Summary
Ferskvannsplanarianere viser tre gaits (gliding, peristaltikk og scrunching) som kan skilles ved kvantitativ atferdsanalyse. Vi beskriver en metode for å indusere scrunching ved hjelp av ulike skadelige stimuli, kvantifisering av disse, og skille fra peristaltikk og gliding. Ved hjelp av genbanke, viser vi spesifisiteten av scrunching som en kvantitativ fenotypisk avlesning.
Abstract
Ferskvannsplanarianere glir normalt jevnt gjennom ciliary fremdrift på deres ventrale side. Visse miljøforhold kan imidlertid indusere muskulaturdrevne former for bevegelse: peristaltikk eller scrunching. Mens peristaltikk skyldes en ciliary defekt, er scrunching uavhengig av flimmerhår funksjon og er en spesifikk respons på visse stimuli, inkludert amputasjon, skadelig temperatur, ekstrem pH og etanol. Dermed er disse to muskulaturdrevne gaits mekanistisk distinkte. Imidlertid kan de være vanskelige å skille kvalitativt. Her gir vi en protokoll for å indusere scrunching ved hjelp av ulike fysiske og kjemiske stimuli. Vi detaljer den kvantitative karakterisering av scrunching, som kan brukes til å skille den fra peristaltikk og gliding, ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. Siden scrunching er en universell planarian gangart, om enn med karakteristiske artsspesifikke forskjeller, kan denne protokollen brukes bredt på alle arter av planarianere, når man bruker passende hensyn. For å demonstrere dette sammenligner vi responsen fra de to mest populære planariske artene som brukes i atferdsforskning, Dugesia japonica og Schmidtea mediterranea, med samme sett med fysiske og kjemiske stimuli. Videre gjør spesifisiteten av scrunching denne protokollen som skal brukes sammen med RNA-interferens og / eller farmakologisk eksponering for dissekere molekylære mål og nevronale kretser involvert, noe som potensielt gir mekanistisk innsikt i viktige aspekter ved nociception og nevromuskulær kommunikasjon.
Introduction
I tillegg til deres popularitet for stamcelle- og regenereringsforskning1,2,3, har ferskvannsplanarianere lenge vært brukt i atferdsstudier4,5, og drar nytte av deres relativt store størrelse (noen få millimeter i lengde), letthet og lave kostnader for laboratorievedlikehold og bredt spekter av observerbar atferd. Innføringen av datasyn og automatisert sporing til planære atferdsstudier6,7,8,9,10,11 har aktivert kvantitativ differensiering av atferdsfenotyper. Dyrs oppførsel er en direkte avlesning av nevronal funksjon. Fordi det planære nervesystemet er av middels størrelse og kompleksitet, men deler bevarte nøkkelelementer med virveldyr hjernen12,13,14, studere planarisk atferd kan gi innsikt i bevarte mekanismer for nevronal handling som kan være vanskelig å direkte sonde i mer komplekse organismer. Dermed er planarianere en verdifull modell for komparative nevrobiologistudier8,12,15,16,17,18,19,20,21. I tillegg gjør vannmiljøet mulighet for rask og facile eksponering for kjemikalier for å studere deres effekt på hjernefunksjonen i regenererende og voksne planarianere, noe som gjør dem til et populært system for nevrotoksikologi22,23,24,25,26.
Planarianere har tre forskjellige gaits, referert til som gliding, peristaltikk, og scrunching. Hver gangart er utstilt under spesielle omstendigheter: gliding er standard gangart, peristaltikk oppstår når ciliary funksjon erkompromittert 7,27, og scrunching er en flukt gangart - uavhengig av flimmerhår funksjon - som svar på visse skadelige stimuli7. Vi har vist at scrunching er en bestemt respons, fremkalt av følelsen av visse kjemiske eller fysiske signaler, inkludert ekstreme temperaturer eller pH, mekanisk skade eller spesifikke kjemiske induktorer, og dermed ikke er en generell stressrespons7,28,29.
På grunn av sin spesifisitet og stereotypiske parametere, som lett kan kvantifiseres ved hjelp av denne protokollen, er scrunching en kraftig atferdsfenotype som gjør det mulig for forskere å utføre mekanistiske studier som dissekerer sensoriske veier og nevronal kontrollav atferd 25,28. I tillegg har scrunching vist seg å være et følsomt endepunkt for å analysere negative kjemiske effekter på nervesystemet utvikling og funksjon i nevrotoksikologistudier 22,,24,,25,,30. Som flere forskjellige sensoriske veier synes å konvergere for å indusere scrunching gjennom ulikemekanismer 28, scrunching skiller seg fra andre planære atferd fordi ulike, men spesifikke, stimuli kan brukes til å dissekere distinkte nevronale kretser og studere hvordan ulike signaler er integrert for å produsere scrunching fenotype.
