Summary
Ferskvandsplanarians udviser tre gangarter (gliding, peristaltik og scrunching), der kan skelnes ved kvantitativ adfærdsanalyse. Vi beskriver en metode til at fremkalde scrunching ved hjælp af forskellige skadelige stimuli, kvantificering heraf, og skelnen fra peristaltik og gliding. Ved hjælp af gen knockdown, viser vi specificiteten af scrunching som en kvantitativ fænotopisk udlæsning.
Abstract
Ferskvandsplanarians normalt glider jævnt gennem ciliaere fremdrift på deres ventrale side. Visse miljømæssige forhold kan imidlertid fremkalde muskulatur-drevne former for bevægelse: peristaltik eller scrunching. Mens peristaltikken skyldes en ciiliær defekt, er scrunching uafhængig af cilia-funktion og er et specifikt svar på visse stimuli, herunder amputation, skadelig temperatur, ekstrem pH og ethanol. Således er disse to muskulatur-drevet gangarter mekanistisk forskellige. Men de kan være svære at skelne kvalitativt. Her giver vi en protokol for at fremkalde scrunching ved hjælp af forskellige fysiske og kemiske stimuli. Vi detaljeret den kvantitative karakteristik af scrunching, som kan bruges til at skelne det fra peristaltik og gliding, ved hjælp af frit tilgængelige software. Da scrunching er en universel planar gangart, om end med karakteristiske artsspecifikke forskelle, kan denne protokol anvendes bredt på alle arter af planarians, når der anvendes passende overvejelser. For at demonstrere dette, sammenligner vi reaktionen fra de to mest populære planarian arter, der anvendes i adfærdsforskning, Dugesia japonica og Schmidtea mediterranea, til det samme sæt af fysiske og kemiske stimuli. Endvidere gør scrunching's specificitet det muligt at bruge denne protokol sammen med RNA-interferens og/eller farmakologisk eksponering for dissekere de involverede molekylære mål og neuronale kredsløb, hvilket potentielt giver mekanistisk indsigt i vigtige aspekter af nociception og neuromuskulær kommunikation.
Introduction
Ud over deres popularitet for stamceller og regenereringforskning 1,2,3, ferskvandplanarians har længe været brugt i adfærdsmæssigeundersøgelser 4,5, drage fordel af deres forholdsvis store størrelse (et par millimeter i længden), lethed og lave omkostninger til laboratorievedligeholdelse, og bredt spektrum af observerbare adfærd. Indførelsen af computer vision og automatiseret sporing til planar adfærd undersøgelser6,7,8,9,10,11 har muliggjort kvantitativ differentiering af adfærdsmæssige fænotyper. Dyrs adfærd er en direkte udlæsning af neuronal funktion. Fordi det planære nervesystem er af medium størrelse og kompleksitet, men deler bevarede nøgleelementer med hvirveldyr hjernen12,13,14, studere planarian adfærd kan give indsigt i bevarede mekanismer af neuronal handling, som kan være svært at direkte sonde i mere komplekse organismer. Således er planarians en værdifuld model for sammenlignende neurobiologiundersøgelser 8,12,15,16,17,18,19,20,21. Desuden giver vandmiljøet mulighed for hurtig og letkøbt eksponering for kemikalier for at undersøge deres virkning på hjernens funktion i regenerering og voksne planarianere, hvilket gør dem til et populært system for neurotoksikologi22,,23,24,25,26.
Planarians besidder tre forskellige gangarter, benævnt gliding, peristaltik, og scrunching. Hver gangart er udstillet under særlige omstændigheder: gliding er standard gangart, peristalsis opstår, når ciliaere funktion er kompromitteret7,,27, og scrunching er en flugt gangart - uafhængig af cilia funktion - som reaktion på visse skadelige stimuli7. Vi har vist, at scrunching er et specifikt svar, fremkaldt af følelsen af visse kemiske eller fysiske signaler, herunder ekstreme temperaturer eller pH, mekanisk skade, eller specifikke kemiske inducere, og dermed er ikke en generel stress respons7,28,29.
På grund af sin specificitet og stereotype parametre, som let kan kvantificeres ved hjælp af denne protokol, scrunching er en kraftfuld adfærdsmæssig fænotype, der gør det muligt for forskere at udføre mekanistiske undersøgelser dissekere sensoriske veje og neuronal kontrol af adfærd25,28. Derudover har scrunching vist sig at være et følsomt endepunkt for at analysere negative kemiske virkninger på udviklingen af nervesystemet og funktion i neurotoksikologiundersøgelser22,,24,,25,30. Som flere forskellige sensoriske veje synes at konvergere at fremkalde scrunching gennem forskelligemekanismer 28, scrunching adskiller sig fra andre planarian adfærd, fordi forskellige, men specifikke, stimuli kan bruges til at dissekere forskellige neuronal kredsløb og studere, hvordan forskellige signaler er integreret til at producere scrunching fænotype.
