Summary
淡水平面学家表现出三个步态（滑翔、近位和皱），这些步态通过定量行为分析是可区分的。我们描述了一种利用各种有害刺激诱导擦伤的方法，其定量，以及从异形体和滑翔的区别。利用基因敲击，我们证明了皱当作为定量表型读出的特异性。
Abstract
淡水平面学家通常平稳地滑过其腹侧的 cili 推进。然而，某些环境条件会诱发肌肉驱动的运动形式：peristalsis 或皱当。虽然近体病由阴性缺陷导致，但皱毛与硅酸功能无关，是对某些刺激（包括截肢、有害温度、极端 pH 和乙醇）的特定反应。因此，这两个肌肉驱动的步态是机械上不同的。然而，它们可能难以从质量上区分。在这里，我们提供了一个使用各种物理和化学刺激诱导擦伤的协议。我们详细介绍了皱起的定量特征，它可以用来区分它与近位和滑翔，使用免费可用的软件。由于皱当是一种普遍的平面步态，尽管具有特定物种的特征差异，因此，在适当考虑时，此协议可以广泛适用于所有植物学家物种。为了证明这一点，我们比较了行为研究中使用的两种最流行的平面物种， 杜格 西亚·贾波尼卡和施密特亚· 梅迪特拉内亚，对同一组物理和化学刺激的反应。此外，scrunching 的特异性允许将该协议与 RNA 干扰和/或药理暴露结合使用，以解剖所涉及的分子靶点和神经元回路，从而有可能为诺西感知和神经肌肉交流的重要方面提供机械洞察力。
Introduction
除了在干细胞和再生研究,1、2、3,2方面的受欢迎程度外，淡水平面学家长期以来一直用于行为研究4、5，5利用它们相对大的尺寸（几毫米长）、易于和低廉的实验室维护成本，以及广泛的可观察行为。计算机视觉和自动跟踪对平面行为研究的,,引入6、7、8、9、10、11，,7使行为表型的定量分化得以实现。8,9,1011动物行为是神经元功能的直接读出。由于平面神经系统的中等大小和复杂性，但与脊椎动物大脑,12、13、14,13共享保存的关键元素，研究平面体行为可以提供对神经元作用的保守机制的洞察，这些机制在更复杂的生物体中可能很难直接探寻。14因此，平面是比较神经生物学研究,8，12，15，16，17，18，19，20，21,12,15,16,1718,19,20的宝贵模型。此外，水生环境允许快速和容易接触化学品，以研究其对大脑功能在再生和成人平面，使他们成为一个受欢迎的系统神经毒理学22，23，24，25，26。22,23,24,25,26
平面主义者有三个不同的步态，称为滑翔、近位和皱。每个步态在特定情况下表现出来：滑翔是默认的步态，当硅体功能受损7，27,27时，出现坐相看，而皱逸是一种逃生步态——独立于西莉亚功能——以响应某些有害刺激7。我们已经表明，擦伤是一种特定的反应，由某些化学或物理线索的感觉引起，包括极端温度或pH值，机械损伤，或特定的化学诱导剂，因此不是一般的应激反应7,7，28，29。,29
由于其特异性和陈规定型参数，可以很容易地量化使用这个协议，皱起是一个强大的行为表型，使研究人员能够进行机械研究，解剖感官通路和行为25，28的神经元控制。此外，在神经毒理学研究22、24、25、30中，24,25皱力已被证明是测定对神经系统发育和功能的不良化学影响一个敏感终点30。由于几种不同的感官通路似乎汇合通过各种机制诱导皱起，皱起不同于其他平面行为，因为各种，但特定的刺激可以用来解剖不同的神经元电路，并研究如何集成不同的信号，以产生皱起表型。
重要的是，物种差异是存在的，其中一种化学物质可能在一个平面物种中引起皱起，但在另一种物种中引起不同的行为反应。例如，我们发现，阿南达米德诱导在平面物种杜格西亚贾波尼卡，但诱导在施密特亚地中海28的异位体。此示例强调了能够可靠地区分不同步态的重要性，因为它们是不同分子机制的表型表现。然而，使用定性观察数据很难区分与异形体分，因为两个步态都是肌肉驱动的，并且有质量相似性,7，28。因此，为了区分步态，有必要进行西莉亚成像或定量行为研究，允许基于特征参数7，28,进行区分。由于Cilia成像在实验中具有挑战性，需要像高放大倍数复合显微镜和高速照相机,7、28等专门7设备，因此研究人员不像定量行为分析那样广泛地获得这种成像。