Det er viktig at det finnes artsforskjeller, hvor ett kjemikalie kan fremkalle scrunching i en planarisk art, men en annen atferdsrespons i en annen. For eksempel har vi funnet ut at anandamid induserer scrunching i den planære arten Dugesia japonica men induserer peristaltikk i Schmidtea Middelhavet28. Dette eksemplet understreker viktigheten av å kunne skille pålitelig mellom de forskjellige gaits, fordi de er fenotypiske manifestasjoner av forskjellige molekylære mekanismer. Imidlertid er det vanskelig å skille seg fra peristaltikk ved hjelp av kvalitative observasjonsdata, fordi begge gaits er muskulaturdrevet og deler kvalitativelikheter 7,28. Dermed, for å skille gaits er det nødvendig å utføre cilia imaging eller en kvantitativ atferdsstudie, som tillater forskjell basert på karakteristiskeparametere 7,28. Fordi cilia imaging er eksperimentelt utfordrende og krever spesialisert utstyr som et høyforstørrelsessammensnisk mikroskop og et høyhastighetskamera7,28, er det ikke så bredt tilgjengelig for forskere som kvantitativ atferdsanalyse.
Her presenterer vi en protokoll for (1) induksjon av scrunching ved hjelp av ulike fysiske (skadelige temperatur, amputasjon, nær-UV-lys) og kjemisk (allylisothiocyanat (AITC), cinnamaldehyd) stimuli og (2) kvantitativ analyse av planarisk atferd ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. Ved å kvantifisere fire parametere(hyppighetenav kroppslengdesvingninger, relativ hastighet, maksimal amplitude og asymmetri av kroppsforlengelse og sammentrekning) 7 , kan scrunching differensieres fra gliding, peristaltikk og andre atferdsmessige tilstander rapportert i litteraturen, for eksempel slangelignende bevegelse15 eller epilepsi15. Videre, mens scrunching er bevart blant ulike planære arter7, hver art har sin egen karakteristiske frekvens og hastighet; Derfor, når gliding og scrunching hastigheter av en art er bestemt, hastighet alene kan brukes som et middel til å skille scrunching fra gliding og peristaltikk29. Protokollen forutsetter ingen tidligere opplæring i beregningsbildeanalyse eller atferdsstudier, og kan dermed også brukes til planære atferdseksperimenter i en undervisningslaboratoriumkontekst på lavere nivå. Eksempeldata for å legge til rette for protokolltilpasning er gitt i tilleggsmaterialet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kvantitative planære atferdsanalyser
- Eksperimentelt oppsett
- Plasser et dimbart LED-panel på et flatt underlag. LED-panelet tjener to formål: (1) for å gi en ensartet hvit bakgrunn og (2) som skal brukes som justerbar lyskilde for å oppnå passende kontrast. Plasser en 100 mm petriskålarena på LED-panelet.
MERK: For å øke gjennomstrømningen kan en multibrønnplate brukes som arena23,24,men større arenaer forenkler automatisert bildeanalyse., - Monter et kamera på et ringstativ over arenaen (figur 1A). Juster kameraposisjonen, høyden og fokuser etter behov slik at hele arenaen er sentrert innenfor synsfeltet og er i fokus (figur 1B).
MERK: Kameraoppløsningen må være høy nok til å tydelig skille en planarian fra den homogene bakgrunnen fra LED-panelet. - Fyll arenaen med riktig eksponeringsmedie (planarisk vann eller kjemisk løsning) til halvm maksimale volum (dette vil bli referert til som et bad). Dette tilsvarer ca. 25 ml for en 100 mm petriskål. Slå på LED-panelet og slå av andre lyskilder som kan påvirke opptakskvaliteten negativt (det vil si nærliggende lyskilder som gir et gjenskinn på arenaen).
FORSIKTIG: Administrer farlige kjemiske løsninger på riktig måte ved å bruke fullt personlig verneutstyr (PVU) og flytte det eksperimentelle oppsettet til en røykhette om nødvendig. Følg føderale og statlige forskrifter om avfallshåndtering. - Slipp en planarian mot sentrum av arenaen ved hjelp av en overføring pipette. Begynn opptaket. Ta opp data som bildesekvenser i et opprinnelig Fiji31-format (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM eller FITS, se bildeanalysedelen 1.2).
MERK: Fordi atferd og følsomhet for eksterne stimuli varierer mellom individuelle planarianere, er det viktig å samle inn data om et tilstrekkelig stort antall biologiske repliker, i tillegg til å utføre tekniske repliker. Vi har jobbet med opptil 10 mellomstore (4-7 mm) planarianere i en 100 mm petriskål samtidig. Mens tidseffektiv, flere planarians i Petri parabolen på en gang gjøre dataanalyse vanskeligere siden planarians kan krysse stier.- For gliding eksperimenter, ta opp ved hjelp av minst 1 ramme per sekund (FPS). For scrunching / peristaltikk eksperimenter, registrere ved hjelp av en FPS som er minst dobbelt scrunching / peristaltikk frekvens av planarian arter. Hvis den planariske arten har en ukjent scrunching/peristaltikkfrekvens, bruk 10 FPS som utgangspunkt og øk/avtar etter behov.
- Når du bruker en kjemisk løsning, overføre planarian ved hjelp av så få dråper planarisk vann som mulig slik at konsentrasjonen av den kjemiske løsningen ikke endres betydelig.
- For gliding eksperimenter, registrere 1-2 minutter med gliding atferd. For scrunching / peristaltikk eksperimenter, registrere lenge nok til å fange minst 3 påfølgende svingninger som forekommer i en rett linje. Når eksperimentet er fullført, avslutter du opptaket.
MERK: For scrunching/peristaltikkeksperimenter, hvis en planarian ikke tilfredsstiller termineringskriteriet innen en fast tidsperiode som må være konsekvent på tvers av repliker og bestemmes empirisk basert på stimulansen, avslutter du opptaket og tester en annen planarian.- Hvis planaren når grensen av arenaen uten å tilfredsstille oppsigelseskriteriet, pipette planarian tilbake til sentrum av arenaen.
