Summary
פרוטוקול זה מספק הליך מקיף כדי ליצור אורגנואיד עצב מוטורי iPS האנושי נגזר באמצעות הרכבה ספונטנית של חבילה חזקה של אקסונים המורחבת מספרואיד בשבב תרבית רקמות.
Abstract
צואה של אקסונים היא אחד המוטיבים המבניים העיקריים שנצפו במערכת העצבים. שיבוש של fascicles אקסון יכול לגרום למחלות התפתחותיות ונוירודגנרטיביות. למרות מחקרים רבים של אקסונים נערכו, ההבנה שלנו של היווצרות ותפקוד לקוי של fascicles אקסון עדיין מוגבל בשל היעדר מודלים תלת מימדיים חזקים במבחנה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לדור המהיר של אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPS) הנגרמים על ידי בני אדם בשבב תרבות רקמות מבוסס מיקרופלואידי. ראשית, ייצור שבבים המשמשים לשיטה מתואר. מתאי iPS אנושיים, נוצר ספרואיד נוירון מוטורי (MNS). לאחר מכן, מערכת ה-MNS המבודלת מועברת לשבב. לאחר מכן, האקסונים גדלים באופן ספונטני מתוך הכדורית ומתכנסים לתוך שקע בתוך מיקרו-שנל המצויד בשבב, אשר מייצר רקמת MNO הנושאת צרור של אקסונים המורחבים מהספרואיד. לניתוח במורד הזרם, ניתן להוציא MNOs מהשבב כדי להיות קבוע לניתוחים מורפולוגיים או לנתח ניתוחים ביוכימיים, כמו גם הדמיית סידן והקלטות מערך רב אלקטרודות. MNOs שנוצר עם פרוטוקול זה יכול להקל על בדיקות סמים סינון והוא יכול לתרום להבנת מנגנונים הבסיסית פיתוח ומחלות של fascicles אקסון.
Introduction
נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה (MN) מרחיבים את האקסונים לשרירי השלד כדי לשלוט בתנועת הגוף. המסלולים האקסונליים שלהם מאורגנים ומוסדרים מאוד בתהליך ההתפתחותי. למרות מחקרים רבים על הארכת אקסון והדרכה1, מנגנונים להיווצרות צרור אקסון מאורגן עדיין תחת חקירה. אקסונים של נוירונים מוטוריים נפגעים לעתים קרובות על ידי מחלות ניווניות כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS)2, אבל מנגנונים פתופיזיולוגיים של הנזק על fascicles אקסון מובנים היטב. לפיכך, מודל פיזיולוגי ופתולוגי לסיכום היווצרות צרור אקסון ורגרסיה נדרש בתחום.
נוירון מוטורי שמקורו בתאי גזע אנושיים הוא פלטפורמה מבטיחה להבנת ההתפתחות והמחלות כגון ALS3. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (תאי iPS) יכולים לשמש למודל מחלות באמצעות תאים שמקורם בחולה. עד כה, שיטות בידול שונות מתאי גזע פלוריפוטנטיים לתוך MN דווחו4,5,6. עם זאת, אקסונים של נוירונים בתרבות דו מימדית מכוונים באופן אקראי ואינם מסכמים מחדש במיקרו-ווירון vivo בתוך עצבים מתפתחים שבהם אקסונים מורכבים באופן חד כיווני באמצעות אינטראקציות אקסו-אקסונליות צפופות7. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו טכניקה ליצירת רקמה תלת מימדית הדומה לעצב מוטורי מתאי iPS אנושיים8, וקראנו לרקמה אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO). MNO מורכב מגופי תאים הממוקמים בספרואיד נוירון מוטורי (MNS) ו fascicle אקסונלי המורחבת מן הכדוריד. האקסונים ב fascicle הם בעלי אוריינטציה חד כיוונית, אשר דומה אקסונים בפיתוח עצבים מוטוריים. לפיכך, MNOs באופן ייחודי לספק microenvironment אקסונלי פיזיולוגי, אשר לא נעשה על ידי כל שיטות אחרות שפותחו בעבר תרבות עצבית.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לייצור שבבי תרבית רקמות, התמיינות נוירון מוטורי מהירה, היווצרות אורגנואיד עצב מוטורי בשבבים מפותחים. שבב תרבית הרקמות שלנו הוא פשוט מאוד, והוא מכיל רק תא לקבלת ספרואיד, מיקרו-שאנל ליצירת צרור אקסון, ותא לדיור מסופי אקסון. המכשיר אינו מכיל מבנים מורכבים כולל microgrooves או מסנני micropore המשמשים לעתיםקרובותכדי להפריד אקסונים וגופי תאים לפי גודל 9,10. לפיכך המכשירים שלנו ניתן לפברק בקלות על ידי ביצוע השלבים המתוארים בפרוטוקול זה אם הגדרת פוטוליטוגרפיה זמין.
בידול מהיר של תאי iPS אנושיים מושגת עם שילוב ממוטב של גורמי גרימת ודוגמת (SB431542, LDN-193189, חומצה רטינואית (RA), אגוניסט החלקה (SAG)) וגורמי תאוצה (SU5402 ו- DAPT). דווח כי השילוב של SU5402 ו- DAPT מאיץ את הבידול של נוירונים היקפיים ותאי ציצה עצביים11. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שלוש שיטות שונות ליצירת MNOs, כך שהקוראים יוכלו להחליט על שיטה המתאימה ביותר לצרכיהם. אנו ממליצים לבצע בידול של תאי iPS אנושיים לאחר יצירת ספרואיד (שיטת 3D), שכן MNS מובחן יכול להיות מועבר ישירות לתוך שבב תרבית רקמה. לחלופין, תאי iPS אנושיים יכולים להיות מובחנים לתוך נוירונים מוטוריים בתרבות monolayer (2D), ולאחר מכן נוצר לתוך כדורי נוירון מוטורי תלת מימדי כפי שדיווחנו בעבר8. עדכנו את הפרוטוקול, ועם שיטת הבידול התלת מימדית המתוארת בפרוטוקול זה, ניתן להימנע מהמעבר מד"ד לתלת-ממד וניתן להשיג MNOs עם זמן בידול קצר יותר, פחות שלבים וסיכונים טכניים מופחתים ללא שלב הניתוק. נוירונים זמינים מסחרית יכולים לשמש גם כדי ליצור MNS כדי להפחית את הזמן עבור בידול.
כדי ליצור MNO, אנחנו תרבותיים MNS בשבב תרבות הרקמות. האקסונים מתעלים מהספרואיד ומתרחבים למיקרו-שנל שבו האקסונים מתאספים ומתיישרים באופן חד-כיווני. זה מקל על אינטראקציה אקסו-אקסונלית והיווצרות ספונטנית של רקמת צרור חד כיוונית מורכבת היטב של אקסונים במיקרו-שאנל, אשר מושגת באופן ייחודי על ידי פרוטוקול זה, ואילו היווצרות צרור ספונטני או אוריינטציה אקסונית מודרכת לבדה יכולה להיות מושגת על ידי פרוטוקולים אחרים12,13,14. בניסוי טיפוסי, תאים מעטים נודדים מספרואידים למיקרו-שנל ורוב התאים נשארים ספרואידים סמוכים. שיטה זו מאפשרת להפריד אקסונים באופן ספונטני מהספרואידים מבלי להשתמש במחסומים פיזיים תלויי גודל (למשל, מיקרוגרובים או מסנני מיקרופור) כדי להפריד אקסונים מגופי תאים.
MNO וכתוצאה מכך יכול להיות נתון לבדיקות שונות, כולל ניתוחים מורפולוגיים, ביוכימיים ופיזיים. גוף התא וחבילת האקסון המורחבת יכולים להיות מבודדים פיזית על ידי חיתוך וניתן לנתח אותם בנפרד לניסויים במורד הזרם, למשל, מבחנים ביוכימיים. חומרים ביולוגיים כולל RNA וחלבון ניתן לבודד רק כמה חבילות אקסון עבור מבחנים ביוכימיים רגילים כולל RT-PCR ו סופג המערבי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואיד עצבי מוטורי מתאי iPS, המציע מודל פיזיולוגי ופתולוגי אטרקטיבי לחקר המנגנון שבבסיס ההתפתחות והמחלה של שרירי האקסון.
Protocol
1. ייצור עובש SU-8 על ידי פוטוליטוגרפיה
הערה: הליך זה כרוך כימיקלים מסוכנים. השתמש מכסה המנוע אדים PPE לאורך כל הדרך.
- נקה את רקיק הסיליקון (קוטר 4 אינץ', עובי 1 מ"מ, מלוטש) עם אצטון ולפוצץ עם גז חנקן. לאחר מכן אופים ב 180 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לייבוש.
- לוותר 3 מ"ל של SU-8 2100 על רקיק ניקה.
- מעיל SU-8 אחיד על הוופל באמצעות מעיל ספין ב 500 סל"ד עבור 10 s ולאחר מכן, ברצף להסתובב ב 1500 סל"ד עבור 30 s עם האצה של 300 סל"ד / s כדי להשיג שכבה עבה 150 מיקרומטר של SU-8.
הערה: ודא כי רקיק הסיליקון ממוקם במרכז מעיל הספין ומתוקן כראוי על ידי ואקום. - אופים את הוופל על הצלחת החמה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ב 65 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות, וב 95 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
- הגדר את הפוטומסק (איור 1) למיישר המסיכה וחשוף את נורית ה- UV (365 ננומטר) למשך 60 שניות.
הערה: זמן החשיפה צריך להיות ממוטב על ידי מנה מתאימה של אור UV. - לאחר החשיפה, אופים את הוופל ב 65 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות, וב 95 מעלות צלזיוס במשך 13 דקות על הצלחת החמה.
- לפתח את הוופל במשך 10-20 דקות במפתח SU-8 עם תסיסה באמצעות שייקר מסלולית, שינוי הפתרון המתפתח פעם אחת במהלך התהליך.
הערה: להאריך את זמן הפיתוח כאשר הפסולת של SU-8 נשאר. - שוטפים את הוופל באיזופרופנול ומייבשים בעדינות את הוופל בגז חנקן.
- למדוד את הגובה של SU-8 שהופקד על ידי מיקרוסקופ מדידה ולוודא שזה כ 150 מיקרומטר עובי. ניתן לאחסן אותו ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.
2. ייצור שבבי רקמות מיקרופלואידיים מבוססי PDMS
- תקן את הוופל המופקד SU-8 למיכל (למשל, צלחת פטרי מפלסטיק 15 ס"מ) באמצעות סרט צד כפול.
- לפוצץ את האבק מהוופל באמצעות גז חנקן.
- כדי silanize, לשים את הוופל SU-8-הפקדה בתא ואקום יחד עם מיכל קטן (למשל, צלחת 35 מ"מ). טיפה 10 μL של (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-טריכלורוסילן לתוך המיכל הקטן. אין להחיל ישירות את (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-טריכלורוזילאן על וופל SU-8.
- סוגרים היטב את תא הוואקום והדליקו משאבת ואקום למשך 2 שעות לפחות.
- קח פלסטיק ויוצקים את אלסטומר סיליקון (למשל, Silpot 184 או שווה ערך סילגרד 184) ואת סוכן הריפוי ביחס משקל 10:1. לאחר מכן, מערבבים היטב באמצעות מרית ו degas בתא ואקום עד בועות מוסרים לחלוטין.
- יוצקים את תערובת PDMS לתוך המיכל עם רקיק SU-8 לעובי הרצוי (3-4 מ"מ) ו degas שוב כדי להסיר בועות.
- אופים את ה-PDMS בתנור ב-60 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לפחות כדי לרפא באופן מלא את ה-PDMS.
- לאחר הקירור, יש לנתק את ה-PDMS שנרפא מהוופל באמצעות אזמל או סכין גילוח.
- כדי ליצור את שני התאים של שבב תרבות הרקמה, ניקוב שני חורים שבו שני התאים ממוקמים באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר 1.5 מ"מ.
- ליצירת מאגר בינוני, הכינו תערובת PDMS נוספת (אלסטומר סיליקון וסוכן הריפוי ביחס משקל של 10:1) ושפכו אותו לצלחת פטרי חדשה של 10 ס"מ. כוונן את עוצמת ההזרכה לעובי של 5 מ"מ של PDMS.
- אופים את ה-PDMS בתנור ב-60 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לפחות כדי לרפא באופן מלא את ה-PDMS.
- לאחר קירור PDMS, לחתוך את PDMS נרפא עם אזמל כדי לקבל טבעת מלבנית.
- קשרו את השכבה התחתונה עם המאגר הבינוני על ידי החלת PDMS לא מאובטח ביניהם ואפיית שכבות ה-PDMS שהורכבו. מבנה מלוכדות זה גורם לשבב תרבית הרקמה PDMS.
- נקה את שבב תרבות הרקמה PDMS באמצעות סרט וויסקי להסרת אבק וחלקיקים קטנים מפני השטח. שבבי תרבית רקמת PDMS ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר אם מוגן מפני אבק ו- UV.
3. הכנת התרבות
- מדיום תרבות
הערה: יש לסנן את כל המדיה המפורטת להלן לצורך עיקור, אלא אם צוין אחרת. ניתן לאחסן מדיה מוכנה ב- 4 °C (60 °F) ולהשתמש בה בתוך חודש.- להכנת mTeSR פלוס בינוני: לשלב בקבוק אחד של 100 מ"ל mTeSR בתוספת 5x תוספת עם בקבוק אחד של 400 מ"ל של mTeSR בתוספת בינוני בזל.
- כדי להכין 100 מ"ל של מדיום KSR: ב 85 מ"ל של DMEM / F12, להוסיף 15 מ"ל של החלפת סרום נוקאאוט (KSR, 15%), 1 מ"ל של תוספת גלוטמין מסחרי (1%) ו-1 מ"ל של חומצת אמינו לא חיונית (NEAA, 1%).
- כדי להכין 100 מ"ל של N2 בינוני: ב 100 מ"ל של מדיום נוירובאסלי, להוסיף 1 מ"ל של N2 (100x), 1 מ"ל של תוספת גלוטמין מסחרי, ו 1 מ"ל של NEAA.
- כדי להכין 250 מ"ל של מדיום התבגרות: ב 250 מ"ל של מדיום נוירובאסלי, להוסיף 5 מ"ל של B27 (2%), 2.5 מ"ל של תוסף גלוטמין מסחרי (1%), ו 2.5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (1%).
- Resuspend את התרכובות (חומצה רטינואית (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) בתא תרבות כיתה DMSO לריכוז הרצוי. הכינו aliquots ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים. נעשה שימוש בפתרונות המלאי הבאים: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 מיקרומטר LDN-193189, 10 מ"מ SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- ציפוי
הערה: כדי למנוע פילמור של מטריצת קרום המרתף על ידי חום, למנוע מחזורי הפשרה חוזרת ונשנית. טפל בכל הליכי הציפוי עם טיפים וצינורות פיפטה מקוררים מראש במידת האפשר. מטריצת קרום המרתף צריכה להיות מופשרת לילה ב 4 מעלות צלזיוס ו aliquoted באמצעות טיפים פיפטה מצונן מראש וצינורות. aliquots ניתן להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס.- להפשיר את aliquot קפוא ב 4 מעלות צלזיוס על קרח. aliquot צריך להישמר קר במהלך הליך הציפוי. באמצעות קצה פיפטה מקורר מראש, לדלל את מטריצת קרום המרתף עם DMEM /F12 קר כקרח ביחס של 1:40. מטריצת קרום מרתף מדולל שאינו בשימוש ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים בהתחשב בכך שלא התרחש פילמור.
- הוסף 1 מ"ל של מטריצת קרום המרתף / DMEM-F12 פתרון לציפוי באר אחת של צלחת 6 גם.
- דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר לפחות שעה, או 4 מעלות צלזיוס לילה. צלחות מצופות ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר שבוע אחד.
4. תחזוקת תאי שב"ס
הערה: תאי iPS לא מובחנים נשמרים ב- mTeSR Plus בינוני ותת-תרבותי כאשר המפגש של ≥ 90% נצפה בצלחת 6 באר בפרוטוקול זה. ייתכן שיידרשו התאמות קלות עבור תאי iPS המחורבתים במדיה אחרת.
- הכינו מנות מצופות מטריצת ממברנת מרתף כאמור בשלב 3.2.
- שאפתן מלא של מדיום mTeSR Plus. לשטוף את הבאר פעם אחת עם PBS ולהוסיף 0.5 מ"ל של מגיב עובר (ראה טבלה של חומרים). המתן מספר שניות ושואף את הפתרון.
- דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 5 דקות או עד שהתאים הופכים עגולים.
הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בין קווי תאי iPS שונים לבין המפגש. אנא בדוק מעת לעת תחת המיקרוסקופ כדי לקבוע את זמן הניתוק במהלך הדגירה. - הוסף 1 מ"ל של mTeSR פלוס בינוני והקש על הצלחת במשך 30-60 שניות כדי לנתק את המושבות.
- מערבבים בעדינות 1 מ"ל של פתרון המתלים של התא עם 7 מ"ל של mTeSR טרי בתוספת בינוני. אין פיפטה יותר מ 5 פעמים.
- צלחת ביחס של 1:8. בדרך כלל להוסיף 1 מ"ל של ההשעיה משלב 4.5 ולהוסיף 1 מ"ל של mTeSR בתוספת מדיה בתוספת 5-10 מיקרומטר של Y-27632 (מעכב רוק). יחס דילול המעבר תלוי בקו iPSC.
- מניחים את התא באינקובטור 5% CO2/37 °C (60 °F). ביום שלמחרת, הסר את Y-27632 על-ידי הוספת מדיום mTeSR Plus טרי. לאחר מכן, לשנות את המדיה כל יומיים בתחילה, וכל יום כמו התא מגיע מפגש גבוה יותר.
5. בידול של תאי iPS לנוירונים מוטוריים
הערה: כל האפשרויות שלהלן (5.2, 5.3 ו- 5.4) מפיקות MNOs ביעילות של 90%.
- העברת iPSC לבידול נוירונים מוטוריים
הערה: ניתן לערוך בידול בהצלחה בפרוטוקולים תלת-ממדיים (5.2) או דו-ממדיים (5.3).- אפשר לתאי iPS לא מובחנים לגדול עד שהם מגיעים ל-80% ב-mTeSR Plus בינוני בצלחת של 6 בארות.
- שאף לחלוטין את המדיום. מיד לשטוף את הבאר פעם אחת עם PBS סטרילי ולהוסיף 0.5 מ"ל של פתרון ניתוק התא לתאים.
- דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך כ 2-3 דקות, או עד התאים להיות מופרדים ועגול אבל להישאר מחובר לבאר.
- הוסף 1 מ"ל של פיפטה בינונית ועדינה למעלה ולמטה כמה פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל. להעביר את ההשעיה התא לצינור 15 מ"ל המורכב 4 מ"ל של המדיום.
- צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 3 דקות.
- בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר את גלולה באין מפריע, ו resuspend התאים ב 1 מ"ל של המדיום בתוספת 10 מיקרומטר של Y-27632.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהמשיך גם 5.2 (בידול 3D), או 5.3 (בידול דו-ממדי).
- היווצרות של ספירואיד נוירון מוטורי (MNS) בהבחנה תלת-ממדית ("פרוטוקול תלת-ממד")
הערה: שינוי בינוני מלא נעשה מדי יום מתוך ימים 0-12 של בידול (איור 2).- זרעו את תאי ה-iPS משלב 5.1.7 לצלחת תחתית U של 96 באר ב-40,000 תאים/באר ב-100 מיקרו-ל' של mTeSR Plus בתוספת 10 מיקרומטר של Y-27632.
- למחרת, להחליף כל באר עם 100 μL של המדיום טרי.
- בימים 0 ו-1: שאפו את מדיום התרבות והחליפו ב-100 μL של מדיום KSR בינוני (3.1.2) בתוספת 10 מיקרומטר SB431542 ו-100 ננומטר LDN-193189.
- בימים 2 ו -3: לשאוף את מדיום התרבות ולהחליף עם 100 μL של מדיום KSR בתוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 מיקרומטר SU5402, 1 מיקרומטר RA ו 1 מיקרומטר SAG.
- בימים 4 ו-5: הכינו מדיום מעורב המורכב מ-75% בינוני KSR ובינוני של 25% N2 (3.1.3). לאחר מכן, לשאוף את מדיום התרבות ולהחליף עם 100 μL של בינוני מעורב בתוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 מיקרומטר SU5402, 1 מיקרומטר RA, ו 1 מיקרומטר SAG.
- בימים 6 ו-7: הכינו מדיום מעורב המורכב מ-50% בינוני KSR ובינוני ב-50% N2. לאחר מכן, לשאוף תרבות בינונית ולהחליף אותו עם 100 μL של בינוני מעורב בתוספת 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM חומצה רטינואית 1 μM SAG.
- בימים 8 ו-9: הכינו מדיום מעורב המורכב מ-25% בינוני KSR ובינוני ב-75% N2. לאחר מכן, לשאוף תרבות בינונית ולהחליף עם 100 μL של בינוני מעורב בתוספת 5 μM DAPT, 5 מיקרומטר SU5402, 1 מיקרומטר RA ו 1 מיקרומטר SAG.
- בימים 10 ו -11: החלף בינוני עם 100 μl של N2 בינוני בתוספת 5 μM DAPT, 5 מיקרומטר SU5402, 1 מיקרומטר RA ו 1 מיקרומטר SAG.
- ביום 12: המשך להעביר את ה- MNs לשבב תרבית הרקמות (שלב 6) או להחליף בינוני עם 100 μL של מדיום ההבשלה (3.1.4) בתוספת 20 ng/mL המוח נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF).
הערה: ניתן להעביר את ה- MNS לשבב תרבית הרקמות החל מהיום ה-12 ועד היום ה-19. Spheroids שאינם מועברים צריך להישמר בתרבית 96 גם U צלחות תחתונות בינוני Maturation בתוספת 20 ng/mL BDNF עד ההעברה.
- (אפשרות חלופית) בידול דו-ממדי ומעבר ל- MNS תלת-ממדי ("פרוטוקול דו-ממדי")
- שאפו את תמיסת הציפוי מצלחת 12 באר מצופה מראש.
- זרעו את תאי ה-iPS משלב 5.1.7 בצפיפות של 100,000 – 200,000 תאים לבאר במדיום mTeSR Plus עם 10 מיקרומטר של Y-27632.
הערה: המשך culturing תאי iPS מובחנים mTeSR פלוס בינוני ללא Y-27632 עד התאים להגיע 80% confluency אם התאים דליל מדי לשלב הבא (5.3.3). - בימים 0 ו- 1: מדיום תרבות שאיפה ולהחליף עם 1 מ"ל של מדיום KSR (3.1.2) בתוספת 10 מיקרומטר SB431542 ו 100 nM LDN-193189.
- בימים 2 ו -3: מדיום תרבות שאיפה ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של מדיום KSR בתוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 מיקרומטר SU5402, 1 מיקרומטר RA ו 1 מיקרומטר SAG.
- בימים 4 ו-5: הכינו מדיום מעורב המורכב מ-75% בינוני KSR ובינוני של 25% N2 (3.1.3). לשאוף תרבות בינונית ולהחליף עם 1 מ"ל של בינוני מעורב בתוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 מיקרומטר DAPT, 5 מיקרומטר SU5402, 1 מיקרומטר RA, ו 1 מיקרומטר SAG.
- בימים 6 ו-7: הכינו מדיום מעורב המורכב מ-50% בינוני KSR ובינוני ב-50% N2. לשאוף את מדיום התרבות ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של בינוני מעורב בתוספת 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM חומצה רטינואית ו 1 מיקרומטר SAG.
- בימים 8 ו-9: הכינו מדיום מעורב המורכב מ-25% בינוני KSR ובינוני ב-75% N2. לשאוף את מדיום התרבות ולהחליף עם 1 מ"ל של המדיום המעורב בתוספת 5 μM DAPT, 5 מיקרומטר SU5402, 1 μM RA ו 1 מיקרומטר SAG.
- בימים 10 ו -11: החלף בינוני עם 1 מ"ל של N2 בינוני בתוספת 5 μM DAPT, 5 מיקרומטר SU5402, 1 מיקרומטר RA ו 1 מיקרומטר SAG.
- ביום 12: לשאוף את מדיום הבידול, לשטוף במהירות היטב פעם אחת עם PBS ולהוסיף 0.5 מ"ל של מדיום ניתוק התא. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 דקות (למשל, אם משתמשים ב-TrypLE Express) או 20-30 דקות (למשל, אם משתמשים ב-Accutase).
- באמצעות פיפטה P1000, בעדינות לאסוף את התאים ולהעביר את התאים לתוך צינור חרוט 15 מ"ל עם בינוני התבגרות טרי צנטריפוגה ב 200 x g במשך 3 דקות. אם התאים מגושמים, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים. אין פיפט יותר מדי כמו זה עלול לגרום נזק לתאים.
- לשאוף את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מדיום התבגרות (3.1.4) בתוספת 20 ng/mL BDNF.
- לספור את התא באמצעות המוציטרומטר. צלחת התאים ב 10,000-40,000 תאים לבאר ב 96 גם U צלחת התחתונה בינונית Maturation בתוספת 20 ng/ml של BDNF. צפיפות הזריעה הראשונית צריכה להיות ממוטבת בהתאם לקו התא iPS ומצב התאים, כך הקוטר של ספרואיד הוא 800-900 מיקרומטר כאשר הציג לתוך שבב תרבות הרקמה. ברוב המקרים, להתחיל ב 20,000 תאים לכל באר בתחילה, ולאחר מכן להגדיל או להקטין את מספר התאים בהתאם לגודל.
- תרבות במשך 3-10 ימים נוספים עד שהתאים יוצרים ספרואיד עם קצה חלק.
- (אפשרות חלופית): היווצרות MNS מתאי עצב מוטוריים
הערה: ניתן להשתמש בנוירונים מוטוריים אנושיים שמקורם בתאי iPS (ראה טבלת חומרים)כדי ליצור MNOs במקום להבדיל מתאי iPS אנושיים.- לאחר הפשרת cryovial של נוירונים מוטוריים, במהירות resuspend התאים עם 9 מ"ל של מדיום נוירונים מוטוריים. סובב למטה ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשאוף את supernatant ו resuspend גלולה עם מדיום נוירון מוטורי.
- בצע את אותם שלבים כמו לעיל (5.3.12- 5.3.13) כדי לייצר MNSs.
6. הכנת שבב תרבות הרקמות להיווצרות אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO)
- לעקר את PDMS מוכן (משלב 2.13) על ידי טבילה אותו 70% אתנול בצלחת פטרי לפחות 1 שעות.
הערה: יש לתמרן את כל השלבים הבאים בארון רוויה. - לעקר את המיקרוסקופ (76 x 52 ממ) על ידי טבילת אותו 70% אתנול בצלחת פטרי.
- במהלך תהליך הייבוש של המיקרוסקופ, הניחו את התקן ה- PDMS על המיקרוסקופ הרטוב למחצה והניחו לו להתייבש לחלוטין על ידי המתנה של לילה. ברגע שהוא מיובש לחלוטין, התקן PDMS צריך לדבוק בזכוכית.
הערה: מליטה זו אינה קבועה כדי לאפשר ניתוק של התקני PDMS מזכוכית המיקרוסקופ לאחר התרבות לאיסוף רקמות. מליטה קבועה על ידי פלזמת חמצן יכולה לשמש כדי למקסם את ההידבקות בין PDMS וזכוכית, אבל זה יאסור פירוק של שבבים ואיסוף רקמות. - מצפים את פני השטח של המיקרו-שנל במכשיר PDMS וזכוכית מיקרוסקופית עם 30 μL של מטריצת קרום מרתף מדוללת ב- DMEM/F12 (1:40) על ידי ביצוע טיפה בצד אחד של כניסת הערוץ ולאחר מכן לשאוף את הפתרון מהצד השני של המפרצון עם משאבת פיפטה או יניקה (איור 3A). אין לשאוף נפח גדול מדי של פתרון כדי למנוע זיהום בועה.
- לאחר מכן, דגירה המכשיר PDMS במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס במיכל משני (למשל, צלחת פטרי).
7. היווצרות אורגנואיד עצב מוטורי (MNO)
- החלף את פתרון הציפוי עם 150 μL מחומם מראש של מדיום התבגרות בתוספת 20 ng/mL של BDNF ממש לפני השימוש.
- לאחר מכן, מקם את מערכת העצבים המרכזית משלב 5.2.9 או 5.3.13 לתוך הכניסה של המיקרו-שאנל באמצעות מיקרופיפט עם קצה רחב משעמם. מערכת העצבים המרכזית יכולה להתיישב באופן ספונטני בתחתית המכשיר בכוח המשיכה. אין להפעיל לחץ רב מדי בעת הזרקת מערכת העצבים המרכזית(איור 3B).
הערה: אם מערכת העצבים המרכזית תקועה על קיר הצד של חור בשבב תרבית רקמות, שאף בעדינות את הפתרון מצד אחר של המפרצון. - מלא מאגר קטן (למשל, כובע של צינור 15 מ"ל) במים סטריליים והנח אותו בקרבת שבב תרבות הרקמה במיכל המשני כדי למנוע אידוי בינוני. לאחר מכן, למקם אותו 5% CO2/37 °C (69 °F).
- לשינוי בינוני, שאפתן את מדיום התרבות המותש ממרכז המאגר הבינוני (איור 3C). אין לשאוף את כל המדיום והרקמה.
- הוסיפו בעדינות מדיום התבגרות טרי (עם BDNF). יש להחליף את המדיום כל 2-3 ימים. אין לייבש את מדיום התרבות בכל עת במהלך התרבות. אקסונים לגדול מ MNS לתוך הערוץ באופן ספונטני להרכיב לתוך חבילה אחת ב 2-3 שבועות, אשר לגרום להיווצרות של MNO. MNO יכול להיות תרבותי במשך יותר מחודש נוסף במכשיר.
8. ניתוח במורד הזרם של MNO
- חיסון בהר שלם
- הביאו את המכשיר או הכלים למכסה המנוע הכימי. תקן MNO על ידי הוספת נפח שווה בקירוב של 8% paraformaldehyde (PFA) לתקשורת כדי להשיג ריכוז סופי של 4% PFA. לקלף את המכשיר PDMS מן הזכוכית דגירה במשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את MNO עם PBS ולאחר מכן לחזור על שטיפת PBS 2x.
- חלחלו ל-MNO עם 0.2% מטריטון X-100 ב-PBS והדגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את MNO עם PBS ולאחר מכן לחזור על שטיפת PBS 2x. לאחר מכן, לחסום את MNO עם PBS המכיל 1% BSA ודגרת במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- לדלל נוגדנים ראשוניים PBS המכילים 0.1% BSA ו דגירה MNO עם פתרון הנוגדנים העיקרי לילה ב 4 °C (69 °F). לשטוף את MNO עם PBS שלוש פעמים.
- לדלל נוגדנים משניים PBS עם 0.1% BSA ו דגירה MNO עם פתרון נוגדן משני עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את MNO שלוש פעמים עם PBS.
- הכתים את ה-MNO עם Hoechst ב-PBS המכיל 0.2% טריטון-X ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את MNO שלוש פעמים עם PBS. MNO immunostained מוכן להדמיה עם מיקרוסקופים לייזר פלואורסצנטי או confocal.
- איסוף רקמות ובידוד של צרור אקסון
- יוצקים 10 מ"ל של תמיסת HBSS לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ. לאחר מכן, טבלו את כל התקן ה-PDMS בפתרון HBSS.
- נתק בזהירות את ה-PDMS מזכוכית המיקרוסקופ תחת סטריאומיקרוסקופ. כאשר הרקמות נדבקות להתקן PDMS, יש למרוח בעדינות 1 מ"ל של פתרון HBSS מראש החור באמצעות פיפטה.
- ברגע שהרקמה יוצאת מה-PDMS, יש למרוח בעדינות 1 מל של HBSS על המיקרוסקופ כדי לנתק לחלוטין את ה-PDMS מזכוכית המיקרוסקופ.
- כדי לבודד צרור אקסון מספרואיד, חותכים את צרור האקסון עם סכין כירורגית או פינצטה מתחת למיקרוסקופ. חותכים את צרור האקסון מעט רחוק (> 1 מ"מ) מהספרואיד כדי למנוע זיהום של תאים נודדים.
- חבילות אקסון מבודדות וספרואידים ניתן לנתח עוד יותר על ידי ניתוחים שונים במורד הזרם כגון RT-PCR, RNA-seq, ואת הכתם המערבי.
- ניתן לעשות שימוש חוזר בשבב התרבות של PDMS. כדי לנקות את שבב התרבות, sonicate שבב התרבות בתוך מים מזוקקים במשך 15 דקות. לאחר מכן, sonicate השבב במים מזוקקים בתוספת 1% חומר ניקוי. לשטוף את שבב התרבות עם מים מזוקקים 5 פעמים.
- דימות סידן
הערה: פעילות עצבית ניתן למדוד עם מחוון סידן הן לפני ואחרי איסוף של רקמה משבב תרבות הרקמה (מ 8.2). הפרוטוקול מבוסס על ערכה מסחרית ספציפית (ראה טבלת חומרים). לחלופין, ניתן להשתמש בערכות הדמיית סידן אחרות או בשיטות שוות ערך.- לשטוף את MNO עם PBS (ללא Ca2 + ו מ"ג2 +) במשך שלוש פעמים.
- דגירה הרקמה עם 5 מיקרומטר של Fluo-4AM במדיום הקלטה (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl2, 1.8 mM, CaCl2, 13.8m גלוקוז) עבור 30-60 דקות ב 37 °C (60 °F). תוספת של 0.01-0.02 % של F-127 פלורוני יכול לסייע ספיגת Fluo-4 AM לתוך התאים.
- לאחר מכן, לשטוף את הרקמה עם PBS (ללא Ca2 + ו מ"ג2 +) ולהחליף אותו עם מדיום הקלטה.
- רכוש תמונות עם זמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם ערכת מסננים GFP/Cy2. הגדר את זמן החשיפה של פחות מ- 20 אלפיות השנייה למסגרת.
- פתח את קובץ הסרט שנרכש כרצף תמונות באמצעות Image J.
- בשעת שימוש במצלמת CCD או CMOS צבעונית, המירו תמונות RGB לתמונות מונו של 16 סיביות. פתחאת " נתח | כלים | מנהל החזר ההשקעות", צייר את אזור העניין ולחץ על "הוסף". לחץ על "מידה מרובה". ממוצע העוצמה בהו"ר מרובים יוצג בתוצאה.
- התווה את השינוי בעוצמת האות באמצעות תוכנת ניתוח נתונים כללית.
- מדידת פעילות עצבית על ידי מערך רב אלקטרודות
הערה: הפעילות של נוירונים מוטוריים ניתן ללכוד על ידי מערך רב אלקטרודות (MEA).- לאחר יצירת MNO, להעביר אותו על מטריצת מרתף מצופה MEA בדיקה. מקם את הרקמה על אלקטרודות.
- הוסף 200 μL של בינוני התבגרות דגירה 1-2 שעות ב 37 °C (69 °F) כדי לאפשר MNO לצרף את פני השטח.
- החלף את המדיום במדיום הקלטה (8.3.2). באופן אופציונלי למקם רשת ומשקל על גבי MNO כדי להגדיל את החוזה עם האלקטרודות.
- הגדר את הגשוש MEA לשלב ראש ההקלטה. נגב את המגע בין הגשוש MEA לשלב הראש עם 70% אתנול.
- התחל להקליט פעילות עצבית על-ידי ביצוע ההוראות של יצרני MEA.
Representative Results
נוירונים מוטוריים נבדלו תוך 12-14 ימים בהליכי בידול תלת-ממדיים (איור 4 ואיור 5). חשוב לציין, יותר מ 60% מהתאים הביעו סמן נוירון מוטורי HB9 במהלך הבידול. אימונוהיסטוכימיה גילתה שכ-80% מהתאים במערכת העצבים החוץ-ארגונית היו נוירונים מוטוריים חיוביים SMI32. HB9 ו SMI32 הם הוקמה בשלב מוקדם נוירון מנוע סמנים15,16. הביטוי של HB9 ו- SMI32 הם הפרמטרים העיקריים שיש לאשר כדי להבטיח זהות תאית של נוירונים מוטוריים. לאחר כניסתה של MNS לתוך שבב התרבות, אקסונים להרחיב לתוך הערוץ ואת צורות צרור אקסון. בשל מיקרו-ערוצים המשמשים כמדריכים פיזיים, האקסונים מתעלים מה-MNS ויוצרים חבילה באמצעות אינטראקציה אקסו-אקסונלית(איור 6A). זה חיוני כדי לאשר את היווצרות צרור האקסון על ידי תצפית מיקרוסקופית כדי לאשר את הדור של MNO. MNO מוצלח נושא צרור אקסון רחב יותר מ 50 מיקרומטר וכמה אקסונים מבודדים מתוך החבילה בערוץ. התארכות ראשונית של אקסונים ניתן לראות 24 שעות לאחר כניסתה של ספרואיד. בתוך 3-4 הימים הבאים, האקסונים הגיעו למרכז המיקרו-שנל ואז מגיעים לקצה השני תוך 10 ימים נוספים(איור 6A). כתוצאה מכך, האקסונים התאספו ויצרו צרור ישר וחד כיווני ב 2-3 שבועות בשבב, ופעילויות עצביות נצפו לאחר מכן.
ניתן לאסוף אורגנואידים של עצבים מוטוריים מהשבב על ידי ניתוק ה- PDMS מזכוכית המיקרוסקופ לצורך ניתוח ביולוגי (איור 6B). ניתן לנתח ולבודד חבילות אקסון וגופי תאים באמצעות חיתוך באמצעות סכין כירורגית או פינצטה מתחת למיקרוסקופ (איור 6B). חומרים ביולוגיים אלה כולל RNA וחלבון יכולים לשמש עבור מבחנים ביוכימיים רגילים כגון RT-PCR ו סופג המערבי. בחבילות אקסון של MNOs, חלבונים גרעיניים או יצרנים דנדריטיים אינם מזוהים בנפח המערבי(איור 6C).
בשילוב עם מחוון סידן (Fluo-4 AM), פעילות עצבית ניתן ללכוד שבב תרבות הרקמה. פעילות ספונטנית של נוירונים מוטוריים בספרואיד ובחבילת האקסון נצפתה בתוך MNO. כמו כן, הפעילויות העצביות נצפו באמצעות מערכת מערך רב אלקטרודה.
איור 1: הממד של שבב תרבות הרקמות PDMS.
(A)פוטומסק של שבב תרבות הרקמות. (B)מידות של מיקרו-שנל בשבב תרבית הרקמות. קוטר תא הבסיס להחזקת ספרואיד נוירון מוטורי הוא 2 מ"מ והחור של PDMS מעל התא הוא 1.5 מ"מ. הרוחב והגובה של מיקרו-שאנל המגשר בין שני תאים הם שניהם 150 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: איור סכמטי של בידול נוירונים מוטוריים.
(A) צעדי הבידול כללו אינדוקציה עצבית, דפוס לתוך שושלת נוירון מוטורי, והתבגרות של נוירונים מוטוריים. (B)שתי אפשרויות ליצירת ספירואיד נוירון מוטורי (MNS) מתאי iPS: פרוטוקול תלת-ממד, ופרוטוקול דו-ממדי עם שלב הניתוק של נוירונים מוטוריים. אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) ניתן להשיג על ידי שני הפרוטוקולים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פרוטוקול צעד אחר צעד לציפוי מטריצת קרום מרתף והצגת כדוריות של נוירונים מוטוריים.
(A)ציפוי מטריצת קרום מרתף בערוץ של שבב תרבות הרקמות. (B)כניסת MNS לתוך החור של השבב. (ג)שינוי תרבותי בינוני על ידי שאיפה של מדיום מותש. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בידול בין נוירונים מוטוריים דו-ממדיים ותל-ממדיים.
(A)קורס זמן של בידול MNS תלת-ממדי מייצג (פרוטוקול תלת-ממד). גודלו של מערכת העצבים המרכזית גדל בהדרגה עם הזמן. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (ב) משך זמן של בידול דו-ממדי ב- -D2, D0, D1, D6, D12 (פרוטוקול דו-ממדי). סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אפיון של נוירונים מוטוריים.
(A)(משמאל) הקפאה של מערכת MNS מוכתמת בנוגדן SMI-32 וב-DAPI. (אמצע) אני לא יכול לעשות את זה. תמונת ניגודיות פאזה של מערכת MNS שהושלכה מחדש על משטח מצופה מטריצת ממברנה במרתף. התארכות אקסונלית נצפתה. (מימין) אני לא יכול לעשות את זה. אקסונים של MNS replated מוכתם נוגדנים סינפסין I ו Tuj1. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר (שמאל ואמצע) ו 50μm (ימין). (B)תמונה מייצגת של נוירונים מוטוריים דו-מימדיים עם נוגדני Tuj ו- HB9. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: אפיון אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) שנוצר בשבב תרבות.
(A)תמונות מייצגות של התארכות אקסון והיווצרות צרור אקסון עבה על D32. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (B)חיסון של אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) על ידי SMI-32 ו- DAPI. אקסונים וגופי תאים יכולים להיות מבודדים על ידי חיתוך פיזי. סרגל סולם: 1 מ"מ. (C) טוהר החלבון מאקסונים וגופי תאים מכמתים על ידי סופג מערבי. MAP2, סמן דנדריטי, לא זוהה בחלבון אקסונלי, ואילו סמן אקסונלי Tau1 מועשר בחלבון האקסונלי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר היווצרות של אורגנואיד עצב מוטורי (MNO) אשר יש צרור אקסון המורחבת מספרואיד נוירון מוטורי שנוצר מתאי iPS אנושיים. צרור האקסון שנוצר הוא עבה, גמיש ומאורגן היטב במבנים חד-כיווניים. על ידי ניתוח צרור האקסון, ניתן להשיג חלבון אקסונלי ו- RNA בטוהר גבוה מספיק לניתוחים ביוכימיים. פעילות עצבית ניתן למדוד בחבילות אקסון וספרואידים עם הדמיית סידן. זיהום של חלבונים גרעיניים ודנדריטיים בליסט האקסונלי לא זוהה על ידי סופג מערבי, והוכיח שהשיטה שלנו הפרידה ביעילות אקסונים מגופי תאים ודנדריטים.
אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא בידול מהיר ויצירת MNO מצויד צרור אקסון, שבו כל התהליכים יכולים להיעשות ב 4 שבועות עם פרוטוקול 3D ו 5-6 שבועות באמצעות פרוטוקול 2D. זה קצר בהשוואה לפרוטוקולים אחרים אשר בדרך כלל לקחת 3-4 שבועות פשוט להבדיל לתוך MN מתאי גזע עובריים ותאי iPS17 וזה לוקח 2-4 שבועות נוספים כדי לקבל התארכות אקסון. פרוטוקול תלת-ממד מועדף בדרך כלל על-פני פרוטוקול דו-ממדי בשל זמן הבידול הקצר יותר, פחות שלבים והסיכונים הטכניים המופחתים ללא שלב הניתוק בהשוואה לפרוטוקול הדו-ממדי. שבב תרבות הרקמה המבוסס על מיקרופלואידים תוכנן באופן כך שהאקסונים של MNS יוכלו להאריך לכיוון התא השני דרך המיקרו-שאנל, המאפשר היווצרות צרור של אקסונים על ידי גרימת אינטראקציות אקסו-אקסונליות וזיקה בין אקסונים. בגלל ההגדרה הניסיונית הפשוטה, כל הפרוטוקולים המתוארים כאן יכולים להתבצע לא רק על ידי ביו-הנדסה, המכירים את המניפולציה של שבב תרבות רקמות, אלא גם ביולוגים וחוקרי מוח שאינם מכירים מיקרופלואידים וטכניקות מיקרו-פיבריקציה. יש לציין כי שלבים 1 ו- 2 יכולים להתבצע גם באמצעות שירות ייצור חיצוני.
אחד הצעדים הקריטיים להשגת הפרוטוקול הוא שינוי רציף של מדיום תרבותי. מומלץ לשנות לחלוטין את מדיום התרבות בכל שלב במהלך הבידול, כך שגורמים במדיום המושקע לא יפריעו לבידול MN. נקודה קריטית נוספת של פרוטוקול זה היא לשמור על תאי iPS מובחנים באיכות טובה. איכות תרבות התאים הראשונית של iPS משפיעה באופן משמעותי על היעילות להשגת נוירונים מוטוריים ו- MNO. נקודה נוספת היא כי הקוטר של MNS צריך להיות קטן יותר מגודל החור של השבב (1.5 מ"מ). ספרואידים גדולים יותר אינם יכולים להיכנס לתא, ועלולים לחוות נמק היפוקסי חמור בחלק המרכזי. ניתן לשלוט בגודל של MNSs על ידי שינוי מספר זריעה ראשוני של תאי iPS (בפרוטוקול 3D) או נוירונים מוטוריים (בפרוטוקול דו-ממדי). יש למטב את צפיפות הזריעה של תאים עבור כל קו תא iPS.
מכשירים מיקרופלואידיים ממודרים עם מיקרוגרובים ומסנני נקבוביות קטנים שימשו באופן נרחב להפרדת אקסונים מגופי תאים ודנדריטים. טכניקה זו יכולה גם להפריד אקסונים מגופי תאים ודנדריט, עם שפע מעולה של אקסונים ברקמות ארוזות. בהשוואה לשיטות אחרות, מגבלה מרכזית אחת של שיטה זו היא שהיא אינה יכולה להפריד בין שתי מדיה תרבותית שונה בעיצוב הנוכחי של שבב תרבות הרקמה, המעכב את היכולת של תרבות משותפת של שני תאים שונים הדורשים שתי מדיה נפרדת. מגבלה נוספת היא כי שבב PDMS לשים הגבלה קבועה מראש על גודל הרקמה. ספרואיד גדול יותר מהחור לא יכול להיכנס לתא, וחבילת האקסון לא יכולה להיות עבה יותר מרוחב הערוץ המיקרופלואידי.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים אחרים של נוירונים. הקבוצה שלנו הראתה יכולת מודל של מערכת מוחית באמצעות שיטה שונה בשילוב עם טכניקות אורגנואיד מוחי18. ספירואידים קליפת המוח הוכנסו לשני התאים והאקסונים התארכו באופן ספונטני הדדית לכיוון כל ספרואיד, ולאחר מכן צרור אקסון נוצר באופן ספונטני. כתוצאה מכך, ניתן לחבר שני כדוריות קליפת המוח באמצעות צרור אקסון, ואת הרקמה ניתן להשיג כחתיכה אחת. זה מדגים כי הגישה היא מאוד תכליתי כדי ליצור רקמות צרור אקסון ללא קשר לסוגי תאים עצביים. בפרוטוקול זה, תאי iPS אנושיים שימשו, עם זאת, תאי גזע אחרים כולל תאי ES אנושיים ותאי גזע עצביים אנושיים עשויים לשמש עם שינויים בפרוטוקול המוצג. 3D spheroids של נוירונים יכול להיווצר על ידי פרוטוקולים מגוונים19,20. שיטה זו של ביצוע רקמות עם צרור אקסון יכול להיות משולב בעתיד עם פרוטוקולי בידול אחרים להכנת כדורי MN 3D. בנוסף, עובי ואורך צרור האקסון ניתן לשלוט פשוט על ידי שינוי הרוחב והגובה של microchannels של שבב תרבות הרקמה להתפתחויות עתידיות.
אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לשמש בדיקות סמים סינון והוא יכול לתרום להבנת מנגנונים שבבסיס הפיתוח והמחלות של fascicles אקסון.
Disclosures
במסגרת פרוטוקול זה, פטנט כבר מורשה Jiksak Bioengineering, Inc. אשר נוסדה על ידי ג'ירו קוואדה.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענקים בסיוע למחקר מדעי 17H05661 ו 18K19903, Core-2-core תוכנית, ומעבר AI המכון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
| 6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
| Accutase | ICT | AT104 | |
| B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
| Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
| HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
| HBSS | Wako | 085-09355 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
| Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
| MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
| Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
| N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
| Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
| ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
| Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
| SAG | Sigma | SML1314 | |
| SB431542 | Wako | 192-16541 | |
| Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
| Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
| Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
| SU5402 | Sigma | SML0443 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
| TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
| Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
| Y-27632 | Wako | 030-24021 |
References
- Raper, J., Mason, C. Cellular strategies of axonal pathfinding. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).
- Ito, Y., et al. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science. 353 (6299), 603-608 (2016).
- Fujimori, K., et al. Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).
- Chen, H., et al. Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons. Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
- Imamura, K., et al. The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis. Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).
- Wang, L., Marquardt, T. What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).
- Kawada, J., et al. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. JoVE. (141), e58421 (2018).
- Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. JoVE. (147), e59250 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).
- Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions. bioRxiv. , (2020).
- Cullen, D. K., et al. Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids. iScience. 21, 57-67 (2019).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).
- Egawa, N., et al. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).
- Qu, Q., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).
- Kirihara, T., et al. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions. iScience. 14, 301-311 (2019).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).