在这里，我们提出了一个协议：（1）使用各种物理（有害温度，截肢，近UV光）和化学（甲基同位素（AITC），辛纳尔醛）刺激的诱导和（2）使用自由可用的软件对平面行为进行定量分析。通过量化四个参数（体长振荡的频率、相对速度、最大振幅和身体伸长和收缩的不对称度）7，可以区分滑翔、近位等文献中报告的其他行为状态，如蛇形运动15 或表皮15。此外，虽然在7种不同植物物种中保存，但每种物种都有其特有的频率和速度;因此，一旦确定一个物种的滑翔和皱逸速度，单靠速度就可以作为一种手段来区分滑翔和近体29。该协议假定没有事先接受计算图像分析或行为研究的培训，因此也可以在本科教学实验室环境中应用于平面行为实验。补充材料中提供了促进协议适应的示例数据。
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Protocol
1. 定量平面行为分析
- 实验设置
- 将可调光 LED 面板放在平面上。LED 面板有两个用途：（1） 提供均匀的白色背景和 （2） 用作可调节光源以获得适当的对比度。将 100 mm 培养皿竞技场放在 LED 面板上。
注：为了增加吞吐量，多井板可以用作竞技场23，24，但更大的竞技场有利于自动图像分析。23, - 将相机安装在竞技场上方的环形支架上（图1A）。根据需要调整摄像机的位置、高度和对焦，使整个竞技场居中，并处于对焦状态（图 1B）。
注：摄像机分辨率必须足够高，才能清楚地区分平面和 LED 面板提供的同质背景。 - 用适当的曝光介质（平面水或化学溶液）填充竞技场，达到半最大值（这称为浴缸）。这相当于100毫米培养皿约25 mL。打开 LED 面板并关闭可能对录制质量产生负面影响的所有其他光源（即附近对竞技场产生眩光的光源）。
注意：通过佩戴全套个人防护设备 （PPE） 并必要时将实验装置移动到烟罩中，适当管理危险化学品解决方案。遵守联邦和州关于废物处理的规定。 - 使用转移移液器向竞技场中心放置平面图。开始录制。以本机斐济31 格式记录数据为图像序列（TIFF、GIF、JPEG、PNG、DICOM、BMP、PGM 或 FITS;请参阅图像分析部分 1.2）。
注：由于个体平面学家的行为和对外部刺激的敏感性各不相同，因此除了执行技术复制外，收集足够数量的生物复制数据也很重要。我们与多达10个中等尺寸（4-7毫米）的平面菜在100毫米培养皿一次。虽然时间效率高，但培养皿中的多个平面分析同时使数据分析更加困难，因为平面分析者可能会交叉路径。- 对于滑翔实验，请使用至少 1 帧/秒 （FPS） 进行记录。对于皱褶/活体实验，使用至少是平面物种的皱褶/活体频率两倍的 FPS 进行记录。如果平面物种具有未知的皱褶/活体频率，请使用 10 FPS 作为起点，并酌情增加/减少。
- 使用化学溶液时，使用尽可能少的平面水转移平面水，使化学溶液的浓度没有显著变化。
- 对于滑翔实验，记录1-2分钟的滑翔行为。对于皱/视实验，记录足够长的时间，以捕获至少 3 个连续的直线振荡。实验完成后，终止录制。
注：对于皱实/近位实验，如果平面图在固定时间段内未满足终止标准，而该终止标准需要在复制之间保持一致，并且根据刺激结果进行经验确定，则终止记录并测试另一个平面图。- 如果平面达到竞技场的边界而不能满足终止标准，则移液器将平面器移回竞技场的中心。
注意：避免重复移液个人进行记录，因为这可能会改变其行为。
- 如果平面达到竞技场的边界而不能满足终止标准，则移液器将平面器移回竞技场的中心。