MERK: Unngå gjentatt pipettering av en person for opptak, da dette kan endre virkemåten.
- Hvis planaren når grensen av arenaen uten å tilfredsstille oppsigelseskriteriet, pipette planarian tilbake til sentrum av arenaen.
- Fjern planarianene fra arenaen og kast det planariske vannet eller den kjemiske løsningen i egnede avfallsbeholdere. Planarianere som var i planarisk vann kan returneres til deres hjem container.
MERK: Unngå krysskontaminering ved å bruke forskjellige arenaer for ulike medier (f.eks. gliding i planære vanneksperimenter bør ikke kjøres på en arena som tidligere ble brukt til scrunching/peristaltikkeksperimenter med kjemisk eksponering).- Serielt skylleplanarianere utsatt for en kjemisk løsning i 3 rene 100 mm Petri retter fylt med 25 ml planarisk vann for å grundig fortynne ut kjemikalier. Hvis scrunching eller peristaltikk ble indusert, plasser disse planarianene i en egen beholder. Planarians kan returneres til sin hjem beholder etter en måned siden de fleste celler ville ha slått over innen den tiden1.
MERK: Hvis det er behov for flere forskjellige eksperimenter for den samme populasjonen av planarianere, for eksempel for en RNAi-befolkning, la planarianere komme seg i 24 timer før neste eksperiment kjøres. Bestill eksperimentene slik at det minst invasive eksperimentet er først, og det mest invasive eksperimentet (f.eks. amputasjon) kjøres sist. - Hvis du kjører flere eksperimenter på samme arena, må du kaste badeløsningen på riktig måte og fjerne eventuelle slimstier ved å tørke ned arenaen med et papirhåndkle mellom løypene.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
- Serielt skylleplanarianere utsatt for en kjemisk løsning i 3 rene 100 mm Petri retter fylt med 25 ml planarisk vann for å grundig fortynne ut kjemikalier. Hvis scrunching eller peristaltikk ble indusert, plasser disse planarianene i en egen beholder. Planarians kan returneres til sin hjem beholder etter en måned siden de fleste celler ville ha slått over innen den tiden1.
- Plasser et dimbart LED-panel på et flatt underlag. LED-panelet tjener to formål: (1) for å gi en ensartet hvit bakgrunn og (2) som skal brukes som justerbar lyskilde for å oppnå passende kontrast. Plasser en 100 mm petriskålarena på LED-panelet.
- Kvantitativ analyse av planær atferd
- Utfør planære atferdsanalyser som beskrevet i avsnitt 1.1.
- Åpne den rå bildesekvensen for et eksperiment på Fiji (Fil > Importer > Bildesekvens) og velg det første bildet i bildesekvensen. I sekvensalternativer-vinduet merker du av for "Sorter navn numerisk" og klikker "OK". Når bildesekvensen er lastet inn, konverterer du bildesekvensen til 8-biters (Bilde > Tekst > 8-biters) og bruker pilverktøyet eller glidebryteren nederst i bildestakken til å se eller panorere gjennom bildesekvensen.
MERK: For gliding eksperimenter, kan alle data brukes så lenge planarian kan tydelig ses gjennom hele opptaket. Det er imidlertid vanligvis tilstrekkelig å analysere fri bevegelse i midten av arenaen ved å trekke ut de relevante delene som beskrevet nedenfor. - Hvis du vil trekke ut en tidsperiode og interesseområde, tegner du en interesseregion som omfatter hele banen til en planarian ved hjelp av rektangelverktøyet (figur 2A, 2B). Høyreklikk på bildestakken og velg Dupliser..., merk av i boksen for Dupliser stakk, skriv inn de første og siste rammene i interessesekvensen, og klikk OK. Hvis flere planarianere ble avbildet samtidig, gjentar du dette regionvalget og dupliseringstrinnet for hver planarian i arenaen, slik at det er så mange åpne bildestabler som det er planarianere i arenaen. Følgende trinn (trinn 1.2.4-1.2.10) skal utføres på hver bildestakk, én om gangen.
- For gliding eksperimenter, trekke ut en periode med gliding der planarian beveger seg minst dobbelt så lang kroppslengde.
MERK: Jo mer glidende data hentet per planarian, jo mer pålitelige blir dataene. Planarianen trenger ikke å bevege seg i en rett linje for gliding analysen. - For scrunching / peristaltikk eksperimenter, trekke ut en forekomst når planarian gjennomgår minst tre påfølgende (ideelt mer) kroppen svingninger i en rett linje, noe som gjør at hver svingning er en komplett forlengelse-sammentrekning syklus, som full svingninger er nødvendig for å nøyaktig bestemme frekvensen.
MERK: Jo flere svingninger som kan trekkes ut, jo mer pålitelige blir dataene. Ikke bruk sekvenser der planarian er å snu som disse vil resultere i unøyaktige lengde målinger.
- For gliding eksperimenter, trekke ut en periode med gliding der planarian beveger seg minst dobbelt så lang kroppslengde.
