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Medicine

ラットにおける骨髄間葉系幹細胞の単離と培養

doi: 10.3791/61532 Published: August 25, 2020
* These authors contributed equally

Summary

本稿では、ラット下顎骨から骨髄間葉幹細胞を単離、栽培、選別、同定するための骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせた方法を紹介する。

Abstract

ここでは、実験要件に対して多数の高品質細胞を迅速に得るために、インビトロで下顎骨髄間葉系幹細胞(mBMSC)を単離・培養するための効率的な方法を紹介します。mBMSCは、優れた自己再生能力と多系統分化能力により、将来的に頭蓋顔面疾患や頭蓋顎顔面再生の場合の組織工学細胞としての治療用途に広く使用される可能性があります。したがって、mBMSCs を大量に取得することが重要です。

本研究では、骨髄を下顎骨から洗い流し、原発mBMSCを骨髄付着栽培全体で単離した。さらに、CD29+CD90+CD45−mBMSCを蛍光細胞選別により精製した。第2世代の精製mBMSCは、骨芽細胞、有形細胞、軟骨細胞への分化においてさらなる研究と潜在能力を示す目的で使用された。このin vitroモデルを利用して、多くの増殖性mBMSCsを得ることができ、生物学的特性の研究、その後の微小環境への反応、およびmBMSCsの他の用途を促進することができる。

Introduction

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骨髄間葉系幹細胞(BMC)は、強い増殖能力および多系統分化電位1、2、3、4を示す骨髄由来の非造血幹細胞である。確かに、BMCは発見されて以来、骨組織工学と再生の理想的な候補と考えられてきました。何年もの間、腸骨の紋章や脛骨や大腿骨などの長い骨は、頭蓋顔面再生のためのBMSCの最も一般的な供給源であった。しかし、下顎骨BMC(mBMSC)などの顔面BMSCsは、異なる胚起源および発達パターンなどの長い骨BMSCとのいくつかの違いを示す。下顎骨は神経摘出胚層の神経堤細胞から生じ、内在性骨軟化を受け、軸および付加的骨格は中胚体からであり、内因性骨化を受ける。さらに、臨床観察および実験動物研究は、一貫して、オロフェイシャルと腸骨紋BMC5、6、7、8の間に機能的な違いがあることを示している。報告によると、下顎骨、上顎骨、歯槽骨などの頭蓋顔面骨に由来するBmSCは、軸骨および付属骨からのものよりも優れた増殖、寿命、および分化能力を示したmBMSCは、したがって、ケルビズム、顎腫瘍、顎骨の骨粗鬆症、および歯周組織欠損10、11、12などの頭蓋顔面疾患の将来の治療用途に好まれるリソースであると考えられる。前臨床実験における治療の可能性を理解するためには、インビトロでmBMSCを迅速に単離・培養する方法を確立することが不可欠である。

本研究では、骨髄全体の付着とフローサイトメトリー選別により精製mBMSCsを得ることを目的とした。ラット下顎骨の解剖学的形態は、マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)および組織学的切片を通して明確に観察され、下顎骨の骨膜骨が切歯髄腔と歯槽骨の間であることを示した。骨蓋骨から骨髄を洗い流して下顎骨細胞を得たが、この方法で培養した細胞は純粋なmBMSCではなく、骨、脂肪および内皮細胞13、14の細胞のような不確実なポテンシーおよび多様な系統を有する複数のタイプの細胞から成る可能性が高い。細胞浄化の次のステップは特に重要であった。フローサイトメトリーは、細胞表面タンパク質の組み合わせを認識して細胞をフィルターし、間葉系幹細胞の濃縮に広く採用されています。細胞の均質性はフローサイトメトリーの主な利点であるが、プロセスは細胞の生存率を決定せず、細胞収量が制限される可能性がある。本研究では、骨髄全体の付着から得られたP0 mBMSCをフローサイトメトリーで選別し、高純度で増殖能力の高いmBMSCsを得た。

本研究では、骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせて、ラット下顎骨BMSCの分離、培養、分化のための再現性と信頼性の高いプロトコルを紹介する。関連分野の研究者が利用できる、信頼できる便利な方法です。