Vigtigere, arter forskelle findes, hvor i en kemisk kan fremkalde scrunching i en planarian arter, men en anden adfærdsmæssige reaktion i en anden. For eksempel har vi konstateret, at anandamid inducerer scrunching i den planarian arter Dugesia japonica men inducerer peristaltik i Schmidtea mediterranea28. Dette eksempel fremhæver vigtigheden af at være i stand til pålideligt at skelne mellem de forskellige gangarter, fordi de er de fæotypiske manifestationer af forskellige molekylære mekanismer. Men, sondringen af scrunching fra peristaltikken er vanskelig ved hjælp af kvalitative observationelle data, fordi begge gangarter er muskulatur-drevet og deler kvalitative ligheder7,28. Således, at skelne gangarter er det nødvendigt at udføre cilia billeddannelse eller en kvantitativ adfærdsmæssige undersøgelse, som tillader sondring baseret på karakteristiskeparametre 7,28. Fordi cilia imaging er eksperimentelt udfordrende og kræver specialiseret udstyr såsom en høj forstørrelse sammensatte mikroskop og en high-speed kamera7,28, det er ikke så bredt tilgængelige for forskere som kvantitativ adfærdsanalyse.
Her præsenterer vi en protokol for (1) induktion af scrunching ved hjælp af forskellige fysiske (skadelige temperatur, amputation, nær-UV-lys) og kemiske (allyl isothiocyanat (AITC), cinnamaldehyd) stimuli og (2) den kvantitative analyse af planarisk adfærd ved hjælp af frit tilgængelig software. Ved kvantificering af fire parametre (hyppigheden af kroppens længde svingninger, relativ hastighed, maksimal amplitude, og asymmetri af kroppen forlængelse og sammentrækning)7,scrunching kan skelnes fra gliding, peristalsis, og andre adfærdsmæssige tilstande rapporteret i litteraturen, såsom slange-lignende bevægelse15 eller epilepsier15. Desuden, mens scrunching er bevaret blandt forskellige planarian arter7, hver art har sin egen karakteristiske frekvens og hastighed; Derfor, når glide-og scrunching hastigheder af en art er blevet bestemt, hastighed alene kan bruges som et middel til at skelne scrunching fra gliding og peristaltik29. Protokollen forudsætter ingen forudgående uddannelse i beregningsmæssige billedanalyse eller adfærdsmæssige undersøgelser og dermed også kan anvendes til planariske adfærdsmæssige eksperimenter i en undervisning laboratorium sammenhæng på bachelorniveau. Eksempler på data til at lette protokoltilpasning findes i det supplerende materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kvantitative planar adfærd analyser
- Eksperimentel opsætning
- Placer et dæmpbart LED-panel på en flad overflade. LED-panelet tjener to formål: (1) at give en ensartet hvid baggrund og (2) der skal bruges som en justerbar lyskilde for at opnå passende kontrast. Placer en 100 mm petriskålsarena på LED-panelet.
BEMÆRK: For at øge gennemløb, en multi-brønd plade kan bruges som en arena23,24, men større arenaer lette automatiseret billedanalyse. - Monter et kamera på en ringstander over arenaen (Figur 1A). Juster kameraets position, højde og fokus efter behov, så hele arenaen er centreret inden for synsfeltet og er i fokus (Figur 1B).
BEMÆRK: Kameraopløsningen skal være høj nok til klart at skelne en planar fra den homogene baggrund, der leveres af LED-panelet. - Fyld arenaen med passende eksponeringsmedier (planvand eller kemisk opløsning) til halvt maksimalt volumen (dette vil blive omtalt som et bad). Dette svarer til ca. 25 ml for en 100 mm petriskål. Tænd for LED-panelet, og sluk for alle andre lyskilder, der kan have en negativ indvirkning på optagekvaliteten (dvs. nærliggende lyskilder, der frembringer en blænding på arenaen).
FORSIGTIG: Håndt farlige kemiske opløsninger korrekt ved at bære fuld personlige værnemidler (PPE) og flytte den eksperimentelle opsætning til en røghætte, hvis det er nødvendigt. Følg føderale og statslige regler om bortskaffelse af affald. - Drop en planar mod midten af arenaen ved hjælp af en overførselpipette. Begynd optagelsen. Optag data som billedsekvenser i et oprindeligt Fiji31-format (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM eller FITS; se billedanalyseaf afsnit 1.2).
BEMÆRK: Da adfærd og følsomhed over for eksterne stimuli varierer mellem de enkelte planarianere, er det vigtigt at indsamle data om et tilstrækkeligt stort antal biologiske replikater ud over at udføre tekniske replikater. Vi har arbejdet med op til 10 mellemstore (4-7 mm) planarians i en 100 mm petriskål på én gang. Mens tiden effektiv, flere planarians i Petriskålen på én gang gøre dataanalyse vanskeligere, da planarians kan krydse stier.- Til gliding-eksperimenter skal du optage med mindst 1 ramme pr. sekund (FPS). For scrunching/peristaltikforsøg skal du registrere ved hjælp af en FPS, der er mindst det dobbelte af den planarianske arts scrunching/peristalsisfrekvens. Hvis den planarianske art har en ukendt scrunching/peristalsisfrekvens, skal der anvendes 10 FPS som udgangspunkt og øges/mindskes efter behov.
- Når du bruger en kemisk opløsning, overføre planar brug så få dråber planar vand som muligt, således at koncentrationen af den kemiske opløsning ikke ændres væsentligt.
- For glidende eksperimenter, registrere 1-2 minutter af glidende adfærd. For scrunching/peristaltikforsøg skal du optage længe nok til at registrere mindst 3 på hinanden følgende svingninger, der forekommer i en lige linje. Når eksperimentet er fuldført, skal du afslutte optagelsen.