- Bruk en terskel på den dupliserte bildestakken (Bilde > Juster > Terskel) for å binarize bildet og trekke ut planarian fra bakgrunnen. Juster glidestene etter behov slik at hele planarianen er uthevet i rødt. De nøyaktige verdiene er avhengig av bildekvaliteten. La boksene for Mørk bakgrunn, Stable histogram og Ikke tilbakestill rekkevidde ukontrollert. Bla gjennom bildestakken for å sikre et godt terskelområde (det vil si at planarianen er godt atskilt fra bakgrunnen i hele stakken), og klikk deretter Bruk.
- I vinduet Konverter stakk til binær setter du metoden til Standard og Bakgrunn til Lys. Fjern merket for alle boksene i dette vinduet, og klikk deretter OK. Et binarisert bilde som viser en svart planarian på en hvit bakgrunn vises (Figur 2C). Kontroller at hele planarianen er synlig i alle rammer i bildesekvensen.
Merk: Uønskede objekter i den binariserte bildesekvensen som er mindre eller større enn planarianen, kan filtreres ut i den påfølgende analysen ved hjelp av et størrelsesfilter (figur 2Ciii). - Angi målinger ved å klikke Analyser > Angi målinger. Merk av i boksene for Område, Midtstilt masse, Stakkposisjonog Tilpass ellipse, og klikk OK.
MERK: Disse parameterne trenger bare å angis én gang per Fiji-økt. - Velg den åpne bildestakken, og velg Analyser > Analyser partikler.
- I vinduet Analyser partikler velger du Vis > Masker for å åpne en ny stabel som viser alle objektene som ble oppdaget med de valgte parameterne. Dette kan brukes til å visuelt kontrollere at bare målinger av planarian blir tatt. Et størrelsesfilter kan angis på dette trinnet for å fjerne uønsket støy ved å angi det omtrentlige området av planarian (ipixel 2-enheter) i det angitte området. Merk av i boksene for Vis resultater og Fjern resultater, og klikk OK.
MERK: I Resultat-vinduet, hvis indeksen (første kolonne) ikke er lik skivenummeret for alle rader, betyr dette at enten for mange eller for få objekter ble sporet. En mulighet for denne uoverensstemmelsen er tilstedeværelsen av andre objekter i tillegg til planarian eller at planarian ikke ble sporet i bestemte rammer. - Panorer gjennom maskebildestakken ved hjelp av glidebryteren nederst på panelet. Hvis det er støy eller det er rammer som mangler en planarian, lukker du Resultat-vinduet og maskebildestakken. Gjenta trinn 1.2.7-1.2.8 ved å justere områdefilteret slik at det bare fjerner andre objekter enn planarianen.
MERK: Hvis planarian mangler fra rammen i masken, tyder dette på at den nedre grensen av områdefilteret ble satt for høyt. - Lagre dataene ved hjelp av Fil >Lagre som i Resultater-vinduet. Legg til FILTYPEN CSV i filnavnet for å lagre data som kommadelte verdier. Når data for bildestakken er lagret, lukker du den respektive bildestakken og Resultater og Maske-vinduer.
- Importer data og analyser videre ved hjelp av regnearkprogramvare eller freeware. For å beregne glidehastighet, se pkt. 1.3. Hvis du vil beregne scrunching/peristaltikken fullt parametersett, kan du se avsnitt 1.4.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. - Hvis du vil bestemme pikselen til faktisk lengdekonvertering, åpner du et bilde på Fiji med referanselengde (f.eks. diameteren på arenaen). Velg linjeverktøyet, og tegn en linje over den kjente lengden.
- Konverter pikselenheter til en standard lengdeenhet ved å klikke Analyser > Angi skala. Angi lengden som tilsvarer linjen som er tegnet på bildet, i Kjente avstand-boksen, og endre Lengdeenhet fra piksel til den valgte standardlengdeenheten. Konverteringsfaktoren er skrevet ved siden av Skaler.
MERK: En pikselkonverteringsverdi er ikke nødvendig for å gli eller scrunching/peristaltikkanalyser i avsnitt 1.3 og 1.4.
- Beregning av glidehastighet
- Ved hjelp av datafilen som er lagret i seksjon 1.2, laster du inn midten av masse (COM) x- og y-koordinatene og hovedaksedataene. Hvis dataene lagres som en kommadelte verdier fil, disse listene tilsvarer "XM", "YM" og "Major" kolonner, henholdsvis.
- Beregn forskyvningen (d) til det planære massesenteret i piksler for hver ramme med hensyn til neste ramme ved hjelp av datakolonnene "XM" og "YM". Forskyvning (d) er gitt av:
der x1 og y1 refererer til COM-koordinatene (XM, YM) på én ramme og x2 og y2, refererer til COM-koordinatene (XM, YM) for den påfølgende rammen. - Angi den planære kroppslengden som 95th persentil av "Major" -kolonnen. Siden planarians viser en vegg preferanseatferd 32, sikrer dette at beregnet planarisk kroppslengde er representativ for når planarian er langstrakt24.
- Normaliser forskyvning med planarian kroppslengde ved å dele pikselforskyvningene per ramme med den planære kroppslengden (l). Normalisert forskyvning (dn) er gitt av:
- Generer en liste over normaliserte hastigheter ved å dele de normaliserte forskyvningene etter tiden som er gått per ramme (invers av den registrerte FPS). Normalisert glidingshastighet (sn) er gitt av:
- Beregn den normaliserte glidehastigheten til planarian ved å ta gjennomsnittet av den normaliserte hastighetslisten (sn). Standardavviket kan brukes som en usikkerhetsmåling for planarianen.