- 将平面器从竞技场上拆下，并在适当的废物容器中处理平面水或化学溶液。在平面水中的平面可以返回他们的家庭容器。
注：通过使用不同的介质使用不同的竞技场来避免交叉污染（即，在平面水实验中滑翔不应在以前用于化学接触的擦伤/近位实验的竞技场中运行）。- 在3个干净的100毫米培养皿中，用25 mL的平面水对接触化学溶液进行连续冲洗，以彻底稀释任何化学物质。如果诱发皱起或近位，请将这些平面体放在一个单独的容器中。一个月后，由于大多数细胞在1日时都会上交，因此可以将平面动物返回自己的容器。
注意：如果同一平面学家群体需要多个不同的实验，例如，对于 RNAi 群体，则允许平面学家在运行下一个实验之前恢复 24 小时。命令实验，使侵入性最小的实验是第一，最侵入性的实验（例如，截肢）是最后运行。 - 如果在同一竞技场上运行多个实验，请正确处置沐浴液，并在跑步之间用纸巾擦拭竞技场，从而清除任何粘液痕迹。
注意：可以在这里暂停协议。
- 在3个干净的100毫米培养皿中，用25 mL的平面水对接触化学溶液进行连续冲洗，以彻底稀释任何化学物质。如果诱发皱起或近位，请将这些平面体放在一个单独的容器中。一个月后，由于大多数细胞在1日时都会上交，因此可以将平面动物返回自己的容器。
- 将可调光 LED 面板放在平面上。LED 面板有两个用途：（1） 提供均匀的白色背景和 （2） 用作可调节光源以获得适当的对比度。将 100 mm 培养皿竞技场放在 LED 面板上。
- 平面行为的定量分析
- 执行计划行为分析，如第 1.1 节所述。
- 打开斐济实验的原始图像序列（文件> 导入 > 图像序列），并在图像序列中选择第一个图像。在"序列选项"窗口中，选中"按数字排序名称"复选框，然后单击"确定"。加载图像序列后，将图像序列转换为 8 位（图像 > 类型 > 8 位），并使用图像堆栈底部的箭头工具或滑块监视或平移图像序列。
注：对于滑翔实验，只要在整个记录中可以清楚地看到平面图，就可以使用所有数据。但是，通过提取如下所述的相关部分来分析竞技场中心的自由运动通常就足够了。 - 要提取时间段和感兴趣的区域，请使用矩形工具绘制包含平面图的完整路径的感兴趣区域（图 2A，2B）。右键单击图像堆栈并选择 "重复..."，选中"重复堆栈 "复选框，输入感兴趣序列的第一帧和最后一帧，然后单击"确定 "。如果同时对多个平面图人进行成像，则对竞技场中每个平面图的多个平面图进行重复此区域选择和复制步骤，以便与竞技场中具有平面图叠一样具有多个开放图像堆栈。以下步骤（步骤 1.2.4-1.2.10）应在每个映像堆栈上执行，一次执行一个。
- 对于滑翔实验，提取一段滑翔期，其中平面体至少移动两倍于其体长。
注：每个平面图提取的滑翔数据越可靠，数据就越可靠。平面不需要在直线上移动进行滑翔分析。 - 对于收缩/近位化实验，提取一个实例，当平面体在直线上经历至少三次连续（理想情况下更多）身体振荡时，确保每个振荡是一个完整的伸长收缩周期，因为完全振荡是准确确定频率所必需的。
注：可提取的振荡量越快，数据越可靠。不要使用平面图转动的序列，因为这些序列将导致长度测量不准确。
- 对于滑翔实验，提取一段滑翔期，其中平面体至少移动两倍于其体长。
- 对重复的图像堆栈应用阈值（图像 > 调整 > 阈值）以将图像二进制化并从背景中提取平面图。根据需要调整滑动条，使整个平面图以红色突出显示。精确值取决于成像质量。保留"深色背景""堆栈直方图"和"不重置范围"的框。滚动浏览图像堆栈，以确保良好的阈值范围（即，平面图与整个堆栈的背景很好地分离），然后单击"应用"。
- 在" 将堆栈转换为二进制 "窗口中，将方法 设置为默认值 ，将"背景"设置为 "浅色"。取消选中此窗口中的所有框，然后单击"确定 "。将显示一个双化图像，显示白色背景上的黑色平面图（图2C）。确保整个平面图在图像序列的所有帧中可见。
