSF-muizen minder tijd in het platformkwadrant in tegenstelling tot de controlemuizen. Het bovenste deelvenster toont representatieve tracering van twee groepen. p < 0,0001. (C) In de sondetest heeft de CSF-groep minder keren de perronlocatie overgestoken in vergelijking met de controlegroep. *p < 0,05. (D) De zwemsnelheid van twee groepen in de sondetest. n.s. geeft aan dat veranderingen tussen verschillende groepen niet significant waren. De gegevens werden allemaal gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. n = 10 per groep. Deze figuur is gewijzigd van Xie et al.21Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: CSF-verminderde objectherkenning en werkgeheugen voor korte tijd geëvalueerd door NOR-test. (A) De totale exploratietijd tussen het CB en de controlemuizen in de bekende fase, n.s. duidt op geen significante veranderingen tussen verschillende groepen. (B) De verkenningstijd voor objecten A1 en A2 tussen twee groepen in de vertrouwde fase. n.s. wijst op geen significante veranderingen tussen verschillende groepen. (C) In de testfase is de discriminatie-index (DI) van de CB-groep aanzienlijk gedaald ten opzichte van die van de controlegroep. *p < 0,05. De gegevens werden allemaal gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. n = 10 per groep. Deze figuur is gewijzigd van Xie et al.21Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: CSF verergerde angstachtig maar niet depressie-achtig gedrag geëvalueerd door OFT en FST. (A) De CSF-muizen brachten minder tijd door in de centrale zone gedurende de waargenomen 5 minuten in vergelijking met de controlemuizen in OFT. *p < 0,05. (B) De CSF-groep gaf een langere totale afstand weer die in de tank werd verplaatst versus de controlegroep in OFT. *p < 0,05. (C) De immobiliteitstijd tussen het CB en de controlegroepen in FST. n.s. wijst op geen significante veranderingen tussen verschillende groepen. De gegevens werden allemaal gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. n = 10 per groep. Deze figuur is gewijzigd van Xie et al.21Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritieke stappen in het huidige protocol zijn onder meer het instellen van slaapfragmentatiemachines met de geoptimaliseerde parameters volgens het onderzoeksdoel en het onderhouden van de muizen in een comfortabele en rustige leefomgeving gedurende de hele modelleringssessies. Het is ook cruciaal om de juiste timing te bepalen om slaapfragmentatie te onderbreken of te stoppen en gedragstests voor die muizen te regelen. Net als andere slaapmanipulatiemodellen is het belangrijk om het protocol uit te voeren in een speciale ruimte met gecontroleerde lichtcycli en de leegte van alle mogelijke onnodige interferenties. Er moeten inspanningen worden geleverd om geluidsoverlast te voorkomen en de door de onderzoekers uitgevoerde bedrijfstijd voor het controleren, bijvullen van voedsel en watervoorziening, het verschonen van het beddengoed, enz. In zeldzame gevallen zijn er agressors die de nestgenoten aanvallen, vooral bij het initiëren van ongemakkelijke slaapverstoringssessies. De agressor wanneer aanwezig moet uit de huiskooien en de experimentele groepen worden verwijderd. De meeste proefdieren, op een paar na, zouden zich aanpassen aan de behandeling en naar behoefte toegang krijgen tot het water en voedsel. Muizen met intrinsieke problemen, zoals misvormde tanden, ondergewicht en huidwonden kunnen gewichtsverlies of zwakte veroorzaken. Ze moeten ook worden vermeden voor het modelleren. Omdat dit protocol mogelijk chronische stress en metabole dysregulatie kan veroorzaken, is het essentieel om muizen te gebruiken die zijn gescreend met uniforme criteria, zoals lichaamsgewicht, voor modellering en experimenten.