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Protocol

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本論文の動物実験手順はすべて、上海交通医科大学上海交通医院動物ケア委員会によって承認された。

1. 準備

  1. 実験には5週齢のオスのスプレイグ・ドーリーラットを2匹使用してください。
  2. 針ホルダー、ピンセット、ハサミを含むすべての器具を高温で殺菌するか、75%エタノールに10分間浸漬します。
    注:エタノール浸漬は、細胞の損傷を避けるために長すぎないようにしてください。
  3. 培養培地を事前に準備し、その構成を 表1に示す。以下に説明する各培地を補足する。
    1. α-MEM培地の調製(10%FBS):10%の胎児ウシ血清および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを用いた最小必須培地アルファ(α-MEM)を補う。
    2. 骨形成分化培地の調製:骨形成分化基底培地を10%胎児ウシ血清、1%グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.20%アスコルビン酸、1%βグリセロリン酸および0.01%デキサメタゾンを添加する。
    3. 骨形成誘導培地の調製:70%α-MEM培地(10%FBS)と30%の骨形成分化培地を混合する。
    4. アディポ原性分化培地Aの調製:10%の胎児ウシ血清、1%グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.20%インスリン、0.10%IBMX、0.10%ロシグリタゾンおよび0.01%デタゾンを有する付加的な分化基底液培地。
    5. アディポ原性分化培地Bの調製:10%の牛血清、1%のウシ胎児血清、1%のペニシリン連鎖球菌および0.20%インスリンを有する付加的分化基底培地を補足する。
    6. 軟骨発生分化培地の調製:0.01%デキサメタゾン、0.30%アスコルビン酸、1%ITS、0.10%ピルビン酸ナトリウム、0.10%プロリンおよび1%TGF-β3を有するコンドロゲン分化基底培地を補足する。
      注: 骨形成分化培地は、構成後1ヶ月以内に使い切る必要があります。構成された軟骨発生分化培地の有効期間は12時間である。