BEMÆRK: For scrunching / peristalsis eksperimenter, hvis en planarian ikke opfylder opsigelse kriteriet inden for en bestemt periode, der skal være konsekvent på tværs af replikater og er empirisk bestemt baseret på stimulus, afslutte optagelsen og teste en anden planarian.- Hvis planarian når grænsen af arenaen uden at opfylde opsigelse kriteriet, pipette planarian tilbage til midten af arenaen.
BEMÆRK: Undgå gentagne pipettering af en person til optagelse, da dette kan ændre dens adfærd.
- Hvis planarian når grænsen af arenaen uden at opfylde opsigelse kriteriet, pipette planarian tilbage til midten af arenaen.
- Fjern planaren(e) fra arenaen og bortskaf det planære vand eller den kemiske opløsning i passende affaldsbeholdere. Planarians, der var i planarvand kan returneres til deres hjem container.
BEMÆRK: Undgå krydskontaminering ved at bruge forskellige arenaer til forskellige medier (dvs. gliding i planarian vand eksperimenter bør ikke køres i en arena tidligere brugt til scrunching / peristalsis eksperimenter med kemisk eksponering).- Serielt skylleplanarians udsat for en kemisk opløsning i 3 rene 100 mm petriskåle fyldt med 25 ml planarvand for grundigt at fortynde eventuelle kemikalier. Hvis scrunching eller peristaltik blev induceret, placere disse planarians i en separat beholder. Planarians kan returneres til deres hjem container efter en måned, da de fleste celler ville have vendt på det tidspunkt1.
BEMÆRK: Hvis der er behov for flere forskellige eksperimenter for den samme population af planarianere, f.eks. Bestil forsøgene på en sådan måde, at det mindst invasive eksperiment er det første, og det mest invasive eksperiment (f.eks. amputation) køres sidst. - Hvis du kører flere eksperimenter i samme arena, korrekt bortskaffe badet løsning og fjerne eventuelle slim stier ved at tørre ned arenaen med en køkkenrulle mellem kørsler.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
- Serielt skylleplanarians udsat for en kemisk opløsning i 3 rene 100 mm petriskåle fyldt med 25 ml planarvand for grundigt at fortynde eventuelle kemikalier. Hvis scrunching eller peristaltik blev induceret, placere disse planarians i en separat beholder. Planarians kan returneres til deres hjem container efter en måned, da de fleste celler ville have vendt på det tidspunkt1.
- Placer et dæmpbart LED-panel på en flad overflade. LED-panelet tjener to formål: (1) at give en ensartet hvid baggrund og (2) der skal bruges som en justerbar lyskilde for at opnå passende kontrast. Placer en 100 mm petriskålsarena på LED-panelet.
- Kvantitativ analyse af planar adfærd
- Udfør planar adfærdsanalyser som beskrevet i afsnit 1.1.
- Åbn den rå billedsekvens for et eksperiment i Fiji (Filer > Importer > Billedsekvens), og vælg det første billede i billedsekvensen. Markér afkrydsningsfeltet "Sorter navne numerisk" i vinduet Sekvensindstillinger, og klik på "OK". Når billedsekvensen er indlæst, skal du konvertere billedsekvensen til 8-bit(Billede > Tekst > 8-bit)og bruge pileværktøjet eller skyderen nederst i billedstakken til at se eller panorere gennem billedsekvensen.
BEMÆRK: Til gliding eksperimenter, kan alle data bruges, så længe planarian kan tydeligt ses i hele optagelsen. Men det er normalt tilstrækkeligt at analysere fri bevægelse i midten af arenaen ved at udtrække de relevante del (er) som beskrevet nedenfor. - Hvis du vil udtrække en tidsperiode og et område af interesse, skal du tegne en interesseregion, der omfatter den fulde sti for en planar, ved hjælp af rektangelværktøjet (Figur 2A, 2B). Højreklik på billedstakken, og vælg Dubler..., markér afkrydsningsfeltet for Dubletstak, skriv den første og sidste ramme i interessesekvensen , og klik på OK. Duplicate stack Hvis flere planarians blev afbildet samtidigt, gentag denne region udvælgelse og duplikering skridt for hver planarian i arenaen, så der er så mange åbne billede stakke, som der er planarians i arenaen. Følgende trin (trin 1.2.4-1.2.10) skal udføres på hver billedstak én ad gangen.
- For glidende eksperimenter, udtrække en periode med gliding, hvor den planarian bevæger sig mindst det dobbelte af sin kropslængde.
BEMÆRK: Jo flere glidende data, der udvindes pr. planar, jo mere pålidelige vil dataene være. Den planar behøver ikke at bevæge sig i en lige linje for glidende analyse. - For scrunching / peristalsis eksperimenter, udtrække et tilfælde, hvor planarian gennemgår mindst tre på hinanden følgende (ideelt flere) krop svingninger i en lige linje, og sørg for hver svingning er en komplet forlængelse-sammentrækning cyklus, som fuld svingninger er nødvendige for præcist at bestemme hyppigheden.
BEMÆRK: Jo flere svingninger, der kan udvindes, jo mere pålidelige bliver dataene. Brug ikke sekvenser, hvor planarianerne drejer, da disse vil resultere i unøjagtige længdemålinger.
- For glidende eksperimenter, udtrække en periode med gliding, hvor den planarian bevæger sig mindst det dobbelte af sin kropslængde.
- Anvend en tærskel på den dublerede billedstak (Billede > Juster > Tærskel) for at binarisere billedet og udtrække planarian fra baggrunden. Juster glidestængerne efter behov, så hele planarianerne er fremhævet med rødt. De nøjagtige værdier afhænger af billedkvaliteten. Lad felterne for mørk baggrund ,Stack histogramog Nulstil ikke området være umarkeret. Rul gennem billedstakken for at sikre et godt tærskelområde (dvs. at planarianen er godt adskilt fra baggrunden i hele stakken), og klik derefter på Anvend.
- Angiv metoden til Standard og Baggrund Default til Lys i vinduet Konverter stak til Binær. Fjern markeringen i alle felter i dette vindue, og klik derefter på OK. Der vises et binariseret billede, der viser en sort planar på en hvid baggrund (Figur 2C). Sørg for, at hele planarian er synlig i alle rammer i billedsekvensen.
BEMÆRK: Uønskede objekter i den binariserede billedsekvens, der er mindre eller større end den planarianske kan filtreres ud i den efterfølgende analyse ved hjælp af en størrelse filter (Figur 2Ciii). - Angiv målinger ved at klikke på Analysér > Angiv målinger. Markér afkrydsningsfelterne for Område, Massecenter, Stakplaceringog Tilpas ellipse, og klik på OK.
BEMÆRK: Disse parametre behøver kun at blive indstillet én gang pr. Fiji-session. - Vælg stakken til det åbne billede, og vælg Analysér > Analyser partikler.
- I vinduet Analyser partikler skal du vælge Vis > Masker for at åbne en ny stak, der viser alle de objekter, der blev registreret med de valgte parametre. Dette kan bruges til visuelt at kontrollere, at kun målinger af planarian bliver taget. Der kan indstilles et størrelsesfilter på dette trin for at fjerne uønsket støj ved at indtaste det omtrentlige område af planarian (i pixel2 enheder) i den angivne plads. Markér afkrydsningsfelterne for Vis resultater, og ryd resultater, og klik på OK.
BEMÆRK: Hvis indekset (første kolonne) ikke er lig med udsnitstallet for alle rækker i vinduet Resultater, betyder det, at enten for mange eller for få objekter blev sporet. En mulighed for denne uoverensstemmelse er tilstedeværelsen af andre objekter ud over planaren, eller at planarian ikke blev sporet i specifikke rammer. - Panorer gennem maskebilledstakken ved hjælp af skyderen nederst i panelet. Hvis der er støj, eller hvis der er rammer, der mangler en planar, skal du lukke vinduet Resultater og maskebilledets stak. Gentag trin 1.2.7-1.2.8 ved at justere områdefilteret, så det kun fjerner andre objekter end planarianer.
BEMÆRK: Hvis planarian'en mangler fra rammen i masken, tyder dette på, at den nedre grænse for områdefilteret blev indstillet for højt. - Gem dataene ved hjælp af Filer>Gemsom i vinduet Resultater . Føj filtypenavnet .csv til filnavnet for at gemme data som kommaseparerede værdier. Når data til billedstakken er gemt, skal du lukke den respektive billedstak og vinduer Resultater og Maske.
- Importér data og yderligere analysere ved hjælp af regneark software eller freeware. For at beregne glidehastigheden henvises til punkt 1.3. Hvis du vil beregne det fulde parametersæt scrunching/peristaltik, henvises til punkt 1.4.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. - Hvis du vil bestemme pixel til konvertering af faktisk længde, skal du åbne et billede i Fiji med referencelængde (f.eks. arenaens diameter). Vælg stregværktøjet, og tegn en streg over den kendte længde.
- Konverter pixelenheder til en standardlængdeenhed ved at klikke på Analysér > Angiv skalering. Angiv den længde, der svarer til den linje, der er tegnet på billedet, i feltet Kendt afstand, og skift længdeenhed fra pixel til den valgte standardlængdeenhed. Konverteringsfaktoren skrives ved siden af Skaler.
BEMÆRK: Der kræves ikke en pixelkonverteringsværdi til gliding eller scrunching/peristalsisanalyser i afsnit 1.3 og 1.4.
- Beregning af glidehastighed
- Ved hjælp af den datafil, der er gemt i afsnit 1.2, skal du indlæse centrum for massekoordinaterne (COM) x og y-koordinater og de overordnede aksedata. Hvis dataene gemmes som en kommasepareret værdifil, svarer disse lister til kolonnerne "XM", "YM" og "Major".
- Beregn forskydningen (d) af det planarianske massecenter i pixel for hver ramme i forhold til den næste ramme ved hjælp af datakolonnerne "XM" og "YM". Forskydning d) er givet ved:
hvor x1 og y1 henviser til COM-koordinaterne (XM, YM) for en ramme og x2 og y2, henviser til COM-koordinaterne (XM, YM) for den efterfølgende ramme. - Indstil den planarian kropslængdeth som den 95. Da planarians udviser en væg præference adfærd32, dette sikrer , at den beregnede planarian krop længde er repræsentativ for, hvornår planarian er aflang24.
- Normalisere forskydningen ved planarian kropslængde ved at dividere pixelforskydningerne pr. ramme med den planarian kropslængde (l). Normaliseret forskydning (dn) gives ved:
- Generér en liste over normaliserede hastigheder ved at dividere de normaliserede forskydninger med den tid, der er gået pr. ramme (omvendt af den registrerede FPS). Normaliseret glidehastighed (sn) er givet ved:
- Planarians normaliserede glidehastighed beregnes ved at tage gennemsnittet af den normaliserede hastighedsliste (sn). Standardafvigelsen kan anvendes som en usikkerhedsmåling for planarianerne.
- Gentag trin 1.3.1-1.3.6 for hver planar, der skal analyseres. Gennemsnitlig og tage standardafvigelsen af glidehastigheder for alle planarians at få glidehastighed og tilhørende usikkerhed, henholdsvis for en planarian befolkning.
- Sondring af scrunching og peristalt gangartler ved hjælp af den fulde parameter sæt
- Indlæs datalisten for hovedakse fra den datafil, der er gemt i afsnit 1.2. Hvis dataene gemmes som en kommasepareret værdifil, svarer dette til kolonnen Hoved.
- Opret en liste, der nummerer hvert datapunkt i kolonnen Hoved, startende med 0. Konverter denne liste til den tid, der er forløbet pr. ramme, ved at dividere med den registrerede FPS.
- Afbilde de vigtigste kolonnedata med hensyn til den tid, der er gået, for at generere et scrunching/peristalsis-svingningsplot (Figur 3A). Ved hjælp af svingningsplottet skal dataene trimmes til mindst tre på hinanden følgende lige svingninger (Figur 3Bi). Trim dataene til start og på lokale toppe (maksimal forlængelse af svingninger) eller trug (minimum forlængelse af sving).
BEMÆRK: Hvis den lokale extrema ikke er omtrent lige (toppe/trug varierer dramatisk i højder), tyder dette på, at svingningerne ikke er lige linje (Figur 3Bii). Uddrag en anden sekvens af mindst tre på hinanden følgende lige svingninger. Se afsnit 1.2. - Bekræft, at interessesekvensen er udvundet og beskåret korrekt ved at omplottet de trimmede Major-data med hensyn til tid. Brug denne besnernede dataliste til alle efterfølgende beregninger.
- For at beregne svingningsfrekvensen (νm)divideres antallet af svingninger (On) med det samlede antal datapunkter på den beskårete hovedaksedataliste (N). Multiplicer FPS med denne værdi for at få frekvens i svingninger pr. sekund.
- Sådan beregnes maksimal forlængelse (|Δε| max), trækkes den absolutte mindste kropslængde (lmin) fra den absolutte maksimale kropslængde (lmax). Normalisere til aflange kropslængde ved at dividere med den absolutte maksimale kropslængde.
- For at beregne hastigheden pr. kropslængde (v*m)ganges den beregnede maksimale forlængelse med svingningsfrekvensen.
BEMÆRK: Hastighed alene kan bruges til at skelne mellem scrunching og peristalsis gangarter7. - For at beregne den brøkdel af den tid, der bruges på aflange (flong),skal du tage derivatet af den trimmede hovedaksedataliste med hensyn til tid. Divider antallet af positive datapunkter (dvs. når derivatet er >0 (np)med det samlede antal datapunkter på datalisten for hovedakse (nt)).
BEMÆRK: Scrunching planarians udviser en asymmetrisk brøkdel af den tid, der bruges på aflange, mens planarians udfører peristaltikken bruger lige store mængder af tid på at aflange og ordregivende7. - Gentag trin 1.4.1-1.4.8 for hver planar, der skal analyseres. Beregn en planar populationsparameter, der er angivet, ved at tage den gennemsnitlige og standardafvigelse for hver parameter.
BEMÆRK: Parametersættet kan bruges til at afgøre, om svingningsfunktionen er scrunching, peristaltik eller en anden form for bevægelse med periodiske kropsformændringer. Både scrunching og peristaltik har faste parametre for en given art7, hvor scrunching parametre generelt er større end peristaltikken parametre7. Selv om det er muligt, at en af parametrene kan falde uden for den artsspecifikke rækkevidde, som vi tidligere har observeret med kemisk induktion28, den observerede adfærd skal være enig med mindst 3 af 4 offentliggjorte parametre, der skal kategoriseres som enten peristaltik eller scrunching.
2. Scrunching induktion
- Fysiske stimuli (skadelig temperatur, UV-lys, amputation)
- For alle fysiske stimuliforsøg henvises til afsnit 1.1 for den eksperimentelle opsætning.
BEMÆRK: Det er bedst at bruge en stor arena, såsom en 100 mm petriskål, til fysiske stimuli eksperimenter for at give mulighed for mere åben plads til manøvrering en pipette og / eller barberblad. - For at fremkalde scrunching via skadelig temperatur opvarmes planvand i et glasbæger (mindst 100 μL pr. planant, der skal testes) til 65 °C på en kogeplade.
- Placer en planar i midten af arenaen. Vent, indtil planaren orienterer sig oprejst og begynder at glide. Begynd optagelsen.
- Ved hjælp af en P-200 pipette, langsomt pipette 100 μL af 65 °C planarian vand post-svarytt på enden af planarian at fremkalde scrunching.
BEMÆRK: Sørg for, at det opvarmede planarvand forbliver ved 65°C. Genopvarm om nødvendigt vandet til 65°C, inden der startes et andet eksperiment. Da tryk også kan fremkalde scrunching, langsom pipettering er nødvendig. Pipettering rumtemperatur vand på samme måde som i forsøget kan tjene som en kontrol og praksis mulighed. - Stop optagelsen, når scrunching er ophørt. Placer planarian i et opsving beholder og udveksle medierne i petriskålen med frisk, stuetemperatur planarian vand, hvis der kører flere eksperimenter.
- At fremkalde scrunching via amputation, overføre en planar til midten af arenaen og vente, indtil planarian vender sig oprejst og begynder glider. Begynd optagelsen.
- Amputer planaren ved hjælp af et rent barberblad. Amputationer kan gøres overalt langs planarian, så længe cut placering er konsekvent på tværs af eksperimenter.
BEMÆRK: Scrunching parametre er udvundet fra den forreste brik. Undgå således at blokere kameraets opfattelse af denne del af planarian, når du anvender snittet ved at nærme sig fra den bageste ende. Plastdækselssedler fungerer også godt til skæring og er en sikrere løsning, især i undervisningsindstilling. - Stop optagelsen, når den forreste brik er ophørt scrunching. Fjern begge stykker, placere dem i en separat beholder og give dem mulighed for at regenerere i 7 dage. Amputerede planarianere kan reincorporeres i hjemmet container, når regenereret.
- Amputer planaren ved hjælp af et rent barberblad. Amputationer kan gøres overalt langs planarian, så længe cut placering er konsekvent på tværs af eksperimenter.
- For at fremkalde scrunching ved hjælp af nær-UV-lys, vedhæfte passende filtre (f.eks Roscolux filtre) til kameralinsen for at reducere mængden af reflekteret nær-UV-lys, der indsamles af kameraet og kan forstyrre billeddannelse af planarens reaktion. I stedet for at bruge LED-panelet til at belyse arenaen nedefra, skal du bruge omgivende rød belysning, som planarians er ufølsomme33 .
- Fyld en 100 mm petriskål arena med planarvand og placer en enkelt planarian (5-9 mm) i midten af arenaen. Begynd optagelse på 10 FPS.
- Hold en klasse II UV-laser pointer (405 ± 10 nm, udgangseffekt <5 mW) ca. 30 cm fra arenaen. Placer laser pointer på en 45 ° vinkel fra glidende planarian og derefter skinne laser pointer i 5-10 sekunder halvvejs mellem den bageste ende af svænget og halespidsen til at fremkalde scrunching.
BEMÆRK: Laserpointerens effekt kan måles ved hjælp af en nær-UV-følsom effektmåler. - Vent til planarian at begynde at glide igen, før du forsøger yderligere to stimulationer på den samme person til at teste for reproducerbarhed af reaktionen. Hvis planarian holder viser den samme adfærd, stoppe optagelsen og sætte planarian tilbage i sin container. Hvis adfærden ændres mellem stimulering, viser yderligere test, hvilket svar der er mest fremtrædende.
BEMÆRK: Planarians kan blive desensibiliseret til nær-UV-lys og vil holde op med at reagere. Fortløbende stimulering kræver en hvileperiode på 8-10 sekunder.
- For alle fysiske stimuliforsøg henvises til afsnit 1.1 for den eksperimentelle opsætning.
- Kemisk stimulus (AITC)
- At fremkalde scrunching ved hjælp af et kemikalie, fx TRPA1 agonist AITC28, planarians er ideelt nedsænket i et bad af kemikaliet. Pipettering kan om nødvendigt anvendes som beskrevet i punkt 2.1.2.3.
FORSIGTIG: AITC er brandfarlig, akut giftig, kan forårsage hud- og øjenirritation, luft- og hudsensibilisering og er farlig for vandlevende organismer. AITC olie skal håndteres i en røghætte. Før der foretages lagerløsninger af AITC, skal der sættes passende PPE på (nitrilhandsker og en laboratoriekittel) og opsættes passende beholdere til bortskaffelse af fast og flydende farligt affald. - I en røghætte, lave en 10 mM lager opløsning af AITC i planarisk vand i en 50 ml centrifuge rør. Denne lagerløsning kan bruges i op til en måned, når den opbevares ved 4°C.
- Fra denne bestand, forberede en 25 ml arbejdsopløsning af 100 μM AITC i planarvand i en 50 ml centrifuge rør. Denne 100 μM AITC-opløsning vil blive brugt til at fremkalde scrunching i planarians.
BEMÆRK: 100 μM AITC inducerer konsekvent scrunching i D. japonica og S. mediterranea planarians28. For andre akvatiske planarianere kan 100 μM fungere som startkoncentration og kan justeres i overensstemmelse hermed. - Konfigurer forsøgsopsætningen (se afsnit 1.1). Fyld arenaen med AITC arbejdsløsningen, og læg den i en sekundær beholder. Den sekundære beholder skal rumme mindst dobbelt så stort som arenaen.
BEMÆRK: Forsøg kan udføres inde i en røghætte for ekstra sikkerhed. - Overfør op til 10 planarians til midten af arenaen og begynde at optage.
- Når planarianerne bliver desensibiliserede og ophører med at scrunching, skal du stoppe optagelsen. Fjern planarianerne fra AITC-opløsningen, og skyl (se afsnit 1.1). Bortskaf fast og flydende AITC-affald i passende affaldsbeholdere.
- Kontroller specificiteten af svaret på AITC ved hjælp af RNAi til TRPA128 efter standardprotokoller.
- Fra denne bestand, forberede en 25 ml arbejdsopløsning af 100 μM AITC i planarvand i en 50 ml centrifuge rør. Denne 100 μM AITC-opløsning vil blive brugt til at fremkalde scrunching i planarians.