In het beschreven protocol zou de orbitale rotor automatisch worden ingeschakeld tijdens 8:00 AM-8:00 PM (light-ON) dagelijks, wat het moment is waarop muizen het grootste deel van hun dagelijks leven tentoonstellen. De rotor werd ingesteld op een repetitieve cyclus van 10 s-on, 110 s-off tijdens light-ON fase om frequente opwindingen op te wekken. Verschillende modelleringsduur zou aanleiding geven tot verschillende fenotypen. Acute slaapfragmentatie kan leiden tot een absolute vermindering van de slaapduur, verhoogde activiteiten van het sympathische zenuwstelsel, zoals verhoogde cortisonespiegels en verminderde insulinegevoeligheid23,24. Chronische slaapfragmentatie vertoonde echter niet-beïnvloede cortisoneniveaus en een evenwichtige totale slaaptijd24. Wijzigingen op basis van het huidige protocol, zoals lichtcycli, overeenkomende trilinstellingen (snelheid, amplitude, repetitieve cyclus, enz.) en modelleringsduur, kunnen mogelijk de fenotypen veranderen. Het is vereist om slaapopname en slaapstructuuranalyse uit te voeren onder verschillende modelleringsinstellingen om de slaapfenotypen te identificeren. Het kan ook leiden tot onderscheidende gedrags- en pathologische veranderingen. Terwijl we het cognitieve tekort na langdurige in plaats van een nacht slaapfragmentatie onderzochten en de neiging hadden om de bevooroordeelde effecten van intermitterende slaapfragmentatie op muizengedrag in MWM en NOR te vermijden, voerden we deze twee gedragstests uit na het beëindigen van het CSF-protocol op dag 60. Het effect van herstelslaap bij muizen kan echter onvermijdelijk de resultaten voor MWM en NOR hebben verward.

Hoewel dit model recht heeft op slaapfragmentatiemodel, bestaat het eigenlijk uit gefragmenteerde slaappatronen tijdens de light-ON-fase, dysregulatie van het circadiane ritme en compenserende slaaprebound tijdens de light-OFF-fase. Dit protocol kon niet alleen veranderingen in het slaappatroon veroorzaken, maar ook aanzienlijke neuro-inflammatie, metabole onbalans, verstoring van het immuunsysteem, enz.21,23,24. Al deze pathologische processen kunnen met elkaar interageren en fenotypen bemiddelen als een orkest. Dit model moet als geheel worden genomen om de muizen te genereren met fenotypen van een gedereguleerd slaappatroon, cognitieve tekorten en angstachtig gedrag bij jonge wilde muizen. Zoals vermeld in de vorige sectie, weerspiegelt dit model OSA niet precies vanwege het ontbreken van herhaalde hypoxie. Een andere beperking is dat het moeilijk is om nauwkeurige pathologische veranderingen en slaapfenotypen in dezelfde muizen te genereren. De wijd toegepaste EEG/EMG elektrodeimplantatie voor slaapopname onvermijdelijk veroorzaakte ernstige gliosis in cortex48. In de afgelopen jaren werden videobewakings - en beeldanalysetechnieken op basis van kunstmatige intelligentie toegepast in slaapstudies, die nauwkeurige slaapinformatie zouden verzamelen zonder invasieve elektrodeimplantatie49,50,51.

De betekenissen van deze CSF-methode in vergelijking met bestaande methoden zijn onder meer: 1) Anders dan slaaptekortprotocollen die meestal urenlang of dagen worden uitgevoerd, bootst het huidige protocol slaapstoornissen op lange termijn beter na bij gezonde mensen. De compenserende slaap rebound in slaap gefragmenteerde muizen weerspiegelt perfect de slaperigheid overdag envertragende werkprestaties bij mensen met een slechte slaapkwaliteit tijdens de nacht52,53. 2) Het is tot nu toe het enige chronische slaapfragmentatiemodel in jonge wilde muizen met bevestigd cognitief tekort en angstachtige maar niet depressie-achtige gedragsfenotypen, evenals duidelijke moleculaire pathologische veranderingen in hersenweefsel. 3) Deze behandeling veroorzaakt mildere irritaties bij muizen, zodat de modellering maanden kan duren, zelfs met de mogelijkheid om in langere tijd te worden uitgevoerd. 4) Met de juiste instellingen kan dit model stabiele fenotypen van slaapstoornissen, cognitieve tekorten en angstachtig gedrag genereren, die kunnen worden gebruikt als ziektemodellen of interventies voor verschillende studieontwerpen. 5) Sommige slaaptekortmodellen vereisen volledige sessieinterferentie door onderzoekers om zachte hantering of nieuwe objecten toe te passen. Behalve voor regelmatige monitoring minimaliseert deze methode het hanteren van arbeid, wat ook de kunstmatige bias elimineert.

