Summary
Sötvatten planarianer uppvisar tre gångarter (glidning, peristaltik, och scrunching) som är urskiljbara genom kvantitativ beteendeanalys. Vi beskriver en metod för att inducera scrunching med hjälp av olika skadliga stimuli, kvantifiering därav och åtskillnad från peristaltik och glidflygning. Med hjälp av gen knockdown, visar vi specificiteten av scrunching som en kvantitativ fenotypisk avläsning.
Abstract
Sötvattenplanarianer glider normalt smidigt genom ciliär framdrivning på deras ventrala sida. Vissa miljöförhållanden kan dock framkalla muskulatur-driven former av förflyttning: peristaltik eller scrunching. Medan peristaltiken resultat från en ciliary defekt, scrunching är oberoende av cilier funktion och är ett specifikt svar på vissa stimuli, inklusive amputation, skadliga temperatur, extrema pH och etanol. Således är dessa två muskulatur-driven gångarter mekanistiskt distinkta. De kan dock vara svåra att urskilja kvalitativt. Här ger vi ett protokoll för att förmå scrunching med hjälp av olika fysiska och kemiska stimuli. Vi detalj den kvantitativa karakterisering av scrunching, som kan användas för att skilja den från peristaltik och glidning, med hjälp av fritt tillgänglig programvara. Eftersom scrunching är en universell planarisk gång, om än med karakteristiska artspecifika skillnader, kan detta protokoll i stort sett tillämpas på alla arter av planarianer, när man använder lämpliga överväganden. För att visa detta jämför vi svaret från de två mest populära plana arter som används i beteendeforskning, Dugesia japonica och Schmidtea mediterranea, till samma uppsättning fysiska och kemiska stimuli. Dessutom tillåter specificiteten av scrunching detta protokoll som ska användas tillsammans med RNA-interferens och/eller farmakologisk exponering för dissekera de molekylära mål och neuronala kretsar inblandade, potentiellt ger mekanistisk inblick i viktiga aspekter av nociception och neuromuskulär kommunikation.
Introduction
Förutom deras popularitet för stamceller och regenerering forskning1,2,,3, sötvatten planarianer har länge använts i beteendestudier4,5, dra nytta av deras jämförelsevis stora storlek (några millimeter i längd), lätthet och låg kostnad för laboratoriet underhåll, och brett spektrum av observerbara beteenden. Införandet av datorseende och automatiserad spårning till planarisk beteende studier6,7,8,9,10,11 har möjliggjort kvantitativ differentiering av beteendemässiga fenotyper. Djurbeteende är en direkt avläsning av neuronal funktion. Eftersom det planiska nervsystemet är av medelstorlek och komplexitet, men aktier bevarade viktiga element med ryggradsdjur hjärnan12,13,14, studera planarisk beteende kan ge insikt i bevarade mekanismer för neuronala åtgärder som kan vara svårt att direkt sond i mer komplexa organismer. Således är planarianer en värdefull modell för jämförande neurobiologistudier 8,12,15,16,17,18,19,20,21. Dessutom tillåter vattenmiljön för snabb och facile exponering för kemikalier för att studera deras effekt på hjärnans funktion i regenererande och vuxna planarianer, vilket gör dem till ett populärt system för neurotoxikologi22,23,24,25,26.
Planarianer besitter tre distinkta gångarter, som kallas glidflygning, peristaltik och scrunching. Varje gång är utställd under särskilda omständigheter: glidning är standardgång, peristaltik inträffar när ciliär funktion äventyras7,27, och scrunching är en flykt gång – oberoende av cilier funktion – som svar på vissa skadliga stimuli7. Vi har visat att scrunching är ett specifikt svar, framkallas av känslan av vissa kemiska eller fysiska ledtrådar, inklusive extrema temperaturer eller pH, mekanisk skada, eller specifika kemiska inducerare, och därmed inte är en allmän stressrespons7,28,29.
På grund av dess specificitet och stereotypa parametrar, som lätt kan kvantifieras med hjälp av detta protokoll, scrunching är en kraftfull beteendemässiga fenotyp som gör det möjligt för forskare att utföra mekanistiska studier dissekera sensoriska vägar och neuronal kontroll av beteende25,28. Dessutom har scrunching visat sig vara en känslig endpoint för att analys skadliga kemiska effekter på nervsystemets utveckling och funktion i neurotoxikologistudier 22,24,25,30. Som flera olika sensoriska vägar verkar konvergera för att framkalla scrunchinggenom olika mekanismer 28, scrunching skiljer sig från andra planarian beteenden eftersom olika, men specifika, stimuli kan användas för att dissekera distinkta neuronala kretsar och studera hur olika signaler är integrerade för att producera scrunching fenotyp.