2. ラットmMCの分離と栽培

注: 細胞の生存率を維持するために、すべての実験操作を氷上で可能な限り実行する必要があります。

  1. ラット下顎の収穫
    1. CO2 窒息によって2匹の5週齢の雄のスプレイグ・ドーリーラットを安楽死させる。実験を進める前に、動物の呼吸が止まっていることを確認してください。
    2. これらのラットを3分間75%エタノールを含むビーカーでリンスする。
    3. ネズミを清潔な煙のフードの中に入れて下顎を収穫します。
      注:使用前に30分間紫外線照射でヒュームフードを殺菌してください。
    4. ラットをサピーヌの位置に置きます。両側性アングルスオリスから下切歯を有する唯一の可動骨である下顎骨の後部領域に皮膚およびブハネーター筋肉を切開する。
      注:明確な操作フィールドを得るためにアングルスの両側に2cmの切開を行うことをお勧めします。
    5. 両親指で上顎および下顎切歯を反対方向に押し出してラットの口を開き、下顎に付着した下顎歯を露出させる。
    6. 頬筋と角筋と下顎下の下の境界に取り付けられた腱を完全に切断します。
      注:筋肉の緊張の欠如のために、このステップ中に下顎の移動性の増加が観察されます。
    7. 下顎後歯を押し、両側の顆がはっきりと露出するまで前後に回転します。
      注:このステップは、人工的にラットの口を開いて、コンディレを外す可能性のある最大限の範囲で行います。下顎骨は両側の顆を通して頭蓋骨に接続されているので、顆の暴露は頭蓋骨と下顎骨の間の切断につながる。
    8. 下顎骨の体を頭蓋骨から分離します。
    9. 濡れたガーゼを使用して、骨表面の付着性の軟組織を洗浄します。
    10. 生存率を維持するために、氷の上に予冷された最低必須培地α(α-MEM)またはリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)で満たされた10cmの無菌ガラス皿に骨を入れます。
  2. mBMSCsの分離と栽培
    1. 下顎体から最初の臼歯の間縁に沿って前骨を切り落とす。骨髄腔を露出させるために、3番目の大臼歯の遠位縁に沿って、コラコイドと顆を含む下顎のラムスを取り除きます。
    2. 10 cmの無菌ガラス皿に10 mLのα-MEM(10%FBS)を充填します。
    3. 1 mL シリンジを使用して、α-MEM培地を吸引します。注射針を骨髄腔に挿入すると、骨髄を皿に繰り返し洗い流す。骨が白くなるまで、骨の前後側から骨腔を少なくとも3回洗い流す。
      注:これは、ラット下顎骨の骨髄腔が長い骨ほど明白ではなく、針を挿入するための適切な点を経験的に決定する必要があるため、最も重要なステップです。上記の実験サンプルはすべて、細胞の生存率を維持するために氷の上に保存する必要がありますので、操作時間は2時間以下でなければなりません。
    4. 洗い流された細胞を含む培地を15mL遠心管に移し、4°Cで 800xg の遠心分離機を5分間移動させます。上清を捨てます。
    5. セルを3 mLのα-MEMで再中断します(FBSが10%)。新しい10cm培養皿に細胞をプレートし、5%CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートします。
    6. 培養3日目にこれらの細胞の形態変化と成長を確認してください。非接着性細胞および組織断片を含む培地を除去する。10 mLの新鮮なα-MEM(FBS 10%)をそっと加えます。
    7. 培養7日後、P0 mBMSCは70~80%の合流に達した。
  3. フローセルの並べ替え
    注: P0 mBMSC は、フローセルのソートによって、典型的に同定され、主に精製されました。
    1. 吸引し、培養液を捨て、その後PBSで皿を洗います。PBS を破棄します。
    2. 0.25%のトリプシンを1 mL加え、0.02%EDTAを皿に入れます。37°Cで5分間細胞を消化し、2mLのα-MEM(10%FBS)を加えて反応を止めます。
    3. 細胞懸濁液を15mL遠心チューブに移し、800 x g で遠心分離機を5分間移動します。
    4. 遠心分離後、PBSの120 μL(10%FBS)で細胞を再懸濁します。
    5. これらの細胞懸濁液を、CD16/CD32に対して1μLの抗体を4°Cで15分間ブロックします。
    6. 細胞懸濁液100μLを新しいマイクロ遠心分離管に移し、CD45に対するフィコエリスリン(PE)共役抗体で細胞を染色し、フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)-CD90およびAllophycocyanin(APC)抗体に対して13°Cで13°13°の間にCD29抗体を結合させた抗体この実験で使用した抗体の濃度を表2に示す。他の20μLの細胞懸濁液を無染色陰性対照として使用してください。
    7. その後、チューブを800 x g で5分間遠心し、懸濁液を捨て、細胞をPBSの0.5 mL(10%FBS)で再懸濁します。
    8. 分析前に10分間0.01mg/mL DAPIの10 μLを加えます。
    9. 遠心分離管に配置された40nmフィルターを使用して細胞をフィルター処理します。
    10. 蛍光活性化細胞ソーター上の細胞を分析する。パネルを次のように設定します。まず、DAPI-細胞、次にCD29+CD90+CD45-を標的mBMSCsとして選択した細胞にゲートして、細胞総数から死んだ細胞を除去する。
    11. ソートされたCD29+CD90+CD45-細胞を3mLのα-MEM(10%FBS)をあらかじめ用意した15 mL遠心管に集める。
    12. チューブを800 x g で5分間遠心します。収集バッファーを取り外し、1 mL の新鮮な α-MEM (10% FBS) を追加してセルを再中断します。その後、6 cmの文化皿に入れてお皿に入れます。