注：在后续分析中，可以使用大小过滤器（图2CIII）过滤掉二进制图像序列中小于平面的不需要的对象。 - 通过单击"分析> 设置测量"来设置测量值。选中"区域"、质量中心、堆栈位置和"拟合椭圆"的框，然后单击"确定"。
注意：这些参数只需每个斐济会话设置一次。 - 选择打开的图像堆栈，然后选择"分析>分析粒子"。
- 在"分析粒子"窗口中，选择"显示 >蒙版"以打开一个新堆栈，显示使用所选参数检测到的所有对象。这可用于直观地检查是否只测量了平面图。在此步骤中可以设置大小滤波器，通过输入提供空间中的平面图（像素2单位）的近似区域来消除不需要的杂色。选中"显示结果"和"清除结果"复选框，然后单击"确定"。
注意：在 "结果" 窗口中，如果索引（第一列）不等于所有行的切片编号，则意味着跟踪的对象太多或太少。这种差异的一个可能性是除了平面外存在其他物体，或者平面图没有在特定帧中跟踪。 - 使用面板底部的滑块平移蒙版图像堆栈。如果有任何杂色或框架缺少平面图，请关闭"结果 "窗口和 蒙版图像堆栈。通过调整区域滤镜以仅移除平面图以外的对象，重复步骤 1.2.7-1.2.8。
注意：如果遮罩中的帧中缺少平面图，则表明区域筛选器的下限设置得过高。 - 导入数据并使用任何电子表格软件或免费软件进一步分析。要计算滑翔速度，请参阅第 1.3 节。要计算皱/永久参数集，请参阅第 1.4 节。
注意：可以在这里暂停协议。 - 要确定像素到实际长度转换，请打开斐济具有参考长度的图像（例如竞技场的直径）。选择线条工具，并在已知长度上绘制一条线。
- 通过单击"分析 > 设置比例"将像素单位转换为标准长度单位。输入与"已知距离"框中在图像上绘制的线条对应的长度，并更改长度单位从像素更改为所选的标准长度单位。转换因子写在"缩放"旁边。
注：在第 1.3 节和 1.4 节中，滑翔或皱擦/永久分析不需要像素转换值。
- 滑翔速度的计算
- 使用保存在第 1.2 节中的数据文件，加载质量 （COM） x 和 y 坐标的中心以及主轴数据。如果将数据保存为逗号分隔的值文件，则这些列表分别对应于"XM"，"YM"和"主要"列。
- 使用 "XM"和"YM" 数据列计算每个帧的平面质量中心的位移 （d）， 与下一帧的像素为单位。位 移（d） 由以下情况提供：
其中 x1 和 y1 是指一个帧的 COM 坐标 （XM， YM），x2 和 y2 表示后续帧的 COM 坐标 （XM， YM）。 - 将平面体长度设置为"主要"列的第95个百分位。由于平面学家表现出墙的偏好行为32，这确保了计算的平面体长度代表当平面体被拉长24。
- 通过将每帧像素位移除为平面体长度 （l） 来使位移 按平面体长度进行标准化。规范化位 移 （dn） 由以下情况给出：
- 通过将规范化的位移除除以每帧经过的时间（与记录的 FPS 相反），生成规范化速度列表。规范化滑翔速度 （sn） 由：
- 通过采取规范化速度列表（sn）的平均值计算平面的规范化滑翔速度。标准偏差可用作平面图的不确定性度量。
- 对要分析的每个平面图重复步骤 1.3.1-1.3.6。平均并测量所有平面学家的滑翔速度的标准偏差，以获得滑翔速度和相关的不确定性，分别为平面人口。
- 使用完整参数集区分皱截和近位步态
- 从第 1.2 节保存的数据文件中加载主轴数据列表。如果数据保存为逗号分隔的值文件，则对应于"主要 " 列。
- 创建一个列表，该列表从 0 开始，在"主要 "列中 对每个数据点进行编号。将此列表转换为每帧经过的时间，除以记录的 FPS。
- 绘制 与 经过的时间有关的主要列数据，以生成皱/永久振荡图（图 3A）。使用振荡图，将数据修剪为至少三个连续的直线振荡（图3Bi）。修剪数据以在局部峰值（振荡的最大伸长）或波谷（振荡的最小伸长）开始和结束。