- At fremkalde scrunching ved hjælp af et kemikalie, fx TRPA1 agonist AITC28, planarians er ideelt nedsænket i et bad af kemikaliet. Pipettering kan om nødvendigt anvendes som beskrevet i punkt 2.1.2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekstraokulære nær-UV opfattelse i S. mediterranea planarians er TRPA1-afhængige og er blevet foreslået at være knyttet til H2O2 release17. Da H2O2-eksponering fremkalder TRPA1-afhængig scrunching i S. mediterranea og D. japonica planarians28, kan trinene i afsnit 2.1.4 bruges til at teste, om eksponering af nær-UV-lys inducerer scrunching hos begge arter. Mens D. japonica planarians scrunch (10/10), når de udsættes for nær-UV-lys, S. mediterranea planarians enten udstille hale udtynding (7 / 10) som tidligere beskrevet17 eller intet svar (3 / 10) (Figur 4A, 4B). En kvantificering af scrunching parametre, som beskrevet i afsnit 1.4, for D. japonica planarians, der udstillede mindst 3 på hinanden følgende straight-line scrunches afslører karakteristiske scrunching parametre for denne art7,28 (νm = 0,84 ± 0,14, | Δε| max = 0,56 ± 0,06, v*m = 0,47 ± 0,07 og f aflang = 0,56 ± 0,03, værdier rapporteret som gennemsnitlig ± standardafvigelse for N=7).
Derimod forårsager eksponering for 250 μM cinnamaldehyd, en kendt TRPA1-agonist i mus34, scrunching i S. mediterranea7,28 (νm = 0,46 ± 0,08, | Δε| max = 0,36 ± 0,08, v*m = 0,16 ± 0,04 og felong = 0,58 ± 0,04, værdier rapporteret som middelværdi n ± standardafvigelse for N =8) (Figur 5A), mens D. japonica planarians på samme (og 1,6x koncentrationen) viser en blanding af slange-lignende og oscillerende bevægelse, afbrudt af gliding og / eller kraftig hoved vender (Figur 5A) . En kvantificering af (8/24) prøverne med mindst tre på hinanden følgende svingninger giver betydeligt lavere værdier for 3 ud af 4 parametre end forventet for scrunching hos denne art (νm = 0,43 ± 0,08, | Δε| max = 0,39 ± 0,03, v*m = 0,17 ± 0,02 og f aflang = 0,54 ± 0,06, værdier rapporteret som gennemsnitlig ± standardafvigelse for N=8). Mens D. japonica således synes at scrunch på cinnamaldehyd eksponering, en sammenligning af de beregnede parametre med litteraturværdier for denneart 7,28 viser, at den observerede oscillerende bevægelse ikke er scrunching. Dette eksempel fremhæver vigtigheden af kvantitative målinger i forbindelse med omhyggelig inspektion af de rå adfærdsmæssige data til korrekt fortolkning observeret adfærd.
RNAi bekræfter specificiteten af scrunching som reaktion på cinnamaldehydeksponering i S. mediterranea. Inden for 180 sekunder efter eksponering for 250 μM cinnamaldehyd i planvand 15/15 unc22 (kontrol) RNAi S. mediterranea planarians scrunched, mens 0/ 16 SmTRPA1 RNAi planarians scrunched (Figur 5B), viser, at S. mediterranea scrunching i cinnamaldehyd kræver SmTRPA1. Knockdown af SmTRPA1 blev bekræftet gennem en 60 sekunders eksponering for et 100 μM AITC bad28.
Figur 1: Planar adfærd eksperimentel opsætning.
(A)Prøve eksperimentel opsætning for at studere planarian adfærd. (B) 100 mm Petriskål arena centreret i synsfeltet af kameraet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative eksempler på Fijis billedanalyse af planarians i arenaen.
(A) Udvalgt interesseregion, der omfatter den fulde planarsti, angivet med det gule rektangel. bB) Prøverammer fra det område, der er af interesse efter dobbeltarbejde. (C) Trække planar fra baggrund og støj via tærskelværdi (i) 8-bit billede af planarian med støj, betegnet af stjernen. (ii) Binarized billede af planarian efter tærskelring. (iii) Maske af planar efter indstilling filtrering efter størrelse for at fjerne støj. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Plotte planarlængde med hensyn til tid.
(A)Rå plot af planar længde versus tid til en scrunching S. mediterranea planarian. Stjernen betegner et øjeblik, hvor planaren vendte sig, mens scrunching. (B) Mulige måder at trimme scrunching data. (i) Et korrekt beskåret plot, der fjerner drejningshændelsesdataene. (ii) Et forkert beskåret plot, der ikke fjerner drejningshændelsesdataene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Artsspecifikke reaktioner på nær-UV-lys.
(A)Prøverammer af D. japonica scrunching og S. mediterranea hale udtynding som reaktion på nær-UV-lys. BB) Repræsentative svingningsområder af S. mediterranea og D. japonica som reaktion på nær-UV-lys. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Artsspecifik respons på 250 μM cinnamaldehyd, en TRPA1 agonist.
a) Repræsentative svingningsområder for D. japonica og S. mediterranea planarians i et 250 μM cinnamaldehyd bad. b) Repræsentative svingningsområder, der udviser tab af scrunching i 250 μM cinnamaldehyd i SmTRPA1 RNAi S. mediterraneaplanarians. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende materialer. Klik her for at downloade disse materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af denne protokol, kan man kvantitativt studere virkningerne af fysiske og kemiske stimuli7,28,29 eller genetisk manipulation (RNAi)28,29 på planarian bevægelse. For at maksimere rumlig opløsning er det bedst at flytte kameraet så tæt som muligt på arenaen og samtidig sikre, at hele arenaen er inden for synsfeltet. For at øge gennemløbet kan flere planarianers funktionsmåde screenes på én gang ved at optage flere planarianere samtidigt. Når screening mere end én planarian i en enkelt arena, regioner af interesse kan drages i Fiji for at isolere de enkelte planarians som beskrevet her eller mere avanceret multi-objekt tracking kan anvendes. Et problem med at have flere planarians i samme arena er, at de kan krydse stier. Dette problem kan løses ved hjælp af multi-brønd plader til at isolere planarians fra hinanden, mens du stadig gør det muligt samtidig registrering af mange personer til at kvantificere adfærd23,24. Men, planarians vil bruge relativt mere tid på væggen i mindre arenaer, der kræver justeringer af billedet analyse og begrænse opløsningen for scrunching / peristalsis kvantificering.