- Gjenta trinn 1.3.1-1.3.6 for hver planarian som skal analyseres. Gjennomsnitt og ta standardavviket av glidehastighetene for alle planarianere for å få glidehastighet og tilhørende usikkerhet, henholdsvis for en planær befolkning.
- Skille mellom scrunching og peristaltikk gaits ved hjelp av hele parametersettet
- Last inn hovedaksedatalisten fra datafilen som er lagret fra del 1.2. Hvis dataene lagres som en kommadelte verdier fil, tilsvarer dette Major-kolonnen.
- Opprett en liste som nummererer hvert datapunkt i Hoved-kolonnen, og starter med 0. Konverter denne listen til tid som er gått per ramme ved å dele med den innspilte FPS.
- Plott de store kolonnedataene med hensyn til tiden som er gått for å generere en scrunching / peristaltsis oscillasjon plot (Figur 3A). Bruk svingningsplottet til å trimme dataene til minst tre påfølgende, rette svingninger (figur 3Bi). Trim dataene for å starte og slutte på lokale topper (maksimal forlengelse av oscillasjon) eller trau (minimum forlengelse av oscillasjon).
MERK: Hvis lokal ekstrema ikke er omtrent lik (topper/trau varierer dramatisk i høyder), tyder dette på at svingningene ikke er rettlinjede (figur 3Bii). Trekk ut en annen sekvens med minst tre påfølgende, rette svingninger. Se avsnitt 1.2. - Bekreft at svingningssekvensen av interesse er hentet ut og trimmet riktig ved å replotte de trimmede Hoveddataene med hensyn til tid. Bruk denne trimmede datalisten for alle etterfølgende beregninger.
- Hvis du vil beregne svingfrekvens (νm), deler du antall svingninger (On) med det totale antallet datapunkter i den trimmede datalisten (N) medhovedaksen (N). Multipliser FPS med denne verdien for å få frekvens i svingninger per sekund.
- Slik beregner du maksimal forlengelse (|Δε| max), trekk den absolutte minimumslengden (lmin) fra den absolutte maksimale kroppslengden (lmaks). Normaliser til langstrakt kroppslengde ved å dele med absolutt maksimal kroppslengde.
- For å beregne hastighet per kroppslengde (v*m), multiplisere den beregnede maksimale forlengelsen med svingfrekvensen.
MERK: Hastighet alene kan brukes til å skille mellom scrunching og peristaltikk gaits7. - For å beregne brøkdelen av tiden brukt langstrakt (felong), ta derivatet av trimmet storakse dataliste med hensyn til tid. Del antall positive datapunkter (det vil si når derivatet er >0 (np), med det totale antallet datapunkter i datalisten med hovedakse (nt)).
MERK: Scrunching planarians viser en asymmetrisk brøkdel av tiden brukt langstrakt mens planarianere utfører peristaltikk bruker like mye tid langstrakt og kontrahering7. - Gjenta trinn 1.4.1-1.4.8 for hver planarian som skal analyseres. Beregn en planarisk populasjonsparameter som angis ved å ta gjennomsnittlig og standardavvik for hver parameter.
MERK: Parametersettet kan brukes til å avgjøre om svingningsatferden er scrunching, peristaltikk eller en annen form for bevegelse med periodiske kroppsformendringer. Både scrunching og peristaltikk har faste parametere for en gittart 7, med scrunching parametere generelt er større enn peristaltikkparametere 7. Selv om det er mulig at en av parametrene kan falle utenfor det artsspesifikke området, som vi tidligere har observert med kjemisk induksjon28, må den observerte oppførselen være enig med minst 3 av 4 publiserte parametere som skal kategoriseres som enten peristaltikk eller scrunching.
2. Scrunching induksjon
- Fysiske stimuli (skadelig temperatur, UV-lys, amputasjon)
- For alle fysiske stimulieksperimenter, se avsnitt 1.1 for det eksperimentelle oppsettet.
MERK: Det er best å bruke en stor arena, for eksempel en 100 mm petriskål, for fysiske stimuli eksperimenter for å tillate mer åpen plass for manøvrering av en pipette og / eller barberblad. - For å indusere scrunching via skadelig temperatur, varmeplanarisk vann i et glassbeger (minst 100 μL per planarian som skal testes) til 65 ° C på en kokeplate.
- Plasser en planarian i sentrum av arenaen. Vent til planarian orienterer seg oppreist og begynner å gli. Begynn opptaket.
- Bruk en P-200 pipette, sakte pipette 100 μL av 65 ° C planarian vann post-pharyngeally på halen enden av planarian å indusere scrunching.
MERK: Pass på at det oppvarmede planegenvannet holder seg ved 65 °C. Varm eventuelt opp vannet til 65 °C før du starter et nytt eksperiment. Siden trykk også kan indusere scrunching, er langsom pipettering nødvendig. Pipettering romtemperatur vann på samme måte som i forsøket kan tjene som en kontroll og praksis alternativ. - Stopp opptaket når scrunching har opphørt. Plasser planarian i en gjenvinningsbeholder og byr mediene i petriskålen med friskt, romtemperatur planært vann hvis du kjører flere eksperimenter.
- For å indusere scrunching via amputasjon, overføre en planarian til sentrum av arenaen og vente til planarian orienterer seg oppreist og begynner å gli. Begynn opptaket.