Viktigt, arter skillnader finns, där en kemikalie kan framkalla scrunching i en planarian art, men en annan beteendemässiga svar i en annan. Till exempel har vi funnit att anandamid inducerar scrunching i den plana arter Dugesia japonica men inducerar peristalsis i Schmidtea medelhavet28. Detta exempel belyser vikten av att kunna på ett tillförlitligt sätt skilja mellan de olika gångarter, eftersom de är de fenotypiska manifestationer av distinkta molekylära mekanismer. Men är åtskillnad av scrunching från peristaltiken svårt att använda kvalitativa observationsdata, eftersom båda gångarter är muskulatur-driven och dela kvalitativa likheter7,28. Således, för att skilja de gångarter är det nödvändigt att utföra cilier bildbehandling eller en kvantitativ beteendestudie, som möjliggör åtskillnad baserad på karakteristiska parametrar7,28. Eftersom cilia imaging är experimentellt utmanande och kräver specialiserad utrustning såsom en hög förstoring förening mikroskop och en höghastighetskamera7,28, det är inte så brett tillgänglig för forskare som kvantitativbeteendeanalys.
Här presenterar vi ett protokoll för (1) induktion av scrunching med hjälp av olika fysiska (skadliga temperatur, amputation, nära UV-ljus) och kemiska (allyl isothiocyanate (AITC), cinnamaldehyd) stimuli och (2) den kvantitativa analysen av planarisk beteende med hjälp av fritt tillgänglig programvara. Genom att kvantifiera fyra parametrar (frekvens av kroppslängd svängningar, relativ hastighet, maximal amplitud, och asymmetri av kroppen töjning och kontraktion)7, scrunching kan skiljas från glidning, peristaltik, och andra beteendemässiga tillstånd rapporteras i litteraturen, såsom orm-liknande locomotion15 ores15. Vidare, medan scrunching bevaras bland olika plana art7, har varje art sin egen karakteristiska frekvens och hastighet; därför, när glid- och scrunchinghastigheterna för en art har fastställts, kan hastigheten ensam användas som ett medel för att skilja scrunching från glidning och peristaltik29. Protokollet förutsätter ingen föregående utbildning i beräkningsbildanalys eller beteendestudier och kan därmed också tillämpas för planatiska beteendeexperiment i ett undervisningslaboratoriekontext på grundnivå. Exempel data för att underlätta protokoll anpassning tillhandahålls i det kompletterande materialet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kvantitativa plana beteende analyser
- Experimentell inställning
- Placera en dimbar LED-panel på en plan yta. LED-panelen tjänar två syften: (1) att ge en enhetlig vit bakgrund och (2) som ska användas som en justerbar ljuskälla för att erhålla lämplig kontrast. Placera en 100 mm Petriskålarena på LED-panelen.
OBS: För att öka genomströmningen kan en fler-brunnsplatta användas som en arena23,24, men större arenor underlättar automatiserad bildanalys. - Montera en kamera på en ringstativ ovanför arenan (Bild 1A). Justera kamerans position, höjd och fokus efter behov så att hela arenan är centrerad inom synfältet och är i fokus (Bild 1B).
OBS: Kamerans upplösning måste vara tillräckligt hög för att tydligt skilja en planarian från den homogena bakgrund som LED-panelen tillhandahåller. - Fyll arenan med lämpligt exponeringsmedi (planarisk vatten eller kemisk lösning) till halv-maximal volym (detta kommer att kallas ett bad). Detta motsvarar cirka 25 mL för en 100 mm Petriskål. Slå på LED-panelen och stäng av alla andra ljuskällor som kan påverka inspelningskvaliteten negativt (dvs. närliggande ljuskällor som ger en bländning på arenan).
VAR FÖRSIKTIG: Hantera farliga kemiska lösningar på lämpligt sätt genom att bära full personlig skyddsutrustning (PPE) och flytta den experimentella uppställningen till en rökhuv om det behövs. Följ federala och statliga bestämmelser om avfallshantering. - Släpp en planarian mot mitten av arenan med hjälp av en överföring pipett. Påbörja inspelningen. Registrera data som bildsekvenser i ett inbyggt Fiji31-format (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM eller FITS; se bildanalysavsnitt 1.2).
OBS: Eftersom beteenden och känslighet för yttre stimuli varierar mellan enskilda planarianer, är det viktigt att samla in data på ett tillräckligt stort antal biologiska replikat, förutom att utföra tekniska replikat. Vi har arbetat med upp till 10 medelstora (4-7 mm) planarianer i en 100 mm Petriskål på en gång. Medan tiden effektiv, flera planarianer i Petriskålen på en gång göra dataanalys svårare eftersom planarianer kan korsa vägar.- För glidningsexperiment, registrera med hjälp av minst 1 bildruta per sekund (FPS). För scrunching/peristalsis experiment, spela in med hjälp av en FPS som är minst dubbelt scrunching / peristaltiken frekvensen av den planaistiska arten. Om den planarian arten har en okänd scrunching/peristalsis frekvens, använd 10 FPS som utgångspunkt och öka/minska i förekommande fall.
- Vid användning av en kemisk lösning, överför planari med så få droppar plana vatten som möjligt så att koncentrationen av den kemiska lösningen inte ändras nämns i någon större utsträckning.
- För glidningsexperiment, spela in 1-2 minuters glidbeteende. För scrunching/peristalsis experiment, spela in tillräckligt länge för att fånga minst 3 på varandra följande svängningar som förekommer i en rak linje. När experimentet är klart avslutar du inspelningen.
OBS: För scrunching / peristalsis experiment, om en planarian inte uppfyller uppsägningskriteriet inom en fast tidsperiod som måste vara konsekvent över replikat och är empiriskt bestäms baserat på stimulans, avsluta inspelningen och testa en annan planarian.- Om planarianen når gränsen av arenan utan att tillfredsställa uppsägningskriteriet, pipettera planarian tillbaka till mitten av arenan.