Dit CSF-protocol biedt de mogelijkheid om een aantal belangrijke wetenschappelijke vragen te beantwoorden, zoals, is chronische slaapstoornis de oorzaak of het gevolg van neurodegeneratieve ziekten? Is chronische slaapstoornis geïnduceerde pathogenese op jonge leeftijd reversibel? Verschillen de compenserende mechanismen bij chronische slaapstoornissen tussen jongeren en ouderen, gezonde mensen en patiënten? Dit protocol kan ook worden toegepast om therapieën te verkennen door de ernst en verbetering van de gedrags- en moleculaire fenotypen te beoordelen. Het zou ook worden toegepast om de muizen te modelleren met chronische craniectomie, optische vezelimplantatiepreparaten voor functionele opnames. Bovendien kan het mogelijk worden gebruikt als interventionele strategie om fenotypen op te wekken of te verergeren bovenop reeds bestaande aandoeningen. Ten slotte kan het worden gebruikt voor het bestuderen van overgangsmechanismen voor slaap-waaktoestand. Interessant is dat het huidige CSF-model angstachtig in plaats van depressie-achtig gedrag bij muizen zou kunnen induceren, wat in overeenstemming is met de klinische observatie dat de slaapstoornis bij patiënten waarschijnlijk veel meer geassocieerd zou worden met angst dan met depressie54,55. Het biedt een praktisch model om emotionele stoornissen bij knaagdieren te bestuderen.

Samenvattend presenteren we het protocol voor het modelleren van chronische slaapfragmentatie door gebruik te maken van een trillende orbitale rotor, die stabiele fenotypen kan produceren bij jonge wilde muizen en de modelleringsarbeid met een hoog rendement kan minimaliseren. Het kan mogelijk worden gegenereerd voor verschillende onderzoeksdoeleinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (61327902-6 aan W. Wang en 81801318 aan F.F. Ding). We erkennen Dr. Sigrid Veasy voor het opzetten van het SF experimentele systeem en het vriendelijk verstrekken van technische details. We erkennen Dr. Maiken Nedergaard voor leerzame opmerkingen voor gerelateerde experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Any-maze behavior tracking system Stoelting,Inc,USA - A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice.
C57BL/6J mice Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China. - healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals
Graphpad Prism 6.0 Software Graphpad Software,Inc.USA - Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs.
Morris water maze system Shanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,China XR-XM101 The system was used to perform Morris water maze test
Orbial rotor Shanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,China SPH-331 The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model
Solid state timer OMRON Corporation, Kyoto, Japan H3CR-F8-300 The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running
Wooden Lusterless Tank - - length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peter-Derex, L., Yammine, P., Bastuji, H., Croisile, B. Sleep and Alzheimer's disease. Sleep Medicine Reviews. 19, 29-38 (2015).
  2. Mathias, J. L., Cant, M. L., Burke, A. L. J. Sleep disturbances and sleep disorders in adults living with chronic pain: a meta-analysis. Sleep Medicine. 52, 198-210 (2018).
  3. Murphy, M. J., Peterson, M. J. Sleep Disturbances in Depression. Sleep Medicine Clinics. 10 (1), 17-23 (2015).
  4. Walter, L. M., et al. Sleep disturbance in pre-school children with obstructive sleep apnoea syndrome. Sleep Medicine. 12 (9), 880-886 (2011).
  5. Helfand, B. T., et al. The relationship between lower urinary tract symptom severity and sleep disturbance in the CAMUS trial. Journal of Urology. 185 (6), 2223-2228 (2011).
  6. Kimoff, R. J. Sleep fragmentation in obstructive sleep apnea. Sleep. 19 (9), Suppl 61-66 (1996).
  7. Dhondt, K., et al. Sleep fragmentation and periodic limb movements in children with monosymptomatic nocturnal enuresis and polyuria. Pediatric Nephrology. 30 (7), Berlin, Germany. 1157-1162 (2015).
  8. Young, T., Peppard, P. E., Gottlieb, D. J. Epidemiology of obstructive sleep apnea: a population health perspective. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (9), 1217-1239 (2002).
  9. Peppard, P. E., et al. Increased prevalence of sleep-disordered breathing in adults. American Journal of Epidemiology. 177 (9), 1006-1014 (2013).
  10. Marcus, C. L., et al. Diagnosis and management of childhood obstructive sleep apnea syndrome. Pediatrics. 130 (3), 714-755 (2012).
  11. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), New York, N.Y. 373-377 (2013).