Når stimuli administreres lokalt (f.eks pipettering7, amputation7,28, laser pointer17), er det afgørende, at planarians konsekvent stimuleres i samme region, fordi stimulere andre organ regioner potentielt kan fremkalde forskellige adfærd. Forskellige metoder til levering (såsom pipettering eller bad af et kemikalie) kan også påvirke konsistensen af adfærdsmæssige fænotype. Derudover kan planarians desensibilisere hurtigt28, som skal tages i betragtning, når planlægning eksperimenter som de samme planarians bør ikke straks genbruges til flere eksperimenter, enten ved hjælp af samme eller forskellige stimuli. Endelig, som vist her for nær-UV eksponering og cinnamaldehyd, er det vigtigt at være opmærksom på, at den samme stimulus kan fremkalde forskellige adfærd i forskellige planarian arter. D. japonica scrunched når stimuleret med nær-UV-lys nær baglyppen, mens S. mediterranea planarians viste hale udtynding. I modsætning hertil cinnamaldehyd eksponering induceret scrunching i S. mediterranea, men ikke i D. japonica planarians. Således, mens scrunching er en bevaret reaktion af forskellige planarian arter til skadelige stimuli7, det har arter specifikkeparametre 7,28, følsomheder28, og inducers28. Derfor er det for en ny art, for hvilke scrunching endnu ikke er blevet parameteriseret, bedst at starte med en velbevaret inducer, såsom amputation7,at bestemme de artsspecifikke parametre, før du tester reaktionen på andre stimuli.
En begrænsning af analysen beskrevet her er, at det ikke tegner sig for sving og / eller blandet adfærd, såsom intermitterende scrunching med hovedet vrikke, gliding, eller andre kropsform ændringer. En nærmere undersøgelse af rådata kan dog bidrage til at afbøde disse problemer, hvis disse tilfælde manuelt udelukkes fra analysen, som det fremgår af figur 3. Derudover er det muligt at tilføje kropsform analyse til centrum af masse og længde sporing beskrevet her og udvide protokollen til at kvantificere disse andre planariske adfærd. Da analysen ikke gør nogen antagelser om den undersøgte organisme, protokollen kunne i princippet også anvendes på andre organismer, der viser lignende typer af adfærd.
Metoden til kvantificering af de forskellige planariske gangarter og skelne scrunching fra peristaltikken, som beskrevet her, påtager sig ingen forudgående uddannelse i beregningsmæssige billedanalyse eller adfærdsmæssige undersøgelser og kræver ikke specialiseret udstyr eller software. For at lette protokoltilpasning findes eksempeldata i det supplerende materiale. Den lethed at opnå og dyrke planarians, samt evnen til at registrere adfærd uden specialiseret udstyr, gør planar adfærdsmæssige undersøgelser bredt tilgængelige for forskning på tværs af alle niveauer, fra grundskole klasseværelser til akademiske laboratorier. En modificeret version af denne protokol er blevet anvendt med succes i en undervisning laboratorium indstilling, der primært var sammensat af freshmen og sophomore studerende og omfattede både potentielle STEM og ikke-STEM store selskaber.
Kombinationen af molekylære (RNAi) og kemiske værktøjer med kvantitativ adfærdsanalyse, som beskrevet i denne protokol, giver forskerne mulighed for at få mekanistisk indsigt i den molekylære kontrol af adfærd. Et sådant arbejde har afdækket nogle af de vigtigste mæglere og neuronal kredsløb involveret i planarian gliding19,20, phototaxis17,35,36, termostatik9,37, og scrunching9,28,29. Selv om planarian adfærd ikke kan have direkte naturlig adfærd i højere organismer, såsom mennesker, disse adfærd repræsenterer grundlæggende neuronale funktioner vigtigt for alle organismer - evnen til at fornemme og behandle specifikke stimuli og reagere hensigtsmæssigt. På grund af bevarelsen af vigtige neuronale funktioner på tværs af forskellige organismer, kan mekanistiske undersøgelser i planarians lære os mere bredt om neuronal kontrol af adfærd. Derudover, analysere planarian adfærd som reaktion på kemisk eksponering kan bruges til at studere kemikaliets virkninger på det planarian nervesystem23,,24,25, som kan informere om potentielle risici for den menneskelige hjerne. Især blev scrunching forårsaget af skadelig varme fundet at være et følsomt og specifikt endepunkt for analyse af neurotoksicitet, fordi det bliver forstyrret af eksponering for visse klasser af kemikalier22,24,25,30. Endelig, den planarian unikke regenerative kapaciteter giver forskerne mulighed for at dissekere dynamikken i, hvordan forskellige adfærd er genoprettet under neuroregeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Mr. Tapan Goel for kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , Planarian Press. (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