3. コロニー形成能力

注: このステップは mBMSCs の区分能力をチェックするために実行されました。15

  1. この実験では、2番目のパッセージmBMSCs(P2)を選択します。細胞合流が80%から90%に達したら、細胞を6ウェルプレートの連続勾配で再播種して、そのクローン増殖能力を評価する。
    注:1ウェルあたり1 x 102 から1 x 103 細胞の勾配を設定することをお勧めしますが、人間または動物起源の異なる細胞株の最終的な希釈は経験的に決定されました。
  2. α-MEM(10%FBS)の細胞を、かなりの数のコロニー形成ユニットが光顕微鏡下で見られるまで約2週間培養した。3日ごとに培地をリフレッシュしてください。
  3. 培地を吸引して廃棄し、一度に5分間PBSでウェルを2回洗浄する。次に、各ウェルに4%パラホルムアルデヒド溶液を加え、少なくとも10分間固定します。
  4. パラホルムアルデヒドを取り出し、PBSでウェルを2回リンスします。
  5. 結晶紫色染色液で細胞を染色し、37°Cで約10分間インキュベートします。
    注:染色時間は、所望のシェードが達成されるまで適切に調整されました。
  6. 染色液を取り出し、蒸留水でサンプルを洗浄して反応を止めます。
  7. 実体顕微鏡下での画像と、少なくとも50個の細胞から成る散乱細胞コロニーを数える。

4. mMC の多系統分化

注: P2 mBMSCs は、特に説明がない限り、その後の実験に使用されました。

  1. mBMSCsの骨形成誘導
    1. 上記の手順で mBMSCs をダイジェストにします。1 2 mL α-MEM(10%FBS)を補った12ウェルプレートの2.5x 10 5 /cm2 の密度で細胞をシードします。
    2. 細胞合流が60〜70%に達すると、培地を30%骨形成誘導培地に変更する。α-MEM(10%FBS)を陰性対照として細胞を培養し、2日ごとに培地を変化させる。
      注:骨形成中に多数のカルシウム結節が出現した後、骨芽細胞が浮遊するのを防ぐために、2日ごとに中量媒体交換に媒体交換パターンを変更することをお勧めします。
    3. 7日間培養した後、アルカリホスファターゼ染色16,17によるこれらの細胞の石灰化を評価する。
    4. 培養培地を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで細胞を10分間固定します。1ウェルあたり1 mLのPBSを3分間2回使用して細胞をリンスします。
    5. 次にアルカリホスファターゼ染色液で細胞を染色し、37°Cで10〜30分間インキュベートします。
      注:インキュベーションは、必要な色を得るために室温で一晩行うことができます。
    6. 反応を止めるために蒸留水で井戸を洗います。軽顕微鏡で写真を撮る。赤色素色素顆粒はアルカリホスファターゼ(ALP)活性を表す。
    7. 残りの細胞をさらに7日間培養した後、アリザリン赤染色を行い、細胞のミネラル化能力を評価する。
    8. 10分間16、18の細胞固定後に0.5%アリザリン赤染色液で細胞を染色する。3~5分後に蒸留水で発泡反応を止めます。
      注:反応時間は、開発した色に応じて延長することができます。
    9. 最後に、培養プレートを光学顕微鏡の下に置き、骨形成染色の効果を観察します。赤い結節は、これらの細胞のカルシウム沈着を示す。
  2. mBMSCsのアディポジェニック誘導
    1. P2 mBMSCsを上記の12ウェルプレートにシードします。
    2. ウェルが90%コンフルエントになった後、a.α-MEM培地で培養した細胞(10%FBS)を負の対照として使用して、細胞を培養する。
    3. 2日間の誘導の後、培地Aをウェルから吸引し、各ウェルに1mLのアディポジェニック分化培地Bを加える。
    4. 1日後、培地Bを取り除き、ミディアムAを井戸に戻してサイクルを再開します。培地AとBを用いて細胞を交互に培養する。
    5. 分化培地AとBを3サイクルに交互に適用し、油赤O染色16、18によってこれらの細胞の脂質生成を検出する。
      注:丸い、大きな脂質の液滴の多くは、さらに2〜3日間分化培地Bでこれらの細胞を培養することによって観察することができます。
    6. 培地を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで細胞を10分間固定します。PBSで細胞を洗い流します。
    7. 油の赤色O染色液で細胞を染色し、37°Cで約3分間インキュベートする。
    8. 染色液を取り除き、蒸留水で井戸を洗います。
    9. 軽顕微鏡での脂質生成を観察します。
  3. mBMSCsの軟骨形成誘導
    1. P2 mBMSCsを15 mL遠心分離管に5 x 105/cm 2の密度で入れました
    2. チューブを300 x g で5分間遠心します。上清を捨てます。
    3. 0.5 mLの軟骨発生分化培地で細胞を再懸濁する。5分間 300xg で細胞を遠心分離する。
    4. 遠心管のキャップを緩め、37°Cで5%CO2インキュベーターでインキュベートします。2日ごとに培地を更新します。
      注:細胞は24時間後にペレットを開始します。遠心分離管を48時間動かさないのが推奨されます。培地を変える時は細胞ペレットを吸引しないように注意してください。
    5. 21日間の誘導後、4%パラホルムアルデヒドで細胞ペレットを固定し、続いて脱水、パラフィン埋め込み、切除を行います。
    6. 脱パラフィンと水和後、アルシアブルー溶液中のスライドを少なくとも18、19、20、21分間染色し、蒸留水で洗浄して反応を停止します。写真を光顕微鏡で撮影します。
    7. コラーゲンII型の免疫蛍光染色については、以下の手順を行う。
      1. 脱パラフィンと水和のステップの後、37 °Cで15分間5μg/mLプロテイナーゼKでスライドをインキュベートします。
      2. 37°Cで1時間ブロッキングバッファーにスライドをインキュベートします。
      3. 200μLのブロッキングバッファーに1μLのコラーゲンII抗体をスライドに塗布し、4°Cで一晩インキュベートします。
      4. 翌日、PBSでスライドを2回洗浄し、37°Cで2次抗体を1時間インキュベートします。
      5. スライスを40,6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)で10分間インキュベートします。
    8. 蛍光顕微鏡下で各スライドの写真を撮ります。