- Amputer planarian ved hjelp av et rent barberblad. Amputasjoner kan gjøres hvor som helst langs planarian så lenge kuttet plasseringen er konsekvent på tvers av eksperimenter.
MERK: Scrunching parametere er hentet fra fremre stykke. Unngå derfor å hindre kameraets syn på denne delen av planarianen når du bruker kuttet ved å nærme seg fra den bakre enden. Plast deksel slips fungerer også godt for skjæring og er et tryggere alternativ, spesielt i en undervisningsinnstilling. - Stopp opptaket når fremre stykket har opphørt scrunching. Fjern begge delene, legg dem i en egen beholder og la dem regenerere i 7 dager. Amputerte planarianere kan innlemmes i hjemmebeholderen når de er regenerert.
- Amputer planarian ved hjelp av et rent barberblad. Amputasjoner kan gjøres hvor som helst langs planarian så lenge kuttet plasseringen er konsekvent på tvers av eksperimenter.
- For å indusere scrunching ved hjelp av nær-UV-lys, fest passende filtre (f.eks Roscolux filtre) til kameralinsen for å redusere mengden reflektert nær UV-lys som samles inn av kameraet og kan forstyrre avbildningen av planarianens respons. I stedet for å bruke LED-panelet til å belyse arenaen nedenfra, bruk omgivelsesrød belysning som planarianere er ufølsomme33 .
- Fyll en 100 mm Petri skålarena med planarisk vann og plasser en enkelt planarisk (5-9 mm) i sentrum av arenaen. Begynn opptaket med 10 FPS.
- Hold en UV-laserpeker i klasse II (405 ± 10 nm, utgangseffekt <5 mW) ca. 30 cm fra arenaen. Plasser laserpekeren i en 45° vinkel fra glidende planarian og skinn deretter laserpekeren i 5-10 sekunder halvveis mellom den bakre enden av svelget og halespissen for å indusere scrunching.
MERK: Laserpekerens effekt kan måles ved hjelp av en nesten UV-sensitiv strømmåler. - Vent til planarianen begynner å gli igjen før du prøver to stimuleringer på samme person for å teste for reproduserbarhet av reaksjonen. Hvis planarian fortsetter å vise samme oppførsel, stoppe opptak og sette planarian tilbake i sin container. Hvis atferden endres mellom stimuleringer, vil ytterligere tester vise hvilket svar som er mest fremtredende.
MERK: Planarianere kan bli desensibilisert til nær-UV-lys og vil slutte å reagere. Påfølgende stimuleringer krever en hvileperiode på 8-10 sekunder.
- For alle fysiske stimulieksperimenter, se avsnitt 1.1 for det eksperimentelle oppsettet.
- Kjemisk stimulans (AITC)
- For å indusere scrunching ved hjelp av et kjemikalie, for eksempel TRPA1 agonist AITC28, er planarianere ideelt nedsenket i et bad av kjemikaliet. Om nødvendig kan pipettering påføres som beskrevet i pkt. 2.1.2.3.
FORSIKTIG: AITC er brannfarlig, akutt giftig, kan forårsake hud- og øyeirritasjon, respirasjons- og hudsensibilisering, og er farlig for vannlevende liv. AITC-olje skal håndteres i en røykhette. Før du lager lagerløsninger av AITC, ta på passende PPE (nitrilhansker og en labcoat) og sett opp passende faste og flytende farlige avfallsbeholdere. - I en røykhette, lage en 10 mM lagerløsning av AITC i planært vann i en 50 ml sentrifuge rør. Denne lagerløsningen kan brukes i opptil én måned når den oppbevares ved 4 °C.
- Fra denne bestanden, lag en 25 ml arbeidsløsning på 100 μM AITC i planært vann i et 50 ml sentrifugerør. Denne 100 μM AITC-løsningen vil bli brukt til å indusere scrunching i planarianere.
MERK: 100 μM AITC induserer konsekvent scrunching i D. japonica og S. mediterranea planarians28. For andre akvatiske planarianere kan 100 μM tjene som en startkonsentrasjon og kan justeres tilsvarende. - Sett opp det eksperimentelle oppsettet (se avsnitt 1.1). Fyll arenaen med AITC-arbeidsløsningen og plasser den i en sekundær beholder. Den sekundære beholderen skal inneholde minst dobbelt så mye volum av arenaen.
MERK: Eksperimenter kan utføres inne i en røykhette for ekstra sikkerhet. - Overfør opptil 10 planarianere til sentrum av arenaen og begynn å spille inn.
- Når planarianerne blir desensibilisert og slutter å scrunching, stopp opptak. Fjern planarianerne fra AITC-oppløsningen og skyll (se pkt. 1.1). Kast fast og flytende AITC-avfall i egnede avfallsbeholdere.
- Kontroller spesifisiteten til svaret på AITC ved hjelp av RNAi til TRPA128 etter standardprotokoller.
- Fra denne bestanden, lag en 25 ml arbeidsløsning på 100 μM AITC i planært vann i et 50 ml sentrifugerør. Denne 100 μM AITC-løsningen vil bli brukt til å indusere scrunching i planarianere.