注：如果局部极值不是大致相等的（峰值/波点在高度上差异很大），则表明振荡不是直线（图3Bii）。提取至少三个连续直线振荡的另一个序列。请参阅第 1.2 节。 - 确认已正确提取和修剪感兴趣的振荡序列，重新显示与时间有关 经过 修剪的主要数据。使用此修剪的数据列表进行所有后续计算。
- 要计算振荡频率（\m），m请将振荡数 （On）除以修剪主轴数据列表（N）中的数据点总数。将 FPS 乘以此值，以以振荡/秒的速度获得频率。
- 计算最大伸长率（[]最大值），从绝对最大正文长度（l最大值）中减去绝对最小体长（lmin）。通过除以绝对最大身体长度来归化为拉长的体长。
- 要计算每个身体长度的速度（v*m），将计算到的最大伸长乘以振荡频率。
注：速度本身可用于区分皱起和近位等数7。 - 要计算拉长时间（f 伸长）的分数，请选择修剪的主要轴数据列表的导数与时间。将正数据点数（即，当导数为 >0 （np）时，除以主轴数据列表（nt）中的数据点总数）。
注：皱着的平面图师表现出一个不对称的一部分时间花在拉长上，而执行近位分析的平面学家花费相等的时间拉长和收缩7。 - 对要分析的每个平面图重复步骤 1.4.1-1.4.8。通过计算每个参数的平均值和标准偏差来计算平面总体参数。
注：参数集可用于确定振荡行为是皱着、PERSalsis 还是具有周期性体形变化的某种其他类型的运动。皱擦和近体化都有给定物种7的固定参数，而皱擦参数通常大于近体参数7。虽然其中一个参数可能不属于物种特定范围，正如我们之前在化学诱导28中观察到的，但观察到的行为必须与4个已发布参数中至少3个的参数一致，才能被归类为生存或皱。
2. 皱毛感应
- 物理刺激（有害温度、紫外线、截肢）
- 对于所有物理刺激实验，请参阅实验设置的第 1.1 节。
注：最好使用大型竞技场（如 100 mm Petri 盘）进行物理刺激实验，以便为操纵移液器和/或剃刀刀片留出更多开放空间。 - 为了通过有害温度诱导碎水，在玻璃烧杯中加热平面水（每个平面水至少100微升，要测试）至热盘上65°C。
- 在竞技场的中心放置一个平面。等到平面者直立方向并开始滑翔。开始录制。
- 使用P-200移液器，缓慢移液器100μL的65°C平面水后咽到平面的尾端，以诱导皱。
注：确保加热的平面水保持在65°C。 如有必要，在开始另一个实验之前，将水重新加热到 65°C。由于压力也会引起擦伤，因此需要缓慢移液。以与实验相同的方式移液室温水可作为控制和练习选项。 - 一旦擦伤停止，请停止录制。将平面放在回收容器中，如果进行更多实验，则用新鲜的室温平面水在培养皿中交换介质。
- 要通过截肢来诱导擦伤，请将一名平面者转移到竞技场的中心，然后等待，直到平面者直立方向并开始滑翔。开始录制。
- 用干净的剃刀刀片截肢。截肢可以沿着平面图的任何地方进行，只要切割位置在实验中是一致的。
注：从前片中提取皱毛参数。因此，在从后端接近时，避免妨碍摄像机对平面图的这一部分的视图。塑料盖滑也适合切割，是一种更安全的选择，尤其是在教学环境中。 - 前片停止皱起后停止录制。取出这两块，将它们放在一个单独的容器中，并允许它们再生7天。截肢的平面师一旦再生，就可以重新融入家庭容器中。
- 用干净的剃刀刀片截肢。截肢可以沿着平面图的任何地方进行，只要切割位置在实验中是一致的。
- 要使用近紫外光诱导灼热，请将适当的滤光片（例如 Roscolux 滤镜）连接到相机镜头上，以减少摄像机收集的近紫光反射量，并可能干扰成像平面图的响应。不要使用 LED 面板从下方照亮竞技场，而要使用环境红色照明，而平面主义者对它们不敏感33。
- 将 100 mm Petri 菜竞技场装满平面水，并在竞技场中心放置单个平面（5-9 mm）。以 10 FPS 开始录制。
- 持有一个II类紫外线激光笔（405±10纳米，输出功率<5 mW）约30厘米从竞技场。将激光笔从滑翔平面图以 45° 角放置，然后在咽部后部和尾尖之间照射激光笔 5-10 秒，以诱导擦伤。