OBS: Undvik upprepad pipettering av en individ för inspelning, eftersom detta kan ändra dess beteende.
- Om planarianen når gränsen av arenan utan att tillfredsställa uppsägningskriteriet, pipettera planarian tillbaka till mitten av arenan.
- Avlägsna planari(arna) från arenan och släng det plana vatten eller den kemiska lösningen i lämpliga avfallsbehållare. Planarianer som var i planarisk vatten kan återlämnas till sin hembehållare.
OBS: Undvik korskontaminering genom att använda olika arenor för olika medier (dvs. glidning i planarisk vattenexperiment bör inte köras i en arena som tidigare användes för scrunching/peristalsis-experiment med kemisk exponering).- Seriellt skölj planarianer som exponeras för en kemisk lösning i 3 rena 100 mm Petriskålar fyllda med 25 mL planarivatten för att noggrant späda ut eventuella kemikalier. Om scrunching eller peristaltik inducerades, placera dessa planarians i en separat behållare. Planarians kan returneras till sitt hem behållare efter en månad eftersom de flesta celler skulle ha vänt över vid den tiden1.
OBS: Om flera olika experiment behövs för samma population av planarianer, t.ex., för en RNAi befolkning, låt planarians att återhämta sig i 24 timmar innan du kör nästa experiment. Beställ experimenten så att det minst invasiva experimentet är först och det mest invasiva experimentet (t.ex. amputation) körs sist. - Om du kör flera experiment i samma arena, korrekt avyttra badlösningen och ta bort eventuella slem spår genom att torka ner arenan med en pappershandduk mellan körningar.
OBS: Protokollet kan pausas här.
- Seriellt skölj planarianer som exponeras för en kemisk lösning i 3 rena 100 mm Petriskålar fyllda med 25 mL planarivatten för att noggrant späda ut eventuella kemikalier. Om scrunching eller peristaltik inducerades, placera dessa planarians i en separat behållare. Planarians kan returneras till sitt hem behållare efter en månad eftersom de flesta celler skulle ha vänt över vid den tiden1.
- Placera en dimbar LED-panel på en plan yta. LED-panelen tjänar två syften: (1) att ge en enhetlig vit bakgrund och (2) som ska användas som en justerbar ljuskälla för att erhålla lämplig kontrast. Placera en 100 mm Petriskålarena på LED-panelen.
- Kvantitativ analys av planariskt beteende
- Utför plana beteendeanalyser enligt beskrivningen i avsnitt 1.1.
- Öppna råbildsekvensen för ett experiment i Fiji (Arkiv > Importera > Bildsekvens) och välj den första bilden i bildsekvensen. I fönstret Sekvensalternativ kryssar du i rutan för "Sortera namn numeriskt" och klickar på "OK". När bildsekvensen har lästs in konverterar du bildsekvensen till 8-bitars (Bild > Typ > 8-bitars) och använder pilverktyget eller skjutreglaget längst ned i bildstacken för att titta på eller panorera genom bildsekvensen.
OBS: För glidexperiment kan alla data användas så länge planarian tydligt kan ses under hela inspelningen. Det är dock oftast tillräckligt att analysera den fria rörelse i mitten av arenan genom att extrahera den relevanta delen (s) som beskrivs nedan. - För att extrahera en tidsperiod och en intresseregion drar du en intresseregion som omfattar en planarians fullständiga väg med hjälp av rektangelverktyget (Bild 2A, 2B). Högerklicka på bildstacken och välj Duplicera..., markera rutan för Dubblettstack, ange första och sista bildrutorna i sekvensen av intresse och klicka på OK. Om flera planarianer avbildades samtidigt, upprepa denna region val och dubbelarbete steg för varje planarian i arenan så att det finns så många öppna bild stackar som det finns planarians i arenan. Följande steg (steg 1.2.4-1.2.10) ska utföras på varje bildstack, en i taget.
- För glidning experiment, extrahera en period av glidning där planarian rör sig minst dubbelt sin kroppslängd.
OBS: Ju mer gliddata som extraheras per planarian, desto mer tillförlitliga kommer uppgifterna att bli. Planarianen behöver inte röra sig i en rak linje för glidanalysen. - För scrunching/peristalsis experiment, extrahera en instans när planarian genomgår minst tre på varandra följande (helst mer) kroppssvängningar i en rak linje, se till att varje svängning är en komplett töjning-kontraktion cykel, som full svängningar är nödvändiga för att exakt bestämma frekvensen.
OBS: Ju fler svängningar som kan extraheras, desto mer tillförlitliga blir uppgifterna. Använd inte sekvenser där planarianen vänder eftersom dessa kommer att resultera i felaktiga längdmätningar.
- För glidning experiment, extrahera en period av glidning där planarian rör sig minst dubbelt sin kroppslängd.