- For å indusere scrunching ved hjelp av et kjemikalie, for eksempel TRPA1 agonist AITC28, er planarianere ideelt nedsenket i et bad av kjemikaliet. Om nødvendig kan pipettering påføres som beskrevet i pkt. 2.1.2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekstraokulær nær-UV-oppfatning i S. middelhavet planarians er TRPA1-avhengig og har blitt foreslått å være knyttet til H2O2 utgivelse17. Fordi H2O 2 eksponeringinduserer TRPA1-avhengig scrunching i S. Middelhavet og D. japonica planarians28, trinnene i § 2.1.4 kan brukes til å teste om nær-UV lyseksponering induserer scrunching i begge arter. Mens D. japonica planarians scrunch (10/10) når de utsettes for nær-UV-lys, viser S. mediterranea planarians enten haletynning (7/10) som tidligere beskrevet17 eller ingen respons (3/10) (Figur 4A,4B). En kvantifisering av scrunching parametrene, som beskrevet i § 1.4, for D. japonica planarians som viste minst 3 sammenhengende straight-line scrunches avslører karakteristiske scrunching parametere for denne arten7,28 (νm = 0,84 ± 0,14, | Δε| maks = 0,56 ± 0,06, v*m = 0,47 ± 0,07 og f elong = 0,56 ± 0,03, verdier rapportert som gjennomsnittlig ± standardavvik for N = 7).
I motsetning, eksponering for 250 μM cinnamaldehyd, en kjent TRPA1 agonist hos mus34,forårsaker scrunching i S. Middelhavet7,,28 (νm = 0,46 ± 0,08, | Δε| maks = 0,36 ± 0,08, v*m = 0,16 ± 0,04, og felong = 0,58 ± 0,04, verdier rapportert som gjennomsnitt n ± standardavvik for N = 8) (Figur 5A), mens D. japonica planarians på samme (og 1,6x konsentrasjonen) viser en blanding av slangelignende og oscillatorisk bevegelse, avbrutt av gliding og / eller kraftige hodesvinger (figur 5A). En kvantifisering av (8/24) prøvene med minst tre påfølgende svingninger gir betydelig lavere verdier for 3 av 4 parametere enn forventet for scrunching i denne arten (νm = 0,43 ± 0,08, | Δε| maks = 0,39 ± 0,03, v*m = 0,17 ± 0,02 og f elong = 0,54 ± 0,06, verdier rapportert som gjennomsnittlig ± standardavvik for N = 8). Dermed, mens D. japonica ser ut til å scrunch på cinnamaldehyd eksponering, en sammenligning av de beregnede parametrene med litteraturverdiene for dennearten 7,viser 28 at den observerte svingningsbevegelsen ikke scrunching. Dette eksemplet understreker viktigheten av kvantitative målinger i forbindelse med nøye inspeksjon av rå atferdsdata for å tolke observert atferd på riktig måte.
RNAi bekrefter spesifisiteten av scrunching som svar på cinnamaldehyd eksponering i S. Middelhavet. Innen 180 sekunder etter eksponering for 250 μM cinnamaldehyd i planært vann 15/15 unc22 (kontroll) RNAi S. mediterranea planarians scrunched, mens 0/16 SmTRPA1 RNAi planarians scrunched (Figur 5B), viser at S. middelhavet scrunching i cinnamaldehyd krever SmTRPA1. Knockdown av SmTRPA1 ble bekreftet gjennom en 60 sekunders eksponering for et 100 μM AITC-bad28.
Figur 1: Planarian atferd eksperimentell oppsett.
(A) Eksempel eksperimentell oppsett for å studere planær atferd. (B) 100 mm Petri skål arena sentrert i synsfeltet av kameraet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative eksempler på Fiji bildeanalyse av planarianere i arena.
(A) Valgt interesseområde, som omfatter hele den planære banen, angitt av det gule rektangelet. (B) Eksempelrammer fra interesseområdet etter duplisering. (C) Trekke planarian fra bakgrunn og støy via tersklering ( i ) 8-bit bildeavplanarian med støy, betegnet av stjernen. (ii)Binarisert bilde av planarian etter terskel. (iii) Maske av planarian etter innstilling filtrering etter størrelse for å fjerne støy. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Plotting planarisk lengde med hensyn til tid.
(A) Rå tomt av planarisk lengde versus tid for en scrunching S. middelhavet planarian. Stjernen betegner et øyeblikk da planarian snudde seg mens scrunching. (B)Mulige måter å trimme scrunching data. (i) Et riktig trimmet plott som fjerner hendelsesdataene for dreiing. (ii) Et feil trimmet plott som ikke fjerner hendelsesdataene for dreiing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Arter spesifikke svar på nær-UV-lys.
(A)Eksempel rammer av D. japonica scrunching og S. middelhavet hale tynning som svar på nær-UV-lys. (B)Representative oscillation tomter av S. Middelhavet og D. japonica som svar på nær-UV lys. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Artsspesifikk respons på 250 μM cinnamaldehyd, en TRPA1-agonist.