注：可以使用接近紫外线感应的功率计测量激光笔的功率。 - 等待平面学家重新开始滑翔，然后再尝试对同一个体进行两次刺激，以测试反应的可重复性。如果平面继续显示相同的行为，请停止记录，将平面图放回其容器中。如果行为在刺激之间发生变化，其他测试将显示哪个响应最突出。
注：平面图对接近紫外线的光线会变得不敏，并且会停止反应。连续刺激需要8-10秒的休息时间。
- 对于所有物理刺激实验，请参阅实验设置的第 1.1 节。
- 化学刺激（AITC）
- 为了使用一种化学物质，例如TRPA1激动剂AITC28诱导皱起，平面学家最好浸入这种化学物质的浴缸中。如有必要，可应用移液，如第 2.1.2.3 节所述。
注意：AITC 是易燃、剧毒的，可引起皮肤和眼睛刺激、呼吸和皮肤敏感，对水生生物有害。AITC 机油应在烟罩中处理。在进行 AITC 的库存解决方案之前，请戴上适当的 PPE（硝基手套和实验室外衣），并设置适当的固体和液体危险废物处置容器。 - 在烟罩中，在 50 mL 离心管中，在平面水中制造 AITC 的 10 mM 库存溶液。当储存在4°C时，此库存解决方案可使用长达一个月。
- 从该库存中，在 50 mL 离心管中制备 100 μM AITC 的 25 mL 工作溶液。此 100 μM AITC 解决方案将用于诱导平面收缩。
注：100μM AITC诱导在 D.japonica 和 S.地中海 平面28的一致皱。对于其他水生植物，100 μM可作为起始浓度，并可进行相应调整。 - 设置实验设置（请参阅第 1.1 节）。用 AITC 工作解决方案填充竞技场，并放在辅助容器中。辅助容器应至少容纳竞技场体积的两倍。
注：为了额外的安全性，可以在烟罩内进行实验。 - 将多达 10 名平面学家转移到竞技场中心并开始录制。
- 一旦计划主义者变得脱敏，停止尖叫，停止记录。从 AITC 溶液中去除平面图并冲洗（参见第 1.1 节）。将固体和液体 AITC 废物处理在适当的废物容器中。
- 验证使用 RNAi 到 TRPA128 标准协议对 AITC 的响应的特异性。
- 从该库存中，在 50 mL 离心管中制备 100 μM AITC 的 25 mL 工作溶液。此 100 μM AITC 解决方案将用于诱导平面收缩。
- 为了使用一种化学物质，例如TRPA1激动剂AITC28诱导皱起，平面学家最好浸入这种化学物质的浴缸中。如有必要，可应用移液，如第 2.1.2.3 节所述。
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Representative Results
外视近UV感知在S.地中海平面图是TRPA1依赖，并已被建议链接到H2O2版本17。由于H2O2暴露诱导TRPA1依赖性皱在S.地中海和D.japonica平面28，在第2.1.4节的步骤可用于测试近UV光暴露是否诱导在这两个物种的皱当。当D.japonica平面师在暴露在接近紫外线的光线下时，会皱着一下（10/10），而S.地中海平面图师要么表现出尾部变薄（7/10），如前所述17或无响应（3/10）（图4A，4B）。如第 1.4 节所述，对至少连续 3 次连续皱擦的D. japonica平面线参数进行量化，揭示了该物种,7、28 （0.mm = 0.84 ± 0.14，[ ]最大值= 0.56 ± 0.06，v *m = 0.47 ± 0.07，f elong = 0.56 ± 0.03，值报告为 N=7 的均值 ± 标准差）。