5. リアルタイム PCR

  1. 市販の試薬に基づいてグアニジウムイソチオシアネートを使用してmBMSCから総RNAを抽出する。
  2. 市販のキットを使用して、RNAを相補的なDNAに逆転写します。逆転写の反応条件は、5分間65°C、15分間37°C、15sで85°Cである。
  3. 表3に記載されているプライマーを用いて骨形成および脂質生成特異的遺伝子を検出するためにリアルタイムPCRを行 う。 PCR増幅手順は、5sの場合は5分間95°C、40サイクルの場合は30sの場合は60°Cの95°Cである。

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Representative Results

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このプロトコルを用いて、初期培養後3日目にプレートに接着した細胞の大部分を占めた。典型的には、さらに3〜4日間培養した後、細胞合流率は70〜80%に達した(図1B)。蛍光細胞選別では、DAPI-CD29+CD90+CD45- mBMSCを精製して18,22、P0細胞で約81.1%を占めた(図1C)。

P2 mBMSCsを6ウェルプレートの各ウェル100細胞に1週間播種した後、かなりの量のコロニー形成ユニットが観察され、mBMSCの有意なコロニー形成能力が示唆された(図1D)。

多系統分化能を評価するために、mBMSCは、それぞれ12のウェルプレートで骨系、コンドロ系およびアディポ系統に誘導された。mBMSCは強い骨形成分化能力を示した。ALPの活性の増加は、アリザリン赤染色の下で散発的に分布する赤石灰結節、および骨形成特異的遺伝子Runx2、Alp、BspおよびOcn(図2)の発現増加が、エストロゲン誘導を示した。油赤O染色によって同定された脂肪生成のために、多数の脂質が豊富な液胞は、誘導の9日後に明らかであった。同様に、Pparγ1およびCebpaのアディポ原性特異的遺伝子の発現は有意な増加を示した(図3)。軟骨発生分化スライドの顕微鏡観察のために、サンプルはアルシアンブルーに陽性染色を示した。また、抗II型コラーゲン抗体による免疫染色は、軟骨マトリックスの蓄積を増強した(図4)。