- Tillämpa ett tröskelvärde på den dubblerade bildstacken (Bild > Justera > Tröskelvärde) för att binarisera bilden och extrahera planarian från bakgrunden. Justera skjutstaplarna vid behov så att hela planarian är markerad med rött. De exakta värdena är beroende av bildkvalitet. Lämna rutorna för Mörk bakgrund, Stapla histogram och Återställ inte räckvidden omarkerad. Bläddra igenom bildstacken för att säkerställa ett bra tröskelintervall (dvs. planarian är väl separerad från bakgrunden i hela stapeln) och klicka sedan på Använd.
- I fönstret Konvertera stack till binärt anger du metoden till Standard och bakgrunden till ljus. Avmarkera alla rutor i det här fönstret och klicka sedan på OK. En binariserad bild som visar en svart planarian på en vit bakgrund kommer att visas (Bild 2C). Se till att hela planarian syns i alla bildsekvensens ramar.
OBS: Oönskade objekt i den binariserade bildsekvensen som är mindre eller större än planariet kan filtreras bort i den efterföljande analysen med hjälp av ett storleksfilter (Bild 2Ciii). - Ange mått genom att klicka på Analysera > Ange mått. Markera rutorna för Område, Mitten av massan, Stackpositionoch Passa ellips och klicka på OK.
OBS: Dessa parametrar behöver bara ställas in en gång per Fiji-session. - Markera den öppna bildstacken och välj Analysera > Analysera partiklar.
- I fönstret Analysera partiklar väljer du Visa > Masker om du vill öppna en ny stapel som visar alla objekt som upptäcktes med de valda parametrarna. Detta kan användas för att visuellt kontrollera att endast mätningar av planarianen tas. Ett storleksfilter kan ställas in vid detta steg för att avlägsna oönskat brus genom att ange det ungefärliga området för planarian (i pixel2-enheter) i det utrymme som tillhandahålls. Markera rutorna för Bildskärmsresultat och Rensa resultat och klicka på OK.
OBS: I fönstret Resultat, om indexet (första kolumnen) inte är lika med segmentnumret för alla rader, betyder det att antingen för många eller för få objekt spårades. En möjlighet för denna diskrepans är förekomsten av andra föremål förutom planarian eller att planarian inte spårades i specifika ramar. - Panorera genom maskbildsstacken med hjälp av reglaget längst ned på panelen. Om det finns något brus eller om det finns ramar som saknar en planarian stänger du fönstret Resultat och maskens bildstapel. Upprepa steg 1.2.7-1.2.8 genom att justera områdesfiltret så att det bara tar bort andra objekt än planarian.
OBS: Om planarian saknas i ramen i masken, tyder detta på att den nedre gränsen för området filtret var inställd för högt. - Spara informationen med Arkiv>Sparasom i fönstret Resultat. Lägg till filnamnet .csv för att spara data som kommaavgränsade värden. När data för bildstacken har sparats stänger du respektive bildstapel, och Resultat och Maskera fönster.
- Importera data och ytterligare analysera med hjälp av någon kalkylblad programvara eller freeware. För att beräkna glidhastigheten, se avsnitt 1.3. Om du vill beräkna den fullständiga parameteruppsättningen scrunching/peristalsis hänvisar du till avsnitt 1.4.
OBS: Protokollet kan pausas här. - För att bestämma pixeln till faktisk längdkonvertering öppnar du en bild i Fiji med en referenslängd (t.ex. arenans diameter). Markera linjeverktyget och rita en linje över den kända längden.
- Konvertera pixelenheter till en standardenhet med längd genom att klicka på Analysera > Ange skala. Ange den längd som motsvarar den linje som ritas på bilden i rutan Känt avstånd och ändra Enheten för längd från pixel till den valda standardenheten för längd. Konverteringsfaktorn skrivs bredvid Skala.
OBS: Ett pixelkonverteringsvärde krävs inte för glidning eller scrunching/peristalsisanalyser i avsnitt 1.3 och 1.4.
- Beräkning av glidhastighet
- Med hjälp av datafilen som sparats i avsnitt 1.2 läser du in koordinaterna för masscentrum (COM) x och y och de större axeldatan. Om data sparas som en kommaavgränsad värdefil, motsvarar dessa listor kolumnerna "XM", "YM" respektive "Major".
- Beräkna förskjutningen (d) av det planaska masscentrumet i pixlar för varje bildruta med avseende på nästa bildruta med hjälp av datakolumnerna "XM" och "YM". Deplacement (d) ges av
där x1 och y 1 hänvisar tillCOM-koordinaterna (XM, YM) för en ram och x2 och y 2 referera till KOM-koordinaterna (XM, YM) för den efterföljande ramen. - Ange den planarian kroppslängden som den 95:e percentilen i "Major" kolumnen. Eftersom planarians uppvisar en vägg preferensbeteende 32, detta säkerställer att den beräknade planarian kroppslängd är representativ för när planarian är långsträckt24.
- Normalisera förskjutningen efter planarisk kroppslängd genom att dela pixelförskjutningarna per bildruta med den planaska kroppslängden (l). Normaliserad förskjutning (dn) ges av:
- Generera en lista över normaliserade hastigheter genom att dividera de normaliserade förskjutningarna med den tid som förflutit per bildruta (invers av det inspelade FPS). Normaliserad glidhastighet (sn) ges av:
- Beräkna den normaliserade glidhastigheten för planarian genom att ta medelvärdet av den normaliserade hastighetslistan (sn). Standardavvikelsen får användas som osäkerhetsmätning för planarian.