相比之下，暴露在小鼠34中已知的TRPA1激动剂250μM辛纳尔醛，导致在S.地中海7，28,28 （μmm = 0.46± 0.08， |[ ]最大值= 0.36 ± 0.08，v *m = 0.16 ± 0.04，和 felong = 0.58 ± 0.04，值报告为平均 n ± 标准差为 N=8） （图5A），而 D. japonica 平面图在同一 （和 1.6 倍浓度） 显示蛇一样和振荡运动的混合物，被滑翔和/或剧烈的头部转弯中断 （图5A）。 ,对至少连续三次振荡的 （8/24） 样本进行定量，4 个参数中的 3 个值比本物种的皱痕值低得多（5m m = 0.43 ± 0.08， |[ ]最大值= 0.39 ± 0.03，v *m = 0.17 ± 0.02，f elong = 0.54 ± 0.06，值报告为 N=8 的均值 ± 标准差）。因此，虽然D.japonica似乎在接触辛纳尔醛时出现皱褶，但将计算参数与该物种的文献值,7、28进行比较，表明观测到的振荡运动没有刮擦。此示例强调定量测量与仔细检查原始行为数据以正确解释观察到的行为的重要性。
RNAi 确认了在 S. 地中海中对辛纳尔醛暴露的反应的皱毛特异性。在180秒内暴露在250μM辛纳甲醛在平面水15/15 unc22 （控制） RNAi S.地中海平面体皱，而0/16 SmTRPA1 RNAi平面体皱 （图5B），证明S.地中海硬化在辛纳尔醛需要SMTRPA1.SmTRPA1 的敲击通过 60 秒暴露于 100 μM AITC 浴池28 得到证实。
图1：平面行为实验设置。
（A） 用于研究平面行为的实验设置样本。（B） 100毫米培养皿竞技场，以摄像机视野为中心。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：斐济竞技场平面图图像分析的代表性示例。
（A） 选定感兴趣的区域，包括由黄色矩形指示的完整平面路径。（B） 重复后感兴趣的区域的采样帧。（C） 通过阈值从背景和噪声中减去平面图（i） 8 位平面图，用星号表示。（ii） 阈值后平面图的二进制图像。（iii） 按大小设置滤波以去除噪声后，平面的蒙版。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：绘制与时间的关系平面长度。
（A） 一个皱着的 S. 地中海平面图的平面 长度与时间的原始 情节。星号表示平面图在皱起时转动的瞬间。（B） 修剪皱乱数据的可能方法.（i） 正确修剪的绘图，用于删除车削事件数据。（ii） 不删除车削事件数据的修剪错误图。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：物种对近紫外光的特定反应。
（A） 样品帧的D.japonica 擦伤 和S.地中海 尾变薄，以响应接近UV光。（B） S. 地中海和 D. japonica 的代表振荡图 ，以响应近紫光。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：物种对250μM辛纳尔醛（TRPA1激动剂）的特定反应。
（A） 在250μM辛纳尔醛浴中，D.japonica和S.地中海平面图具有代表性振荡图。 D. japonica（B） 代表振荡图显示SmTRPA1 RNAi S.地中海平面图中 250 μM 辛纳尔醛的减损。请单击此处查看此图的较大版本。
补充材料。请点击这里下载这些材料。
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Discussion
使用这个协议，我们可以定量地研究物理和化学刺激7，28，29,或基因操纵7,（RNAi）28，2928,29对平面运动的影响。29为了最大限度地提高空间分辨率，最好将摄像机尽可能靠近竞技场，同时确保整个竞技场位于视野中。为了增加吞吐量，可以通过同时记录多个平面图，同时筛选多个平面学家的行为。在单个竞技场中筛选多个平面图时，可以在斐济绘制感兴趣的区域来隔离此处所述的单个平面学家，或者可以使用更高级的多对象跟踪。在同一舞台上有多个平面学家的一个问题，就是他们可以交叉路径。这个问题可以通过使用多孔板来隔离平面学家彼此，同时使许多人能够同时记录来量化行为23，24。23,然而，平面学家将花相对更多的时间在墙上在较小的竞技场，需要调整图像分析，并限制分辨率的皱截/近位定量。
