Summary
Tatlı su planarians üç yürüyüş sergiler (kayma, peristalsis, ve scrunching) kantitatif davranış analizi ile ayırt edilebilir. Çeşitli zararlı uyaranlar, bunların nicelliği ve peristalsis ve süzülme ayrımı kullanılarak scrunching'i tetikleyen bir yöntem tanımladık. Gen nakavtını kullanarak, kantitatif henotipik okuma olarak scrunching özgüllüğünü gösteririz.
Abstract
Tatlı su planarians normalde kendi ventral tarafında siliyer itiş yoluyla sorunsuz kayma. Ancak bazı çevre koşulları kas lara bağlı hareket biçimlerine neden olabilir: peristalsis veya scrunching. Peristalsis bir siliyer defektinden kaynaklanırken, scrunching silia fonksiyonundan bağımsızdır ve ampütasyon, zararlı sıcaklık, aşırı pH ve etanol gibi belirli uyaranlara özgü bir tepkidir. Böylece, bu iki kas odaklı yürüyüş mekanistik farklıdır. Ancak, nitel olarak ayırt etmek zor olabilir. Burada, çeşitli fiziksel ve kimyasal uyaranlar kullanılarak scrunching indükleme için bir protokol sağlar. Serbestçe kullanılabilen bir yazılım kullanarak peristalsis ve kaymadan ayırt etmek için kullanılabilen scrunching'in nicel karakterizasyonunu ayrıntılarıyla anlatıyoruz. Scrunching evrensel bir planarian yürüyüş olduğundan, karakteristik türlere özgü farklılıklar olsa da, bu protokol genel olarak planarians tüm türler için uygulanabilir, uygun hususlar kullanılarak. Bunu göstermek için, davranışsal araştırmalarda kullanılan en popüler iki planertürün yanıtını karşılaştırıyoruz, Dugesia japonica ve Schmidtea mediterranea, aynı fiziksel ve kimyasal uyaranlarla. Ayrıca, scrunching özgüllüğü bu protokolün RNA girişim ve / veya ilgili moleküler hedefler ve nöronal devreleri incelemek için farmakolojik maruz kalma ile birlikte kullanılmasına olanak sağlar, potansiyel nosiception ve nöromüsküler iletişim önemli yönleri ne mekanik anlayış sağlayan.
Introduction
Kök hücre ve rejenerasyon araştırma1,2,,3, tatlı su planarians için popülerlik ek olarak uzun davranış çalışmaları kullanılmıştır4,5, onların nispeten büyük boyutu yararlanarak (uzunluğu birkaç milimetre), kolay ve laboratuvar bakım düşük maliyet, ve gözlemlenebilir davranışların geniş spektrumlu. Bilgisayarlı görme ve planer davranış çalışmaları6,7,8,,9,10,11 için otomatik izleme giriş davranış lı fenotiplerin nicel farklılaşmasını sağlamıştır. Hayvan davranışları nöronal fonksiyonun doğrudan okunmasıdır. Planer sinir sistemi orta boy ve karmaşıklık ta olduğu için, ancak omurgalı beyin12,13,,14ile korunmuş anahtar elementleri paylaştığı için, planer davranışların incelenmesi, daha karmaşık organizmalarda doğrudan araştırmak zor olabilecek nöronal eylemin korunmuş mekanizmalarına ışık verebilir. Böylece, planarians karşılaştırmalı nörobiyoloji çalışmaları için değerli bir model8,12,15,16,17,18,19,20,21. Buna ek olarak, su ortamında kimyasallara hızlı ve kolay maruz kalma için rejenerasyon ve yetişkin planarians beyin fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için izin verir, onları nörotoksikoloji için popüler bir sistem yapma22,23,24,25,26.
Planarianlar kayma, peristalsis ve scrunching olarak adlandırılan üç farklı yürüyüş, sahip. Her yürüyüş belirli koşullar altında sergilenir: kayma varsayılan yürüyüş, peristalsis siliary fonksiyonu tehlikeye oluşur7,27, ve scrunching bir kaçış yürüyüşü - cilia fonksiyonu bağımsız – bazı zararlı uyaranlara yanıt olarak7. Biz scrunching belirli bir yanıt olduğunu göstermiştir, bazı kimyasal veya fiziksel ipuçları hissi tarafından ortaya, aşırı sıcaklıklar veya pH dahil, mekanik yaralanma, ya da belirli kimyasal indükleyiciler, ve böylece genel bir stres tepkisi7değildir,28,29.