培地 コンポーネント 最終濃度
1.α-MEM培地(10%FBS) α最小必須培地
ウシ胎児血清 10%
ペニシリンとストレプトマイシン 1%
2.骨形成誘導培地 α-MEM培地(10%FBS) 70%
骨形成分化分化培地 30%
3.骨形成分化培地 骨形成基底培地
ウシ胎児血清 10%
グルタミン 1%
ペニシリンストレプトマイシン 1%
アスコルビン酸 0.20%
β-グリセロリン酸塩 1%
デキサメタゾン 0.01%
4.アディポジェニック分化培地A アディポジェニック分化基底培地
ウシ胎児血清 10%
グルタミン 1%
ペニシリンストレプトマイシン 1%
インスリン 0.20%
IBMX 0.10%
ロシグリタゾン 0.10%
デキサメタゾン 0.01%
5.アディポジェニック分化培地B: アディポジェニック分化基底培地
ウシ胎児血清 10%
グルタミン 1%
ペニシリンストレプトマイシン 1%
インスリン 0.20%
6.軟骨原性分化培地: 軟骨形成分化基底培地
デキサメタゾン 0.01%
アスコルビン酸 0.30%
その 1%
ピルビン酸ナトリウム 0.10%
プロリン 0.10%
TGF-β3 1%

表1:培地及び分化培地の成分。

抗体 濃度
CD90.1 (thy-1.1) モノクローナル抗体 0.5mg/mL
CD45モノクローナル抗体 0.2mg/mL
CD29抗体 0.2mg/mL
コラーゲンIIウサギポリクローナル抗体 5mg/mL
ヤギアンチラビットIgG H&L(アレクサフルーオール®488) 1mg/mL

表2:本研究で用いた抗体濃度。

入門 シーケンス(5'から3'まで)
ギャップド フォワード: CGGCAGTTCAACGGCACAGTCAAGGAGG
逆: アガカテッカGCACCACCACC
ランクス2 フォワード: GCCTTCAAGGTTGTAGCCCT
逆: トガアックトコックラクト
アルプ フォワード: AAACTCGCTATTCCCCG
逆: TGGGTTGAATTCCTGCGGT
BPS フォワード: GCACGGTTGAGTATGGGGAA
リバース: アトックガクツCGタグックット
オセン フォワード:カークカートクトガッカグ
リバース:ガッカカサガクCCCAACG
セブパ フォワード: アクトCGGTGTGGATAAGAACAGCACG
逆: CGGTCATTGTクトッカクトッカクトクッチ
パーパー1 フォワード:CCATCGAGGAGGカッカカガカアク
逆: GTGCTCTGTガアットクトクトガガガグ

表3:リアルタイムPCRで使用されるプライマー

Figure 1
図 1: mBMSCs の分離と文化(A) プロトコルのスケマティック ダイアグラム。mBMSCを0日目に単離してメッキし、α-MEM培地でインキュベートした。7日目、P0 mBMSCをフローサイトメトリー選別で精製し、選別された細胞を新しい培養皿にメッキした。14日目に、P1 mBMSCを回収し、12ウェルプレートにめっきを行った。15日目、P2 mBMSCは、対応する誘導培地下で骨芽細胞、有量細胞および軟骨芽細胞に誘導された。(B) ラット下顎骨骨髄の模式模型とP0 mBMSCsの顕微鏡観察(C) ラット mBMSCs のフローサイトメトリー分類フローサイトメトリー分析は、これらの細胞がCD29およびCD90に対して陽性であったが、BMSC特性と一致するCD45では陰性であったことを示している。このうち、1.4 x 106個 の細胞がソートされ、全細胞の80%を適切に占めた。(D) 結晶バイオレット染色P2 mBMSCクローンの代表的な画像。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:mBMSCsの骨形成性分化ポテンシャル(A) 骨形成誘導の7日後に、ALP活性の変化を可視化した。多数のミネラル化結節が、骨形成分化の誘導後14日目にアリザリン赤染色下染色された。(B,C)ALPとアリザリン赤染色の正の領域を、イメージJソフトウェアを用いて評価した。(C-G)骨芽細胞特異的マーカー Runx2、Alp、Bsp および Ocn のmRNA発現は、骨形成の7日後に有意に増加した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:9日間の誘導後のmBMSCsのアディポジェニック分化ポテンシャル(A)大量の脂質滴が形成され、脂肪細胞はオイルレッドOによって染色された。(B,C)このアディポジェニックマーカーセプタおよびPparγ1のmRNA発現は、9日後に顕著に増加した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:軟骨発生性分化効果のステレオスコープ図。(A)21日後の軟骨形成誘導後のmBMSCsは、アルシアンブルー染色に陽性を示した。(B)抗II型コラーゲンで染色した軟骨形成凝集体の免疫蛍光画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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このプロトコルは、骨髄付着と蛍光細胞選別を組み合わせることによって、ラット下顎骨からBMCを分離する方法を説明する。この方法は、フローセルソーティングによってmBMSCを予備的に精製することができますが、細胞の均質性に対してより高い要件がある場合は、より正確な精製方法が必要になる可能性があります。