  12. Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. 65 (2), 106-119 (2019).
  13. Stickgold, R., Walker, M. P. Memory consolidation and reconsolidation: what is the role of sleep. Trends in Neurosciences. 28 (8), 408-415 (2005).
  14. Stickgold, R. Sleep-dependent memory consolidation. Nature. 437 (7063), 1272-1278 (2005).
  15. Aalling, N. N., Nedergaard, M., DiNuzzo, M. Cerebral Metabolic Changes During Sleep. Current Neurology and Neuroscience Reports. 18 (9), 57 (2018).
  16. Rempe, M. J., Wisor, J. P. Cerebral lactate dynamics across sleep/wake cycles. Frontiers in Computational Neuroscience. 8, 174 (2014).
  17. Kang, J. E., et al. Amyloid-beta dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (5955), New York, N.Y. 1005-1007 (2009).
  18. Minakawa, E. N., et al. Chronic sleep fragmentation exacerbates amyloid beta deposition in Alzheimer's disease model mice. Neuroscience Letters. 653, 362-369 (2017).
  19. Qiu, H., et al. Chronic Sleep Deprivation Exacerbates Learning-Memory Disability and Alzheimer's Disease-Like Pathologies in AβPP(swe)/PS1(ΔE9) Mice. Journal of Alzheimer's Disease : JAD. 50 (3), 669-685 (2016).
  20. Holth, J. K., et al. The sleep-wake cycle regulates brain interstitial fluid tau in mice and CSF tau in humans. Science. 363 (6429), New York, N.Y. 880-884 (2019).
  21. Xie, Y., et al. Chronic sleep fragmentation shares similar pathogenesis with neurodegenerative diseases: Endosome-autophagosome-lysosome pathway dysfunction and microglia-mediated neuroinflammation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 26 (2), 215-227 (2020).
  22. Ba, L., et al. Distinct Rab7-related Endosomal-Autophagic-Lysosomal Dysregulation Observed in Cortex and Hippocampus in APPswe/PSEN1dE9 Mouse Model of Alzheimer's Disease. Chinese Medical Journal (England). 130 (24), 2941-2950 (2017).
  23. Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
  24. Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
  25. Misrani, A., et al. Differential effects of citalopram on sleep-deprivation-induced depressive-like behavior and memory impairments in mice. Progress Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 88, 102-111 (2019).
  26. Xu, A., et al. Roles of hypothalamic subgroup histamine and orexin neurons on behavioral responses to sleep deprivation induced by the treadmill method in adolescent rats. Journal of Pharmacological Sciences. 114 (4), 444-453 (2010).
  27. Saito, L. P., et al. Acute total sleep deprivation potentiates amphetamine-induced locomotor-stimulant effects and behavioral sensitization in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 117, 7-16 (2014).
  28. Spano, G. M., et al. Sleep Deprivation by Exposure to Novel Objects Increases Synapse Density and Axon-Spine Interface in the Hippocampal CA1 Region of Adolescent Mice. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (34), 6613-6625 (2019).
  29. Morrow, J. D., Opp, M. R. Sleep-wake behavior and responses of interleukin-6-deficient mice to sleep deprivation. Brain, Behavior, and Immunity. 19 (1), 28-39 (2005).
  30. Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
  31. Aleisa, A. M., Alzoubi, K. H., Alkadhi, K. A. Post-learning REM sleep deprivation impairs long-term memory: reversal by acute nicotine treatment. Neuroscience Letters. 499 (1), 28-31 (2011).
  32. Zagaar, M., Dao, A., Alhaider, I., Alkadhi, K. Regular treadmill exercise prevents sleep deprivation-induced disruption of synaptic plasticity and associated signaling cascade in the dentate gyrus. Molecular and Cellular Neurosciences. 56, 375-383 (2013).
  33. McKenna, J. T., et al. Sleep fragmentation elevates behavioral, electrographic and neurochemical measures of sleepiness. Neuroscience. 146 (4), 1462-1473 (2007).
  34. Tartar, J. L., et al. Hippocampal synaptic plasticity and spatial learning are impaired in a rat model of sleep fragmentation. The European Journal of Neuroscience. 23 (10), 2739-2748 (2006).
  35. Guzman-Marin, R., Bashir, T., Suntsova, N., Szymusiak, R., McGinty, D. Hippocampal neurogenesis is reduced by sleep fragmentation in the adult rat. Neuroscience. 148 (1), 325-333 (2007).