- Upprepa steg 1.3.1-1.3.6 för varje planarian som ska analyseras. Medel och ta glidhastighetens standardavvikelse för alla planarianer för att få glidhastigheten respektive tillhörande osäkerhet för en planariansk population.
- Åtskillnad av scrunching och peristalsis gångarter med hjälp av den fullständiga parameteruppsättningen
- Läs in datalistan för huvudaxeln från datafilen som sparats från Avsnitt 1.2. Om data sparas som en kommaavgränsad värdefil motsvarar detta kolumnen Större.
- Skapa en lista som numrerar varje datapunkt i kolumnen Major, med början på 0. Konvertera den här listan till tid som förflutit per bildruta genom att dividera med det inspelade FPS.
- Rita in de större kolumnuppgifterna med avseende på tid som förflutit för att generera en scrunching/peristalsis svängningsrit (Figur 3A). Med hjälp av svängningsriten trimmar du data till minst tre på varandra följande, linjära svängningar (Figur 3Bi). Trimma data för att starta och sluta vid lokala toppar (maximal töjning av svängning) eller dalar (minsta töjning av svängning).
OBS: Om lokala extrema inte är ungefär lika (toppar/dalar skiljer sig dramatiskt i höjder), tyder detta på att svängningarna inte är linjära (figur 3Bii). Extrahera en annan sekvens av minst tre på varandra följande, linjära svängningar. Se avsnitt 1.2. - Bekräfta att svängningssekvensen av intresse har extraherats och trimmats ordentligt genom att omlotta de trimmade Major-data med avseende på tiden. Använd den här trimmade datalistan för alla efterföljande beräkningar.
- För att beräkna svängningsfrekvens (νm), dividera antalet svängningar (On) med det totala antalet datapunkter i den trimmade datalistan för större axel (N). Multiplicera FPS med detta värde för att få frekvens i svängningar per sekund.
- Så här beräknar du maximal töjning (|Δε| max), subtrahera den absoluta minsta kroppslängden (lmin) från den absoluta maximala kroppslängden (lmax). Normalisera till avlång kroppslängd genom att dividera med den absoluta maximala kroppslängden.
- För att beräkna hastighet per kroppslängd (v*m), multiplicera den beräknade maximala töjningen med svängningsfrekvensen.
OBS: Hastighet ensam kan användas för att skilja mellan scrunching och peristalsis gångarter7. - För att beräkna den fraktion av tid som spenderas avlånga (flångf år), ta derivat av trimmade större axel datalista med avseende på tid. Dividera antalet positiva datapunkter (dvs. när derivatan är >0 (np), med det totala antalet datapunkter i datalistan för huvudaxeln (nt)).
OBS: Scrunching planarians uppvisar en asymmetrisk del av den tid som spenderas avlånga medan planarianer utför peristalsis spendera lika mycket tid som avlånga och upphandlande7. - Upprepa steg 1.4.1-1.4.8 för varje planarian som ska analyseras. Beräkna en planarian population parameter som anges genom att ta medelvärdet och standardavvikelsen för varje parameter.
OBS: Parameteruppsättningen kan användas för att avgöra om svängningsbeteendet är scrunching, peristaltik eller någon annan form av förflyttning med periodiska förändringar kroppsform. Både scrunching och peristalsis har fasta parametrar för en viss art7, med scrunching parametrar i allmänhet är större än peristalsis parametrar7. Även om det är möjligt att en av parametrarna kan falla utanför det artspecifika utståetet, som vi tidigare har observerat med kemiskinduktion 28, måste det observerade beteendet komma överens med minst 3 av 4 publicerade parametrar som ska kategoriseras som antingen peristaltik eller scrunching.
2. Scrunching induktion
- Fysiska stimuli (skadlig temperatur, UV-ljus, amputation)
- För alla fysiska stimuli-experiment, se avsnitt 1.1 för experimentinställningen.
OBS: Det är bäst att använda en stor arena, såsom en 100 mm Petriskål, för fysiska stimuli experiment för att möjliggöra mer öppet utrymme för manövrering av en pipett och / eller rakblad. - För att framkalla scrunching via skadlig temperatur, värmeplanarvatten i en glasbägare (minst 100 μL per planarisk som ska testas) till 65 °C på en värmeplatta.
- Placera en planarian i mitten av arenan. Vänta tills planarian orienterar sig upprätt och börjar glida. Påbörja inspelningen.
- Med hjälp av en P-200-pipett, långsamt pipettera 100 μL av 65 ° C planarian vatten post-faryngeally på svansen änden av planarian att inducera scrunching.
OBS: Se till att det uppvärmda planarivattnet stannar vid 65°C. Värm om vattnet till 65°C innan du startar ett nytt experiment om det behövs. Eftersom trycket kan också framkalla scrunching, är långsam pipettering nödvändig. Pipetting rumstemperatur vatten på samma sätt som i experimentet kan fungera som en kontroll och praxis alternativ. - Stoppa inspelningen när scrunching har upphört. Placera planarian i en återvinning behållare och utbyta media i petriskålen med färska, rumstemperatur plana vatten om kör fler experiment.
- För att framkalla scrunching via amputation, överföra en planarian till centrum av arenan och vänta tills planarian orienterar sig upprätt och börjar glida. Påbörja inspelningen.
- Amputera planarian med hjälp av ett rent rakblad. Amputationer kan göras var som helst längs planarian så länge den skurna platsen är konsekvent över experiment.
OBS: Scrunching parametrar extraheras från den främre biten. Undvik således att hindra kamerans syn på denna del av planaren när du tillämpar snittet genom att närma sig från den bakre änden. Plastskyddssliar fungerar också bra för skärning och är ett säkrare alternativ, särskilt i en undervisningsmiljö. - Stoppa inspelningen när den främre pjäsen har upphört scrunching. Ta bort båda bitarna, placera dem i en separat behållare och låt dem regenerera i 7 dagar. Amputerade planarianer kan återinföras i hembehållaren när de regenererats.
- Amputera planarian med hjälp av ett rent rakblad. Amputationer kan göras var som helst längs planarian så länge den skurna platsen är konsekvent över experiment.
- För att framkalla scrunching med hjälp av nära UV-ljus, fäst lämpliga filter (t.ex. Roscolux filter) till kameralinsen för att minska mängden reflekterat nära UV-ljus som samlas in av kameran och kan störa bildframställning planarians svar. Istället för att använda LED-panelen för att belysa arenan underifrån, använd omgivande röd belysning som planarianer är okänsliga33.
- Fyll en 100 mm Petriskålarena med planärt vatten och placera en enda planarian (5-9 mm) i arenans centrum. Börja inspelningen på 10 FPS.
- Håll en klass II UV-laserpekare (405 ± 10 nm, uteffekt <5 mW) cirka 30 cm från arenan. Placera laserpekaren i 45° vinkel från glidplanaren och sedan lysa laserpekaren i 5-10 sekunder halvvägs mellan den bakre änden av svalget och svansspetsen för att framkalla scrunching.
OBS: Laserpekarens effekt kan mätas med hjälp av en nära UV-känslig effektmätare. - Vänta tills planarian att börja glida igen innan du försöker två mer stimulanser på samma individ för att testa för reproducerbarhet av reaktionen. Om planarianen fortsätter att visa samma beteende, sluta spela in och sätt tillbaka planarian i sin behållare. Om beteendet ändras mellan stimulering, kommer ytterligare tester att visa vilket svar som är den mest framträdande.
OBS: Planarianer kan bli desensibiliserade till nära UV-ljus och kommer att sluta reagera. På varandra följande stimulering kräver en viloperiod på 8-10 sekunder.
- För alla fysiska stimuli-experiment, se avsnitt 1.1 för experimentinställningen.
- Kemisk stimulans (AITC)
- För att framkalla scrunching med hjälp av en kemikalie, t.ex.28 Vid behov kan pipettering tillämpas enligt beskrivningen i avsnitt 2.1.2.3.
VAR FÖRSIKTIG: AITC är brandfarligt, akut giftigt, kan orsaka hud- och ögonirritation, luftvägs- och hudsensibilisering, och är farligt för vattenlevande liv. AITC olja ska hanteras i en rök huva. Innan du gör lager lösningar av AITC, sätta på lämplig PPE (nitrilhandskar och en labbrock) och inrätta lämpliga fasta och flytande farligt avfall destruktionsbehållare. - I en rökhuv, gör en 10 mM stamlösning av AITC i planarisk vatten i ett 50 mL centrifugrör. Denna stamlösning är brukbar i upp till en månad vid förvaring i 4°C.
- Från detta lager, preparera en 25 mL arbetslösning på 100 μM AITC i planarisk vatten i ett 50 mL centrifugrör. Denna 100 μM AITC-lösning kommer att användas för att framkalla scrunching hos planarianer.
OBS: 100 μM AITC inducerar konsekvent scrunching i D. japonica och S. mediterranea planarians28. För andra akvatiska planarianer kan 100 μM tjäna som startkoncentration och kan justeras i enlighet med detta. - Ställ in experimentinställningen (se avsnitt 1.1). Fyll arenan med AITC arbetslösningen och placera den i en sekundär behållare. Den sekundära behållaren bör hålla minst två gånger volymen av arenan.
OBS: Experiment kan utföras inuti en draghuv för extra säkerhet. - Överför upp till 10 planarianer till arenans centrum och börja spela in.
- När planarianerna blir desensibiliserade och upphör med scrunching, sluta spela in. Ta bort planarianerna från AITC-lösningen och skölj (se avsnitt 1.1). Kassera fast och flytande AITC-avfall i lämpliga avfallsbehållare.
- Verifiera specificiteten hos svaret på AITC med hjälp av RNAi till TRPA128 enligt standardprotokoll.
- Från detta lager, preparera en 25 mL arbetslösning på 100 μM AITC i planarisk vatten i ett 50 mL centrifugrör. Denna 100 μM AITC-lösning kommer att användas för att framkalla scrunching hos planarianer.