(A) Representative oscillation tomter for D. japonica og S. middelhavet planarians i en 250 μM cinnamaldehyd bad. (B)Representative oscillation tomter som viser tap av scrunching i 250 μM cinnamaldehyd i SmTRPA1 RNAi S. middelhavet planarians. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsmaterialer. Vennligst klikk her for å laste ned disse materialene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av denne protokollen kan man kvantitativt studere effekten av fysiske og kjemiske stimuli7,28,,29 eller genetisk manipulasjon (RNAi)28,29 på planær bevegelse. For å maksimere romlig oppløsning, er det best å flytte kameraet så nært som mulig til arenaen samtidig som hele arenaen er i synsfeltet. For å øke gjennomstrømningen kan oppførselen til flere planarianere screenes samtidig ved å registrere flere planarianere samtidig. Når du screener mer enn én planarian på én enkelt arena, kan det trekkes interesseområder i Fiji for å isolere individuelle planarianere som beskrevet her, eller mer avansert sporing av flere objekter kan brukes. Et problem med å ha flere planarianere på samme arena er at de kan krysse stier. Dette problemet kan løses ved bruk av multi-brønnplater for å isolere planarianere fra hverandre samtidig som samtidig opptak av mange individer kan kvantifisereatferd 23,24. Planarianerne vil imidlertid bruke relativt mer tid på veggen på mindre arenaer, noe som krever justeringer av bildeanalysen og begrense oppløsningen for scrunching / peristaltikk kvantifisering.
Når stimuli administreres lokalt (f.eks, pipettering7,amputasjon 7,,28, laserpeker17),er det avgjørende at planarianerne konsekvent stimuleres i samme region fordi stimulerende andre kroppsregioner potensielt kan indusere ulike atferd. Ulike leveringsmetoder (for eksempel pipettering eller bad av et kjemikalie) kan også påvirke konsistensen av atferdsfenotypen. I tillegg kan planarianere desensibilisereraskt 28, som må tas i betraktning når du planlegger eksperimenter som de samme planarianerne ikke bør umiddelbart gjenbrukes for flere eksperimenter, enten ved hjelp av samme eller forskjellige stimuli. Til slutt, som vist her for nær-UV-eksponering og cinnamaldehyd, er det viktig å være klar over at den samme stimulansen kan indusere distinkt atferd i forskjellige planære arter. D. japonica scrunched når stimulert med nær-UV lys nær halen spissen, mens S. middelhavet planarians viste halen tynning. I motsetning, cinnamaldehyd eksponering indusert scrunching i S. Middelhavet, men ikke i D. japonica planarians. Dermed, mens scrunching er en bevart respons av ulike planære arter til skadelige stimuli7, den har arter spesifikkeparametere 7,28, følsomheter28, og induktorer28. Derfor, for en ny art som scrunching ennå ikke er parameterisert, er det best å starte med en godt konstert induktor, for eksempel amputasjon7, for å bestemme de artsspesifikke parametrene før du tester responsen på andre stimuli.
En begrensning av analysen som er beskrevet her er at den ikke tar hensyn til svinger og / eller blandet atferd, for eksempel intermitterende scrunching med hodestwiggling, gliding eller andre kroppsformendringer. Tett inspeksjon av rådata kan imidlertid bidra til å redusere disse problemene hvis disse forekomstene er manuelt utelukket fra analysen, som vist i figur 3. I tillegg er det mulig å legge til kroppsformanalyse til midten av masse- og lengdesporing som er beskrevet her, og utvide protokollen for å kvantifisere disse andre planære atferdene. Gitt at analysen ikke gjør noen antagelser om den studerte organismen, kan protokollen i prinsippet også brukes på andre organismer som viser lignende typer atferd.
Metoden for å kvantifisere de forskjellige planære gaits og skille scrunching fra peristaltikk, som beskrevet her, forutsetter ingen tidligere opplæring i beregningsbildeanalyse eller atferdsstudier og krever ikke spesialisert utstyr eller programvare. For å legge til rette for protokolltilpasning er eksempeldata gitt i tilleggsmaterialet. Den enkle å skaffe og kultivere planarianere, samt evnen til å registrere atferd uten spesialisert utstyr, gjør planære atferdsstudier bredt tilgjengelig for forskning på tvers av alle nivåer, fra grunnskoleklasserom til akademiske laboratorier. En modifisert versjon av denne protokollen har blitt brukt i en undervisning laboratorieinnstilling som først og fremst består av freshmen og sophomore studenter og inkludert både potensielle STEM og ikke-STEM majors.
Kombinasjonen av molekylære (RNAi) og kjemiske verktøy med kvantitativ atferdsanalyse, som beskrevet i denne protokollen, tillater forskere å få mekanistisk innsikt i molekylær kontroll av atferd. Slikt arbeid har avdekket noen av de viktigste meklere og nevronale kretser involvert i planære gliding19,20, phototaxis17,35,36, thermotaxis9,37, og scrunching9,28,29. Selv om planarisk atferd kanskje ikke har direkte corollary atferd i høyere organismer, for eksempel mennesker, representerer disse atferdene grunnleggende nevronale funksjoner som er viktige for alle organismer - evnen til å føle og behandle spesifikke stimuli og reagere riktig. På grunn av bevaring av viktige nevronale funksjoner på tvers av forskjellige organismer, kan mekanistiske studier i planarianere lære oss bredere om nevronal kontroll av atferd. I tillegg kan analyse av planarisk atferd som svar på kjemisk eksponering brukes til å studere kjemikaliets effekter på det planære nervesystemet23,24,25, som kan informere om potensiell risiko for den menneskelige hjernen. Spesielt ble scrunching indusert av skadelig varme funnet å være et følsomt og spesifikt endepunkt for analyse av nevrotoksisitet, fordi det blir forstyrret av eksponering for visse klasser av kjemikalier22,,24,,25,,30. Til slutt tillater planarianens unike regenerative evner forskere å dissekere dynamikken i hvordan ulike atferd gjenopprettes under nevroregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Mr. Tapan Goel for kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , Planarian Press. (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