現在、mBMSCsの単離に使用される4つの主要な技術は、骨髄全体の付着、密度勾配遠心分離、蛍光細胞選別および磁気活性化細胞選別22を含む。骨髄付着と密度勾配遠心分離は、mBMSCsを短時間で得るために使用される最も一般的で容易な方法ですが、収穫されたmBMSCsの低純度は、その主な欠点です。最後の2つの方法は、免疫学的手法を通じて高度に精製されたmBMSCを分離することができるが、高価であること、長い時間がかかり、細胞生存率の障害の欠点を有する。本研究では、骨髄全体の付着と蛍光細胞選別法の利点を組み合わせて、短時間で十分な数の増殖mBMSCを得た。

間違いなく、このプロトコルの中で最も重要なステップの1つは、軸骨および付加的骨のものとは全く異なるラット下顎骨の解剖である。ラット下顎の解剖学を理解して、そのままのサンプルを得ることが不可欠です。人間と同様に、ラット下顎骨は上顎の下に座り、下の歯を所定の位置に保持し、両側のコンディレによって頭蓋骨に接続される。下顎骨は頭蓋骨の中で動くことができる唯一の骨であるので、その動きを制御する下顎骨に取り付けられた多くの筋肉がある。これらの軟部組織を完全に取り除き、口を最大に開くことによってのみ、頭蓋骨と接続する顆が露出することができる。また、顆頭は下顎骨の物理的な弱点であり、骨折しやすいことも言及する価値があります。下顎を下方に回転させると過度の抵抗が見つかった場合、それは咀嚼筋が完全に除去されていない可能性があることを意味します。これが観察されると、それを拘束して回転させないでください、そうでなければ、細胞汚染につながるコンディラーネックを壊すのは容易です。mBMSCの分離および培養における他の困難は、骨髄中の低含量、繊細な細胞活性、低純度、低細胞頻度および造血細胞18、23の汚染を含む。良好な成長と比較的高い分化の可能性を持つ mBMSCs を得るためには、mBMSCs の活動を確保することが非常に重要です。若いラットが良好な生存率を維持することが好ましいので、これとその後の実験のために4週齢のラットを使用するなど、いくつかの重要なステップがあります。mBMSCsの活性が実験動物の年齢に関連していることを多くの研究が確認しています。高齢ドナーからのこれらのmBMSCは、より低い増殖活性、分化電位および寿命2をもたらす可能性がある。細胞収穫中のすべての操作は氷上で完了する必要があり、操作時間は可能な限り短く、できれば2時間以内である必要があります。さらに、トリプシン消化時間を3分以上保持してください。最後に、このプロトコルのもう一つの課題は、mBMSCsを収穫するプロセスです。ラット下顎骨の空洞は非常に小さいため、骨腔からmBMSCを洗い流すのも大変なことがあり、解剖学的構造に精通していることが非常に重要です。マイクロCT画像はこの点で大いに役立ちます。また、若い骨は細く脆く、破損は汚染につながる可能性があることは注目に値します。