- För att framkalla scrunching med hjälp av en kemikalie, t.ex.28 Vid behov kan pipettering tillämpas enligt beskrivningen i avsnitt 2.1.2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Extraocular near-UV-uppfattning i S. medelhavet planarians är TRPA1-beroende och har föreslagits att kopplas till H2O2 release17. Eftersom H2O2 exponering inducerar TRPA1-beroende scrunching i S. mediterranea och D. japonica planarians28, stegen i avsnitt 2.1.4 kan användas för att testa om nära UV-ljus exponering inducerar scrunching i båda arterna. Medan D. japonica planarians scrunch (10/10) när de utsätts för nära UV-ljus, S. medelhavet planarians antingen uppvisar svans gallring (7/10) som tidigarebeskrivits 17 eller inget svar (3/ 10) (Figur 4A,4B). En kvantifiering av scrunching parametrarna, som beskrivs i avsnitt 1.4, för D. japonica planarians som uppvisade minst 3 på varandra följande rak-line scrunches avslöjar karakteristiska scrunching parametrar för denna art7,28 (νm = 0,84 ± 0,14, | Δε| max = 0,56 ± 0,06, v*m = 0,47 ± 0,07, och f elong = 0,56 ± 0,03, värden som redovisas som medelvärde ± standardavvikelse för N=7).
Däremot ger exponering för 250 μM cinnamaldehyd, en känd TRPA1-agonist hosmöss 34, orsakar scrunching i S. mediterranea7,28 (νm = 0,46 ± 0,08, | Δε| max = 0,36 ± 0,08, v*m = 0,16 ± 0,04, och felong = 0,58 ± 0,04, värden som rapporteras som medelvärde n ± standardavvikelse för N=8) (Figur 5A), medan D. japonica-planarianer vid samma (och 1,6x koncentrationen) visar en blandning av ormliknande och oscillatorisk rörelse, avbruten av glidning och/eller kraftig huvudsvål (Figur 5A). En kvantifiering av (8/24) proverna med minst tre på varandra följande svängningar ger betydligt lägre värden för 3 av 4 parametrar än förväntat för scrunching i denna art (νm = 0,43 ± 0,08, | Δε| max = 0,39 ± 0,03, v*m = 0,17 ± 0,02, och f elong = 0,54 ± 0,06, värden som redovisas som medelvärde ± standardavvikelse för N=8). Medan D. japonica verkar scrunch vid cinnamaldehyd exponering, en jämförelse av de beräknade parametrarna med litteraturvärdena för denna art7,28 visar att den observerade oscillatory rörelse inte scrunching. Det här exemplet belyser vikten av kvantitativa mätningar i samband med noggrann inspektion av de råa beteendedata för att korrekt tolka observerade beteenden.
RNAi bekräftar specificiteten hos scrunching som svar på cinnamaldehyd exponering i S. mediterranea. Inom 180 sekunder efter exponering för 250 μM cinnamaldehyd i planarisk vatten 15/15 unc22 (kontroll) RNAi S. Medelhavsområdet planarianer scrunched, medan 0/16 SmTRPA1 RNAi planarians scrunched (Figur 5B), visar att S. medelhavet scrunching i cinnamaldehyd kräver SmTRPA1. Knockdown av SmTRPA1 bekräftades genom en 60 sekunders exponering för ett 100 μM AITC-bad28.
Bild 1: Planarisk beteende experimentell inställning.
(A) Prov experimentell setup för att studera plana beteende. (B) 100 mm Petriskål arena centrerad i synfältet av kameran. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa exempel på Fijis bildanalys av planarianer i arena.
(A) Utvald region av intresse, som omfattar hela planiska vägen, som anges av den gula rektangeln. (B) Provramar från den region av intresse efter duplicering. (C) Subtrahera planariet från bakgrund och brus via tröskelvärde (i) 8-bitars bild av planarian med buller, betecknas med asterisken. (ii) Binariserad bild av planarian efter tröskelvärden. (iii) Mask av planarian efter att filtrering efter storlek för att avlägsna brus. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Plottning planarian längd med avseende på tid.
(A) Raw tomt av planarian längd kontra tid för en scrunching S. medelhavet planarian. Asterisken betecknar ett ögonblick när planarian vände medan scrunching. (B) Möjliga sätt att trimma scrunching data. (i) En korrekt trimmad tomt som tar bort svarvningshändelsedata. (ii) En felaktigt trimmad tomt som inte tar bort svarvningshändelsedata. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Artspecifika svar på nära UV-ljus.
(A) Provramar av D. japonica scrunching och S. medelhavet svans gallring som svar på nära UV-ljus. (B) Representativa svängningsytlar av S. mediterranea och D. japonica som svar på nära UV-ljus. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Artspecifikt svar på 250 μM cinnamaldehyd, en TRPA1-agonist.