当刺激在局部施用时（例如，移液7，截肢,7，28，激光笔17），重要的是，平面体在同一区域持续受到刺激，因为刺激其他身体区域可能会诱发不同的行为。不同的递送方法（如化学品的移液或沐浴）也会影响行为表型的一致性。此外，计划主义者可以迅速脱敏28，这需要考虑时，规划实验作为相同的平面学家不应该立即重复使用为多个实验，无论是使用相同的或不同的刺激。最后，如此处所示，对于近紫外线照射和辛纳尔醛，重要的是要注意，同样的刺激可以诱导不同平面物种的不同行为。D. japonica在尾尖附近受到近紫外线刺激时皱起，而 S. 地中海平面图患者则显示尾部变薄。相比之下，辛纳尔醛暴露诱导在S.地中海，但不是在D.japonica planarians皱。因此，虽然皱起是各种平面物种对有害刺激7的保守反应，但它有物种特定的参数7,7，28，敏感性28，和诱导剂28。因此，对于尚未对皱当进行参数化的新物种，最好从保存良好的诱导剂（如截肢7）开始，在测试对其它刺激的反应之前确定物种特定的参数。
此处描述的分析的一个限制是，它不考虑转弯和/或混合行为，例如间歇性皱起头摆动、滑翔或其他体型变化。但是，如果手动从分析中排除这些实例，则对原始数据进行密切检查有助于缓解这些问题，如图 3 所示。此外，也可以将体型分析添加到此处描述的质量和长度跟踪中心，并扩展协议以量化这些其他平面行为。鉴于分析不对所研究的生物体做任何假设，该协议原则上也适用于显示类似行为类型的其他生物体。
如本文所述，量化不同平面步态和区分皱远位的方法假定没有事先进行计算图像分析或行为研究的培训，也不需要专门的设备或软件。为了促进协议适应，补充材料中提供了示例数据。获得和培养平面图家的易用性，以及在没有专门设备的情况下记录行为的能力，使得从小学教室到学术实验室等各级研究都能广泛获得平面活动行为研究。该协议的修改版本已成功用于主要由新生和大二学生组成的教学实验室设置，包括未来的 STEM 和非 STEM 专业。
如本协议所述，分子（RNAi）和化学工具与定量行为分析相结合，使研究人员能够获得对行为分子控制的机械见解。这项工作已经发现了一些关键的中介和神经元电路涉及平面滑翔19，20，20光19轴17，35，36，17,35,36热轴9,9，37，和皱照,9，28，29。,29虽然平面行为在高等生物体（如人类）中可能没有直接的必然行为，但这些行为代表了所有生物体都重要的基本神经元功能 - 感知和处理特定刺激和适当反应的能力。由于不同生物体内关键神经元功能的保存，平面学的机械研究可以更广泛地教导我们神经元对行为的控制。此外，分析计划行为对化学接触的反应，可用于研究化学物质对平面神经系统23，24，25,的影响，23,这可能为人脑的潜在风险。特别是，由有毒热量引起的擦伤被发现是一个敏感和特定的终点，以检测神经毒性，因为它成为中断接触某些类别的化学品22，24，25，30。,25,3022,最后，Planarian 独特的再生能力使研究人员能够剖析神经再生过程中不同行为如何恢复的动态。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢塔潘·高尔先生对手稿的评论。这项工作由NSF职业补助金1555109资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
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