  36. Nair, D., et al. Sleep fragmentation induces cognitive deficits via nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-dependent pathways in mouse. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (11), 1305-1312 (2011).
  37. McCoy, J. G., et al. Experimental sleep fragmentation impairs attentional set-shifting in rats. Sleep. 30 (1), 52-60 (2007).
  38. Dumaine, J. E., Ashley, N. T. Acute sleep fragmentation induces tissue-specific changes in cytokine gene expression and increases serum corticosterone concentration. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (12), 1062-1069 (2015).
  39. Carreras, A., et al. Chronic sleep fragmentation induces endothelial dysfunction and structural vascular changes in mice. Sleep. 37 (11), 1817-1824 (2014).
  40. Khalyfa, A., et al. Circulating exosomes potentiate tumor malignant properties in a mouse model of chronic sleep fragmentation. Oncotarget. 7 (34), 54676-54690 (2016).
  41. Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
  42. Tripathi, A., et al. Intermittent Hypoxia and Hypercapnia, a Hallmark of Obstructive Sleep Apnea, Alters the Gut Microbiome and Metabolome. mSystems. 3 (3), (2018).
  43. D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research. Brain Research Reviews. 36 (1), 60-90 (2001).
  44. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
  45. Vogel-Ciernia, A., Wood, M. A. Examining object location and object recognition memory in mice. Current Protocols in Neuroscience. 69, 1-17 (2014).
  46. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The Open Field Test for Measuring Locomotor Activity and Anxiety-Like Behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
  47. Porsolt, R. D., Bertin, A., Blavet, N., Deniel, M., Jalfre, M. Immobility induced by forced swimming in rats: effects of agents which modify central catecholamine and serotonin activity. European Journal of Pharmacology. 57 (2-3), 201-210 (1979).
  48. Hauglund, N. L., Kusk, P., Kornum, B. R., Nedergaard, M. Meningeal Lymphangiogenesis and Enhanced Glymphatic Activity in Mice with Chronically Implanted EEG Electrodes. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
  49. Nguyen-Michel, V. H., et al. Rapid eye movement sleep behavior disorder or epileptic seizure during sleep? A video analysis of motor events. Seizure. 58, 1-5 (2018).
  50. Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31 (11), 1587-1598 (2008).
  51. Abad, J., et al. Automatic Video Analysis for Obstructive Sleep Apnea Diagnosis. Sleep. 39 (8), 1507-1515 (2016).
  52. Sandlund, C., Hetta, J., Nilsson, G. H., Ekstedt, M., Westman, J. Impact of group treatment for insomnia on daytime symptomatology: Analyses from a randomized controlled trial in primary care. International Journal of Nursing Studies. 85, 126-135 (2018).
  53. Shekleton, J. A., Rogers, N. L., Rajaratnam, S. M. Searching for the daytime impairments of primary insomnia. Sleep Medicine Reviews. 14 (1), 47-60 (2010).
  54. Dixon, L. J., Lee, A. A., Gratz, K. L., Tull, M. T. Anxiety sensitivity and sleep disturbance: Investigating associations among patients with co-occurring anxiety and substance use disorders. Journal of Anxiety Disorders. 53, 9-15 (2018).
  55. Press, Y., Punchik, B., Freud, T. The association between subjectively impaired sleep and symptoms of depression and anxiety in a frail elderly population. Aging Clinical and Experimental Research. 30 (7), 755-765 (2018).

Tags

Gedrag Probleem 163 chronische slaapfragmentatie orbitale rotor cognitief tekort angstachtig gedrag obstructieve slaapapneu neurodegeneratieve ziekten
Een chronisch slaapfragmentatiemodel met trillende orbitale rotor om cognitieve tekorten en angstachtig gedrag op te wekken bij jonge wilde muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, Y., Deng, S. Y., Chen, S. M.,More

Xie, Y., Deng, S. Y., Chen, S. M., Chen, X. J., Lai, W. W., Huang, L. F., Ba, L., Wang, W., Ding, F. F. A Chronic Sleep Fragmentation Model using Vibrating Orbital Rotor to Induce Cognitive Deficit and Anxiety-Like Behavior in Young Wild-Type Mice. J. Vis. Exp. (163), e61531, doi:10.3791/61531 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter