Summary
मीठे पानी के प्लैनेरियन तीन गैट्स (ग्लाइडिंग, पेरिस्टलसिस और स्क्रंचिंग) प्रदर्शित करते हैं जो मात्रात्मक व्यवहार विश्लेषण द्वारा अलग-अलग होते हैं। हम विभिन्न हानिकारक उत्तेजनाओं, उसके परिमाणीकरण, और पेरिस्टलसिस और ग्लाइडिंग से अंतर का उपयोग करके स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। जीन नॉकडाउन का उपयोग करके, हम मात्रात्मक फेनोटाइपिक रीडआउट के रूप में स्क्रंचिंग की विशिष्टता प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
मीठे पानी के प्लैनेरियन आम तौर पर अपने वेंट्रल साइड पर सिलियरी प्रणोदन के माध्यम से आसानी से फिसलते हैं। हालांकि, कुछ पर्यावरणीय स्थितियां लोकोमोशन के मांसपेशी-चालित रूपों को प्रेरित कर सकती हैं: पेरिस्टलसिस या स्क्रंचिंग। जबकि पेरिस्टेलसिस एक सिलियरी दोष से परिणाम देता है, स्क्रंचिंग सिलिया फ़ंक्शन से स्वतंत्र है और विच्छेदन, हानिकारक तापमान, चरम पीएच और इथेनॉल सहित कुछ उत्तेजनाओं के लिए एक विशिष्ट प्रतिक्रिया है। इस प्रकार, ये दो मांसपेशी चालित गायों को यंत्रवादी रूप से अलग कर रहे हैं । हालांकि, उन्हें गुणात्मक रूप से अलग करना मुश्किल हो सकता है। यहां, हम विभिन्न भौतिक और रासायनिक उत्तेजनाओं का उपयोग करके स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम स्क्रंचिंग के मात्रात्मक लक्षण वर्णन का विस्तार करते हैं, जिसका उपयोग स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पेरिस्टलसिस और ग्लाइडिंग से अलग करने के लिए किया जा सकता है। चूंकि स्क्रंचिंग एक सार्वभौमिक प्लैनेरियन चाल है, हालांकि विशिष्ट प्रजातियों-विशिष्ट मतभेदों के साथ, उचित विचारों का उपयोग करते समय इस प्रोटोकॉल को मोटे तौर पर प्लैनेरियन की सभी प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है। इसे प्रदर्शित करने के लिए, हम दो सबसे लोकप्रिय प्लैनेरियन प्रजातियों की प्रतिक्रिया की तुलना करते हैं, जो व्यवहार अनुसंधान में उपयोग की जाती हैं, डुगेसिया जैपोनिका और श्मिटिया ध्यान,भौतिक और रासायनिक उत्तेजनाओं के एक ही सेट के लिए। इसके अलावा, स्क्रंचिंग की विशिष्टता इस प्रोटोकॉल का उपयोग आरएनए हस्तक्षेप और/या औषधीय जोखिम के साथ मिलकर आणविक लक्ष्यों और न्यूरोनल सर्किट को विच्छेदन करने की अनुमति देता है, जो संभावित रूप से एनओसी और न्यूरोमस्कुलर संचार के महत्वपूर्ण पहलुओं में मशीनवादी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।
Introduction
स्टेम सेल और,पुनर्जनन अनुसंधान1,2, 3के लिए उनकी लोकप्रियता के अलावा, मीठे पानी के प्लैनेरियन लंबे समय से व्यवहार अध्ययन,34,,5में उपयोग किए जाते हैं, जो उनके तुलनात्मक रूप से बड़े आकार (लंबाई में कुछ मिलीमीटर), प्रयोगशाला रखरखाव की आसानी और कम लागत, और नमूदार व्यवहार के व्यापक स्पेक्ट्रम का लाभ उठाते हैं। कंप्यूटर दृष्टि और योजनावादी व्यवहार अध्ययन के लिए स्वचालित ट्रैकिंग की शुरूआत6,,7,,8,,9,10, 11,11 ने व्यवहार फेनोटाइप के मात्रात्मक भेदभाव को सक्षम किया है।, पशु व्यवहार न्यूरोनल फ़ंक्शन का सीधा रीडआउट है। क्योंकि प्लैनेरियन तंत्रिका तंत्र मध्यम आकार और,जटिलता का है, लेकिन शेयरों ने कशेरुकी मस्तिष्क12, 13,,14के साथ प्रमुख तत्वों को संरक्षित किया, प्लानेरियन व्यवहार का अध्ययन करना न्यूरोनल कार्रवाई केसंरक्षिततंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है जो अधिक जटिल जीवों में सीधे जांच करना मुश्किल हो सकता है। इस प्रकार, 8 , 12 , 15 ,16, 17,17,,,,18 , 19,19,2016,,21के तुलनात्मक न्यूरोबायोलॉजीअध्ययनोंके लिए प्लानेरियन एक मूल्यवान मॉडल हैं ।21 इसके अलावा, जलीय वातावरण रसायनों के तेजी से और फेसियल एक्सपोजर की अनुमति देता है ताकि वे पुनर्जीवित और वयस्क प्लैनेरियन में मस्तिष्क के कार्य पर उनके प्रभाव का अध्ययन कर सकें, जिससे उन्हें न्यूरोटॉक्सिकोलॉजी22, 23, 24,,,25,2624के25,लिए एक लोकप्रिय प्रणाली बन गई।
प्लैनेरियन के पास तीन अलग-अलग गैट्स होते हैं, जिसे ग्लाइडिंग, पेरिस्टलसिस और स्क्रंचिंग के रूप में जाना जाता है। प्रत्येक चाल विशिष्ट परिस्थितियों में प्रदर्शित की जाती है: ग्लाइडिंग डिफ़ॉल्ट चाल है, पेरिस्टलसिस तब होता है जब सिलियरी फ़ंक्शन से समझौता किया जाता है7,,27,और स्क्रंचिंग एक एस्केप चाल है - सिलिया फ़ंक्शन से स्वतंत्र - कुछ हानिकारक उत्तेजनाओं के जवाब में7। हमने दिखाया है कि स्क्रंचिंग एक विशिष्ट प्रतिक्रिया है, जो कुछ रासायनिक या भौतिक संकेतों की अनुभूति से प्राप्त होती है, जिसमें अत्यधिक तापमान या पीएच, यांत्रिक चोट या विशिष्ट रासायनिक प्रेरक शामिल हैं, और इस प्रकार सामान्य तनाव प्रतिक्रिया7,28, 29,29नहीं है।,
इसकी विशिष्टता और टकसाली मापदंडों के कारण, जिसे इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके आसानी से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, स्क्रंचिंग एक शक्तिशाली व्यवहार फेनोटाइप है जो शोधकर्ताओं को संवेदी मार्गों और व्यवहार के न्यूरोनल नियंत्रण को विच्छेदन करने में सक्षम बनाता है25,,28। इसके अतिरिक्त, तंत्रिका तंत्र के विकास पर प्रतिकूल रासायनिक प्रभावों और न्यूरोटॉक्सिकोलॉजी अध्ययन 22 ,,24,,25,30में कार्य करने के लिए स्क्रंचिंग को एक संवेदनशील अंतिम बिंदु दिखाया गया है ।,24 चूंकि कई अलग-अलग संवेदी मार्ग विभिन्नतंत्रों केमाध्यम से स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए एकाग्र होते हैं, इसलिए स्क्रंचिंग अन्य प्लैनेरियन व्यवहारों से अलग है क्योंकि विभिन्न, लेकिन विशिष्ट, उत्तेजनाओं का उपयोग अलग-अलग न्यूरोनल सर्किट को विच्छेदन करने और अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है कि स्क्रंचिंग फेनोटाइप का उत्पादन करने के लिए विभिन्न संकेतों को कैसे एकीकृत किया जाता है।
महत्वपूर्ण बात, प्रजातियों के मतभेद मौजूद हैं, जिसमें एक रसायन एक प्लैनेरियन प्रजातियों में स्क्रंचिंग प्रकाश में लाना हो सकता है, लेकिन दूसरे में एक अलग व्यवहार प्रतिक्रिया । उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि आनंदमाइड प्लैनेरियन प्रजाति डुगेसिया जैपोनिका में स्क्रंचिंग को प्रेरित करता है लेकिन श्मिटिया ध्यानी28में पेरिस्टलसिस को प्रेरित करता है। यह उदाहरण विभिन्न गेटों के बीच मज़बूती से अंतर करने में सक्षम होने के महत्व पर प्रकाश डालता है, क्योंकि वे अलग आणविक तंत्र के फेनोटाइपिक अभिव्यक्तियां हैं। हालांकि, पर्सिस्टल्सिस से स्क्रंचिंग का भेद गुणात्मक अवलोकन डेटा का उपयोग करना मुश्किल है, क्योंकि दोनों गायें मांसपेशी-चालित हैं और गुणात्मक समानताएं साझा करती हैं7,,28। इस प्रकार, गायों को अलग करने के लिए सिलिया इमेजिंग या मात्रात्मक व्यवहार अध्ययन करना आवश्यक है, जो विशिष्ट मापदंडों7,,28के आधार पर अंतर की अनुमति देता है। क्योंकि सिलिया इमेजिंग प्रयोगात्मक रूप से चुनौतीपूर्ण है और इस तरह के एक उच्च आवर्धन यौगिक माइक्रोस्कोप और एक उच्च गति कैमरा7,,28के रूप में विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, यह मात्रात्मक व्यवहार विश्लेषण के रूप में शोधकर्ताओं के लिए मोटे तौर पर सुलभ नहीं है ।
यहां, हम (1) के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं (1) विभिन्न भौतिक (हानिकारक तापमान, विच्छेदन, निकट-यूवी प्रकाश) और रासायनिक (एलिल आइसोथियोसायनेट (एआईटीसी), सिनामलडिहाइड) उत्तेजनाओं और (2) स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्लेरियन व्यवहार के मात्रात्मक विश्लेषण का उपयोग करके स्क्रंचिंग का प्रेरण। चार मापदंडों (शरीर की लंबाई दोलनों की आवृत्ति, सापेक्ष गति, अधिकतम आयाम, और शरीर के विस्तार और संकुचन की विषमता)7,स्क्रंचिंग को ग्लाइडिंग, पेरिस्टाल्सिस, और अन्य व्यवहार राज्यों से अलग किया जा सकता है, जैसे कि सांप की तरह लोकोमोशन15 या मिर्गी15। इसके अलावा, जबकि स्क्रंचिंग को विभिन्न प्लैनेरियन प्रजातियों के बीच संरक्षित किया जाता है7,प्रत्येक प्रजाति की अपनी विशेषता आवृत्ति और गति होती है; इसलिए, एक बार ग्लाइडिंग और एक प्रजाति की स्क्रंचिंग गति निर्धारित किया गया है, अकेले गति ग्लाइडिंग और पेरिस्टलसिस29से स्क्रंचिंग भेद करने के लिए एक साधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है . प्रोटोकॉल कम्प्यूटेशनल छवि विश्लेषण या व्यवहार अध्ययन में कोई पूर्व प्रशिक्षण नहीं मानता है और इस प्रकार स्नातक स्तर पर शिक्षण प्रयोगशाला संदर्भ में प्लानेरियन व्यवहार प्रयोगों के लिए भी लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल अनुकूलन की सुविधा के लिए उदाहरण डेटा पूरक सामग्री में प्रदान किया जाता है।
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Protocol
1. मात्रात्मक योजनावादी व्यवहार परख
- प्रायोगिक सेटअप
- एक सपाट सतह पर एक मंद एलईडी पैनल रखें। एलईडी पैनल दो उद्देश्यों में कार्य करता है: (1) एक समान सफेद पृष्ठभूमि प्रदान करने के लिए और (2) उचित विपरीत प्राप्त करने के लिए एक समायोज्य प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जाना है। एलईडी पैनल पर 100 एमएम पेट्री डिश एरिना रखें।
नोट: थ्रूपुट बढ़ाने के लिए, एक बहु-अच्छी प्लेट का उपयोग एरिना23, 24,24के रूप में किया जा सकता है, लेकिन बड़े एरेनास स्वचालित छवि विश्लेषण की सुविधा प्रदान करते हैं। - एक अंगूठी पर एक कैमरा माउंट क्षेत्र के ऊपर खड़े(चित्रा 1A)। कैमरा स्थिति, ऊंचाई, और ध्यान के रूप में आवश्यक है ताकि पूरे क्षेत्र को देखने के क्षेत्र के भीतर केंद्रित है और ध्यान में है(चित्रा 1B)के रूप में ध्यान दें ।
नोट: कैमरा रिज़ॉल्यूशन को एलईडी पैनल द्वारा प्रदान की गई समरूप पृष्ठभूमि से स्पष्ट रूप से एक प्लैनेरियन को अलग करने के लिए पर्याप्त उच्च होना चाहिए। - आधा अधिकतम मात्रा के लिए उपयुक्त एक्सपोजर मीडिया (प्लैनेरियन पानी या रासायनिक समाधान) के साथ क्षेत्र भरें (यह एक स्नान के रूप में संदर्भित किया जाएगा) । यह 100 मिमी पेट्री डिश के लिए लगभग 25 एमएल से मेल खाती है। एलईडी पैनल को चालू करें और किसी भी अन्य प्रकाश स्रोतों को बंद कर दें जो रिकॉर्डिंग गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं (यानी, आस-पास के प्रकाश स्रोत जो क्षेत्र पर एक चमक का उत्पादन करते हैं)।
सावधानी: पूर्ण व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनकर और यदि आवश्यक हो तो प्रयोगात्मक सेटअप को धूम हुड में ले जाकर खतरनाक रासायनिक समाधानों का उचित प्रबंधन करें। अपशिष्ट निपटान पर संघीय और राज्य के नियमों का पालन करें । - स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके अखाड़े के केंद्र की ओर एक प्लैनेरियन छोड़ दें। रिकॉर्डिंग शुरू करें। एक देशी फिजी31 प्रारूप (झगड़ा, जीआईएफ, जेपीईजी, पीएनजी, डीआईकॉम, बीएमपी, पीजीएम, या फिट्स) में छवि दृश्यों के रूप में डेटा रिकॉर्ड करें; छवि विश्लेषण अनुभाग 1.2 देखें।
नोट: क्योंकि व्यवहार और बाहरी उत्तेजनाओं के प्रति संवेदनशीलता व्यक्तिगत प्लैनेरियन के बीच भिन्न होती है, इसलिए तकनीकी प्रतिकृति प्रदर्शन के अलावा पर्याप्त रूप से बड़ी संख्या में जैविक प्रतिकृति पर डेटा एकत्र करना महत्वपूर्ण है। हमने एक बार में 100 मिमी पेट्री डिश में 10 मध्यम आकार (4-7 मिमी) प्लैनेरियन के साथ काम किया है। जबकि समय कुशल, पेट्री डिश में कई प्लैनियन एक बार में डेटा विश्लेषण को और अधिक कठिन बनाते हैं क्योंकि प्लैनेरियन रास्तों को पार कर सकते हैं।- ग्लाइडिंग प्रयोगों के लिए, कम से कम 1 फ्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) का उपयोग करके रिकॉर्ड करें। स्क्रंचिंग/पेरिस्टलसिस प्रयोगों के लिए, एफपीएस का उपयोग करके रिकॉर्ड करें जो प्लेनेरियन प्रजातियों की कम से दो बार स्क्रंचिंग/पेरिस्टलसिस आवृत्ति है । यदि प्लैनेरियन प्रजातियों में अज्ञात स्क्रंचिंग/पेरिस्टलसिस फ्रीक्वेंसी है, तो 10 एफपीएस को शुरुआती बिंदु के रूप में इस्तेमाल करें और उचित के रूप में वृद्धि/कमी करें ।
- रासायनिक समाधान का उपयोग करते समय, प्लैनेरियन पानी की कुछ बूंदों का उपयोग करके प्लैनेरियन को स्थानांतरित करें ताकि रासायनिक समाधान की एकाग्रता में काफी बदलाव न हो।
- ग्लाइडिंग प्रयोगों के लिए, ग्लाइडिंग व्यवहार के 1-2 मिनट रिकॉर्ड करें। स्क्रंचिंग/पेरिस्टलसिस प्रयोगों के लिए, एक सीधी रेखा में होने वाले कम से कम लगातार दोलनों को पकड़ने के लिए पर्याप्त समय तक रिकॉर्ड करें। प्रयोग पूरा होने के बाद, रिकॉर्डिंग समाप्त करें।
नोट: स्क्रंचिंग/पेरिस्टलसिस प्रयोगों के लिए, यदि कोई प्लैनेरियन एक निश्चित समय अवधि के भीतर समाप्ति मापदंड को संतुष्ट नहीं करता है जिसे प्रतिकृति के पार सुसंगत होने की आवश्यकता होती है और उत्तेजना के आधार पर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाता है, रिकॉर्डिंग समाप्त करें और एक और प्लैनेरियन का परीक्षण करें।- यदि प्लैनेरियन समाप्ति मापदंड को संतुष्ट किए बिना अखाड़े की सीमा तक पहुंचता है, तो प्लैनेरियन को वापस अखाड़े के केंद्र में पिपेट करें।
नोट: रिकॉर्डिंग के लिए किसी व्यक्ति की बार-बार पाइपिंग से बचें, क्योंकि इससे उसका व्यवहार बदल सकता है।
- यदि प्लैनेरियन समाप्ति मापदंड को संतुष्ट किए बिना अखाड़े की सीमा तक पहुंचता है, तो प्लैनेरियन को वापस अखाड़े के केंद्र में पिपेट करें।
- अखाड़े से प्लैनेरियन (एस) निकालें और उचित अपशिष्ट कंटेनरों में प्लैनेरियन पानी या रासायनिक समाधान का निपटान करें। प्लैनेरियन जो प्लैनेरियन पानी में थे, उन्हें उनके घर के कंटेनर में लौटाया जा सकता है।
नोट: विभिन्न मीडिया के लिए विभिन्न एरेनास का उपयोग करके क्रॉस संदूषण से बचें (यानी, प्लैनेरियन पानी प्रयोगों में ग्लाइडिंग को पहले रासायनिक एक्सपोजर के साथ स्क्रंचिंग/पेरिस्टलसिस प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले क्षेत्र में नहीं चलाया जाना चाहिए)।- किसी भी रसायन को अच्छी तरह से पतला करने के लिए 3 साफ 100 मिमी पेट्री व्यंजनों में रासायनिक समाधान के संपर्क में क्रमबद्ध रूप से कुल्ला। यदि स्क्रंचिंग या पेरिस्टलसिस को प्रेरित किया गया था, तो इन प्लानरियंस को एक अलग कंटेनर में रखें। प्लानेरियन एक महीने के बाद अपने घर के कंटेनर में वापस आ सकते हैं क्योंकि अधिकांश कोशिकाएं उस समय तक खत्म हो जाती हैं1।
नोट: यदि प्लानरियंस की एक ही आबादी के लिए कई अलग-अलग प्रयोगों की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए, आरएनएआई की आबादी के लिए, अगले प्रयोग को चलाने से पहले प्लैनेरियन को 24 घंटे तक ठीक होने की अनुमति दें। प्रयोगों को इस तरह ऑर्डर करें कि सबसे कम आक्रामक प्रयोग पहला है और सबसे आक्रामक प्रयोग (जैसे, विच्छेदन) पिछले चलाया जाता है। - यदि एक ही क्षेत्र में कई प्रयोगों चल रहा है, ठीक से स्नान समाधान के निपटान और रन के बीच एक कागज तौलिया के साथ नीचे क्षेत्र पोंछते द्वारा किसी भी बलगम ट्रेल्स को दूर ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
- किसी भी रसायन को अच्छी तरह से पतला करने के लिए 3 साफ 100 मिमी पेट्री व्यंजनों में रासायनिक समाधान के संपर्क में क्रमबद्ध रूप से कुल्ला। यदि स्क्रंचिंग या पेरिस्टलसिस को प्रेरित किया गया था, तो इन प्लानरियंस को एक अलग कंटेनर में रखें। प्लानेरियन एक महीने के बाद अपने घर के कंटेनर में वापस आ सकते हैं क्योंकि अधिकांश कोशिकाएं उस समय तक खत्म हो जाती हैं1।
- एक सपाट सतह पर एक मंद एलईडी पैनल रखें। एलईडी पैनल दो उद्देश्यों में कार्य करता है: (1) एक समान सफेद पृष्ठभूमि प्रदान करने के लिए और (2) उचित विपरीत प्राप्त करने के लिए एक समायोज्य प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जाना है। एलईडी पैनल पर 100 एमएम पेट्री डिश एरिना रखें।
- प्लानेरियन व्यवहार का मात्रात्मक विश्लेषण
- धारा 1.1 में वर्णित प्लैनेरियन व्यवहार परख करें।
- फिजी में एक प्रयोग के लिए कच्चे छवि अनुक्रम को खोलें(फाइल और जीटी; आयात और जीटी; इमेज सीक्वेंस)और छवि अनुक्रम में पहली छवि का चयन करें। अनुक्रम विकल्प विंडो में, "संख्यानुसार नामों को सॉर्ट करें" के लिए बॉक्स की जांच करें और "ओके" पर क्लिक करें। एक बार जब इमेज सीक्वेंस लोड हो जाता है, तो इमेज सीक्वेंस को 8-बिट(इमेज एंड जीटी; टाइप एंड 8-बिट)में परिवर्तित करें और इमेज सीक्वेंस के माध्यम से देखने या पैन करने के लिए इमेज स्टैक के नीचे एरो टूल या स्लाइडर का उपयोग करें।
नोट: ग्लाइडिंग प्रयोगों के लिए, सभी डेटा का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक कि प्लानेरियन को रिकॉर्डिंग के दौरान स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। हालांकि, यह आमतौर पर नीचे वर्णित प्रासंगिक भाग (ओं) को निकालकर क्षेत्र के केंद्र में मुक्त गति का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त होता है। - एक समय अवधि और ब्याज के क्षेत्र को निकालने के लिए, आयत उपकरण(चित्रा 2ए, 2B)का उपयोग करके एक प्लानेरियन का पूरा रास्ता शामिल ब्याज का एक क्षेत्र आकर्षित करें। इमेज स्टैक पर सही क्लिक करें और डुप्लिकेटचुनें ..., डुप्लिकेट स्टैकके लिए बॉक्स की जांच करें, ब्याज के अनुक्रम के पहले और आखिरी फ्रेम दर्ज करें, और ठीक क्लिककरें। यदि कई प्लैनेरियन एक साथ इमेज किए गए थे, तो इस क्षेत्र के चयन और क्षेत्र में प्रत्येक प्लैनेरियन के लिए दोहराव कदम दोहराएं ताकि क्षेत्र में प्लैनियन के रूप में कई खुली छवि ढेर हों। निम्नलिखित चरण (चरण 1.2.4-1.2.10) प्रत्येक छवि स्टैक पर किया जाना चाहिए, एक समय में एक।
- ग्लाइडिंग प्रयोगों के लिए, ग्लाइडिंग की अवधि निकालें जहां प्लैनेरियन अपने शरीर की लंबाई से कम से दो गुना आगे बढ़ता है।
नोट: प्रति प्लैनेरियन जितना अधिक ग्लाइडिंग डेटा निकाला जाएगा, डेटा उतना ही विश्वसनीय होगा। प्लैनेरियन को ग्लाइडिंग विश्लेषण के लिए सीधी रेखा में जाने की आवश्यकता नहीं है। - स्क्रंचिंग/पेरिस्टलसिस प्रयोगों के लिए, एक उदाहरण निकालें जब प्लानेरियन एक सीधी रेखा में लगातार तीन (आदर्श रूप से अधिक) शरीर दोलन से गुजरता है, यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक दोलन एक पूर्ण विस्तार-संकुचन चक्र है, क्योंकि आवृत्ति को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए पूर्ण दोलन आवश्यक हैं।
नोट: जितना अधिक दोलन निकाले जा सकते हैं, डेटा उतना ही विश्वसनीय होगा। उन दृश्यों का उपयोग न करें जहां प्लैनेरियन बदल रहा है क्योंकि इनके परिणामस्वरूप गलत लंबाई माप होगी।
- ग्लाइडिंग प्रयोगों के लिए, ग्लाइडिंग की अवधि निकालें जहां प्लैनेरियन अपने शरीर की लंबाई से कम से दो गुना आगे बढ़ता है।
- छवि को बाइनरी करने और पृष्ठभूमि से प्लानेरियन निकालने के लिए डुप्लिकेट इमेज स्टैक(इमेज एंड जीटी; एडजस्ट करें और थ्रेसहोल्ड)पर एक सीमा लागू करें। स्लाइडिंग बार को आवश्यक रूप से समायोजित करें ताकि पूरे प्लानेरियन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाए। सटीक मान इमेजिंग गुणवत्ता पर निर्भर हैं। डार्क बैकग्राउंड, स्टैक हिस्टोग्रामके लिए बक्से छोड़ दें, और अनियंत्रित रेंज को रीसेट न करें। एक अच्छी सीमा सीमा सुनिश्चित करने के लिए छवि स्टैक के माध्यम से स्क्रॉल करें (यानी, प्लैनेरियन पूरे स्टैक में पृष्ठभूमि से अच्छी तरह से अलग है), और फिर आवेदन पर क्लिक करें।
- कैनरी विंडो में कन्वर्ट स्टैक में, विधि को डिफ़ॉल्ट और पृष्ठभूमि को प्रकाश में सेट करें। इस खिड़की में सभी बक्से अनियंत्रित और फिर ठीकक्लिक करें । एक सफेद पृष्ठभूमि पर एक काले प्लैनेरियन दिखाने वाली एक बिनारिजेड छवि दिखाईदेगी (चित्रा 2C)। सुनिश्चित करें कि पूरे प्लैनेरियन छवि अनुक्रम के सभी फ्रेम में दिखाई दे रहा है।
नोट: बिनारिज्ड इमेज सीक्वेंस में अवांछित वस्तुएं जो प्लानेरियन से छोटी या बड़ी हैं, उन्हें आकार फ़िल्टर(चित्रा 2Ciii)का उपयोग करके बाद के विश्लेषण में फ़िल्टर किया जा सकता है। - विश्लेषण और जीटी सेट मापपर क्लिक करके माप निर्धारित करें । क्षेत्र,द्रव्यमान केंद्र, स्टैक स्थिति,और फिट एलिप्स और क्लिक ओके केलिए बक्से की जांच करें।
नोट: इन मापदंडों को केवल फिजी सत्र के अनुसार एक बार निर्धारित करने की आवश्यकता है। - खुली छवि स्टैक का चयन करें और विश्लेषण और जीटी का विश्लेषण करें; कणों का विश्लेषण करें।
- विश्लेषण कण खिड़की में, चुने हुए मापदंडों के साथ पता लगाए गए सभी वस्तुओं को दिखाने वाले एक नए स्टैक को खोलने के लिए शो एंड जीटी; मास्क का चयन करें। इसका उपयोग नेत्रहीन जांचने के लिए किया जा सकता है कि केवल प्लैनेरियन का माप लिया जा रहा है। प्रदान की गई जगह में प्लानेरियन (पिक्सेल2 इकाइयों में) के अनुमानित क्षेत्र में प्रवेश करके अवांछित शोर को हटाने के लिए इस चरण में एक आकार फ़िल्टर सेट किया जा सकता है। प्रदर्शन परिणामों और स्पष्ट परिणामों के लिए बक्से की जांच करें और ठीक क्लिककरें ।
नोट: परिणाम विंडो में, यदि इंडेक्स (पहला कॉलम) सभी पंक्तियों के लिए स्लाइस संख्या के बराबर नहीं है, तो इसका मतलब है कि या तो बहुत अधिक या बहुत कम वस्तुओं को ट्रैक किया गया था। इस विसंगति के लिए एक संभावना प्लानेरियन के अलावा अन्य वस्तुओं की उपस्थिति है या कि प्लानेरियन को विशिष्ट फ्रेम में ट्रैक नहीं किया गया था। - पैनल के नीचे स्लाइडर का उपयोग कर मुखौटा छवि ढेर के माध्यम से पैन। यदि कोई शोर है या ऐसे फ्रेम हैं जिनमें प्लैनेरियन की कमी है, तो परिणाम खिड़की और मुखौटा छवि स्टैक को बंद करें। केवल प्लानेरियन के अलावा अन्य वस्तुओं को हटाने के लिए क्षेत्र फ़िल्टर को समायोजित करके चरण 1.2.7-1.2.8 दोहराएं।
नोट: यदि प्लैनेरियन मुखौटा में फ्रेम से गायब है, तो इससे पता चलता है कि क्षेत्र फिल्टर की निचली बाउंड बहुत अधिक सेट की गई थी। - परिणाम खिड़की पर, फ़ाइल और जीटी का उपयोग कर डेटा सहेजें; के रूप में बचाओ। कॉमा-अलग मान के रूप में डेटा को सहेजने के लिए फाइलनाम में .csv एक्सटेंशन जोड़ें। एक बार छवि स्टैक के लिए डेटा सहेजे जाने के बाद, संबंधित छवि स्टैक और परिणाम और मास्क खिड़कियां बंद करें।
- डेटा आयात करें और आगे किसी भी स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर या फ्रीवेयर का उपयोग करके विश्लेषण करें। ग्लाइडिंग गति की गणना करने के लिए, धारा 1.3 का उल्लेख करें। स्क्रंचिंग/पर्सीस्टलसिस पूर्ण पैरामीटर सेट की गणना करने के लिए, धारा 1.4 का उल्लेख करें।
नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । - वास्तविक लंबाई रूपांतरण के लिए पिक्सेल निर्धारित करने के लिए, फिजी में संदर्भ लंबाई (उदाहरण के लिए, क्षेत्र का व्यास) के साथ एक छवि खोलें। लाइन टूल का चयन करें और ज्ञात लंबाई पर एक लाइन खींचें।
- पिक्सल यूनिट्स को एनालिसिक और जीटी सेट स्केलपर क्लिक करके लंबाई की मानक इकाई में परिवर्तित करें । ज्ञात दूरी बॉक्स में छवि पर खींची गई रेखा के अनुरूप लंबाई दर्ज करें और लंबाई की चुनी हुई मानक इकाई में पिक्सेल से लंबाई की इकाई को बदलें। रूपांतरण कारक स्केलके बगल में लिखा गया है ।
नोट: सेक्शन 1.3 और 1.4 में ग्लाइडिंग या स्क्रंचिंग/पेरिस्टलसिस विश्लेषण के लिए पिक्सेल रूपांतरण मूल्य की आवश्यकता नहीं है।
- ग्लाइडिंग गति की गणना
- धारा 1.2 में सहेजे गए डेटा फ़ाइल का उपयोग करके, केंद्र द्रव्यमान (कॉम) एक्स और वाई निर्देशांक और प्रमुख अक्ष डेटा लोड करें। यदि डेटा को कॉमा-अलग मूल्य फ़ाइल के रूप में सहेजा जाता है, तो ये सूचियां क्रमशः "एक्सएम", "वाईएम", और "मेजर" कॉलम के अनुरूप हैं।
- "एक्सएम" और "वाईएम" डेटा कॉलम का उपयोग करके अगले फ्रेम के संबंध में प्रत्येक फ्रेम के लिए पिक्सेल में द्रव्यमान के प्लानेरियन केंद्र के विस्थापन (डी) की गणना करें। विस्थापन (घ) द्वारा दिया जाता है:
जहां x1 और वाई1 एक फ्रेम के कॉम निर्देशांक (एक्सएम, वाईएम) और एक्स2 और वाई2 को संदर्भित करते हैं, बाद के फ्रेम के कॉम निर्देशांक (एक्सएम, वाईएम) को संदर्भित करते हैं। - "मेजर" कॉलम के 95 वें शतमक के रूप मेंप्लैनेरियन बॉडी लेंथ सेट करें। चूंकि प्लानेरियन दीवार की वरीयता व्यवहार32प्रदर्शित करते हैं , इसलिए यह सुनिश्चित करता है कि जब प्लानेरियन24लम्बी हो जाती है तो गणना की गई प्लैनेरियन बॉडी की लंबाई का प्रतिनिधि होता है ।
- प्लेनेरियन बॉडी लेंथ (एल)द्वारा प्रति फ्रेम पिक्सेल विस्थापन को विभाजित करके प्लानेरियन बॉडी लेंथ द्वारा विस्थापन को सामान्य बनाएं। सामान्यीकृत विस्थापन (डीएन) द्वारा दिया जाता है:
- प्रति फ्रेम (दर्ज एफपीएस के विलोम) द्वारा सामान्यीकृत विस्थापन को विभाजित करके सामान्यीकृत गति की एक सूची उत्पन्न करें। सामान्यीकृत ग्लाइडिंग गति (एसएन) द्वारा दी गई है:
- सामान्यीकृत गति सूची (एसएन)का औसत लेकर प्लानेरियन की सामान्यीकृत ग्लाइडिंग गति की गणना करें । मानक विचलन का उपयोग प्लैनेरियन के लिए अनिश्चितता माप के रूप में किया जा सकता है।
- प्रत्येक प्लानेरियन का विश्लेषण करने के लिए 1.3.1-1.3.6 चरणों को दोहराएं। औसत और सभी प्लैनेरियन के लिए ग्लाइडिंग गति के मानक विचलन लेने के लिए ग्लाइडिंग गति और संबद्ध अनिश्चितता, क्रमशः, एक planarian आबादी के लिए मिलता है ।
- पूर्ण पैरामीटर सेट का उपयोग करके स्क्रंचिंग और पेरिस्टलसिस गेट्स का अंतर
- धारा 1.2 से सहेजी गई डेटा फ़ाइल से प्रमुख एक्सिस डेटा सूची लोड करें। यदि डेटा को कॉमा-अलग मान फ़ाइल के रूप में सहेजा जाता है, तो यह प्रमुख कॉलम से मेल खाता है।
- एक सूची बनाएं जो प्रमुख कॉलम में प्रत्येक डेटा बिंदु को नंबर दें, जो 0से शुरू होता है। इस सूची को दर्ज एफपीएस द्वारा विभाजित करके प्रति फ्रेम बीता समय में परिवर्तित करें।
- एक स्क्रंचिंग/पेरिस्टलसिस दोलन साजिश(चित्रा 3 ए)उत्पन्न करने के लिए बीता समय के संबंध में प्रमुख कॉलम डेटा प्लॉट करें । दोलन साजिश का उपयोग करना, डेटा को कम से कम लगातार तीन, सीधी-लाइन दोलन(चित्रा 3Bi)में ट्रिम करें। स्थानीय चोटियों (दोलन की अधिकतम विस्तार) या गर्त (दोलन की न्यूनतम विस्तार) पर शुरू और समाप्त करने के लिए डेटा को ट्रिम करें।
नोट: यदि स्थानीय छोर लगभग बराबर नहीं है (चोटियों/गर्त ऊंचाइयों में नाटकीय रूप से अलग है), यह पता चलता है कि दोलन सीधे लाइन(चित्रा 3Bii)नहीं हैं । कम से कम तीन लगातार, सीधे लाइन दोलनों का एक और अनुक्रम निकालें। धारा 1.2 का उल्लेख करें। - पुष्टि करें कि ब्याज के दोलन अनुक्रम को निकाला गया है और समय के संबंध में छंटनी किए गए प्रमुख डेटा को पुनर्प्रांत करके ठीक से छंटनी की गई है। बाद की सभी गणनाओं के लिए इस छंटनी की गई डेटा सूची का उपयोग करें।
- दोलन आवृत्ति (एम)mकी गणना करने के लिए, छंटनी की गई प्रमुख धुरी डेटा सूची (एन) में डेटा बिंदुओं की कुल संख्या के द्वारा दोलनों (ओ एन)की संख्या को विभाजित करें। प्रति सेकंड दोलनों में आवृत्ति प्राप्त करने के लिए इस मूल्य से एफपीएस गुणा करें।
- अधिकतम विस्तार की गणना करने के लिए (. अधिकतम), निरपेक्ष अधिकतम बॉडी लेंथ (एल मैक्स) से निरपेक्ष न्यूनतम बॉडी लेंथ max(एल मिनट) घटाना . शरीर की पूर्ण अधिकतम लंबाई से विभाजित करके शरीर की लंबाई को बढ़ाने के लिए सामान्य करें।
- प्रति शरीर की लंबाई(वी*मी)*गति की गणना करने के लिए, दोलन आवृत्ति द्वारा गणना की गई अधिकतम विस्तार को गुणा करें।
नोट: अकेले स्पीड का उपयोग स्क्रंचिंग और पेरिस्टलसिस गैट्स7के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकता है। - लम्बी (एफelong)खर्च समय के अंश की गणना करने के लिए, समय के संबंध में छंटनी की प्रमुख धुरी डेटा सूची के व्युत्पन्न ले लो । प्रमुख एक्सिस डेटा सूची(एनटी)में डेटा बिंदुओं की कुल संख्या के द्वारा सकारात्मक डेटा बिंदुओं (यानी, जब व्युत्पन्न है >0 (np)की संख्या को विभाजित करें।
नोट: स्क्रंचिंग प्लानरियन समय का एक असममित अंश प्रदर्शित करते हैं जबकि पेरिस्टलसिस का प्रदर्शन करने वाले प्लानर7को बढ़ाने और अनुबंध करने में समान मात्रा में समय बिताते हैं । - प्रत्येक प्लानेरियन का विश्लेषण करने के लिए 1.4.1-1.4.8 चरणों को दोहराएं। प्रत्येक पैरामीटर के औसत और मानक विचलन को लेकर निर्धारित एक प्लैनेरियन जनसंख्या पैरामीटर की गणना करें।
नोट: पैरामीटर सेट का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि आदोलन व्यवहार आवधिक शरीर के आकार में परिवर्तन के साथ स्क्रंचिंग, पेरिस्टलसिस या लोकोमोशन के कुछ अन्य रूप है या नहीं। स्क्रंचिंग और पर्सिस्टलसिस दोनों में किसी दी गई प्रजाति के लिए पैरामीटर तय किए जाते हैं.7 हालांकि यह संभव है कि एक पैरामीटर प्रजातियों-विशिष्ट सीमा के बाहर गिर सकता है, जैसा कि हमने पहले रासायनिक प्रेरण28के साथ देखा है, मनाया गया व्यवहार 4 प्रकाशित मापदंडों में से कम से कम 3 से सहमत होना चाहिए ताकि या तो पेरिस्टलसिस या स्क्रंचिंग के रूप में वर्गीकृत किया जा सके।
2. स्क्रंचिंग इंडक्शन
- शारीरिक उत्तेजनाओं (हानिकारक तापमान, यूवी प्रकाश, विच्छेदन)
- सभी भौतिक उत्तेजनाओं के प्रयोगों के लिए, प्रायोगिक सेटअप के लिए धारा 1.1 का उल्लेख करें।
नोट: यह सबसे अच्छा है इस तरह के एक बड़े क्षेत्र का उपयोग करें, जैसे एक १०० मिमी पेट्री पकवान, शारीरिक उत्तेजनाओं प्रयोगों के लिए एक पिपेट और/ - हानिकारक तापमान के माध्यम से स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए, एक ग्लास बीकर में हीट प्लानेरियन पानी (परीक्षण किए जाने के लिए कम से कम 100 माइक्रोन प्रति प्लैनियन) गर्म प्लेट पर 65 डिग्री सेल्सियस तक।
- अखाड़े के केंद्र में एक प्लैनेरियन रखें। जब तक प्लैनेरियन खुद को सीधा ओरिएंट नहीं करता और ग्लाइडिंग शुरू नहीं करता है तब तक प्रतीक्षा करें। रिकॉर्डिंग शुरू करें।
- पी-200 पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए प्लैनेरियन के पूंछ के अंत पर 65 डिग्री सेल्सियस प्लैनेरियन वॉटर पोस्ट-फरेंगेली के 100 माइक्रोन को पिपेट करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि गर्म प्लैनेरियन पानी 65 डिग्री सेल्सियस पर रहता है। यदि आवश्यक हो, तो एक और प्रयोग शुरू करने से पहले पानी को 65 डिग्री सेल्सियस तक फिर से गरम करें। चूंकि दबाव स्क्रंचिंग को भी प्रेरित कर सकता है, इसलिए धीमी गति से पाइपिंग आवश्यक है। पाइपिंग रूम तापमान पानी उसी तरह से प्रयोग में एक नियंत्रण और अभ्यास विकल्प के रूप में काम कर सकते हैं। - एक बार स्क्रंचिंग बंद हो जाने के बाद रिकॉर्डिंग बंद कर दें। एक वसूली कंटेनर में planarian प्लेस और ताजा, कमरे के तापमान planarian पानी के साथ पेट्री डिश में मीडिया का आदान प्रदान अगर अधिक प्रयोग चल रहा है ।
- विच्छेदन के माध्यम से स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए, एक प्लैनेरियन को अखाड़े के केंद्र में स्थानांतरित करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि प्लैनेरियन खुद को सीधा न कर ले और ग्लाइडिंग शुरू न हो जाए। रिकॉर्डिंग शुरू करें।
- एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करके प्लैनेरियन को काटना। जब तक कटौती स्थान प्रयोगों में सुसंगत है तब तक प्लैनेरियन के साथ कहीं भी विच्छेदन किया जा सकता है।
नोट: स्क्रंचिंग पैरामीटर पूर्वकाल टुकड़े से निकाले जाते हैं। इस प्रकार, पीछे के अंत से आ कर कटौती लागू करते समय प्लैनेरियन के इस हिस्से के कैमरे के दृश्य में बाधा डालने से बचें। प्लास्टिक कवर स्लिप भी काटने के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं और विशेष रूप से शिक्षण सेटिंग में एक सुरक्षित विकल्प हैं। - एक बार पूर्वकाल टुकड़ा स्क्रंचिंग बंद कर दिया है रिकॉर्डिंग बंद करो । दोनों टुकड़ों को निकालें, उन्हें एक अलग कंटेनर में रखें और उन्हें 7 दिनों के लिए पुनर्जीवित करने की अनुमति दें। विच्छेदित प्लैनेरियन को एक बार पुनर्जीवित होने के बाद घर के कंटेनर में फिर से शामिल किया जा सकता है।
- एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करके प्लैनेरियन को काटना। जब तक कटौती स्थान प्रयोगों में सुसंगत है तब तक प्लैनेरियन के साथ कहीं भी विच्छेदन किया जा सकता है।
- निकट-यूवी प्रकाश का उपयोग करके स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए, कैमरे के लेंस पर उपयुक्त फ़िल्टर (जैसे, रोस्कोलक्स फ़िल्टर) संलग्न करें ताकि कैमरे द्वारा एकत्र की गई नियर-यूवी लाइट की मात्रा को कम किया जा सके और प्लैनेरियन की प्रतिक्रिया इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकते हैं। नीचे से अखाड़ा रोशन करने के लिए एलईडी पैनल का उपयोग करने के बजाय, परिवेश लाल प्रकाश का उपयोग करें, जिसके लिए प्लैनियन असंवेदनशील33हैं।
- प्लैनेरियन पानी के साथ 100 मिमी पेट्री डिश एरिना भरें और अखाड़े के केंद्र में एक एकल प्लैनेरियन (5-9 मिमी) रखें। 10 एफपीएस पर रिकॉर्डिंग शुरू करें।
- एक वर्ग द्वितीय यूवी लेजर सूचक (405 ± 10 एनएम, उत्पादन शक्ति और एलटी;5 एमडब्ल्यू) क्षेत्र से लगभग 30 सेमी पकड़ो। ग्लाइडिंग प्लानेरियन से 45 डिग्री कोण पर लेजर पॉइंटर की स्थिति रखें और फिर स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए फरीनेक्स और पूंछ टिप के पीछे के छोर के बीच आधे रास्ते में 5-10 सेकंड के लिए लेजर पॉइंटर चमकें।
नोट: लेजर सूचक की शक्ति एक के पास यूवी संवेदनशील बिजली मीटर का उपयोग कर मापा जा सकता है । - प्रतिक्रिया की प्रजनन क्षमता के लिए परीक्षण करने के लिए एक ही व्यक्ति पर दो और उत्तेजनाओं का प्रयास करने से पहले फिर से ग्लाइडिंग शुरू करने के लिए प्लैनेरियन की प्रतीक्षा करें। यदि प्लैनेरियन एक ही व्यवहार दिखाता रहता है, तो रिकॉर्डिंग बंद कर दें और प्लैनेरियन को अपने कंटेनर में वापस डाल दें। यदि उत्तेजनाओं के बीच व्यवहार बदलता है, तो अतिरिक्त परीक्षण ों से पता चलेगा कि कौन सी प्रतिक्रिया सबसे प्रमुख है।
नोट: Planarians के पास यूवी प्रकाश के लिए असंवेदनशील हो सकता है और प्रतिक्रिया बंद हो जाएगा । लगातार उत्तेजना 8-10 सेकंड की एक आराम अवधि की आवश्यकता होती है।
- सभी भौतिक उत्तेजनाओं के प्रयोगों के लिए, प्रायोगिक सेटअप के लिए धारा 1.1 का उल्लेख करें।
- रासायनिक उत्तेजना (एआईटीसी)
- एक रसायन का उपयोग कर स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए, उदाहरण के लिए, TRPA1 एगोनिस्ट एआईटीसी28,प्लानरियंस आदर्श रूप से रसायन के स्नान में डूबे हुए हैं। यदि आवश्यक हो, तो धारा 2.1.2.3 में वर्णित पाइपिंग लागू की जा सकती है।
सावधानी: एआईटीसी ज्वलनशील, तीव्रता से विषाक्त है, त्वचा और आंखों में जलन, श्वसन और त्वचा संवेदीकरण का कारण बन सकता है, और जलीय जीवन के लिए खतरनाक है। एआईटीसी तेल को धूम हुड में संभाला जाना चाहिए। एआईटीसी के स्टॉक समाधान बनाने से पहले, उपयुक्त पीपीई (नाइट्रिल दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट) पर डाल दिया और उचित ठोस और तरल खतरनाक अपशिष्ट निपटान कंटेनर स्थापित करें। - एक धुएं हुड में, 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में प्लानेरियन पानी में एआईटीसी का 10 एमएमएम स्टॉक समाधान करें। यह स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर एक महीने तक उपयोग करने योग्य है।
- इस स्टॉक से 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में प्लैनेरियन वाटर में 100 माइक्रोन एआईटीसी का 25 एमएल वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें। इस 100 माइक्रोन एआईटीसी समाधान का उपयोग प्लैनेरियन में स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए किया जाएगा।
नोट: १०० μM AITC डी japonica और एस ध्यानी planarians28में लगातार स्क्रंचिंग लाती है । अन्य जलीय प्लैनेरियन के लिए, 100 माइक्रोन एक प्रारंभिक एकाग्रता के रूप में काम कर सकते हैं और तदनुसार समायोजित किया जा सकता है। - प्रायोगिक सेटअप सेट करें (धारा 1.1 को देखें)। एआईटीसी वर्किंग सॉल्यूशन के साथ अखाड़ा भरें और इसे एक माध्यमिक कंटेनर में रखें। माध्यमिक कंटेनर को अखाड़े की मात्रा कम से कम दो गुना पकड़ना चाहिए।
नोट: अतिरिक्त सुरक्षा के लिए एक धूम हुड के अंदर प्रयोग किए जा सकते हैं। - अखाड़े के केंद्र में 10 प्लैनेरियन तक स्थानांतरित करें और रिकॉर्डिंग शुरू करें।
- एक बार जब प्लानरियन असंवेदनशील हो जाते हैं और स्क्रंचिंग बंद कर देते हैं, तो रिकॉर्डिंग बंद कर दें। एआईटीसी समाधान से प्लानरियंस को निकालें और कुल्ला (धारा 1.1 को देखें)। उचित अपशिष्ट कंटेनरों में ठोस और तरल एआईटीसी कचरे का निपटान करें।
- मानक प्रोटोकॉल के बाद टीआरपीए128 को आरएनएआई का उपयोग करके एआईटीसी की प्रतिक्रिया की विशिष्टता को सत्यापित करें।
- इस स्टॉक से 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में प्लैनेरियन वाटर में 100 माइक्रोन एआईटीसी का 25 एमएल वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें। इस 100 माइक्रोन एआईटीसी समाधान का उपयोग प्लैनेरियन में स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए किया जाएगा।
- एक रसायन का उपयोग कर स्क्रंचिंग को प्रेरित करने के लिए, उदाहरण के लिए, TRPA1 एगोनिस्ट एआईटीसी28,प्लानरियंस आदर्श रूप से रसायन के स्नान में डूबे हुए हैं। यदि आवश्यक हो, तो धारा 2.1.2.3 में वर्णित पाइपिंग लागू की जा सकती है।
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Representative Results
एस ध्यानी प्लैनेरियन्स में एक्सट्राकुलर नियर-यूवी धारणा TRPA1-निर्भर है और इसे एच2ओ2 रिलीज17से लिंक करने का प्रस्ताव किया गया है । क्योंकि एच2ओ2 एक्सपोजर एस ध्यानी और डी जैपोनिका प्लानेरियन्स28में TRPA1-निर्भर स्क्रंचिंग को प्रेरित करता है, धारा 2.1.4 में कदम का उपयोग यह परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है कि क्या लगभग-यूवी प्रकाश एक्सपोजर दोनों प्रजातियों में स्क्रूनिंग को प्रेरित करता है। जबकि डी japonica planarians स्क्रंच (10/10) जब पास-यूवी प्रकाश के संपर्क में, एस ध्यानी planarians या तो पूंछ पतला प्रदर्शन (7/10) के रूप में पहले17 या कोई प्रतिक्रिया (3/10)(चित्रा 4A, 4B)वर्णित है । डी जैपोनिका प्लानरियंस के लिए धारा 1.4 में उल्लिखित स्क्रंचिंग मापदंडों का एक परिमाण, जो कम से कम लगातार 3 सीधी-रेखा स्क्रंच प्रदर्शित करता है, इस प्रजाति के लिए विशेषता स्क्रंचिंग मापदंडों का पता चलता है7,,28 (एम = 0.84 ± 0.14, । इसके बादसे ही दोनों के बीच ताने-को अधिकतम = 0.56 ± 0.06, वी*मीटर = 0.47 ± 0.07, और एफ elong = 0.56 ± 0.03, मूल्यों के मतलब के रूप में रिपोर्ट ± N = 7 के लिए मानक विचलन)..
इसके विपरीत, चूहों34में एक ज्ञात TRPA1 एगोनिस्ट 250 माइक्रोन मिलियन सिनेमल्डिहाइड के संपर्क में, एस मेडिटेरेरिया7,,28 m (0.46 ± 0.08 में स्क्रंचिंग का कारण बनता है, । इसके बादसे ही दोनों के बीच ताने-को अधिकतम = 0.36 ± 0.08, v*m = 0.16 ± 0.04, और एफFigure 5A elong = 0.58 ± 0.04, मूल्यों एन = 8 के लिए मतलब n ± मानक विचलन के रूप में रिपोर्ट)(चित्रा 5A), जबकि डी japonica planarians एक ही (और 1.6x. एकाग्रता) सांप की तरह और दोलन गति का मिश्रण प्रदर्शित, ग्लाइडिंग और/ कम से कम तीन लगातार दोलनों वाले नमूनों का मात्राकरण इस प्रजाति में स्क्रंचिंग के लिए उम्मीद से 4 में से 3 मापदंडों के लिए काफी कम मूल्य पैदा करता हैm (0.43 ± 0.08, । इसके बादसे ही दोनों के बीच ताने-को अधिकतम = 0.39 ± 0.03, v*m = 0.17 ± 0.02, और एफ elong = 0.54 ± 0.06, मूल्यों के मतलब के रूप में रिपोर्ट ± N = 8) । इस प्रकार, जबकि डी जैपोनिका सिनामाल्डिहाइड एक्सपोजर पर स्क्रंच करते दिखाई देते हैं, इस प्रजाति के लिए साहित्य मूल्यों के साथ गणना किए गए मापदंडों की तुलना7,,28 से पता चलता है कि मनाया गया आदोलनीय गति स्क्रंचिंग नहीं है। यह उदाहरण कच्चे व्यवहार डेटा के सावधानीपूर्वक निरीक्षण के साथ मात्रात्मक माप के महत्व पर प्रकाश डालता है ताकि अवलोकन व्यवहारों की ठीक से व्याख्या की जा सके।
आरएनएआई एस ध्यानी में सिनेमाल्डिहाइड एक्सपोजर के जवाब में स्क्रंचिंग की विशिष्टता की पुष्टि करता है। प्लैनेरियन वॉटर 15/15 unc22 (नियंत्रण)आरएनएआई एस में 250 μM cinnamaldehyde के संपर्क में आने के 180 सेकंड के भीतर। ध्यान सेन्धनियन प्लानरियंस को कुचल दिया गया, जबकि 0/16 SmTRPA1 RNAi planarians स्क्रंच(चित्रा 5B),यह प्रदर्शित करता है कि सिनामाल्डिहाइड में एस ध्यान में स्क्रंचिंग को SmTRPA1 की आवश्यकता होती है । SmTRPA1 के नॉकआउट की पुष्टि 100 माइक्रोन एआईटीसी बाथ28के 60 सेकंड के एक्सपोजर के माध्यम से की गई थी।
चित्रा 1: प्लानेरियन व्यवहार प्रायोगिक सेटअप।
(ए)प्लानेरियन व्यवहार का अध्ययन करने के लिए नमूना प्रयोगात्मक सेटअप। (ख)100 एमएम पेट्री डिश एरिना कैमरे के दृश्य के क्षेत्र में केंद्रित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2: क्षेत्र में प्लैनेरियन के फिजी छवि विश्लेषण के प्रतिनिधि उदाहरण।
(क)पीले आयत द्वारा इंगित पूर्ण प्लैनेरियन पथ को शामिल करते हुए ब्याज का चयनित क्षेत्र। (ख)दोहराव के बाद ब्याज के क्षेत्र से नमूना फ्रेम। (ग)पृष्ठभूमि और शोर से प्लानेरियन को थ्रेसहोल्डिंग के माध्यम से घटाना(i)शोर के साथ प्लैनेरियन की 8-बिट छवि, तारक द्वारा दर्शाया गया है। (ii)थ्रेसिंग के बाद प्लानेरियन की बिनारिज्ड छवि। 3शोर हटाने के लिए आकार से फ़िल्टरिंग सेट करने के बाद प्लानेरियन का मुखौटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: समय के संबंध में प्लैनेरियन लंबाई की साजिश रचने ।
(A)प्लैनेरियन लेंथ बनाम टाइम का कच्चा प्लॉट एक स्क्रंचिंग एस ध्यानी प्लैनेरियन के लिए । तारक एक पल को दर्शाता है जब प्लैनियन स्क्रंचिंग करते समय बदल गया । (ख)स्क्रंचिंग डेटा को ट्रिम करने के संभावित तरीके । (i)एक सही ढंग से छंटनी की साजिश है कि मोड़ घटना डेटा निकालता है । (ii)एक गलत तरीके से छंटनी की गई साजिश जो टर्निंग इवेंट डेटा को नहीं हटाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: पास-यूवी प्रकाश के लिए प्रजातियों विशिष्ट प्रतिक्रियाएं।
(A)डी जैपोनिका स्क्रंचिंग और एस ध्यानी पूंछ के नमूना फ्रेम निकट-यूवी प्रकाश के जवाब में पतला । (ख)निकट-यूवी लाइट के जवाब में एस ध्यान और डी जैपोनिका के प्रतिनिधि दोलन भूखंड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: 250 माइक्रोन एम सिनामाल्डिहाइड, एक TRPA1 agonist के लिए विशिष्ट प्रतिक्रिया प्रजातियों।
(A) डी जैपोनिका और एस ध्यानी प्लैनेरियन के लिए 250 माइक्रोन मिलियन बाथ में प्रतिनिधि दोलन भूखंड। (ख)प्रतिनिधि दोलन भूखंड smTRPA1 RNAi एस ध्यानी planarians में २५० μM cinnamaldehyde में स्क्रंचिंग के नुकसान दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कोई भी मात्रात्मक रूप से भौतिक और रासायनिक उत्तेजनाओं7,28, 29,या आनुवंशिक हेरफेर (आरएनएआई),28, 29,पर प्लैनेरियन लोकोमोशन केप्रभावों का अध्ययन कर सकता है।29 स्थानिक संकल्प को अधिकतम करने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए पूरे क्षेत्र को देखने के क्षेत्र में है, जबकि क्षेत्र के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में कैमरे को स्थानांतरित करने के लिए सबसे अच्छा है । थ्रूपुट बढ़ाने के लिए, कई प्लैनेरियन के व्यवहार को एक साथ कई प्लैनेरियन रिकॉर्ड करके एक बार में जांच की जा सकती है। एक ही क्षेत्र में एक से अधिक प्लैनेरियन स्क्रीनिंग करते समय, फिजी में व्यक्तिगत प्लैनेरियन को अलग करने के लिए रुचि के क्षेत्रों को खींचा जा सकता है जैसा कि यहां वर्णित है या अधिक उन्नत बहु-वस्तु ट्रैकिंग को नियोजित किया जा सकता है। एक ही क्षेत्र में कई planarians होने के साथ एक मुद्दा यह है कि वे रास्तों को पार कर सकते हैं । इस समस्या को बहु-अच्छी प्लेटों के उपयोग से हल किया जा सकता है ताकि प्लैनेरियन को एक दूसरे से अलग किया जा सके, जबकि अभी भी कई व्यक्तियों की एक साथ रिकॉर्डिंग को सक्षम किया जा सकता है ताकि व्यवहार23,,24की मात्रा निर्धारित की जा सके। हालांकि, planarians छोटे एरेनास में दीवार पर अपेक्षाकृत अधिक समय बिताना होगा, छवि विश्लेषण के लिए समायोजन की आवश्यकता है और scrunching के लिए संकल्प सीमित/
जब उत्तेजनाओं को स्थानीय रूप से प्रशासित किया जाता है (उदाहरण के लिए,7,विच्छेदन,7,28,लेजर पॉइंटर17)को पिपटिंग किया जाता है, तो यह महत्वपूर्ण है कि प्लैनेरियन एक ही क्षेत्र में लगातार उत्तेजित होते हैं क्योंकि अन्य शरीर क्षेत्रों को उत्तेजित करने से संभावित रूप से विभिन्न व्यवहारों को प्रेरित किया जा सकता है। प्रसव के विभिन्न तरीके (जैसे कि रासायनिक के पिपटिंग या स्नान) भी व्यवहार फेनोटाइप की स्थिरता को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, प्लानरियन जल्दी से28को असंवेदनशील बना सकते हैं, जिसे प्रयोगों की योजना बनाते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए क्योंकि एक ही प्लानरियंस को तुरंत कई प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, या तो एक ही या विभिन्न उत्तेजनाओं का उपयोग करना चाहिए। अंत में, जैसा कि निकट-यूवी एक्सपोजर और सिनामाल्डिहाइड के लिए यहां दिखाया गया है, यह जानना महत्वपूर्ण है कि एक ही उत्तेजना विभिन्न प्लैनेरियन प्रजातियों में अलग-अलग व्यवहार को प्रेरित कर सकती है। पूंछ की नोक के पास लगभग यूवी प्रकाश के साथ उत्तेजित होने पर डी जैपोनिका कुचला गया, जबकि एस ध्यानी प्लैनेरियन ने पूंछ को पतला प्रदर्शित किया। इसके विपरीत, सिनामाल्डिहाइड एक्सपोजर ने एस ध्यान में स्क्रंचिंग को प्रेरित किया लेकिन डी जैपोनिका प्लैनियन्स में नहीं। इस प्रकार, जबकि स्क्रंचिंग विभिन्न प्लैनेरियन प्रजातियों की हानिकारक उत्तेजनाओं के लिए एकसंरक्षितप्रतिक्रिया है , इसमें प्रजातियों के विशिष्ट पैरामीटर7,28,संवेदनशीलता 28 और प्रेरक28हैं ।28 इसलिए, एक नई प्रजाति के लिए जिसके लिए स्क्रंचिंग को अभी तक पैरामीटर नहीं बनाया गया है, अन्य उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया का परीक्षण करने से पहले प्रजातियों के विशिष्ट मापदंडों का निर्धारण करने के लिए विच्छेदन 7 जैसे एक अच्छी तरह सेसंरक्षितप्रेरक के साथ शुरू करना सबसे अच्छा है।
यहां वर्णित विश्लेषण की एक सीमा यह है कि यह बदल जाता है और/या मिश्रित व्यवहार के लिए खाता नहीं है, जैसे सिर wiggling, ग्लाइडिंग, या अंय शरीर के आकार में परिवर्तन के साथ आंतरायिक स्क्रंचिंग । हालांकि, कच्चे डेटा का बारीकी से निरीक्षण इन मुद्दों को कम करने में मदद कर सकता है यदि इन उदाहरणों को विश्लेषण से मैन्युअल रूप से बाहर रखा जाता है, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है। इसके अलावा, यहां वर्णित द्रव्यमान और लंबाई ट्रैकिंग के केंद्र में शरीर के आकार विश्लेषण को जोड़ना और इन अन्य प्लैनेरियन व्यवहारों की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार करना संभव है। यह देखते हुए कि विश्लेषण अध्ययन किए गए जीव के बारे में कोई अनुमान नहीं लगाता है, प्रोटोकॉल सैद्धांतिक रूप से अन्य जीवों पर भी लागू किया जा सकता है जो समान प्रकार के व्यवहार दिखाते हैं।
विभिन्न प्लैनेरियन गेट्स की मात्रा निर्धारित करने और पेरिस्टलसिस से भेद करने की विधि, जैसा कि यहां वर्णित है, कम्प्यूटेशनल छवि विश्लेषण या व्यवहार अध्ययन में कोई पूर्व प्रशिक्षण नहीं मानता है और विशेष उपकरण या सॉफ्टवेयर की आवश्यकता नहीं होती है। प्रोटोकॉल अनुकूलन की सुविधा के लिए, पूरक सामग्री में उदाहरण डेटा प्रदान किया जाता है। प्राप्त करने और प्लैनेरियन को बनाने में आसानी, साथ ही विशेष उपकरणों के बिना व्यवहार रिकॉर्ड करने की क्षमता, प्राथमिक स्कूल कक्षाओं से अकादमिक प्रयोगशालाओं तक, सभी स्तरों पर अनुसंधान के लिए व्यापक रूप से सुलभ योजनावादी व्यवहार अध्ययन बनाती है। इस प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण सफलतापूर्वक एक शिक्षण प्रयोगशाला सेटिंग में इस्तेमाल किया गया है जो मुख्य रूप से फ्रेशमैन और सोफोमोर छात्रों से बना था और इसमें संभावित स्टेम और गैर-स्टेम दोनों बड़ी कंपनियां शामिल थीं।
आणविक (RNAi) और मात्रात्मक व्यवहार विश्लेषण के साथ रासायनिक उपकरणों के संयोजन, के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, शोधकर्ताओं को व्यवहार के आणविक नियंत्रण में यंत्रवादी अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए अनुमति देते हैं । इस तरह के कार्य में प्लैनेरियन ग्लाइडिंग 19 , 20,, फोटोटैक्सिस17, 35,36 , थर्मोटैक्सिस 9,,,3737और स्क्रंचिंग9,28,173529में शामिल कुछ प्रमुख मध्यस्थों और न्यूरोनल सर्किट का पर्दाफाश हुआ है ।2829 यद्यपि प्लैनेरियन व्यवहार में मनुष्यों जैसे उच्च जीवों में प्रत्यक्ष परिणामी व्यवहार नहीं हो सकते हैं, ये व्यवहार सभी जीवों के लिए महत्वपूर्ण मौलिक न्यूरोनल कार्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं - विशिष्ट उत्तेजनाओं को समझने और संसाधित करने और उचित प्रतिक्रिया करने की क्षमता। विभिन्न जीवों में प्रमुख न्यूरोनल कार्यों के संरक्षण के कारण, प्लानरियंस में मशीनी अध्ययन हमें व्यवहार के न्यूरोनल नियंत्रण के बारे में अधिक मोटे तौर पर सिखा सकते हैं। इसके अतिरिक्त, रासायनिक जोखिम के जवाब में प्लैनेरियन व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए प्लैनेरियन तंत्रिका,तंत्र23, 24,,25पर रासायनिक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो मानव मस्तिष्क के लिए संभावित जोखिमों पर सूचित कर सकता है।25 विशेष रूप से, हानिकारक गर्मी से प्रेरित स्क्रंचिंग न्यूरोटॉक्सिसिटी को परखने के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट अंत बिंदु पाया गया, क्योंकि यह रसायनों के कुछ वर्गों22, 24,25, 30,के संपर्क में आने से बाधित होजाताहै।,24, अंत में, प्लानेरियन की अनूठी पुनर्योजी क्षमताएं शोधकर्ताओं को न्यूरोरेजेनरेशन के दौरान विभिन्न व्यवहारों को बहाल करने की गतिशीलता को विच्छेदन करने की अनुमति देती हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए लेखक श्री तपन गोयल का आभार व्यक्त करते हैं। इस कार्य को एनएसएफ करियर ग्रांट 1555109 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
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