免疫表現特性を参照すると、BMCはいくつかの表現型を発現するが、いずれもそれらに特異的なものではない24.一般に、BMC は CD11b、CD14、CD34、CD45 を発現しませんが、Sca-1、CD29、CD90、および CD105 の高い表現を持っています。本研究では、蛍光細胞選別13,14,25に対して広く認められたCD29,CD90,CD45のマーカーを選んだ。CD29+CD90+CD45-細胞が細胞全体の80%を適切に占めていることが分かりました。

何十年もの間、幹細胞療法は免疫系疾患、造疫学的全身疾患、癌、外傷などの様々な疾患の治療に広く使用されています。間違いなく、mBMSCsは、BMCの代用として、優れた特性のために幹細胞療法においてより安全で強力なツールとして使用することができます。mBMSCsの細胞培養および拡張は、したがって、治療のために十分な数の細胞を得るために特に重要になる。

要約すると、この研究は、高い均質性と多分化能力を持つ豊富なmBMSCを短期間で収穫するための有望で信頼性の高いプロトコルを実証した。

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Disclosures

すべての著者は、彼らが利益相反を持っていないと述べています。

Acknowledgments

上海第9人民病院頭蓋顔面異常研究センターのデジタル化された病頭学研究センターの支援に感謝します。本稿の研究は中国国立自然科学財団(NSFC)からの助成金によって支えられている[81570950、81870740、81800949]、 上海サミット&高原分野、上海精密医学研究所、上海九人民病院、上海交通大学医学部[JC201809]、上海交通大学医学部の高レベルイノベーションチームインセンティブプロジェクト。L.J.は、優れた青少年医療人材、上海「医療人材の新星」青少年育成プログラム、上海交通大学の「陳興」プロジェクトの学者です。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA(1X) Gibco 25200072
10cm culture dish Corning
acutenaculum
Adipogenic differentiation medium Cyagen biosciences inc. MUBMX-90031
Alcian Blue Beyotime Biotechnology
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Alkaline Phosphatase Color Development Kit Beyotime Biotechnology C3206
alpha-Minimum essential medium GE Healthcare HyClone Cell Culture SH30265.01B
Anti -CollagenII Rabbit pAb Abcam ab34712
Antibodies against CD16/CD32
Antifade Mounting Medium with DAPI Beyotime Biotechnology P0131
APC anti-mouse/rat CD29 Antibody biolegend inc 102215
Biosafety cabinet Esco AC2-4S8-CN
CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience Invitrogen 12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience Invitrogen 11-0900-85
Centrifuge cence L500
Chondrogenesis differentiation medium cyagen biosciences inc.
Confocal laser scanning microscope Zeiss LSM880
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Crystal Violet Staining Solution Beyotime Biotechnology C0121
Fetal Bovine Serum GE Healthcare HyClone Cell Culture SH30084.03
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) abcam ab150077
Incubator Esco CCL-170B-8
Inverted microscope olympus CKX53
Magzol reagent(Trizol reagent) Magen
micropipettor Eppendorf
Oil Red O
Osteogenic differentiation medium cyagen biosciences inc. MUBMX-90021
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063
Phosphate-buffered saline(1X) Gibco 20012027
PrimeScript RT Master Kit TakaRa Bio Inc RR036A
Proteinase K Sigma-Aldrich P6556
QuickBlock Blocking Buffer Beyotime Biotechnology P0260
scissor
SYBR1 Premix TakaRa Bio Inc
Toluidine Blue Beyotime Biotechnology
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061

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ラットにおける骨髄間葉系幹細胞の単離と培養
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Hong, Y., Xu, H., Yang, Y., Zhou, S., Jin, A., Huang, X., Dai, Q., Jiang, L. Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats. J. Vis. Exp. (162), e61532, doi:10.3791/61532 (2020).More

Hong, Y., Xu, H., Yang, Y., Zhou, S., Jin, A., Huang, X., Dai, Q., Jiang, L. Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats. J. Vis. Exp. (162), e61532, doi:10.3791/61532 (2020).

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