(A) Representativa svängningstomter för D. japonica och S. medelhavsplanarianer i ett 250 μM cinnamaldehydbad. (B) Representativa svängningsytlar som visar förlust av scrunching i 250 μM cinnamaldehyd i SmTRPA1 RNAi S. mediterranea planarians. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande material. Vänligen klicka här för att ladda ner dessa material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av detta protokoll kan man kvantitativt studera effekterna av fysiska och kemiska stimuli7,28,29 ellergenetisk manipulation (RNAi)28,29 på planarisk förflyttning. För att maximera rumslig upplösning är det bäst att flytta kameran så nära arenan som möjligt och samtidigt säkerställa att hela arenan är i synfältet. För att öka dataflödet kan beteendet hos flera planarianer visas på en gång genom att flera planarianer registreras samtidigt. När screening mer än en planarian i en enda arena, regioner av intresse kan dras i Fiji för att isolera enskilda planarians som beskrivs här eller mer avancerade flera objekt spårning kan användas. En fråga med att ha flera planarianer på samma arena är att de kan korsa vägar. Detta problem kan lösas genom användning av flera brunnsplåtar för att isolera planarianer från varandra samtidigt som det möjliggör samtidig inspelning av många individer att kvantifiera beteende23,24. Emellertid ska planarians spendera förhållandevis mer tid på väggen i mindre arenas och att kräva justeringar till avbildaanalysen och att begränsa upplösningen för scrunching/peristalsis quantification.
När stimuli administreras lokalt (t.ex. pipettering7, amputation7,28, laserpekare17), är det avgörande att planarianerna konsekvent stimuleras i samma region eftersom stimulera andra kroppsregioner potentiellt kan framkalla olika beteenden. Olika metoder för leverans (såsom pipettering eller bad av en kemikalie) kan också påverka konsistensen av beteendemässiga fenotyp. Dessutom kan planarianer desensibilisera snabbt28, som måste beaktas när man planerar experiment som samma planarianer bör inte omedelbart återanvändas för flera experiment, antingen med samma eller olika stimuli. Slutligen, som visas här för nära-UV-exponering och cinnamaldehyd, Är det viktigt att vara medveten om att samma stimulans kan framkalla distinkta beteenden i olika planarisk art. D. japonica scrunched när stimuleras med nära UV-ljus nära svansen spets, medan S. medelhavet planarianer visas svans gallring. Däremot cinnamaldehyd exponering inducerad scrunching i S. medelhavet men inte i D. japonica planarians. Således, medan scrunching är en bevarad respons av olika planarisk art till skadliga stimuli7, den har arter specifika parametrar7,28,känsligheter 28, och inducerare28. För en ny art för vilken scrunching ännu inte har parametern, är det bäst att börja med en väl bevarad inducerare, såsom amputation7, för att bestämma de artspecifika parametrarna innan man testar svaret på andra stimuli.
En begränsning av analysen som beskrivs här är att den inte tar hänsyn till svängar och/eller blandade beteenden, till exempel intermittent scrunching med huvudswiggling, glidflygning eller andra kroppsformsförändringar. Noggrann inspektion av rådata kan dock bidra till att minska dessa problem om dessa instanser manuellt undantas från analysen, vilket visas i figur 3. Dessutom är det möjligt att lägga till kroppsform analys till centrum av massa och längd spårning som beskrivs här och expandera protokollet för att kvantifiera dessa andra planarian beteenden. Med tanke på att analysen inte gör några antaganden om den studerade organismen, skulle protokollet i princip också kunna tillämpas på andra organismer som visar liknande typer av beteenden.
Metoden att kvantifiera de olika planaserna gångarter och skilja scrunching från peristaltiken, som beskrivs här, förutsätter ingen föregående utbildning i beräkningsbildanalys eller beteendestudier och kräver inte specialiserad utrustning eller programvara. För att underlätta protokollanpassning tillhandahålls exempeldata i supplementalmaterialet. Den lätthet att få och culturing planarians, liksom förmågan att spela in beteenden utan specialiserad utrustning, gör planiska beteendestudier i stort sett tillgängliga för forskning på alla nivåer, från grundskolan klassrum till akademiska laboratorier. En modifierad version av detta protokoll har framgångsrikt använts i en undervisning laboratorium inställning som främst bestod av freshmen och sophomore studenter och inkluderade både blivande STEM och icke-STEM stora.
Kombinationen av molekylära (RNAi) och kemiska verktyg med kvantitativ beteendeanalys, som beskrivs i detta protokoll, gör det möjligt för forskare att få mekanistiska insikter i den molekylära kontrollen av beteende. Sådant arbete har avslöjat några av de viktigaste medlare och neuronala kretsar som deltar i planarian glidning19,20, phototaxis17,35,36, thermotaxis9,37, och scrunching9,28,29. Även om planatiska beteenden kanske inte har direkta följdbeteenden i högre organismer, såsom människor, representerar dessa beteenden grundläggande neuronala funktioner som är viktiga för alla organismer - förmågan att känna av och bearbeta specifika stimuli och reagera på lämpligt sätt. På grund av bevarandet av viktiga neuronala funktioner över olika organismer, mekanistiska studier i planarianer kan lära oss mer allmänt om neuronal kontroll av beteende. Dessutom, analysera planarisk beteende som svar på kemisk exponering kan användas för att studera kemikaliens effekter på det planarian nervsystemet23,24,25, som kan informera om potentiella risker för den mänskliga hjärnan. I synnerhet scrunching framkallas genom skadliga värme befanns vara en känslig och specifik slutpunkt för assaying neurotoxicitet, eftersom det blir störd av exponering för vissa klasser av kemikalier22,24,25,30. Slutligen, planarian unika regenerativ förmåga tillåter forskare att dissekera dynamiken i hur olika beteenden återställs under neuroregeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Mr Tapan Goel för kommentarer om manuskriptet. Detta arbete finansierades av NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , Planarian Press. (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