Özgüllüğü ve basmakalıp parametreleri nedeniyle, kolayca bu protokol kullanılarak ölçülebilir, scrunching araştırmacılar duyusal yollar ve davranış nöronal kontrol diseksiyon mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için olanak sağlayan güçlü bir davranışsal fenotip25,28. Ayrıca, scrunching sinir sistemi gelişimi ve nörotoksikoloji çalışmalarında fonksiyon üzerinde olumsuz kimyasal etkileri tsay hassas bir bitiş noktası olduğu gösterilmiştir22,24,25,30. Birkaç farklı duyusal yollar çeşitli mekanizmalar28ile scrunching ikna etmek için yakınsama gibi görünüyor gibi, çeşitli çünkü scrunching diğer planer davranışlardan farklıdır, ama özel, uyaranlar farklı nöronal devreleri incelemek ve farklı sinyaller inscrunching fenotip üretmek için entegre nasıl çalışma için kullanılabilir.
Daha da önemlisi, tür farklılıkları vardır, oysa bir kimyasal bir planarian türde scrunching ortaya çıkabilir, ama başka bir farklı bir davranışsal tepki. Örneğin, biz anandamid planarian türler Dugesia japonica scrunching neden olduğunu bulduk ama Schmidtea mediterranea28peristalsis neden olur . Bu örnek, farklı moleküler mekanizmaların henotibik tezahürleri olduğundan, farklı yürüyüş leri güvenilir bir şekilde ayırt edebilmenin önemini vurgulamaktadır. Ancak, peristalsis scrunching ayrım nitel gözlemsel veri kullanarak zordur, her iki gait kas odaklı ve paylaşmak nitel benzerlikler7,,28çünkü . Bu nedenle, yürüyüş ayırt etmek için bu cilia görüntüleme veya karakteristik parametreler7 dayalı ayrım sağlayan bir nicel davranışsal çalışma yapmak için gereklidir7,28. Çünkü cilia görüntüleme deneysel zorlu ve yüksek büyütme bileşik mikroskop ve yüksek hızlıkamera7 gibi özel ekipman gerektirir 7,28, bu nicel davranış analizi gibi araştırmacılar için geniş erişilebilir değildir.
Burada, (1) çeşitli fiziksel (zararlı sıcaklık, ampütasyon, yakın UV ışığı) ve kimyasal (allyl izothiocyanat (AITC), cinnamaldehit) uyaranları ve (2) serbestçe kullanılabilir yazılım kullanarak planarian davranışın kantitatif analizi kullanılarak scrunching indüksiyon uğrama için bir protokol satıyoruz. Dört parametre (vücut uzunluğu salınımları sıklığı, göreli hız, maksimum genlik ve vücut uzama ve daralma asimetrisi) ölçerek7, scrunching kayma ayırt edilebilir, peristalsis, ve diğer davranışdurumları literatürde bildirilen, yılan gibi hareket15 veya epilepsi esme15gibi . Ayrıca, scrunching farklı planarian türler arasında korunur iken7, Her türün kendi karakteristik frekans ve hız vardır; bu nedenle, bir türün kayma ve scrunching hızları belirlendikten sonra, hız tek başına kayma ve peristalsis29scrunching ayırt etmek için bir araç olarak kullanılabilir. Protokol, hesaplamalı görüntü analizi veya davranış salg›r›mlar›nda önceden bir eðitim bulunmad›r ve bu nedenle lisans düzeyinde bir öğretim laboratuvar›nda planer davranış deneyleri için de uygulanabilir. Protokol adaptasyonuna yardımcı olmak için örnek veriler Ek Malzeme'de verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nicel planer davranış tahlilleri
- Deneysel kurulum
- Düz bir yüzeye soluk led panel yerleştirin. LED paneli iki amaca hizmet eder: (1) düzgün beyaz arka plan sağlamak ve (2) uygun kontrast elde etmek için ayarlanabilir bir ışık kaynağı olarak kullanılmak üzere. LED panelüzerine 100 mm Petri çanak arena yerleştirin.
NOT: İş bilgililiği artırmak için, çok kuyulu bir plaka arena23,24olarak kullanılabilir, ancak daha büyük arenalar otomatik görüntü analizini kolaylaştırır. - Arenanın üzerindeki bir halka standına kamera monte edin (Şekil 1A). Kamera konumunu, yüksekliğini ve odağı gerektiği gibi ayarlayın, böylece tüm arena görüş alanı içinde ortalanır ve odaktadır(Şekil 1B).
NOT: Kamera çözünürlüğü, bir planacıyı LED panel tarafından sağlanan homojen arka plandan açıkça ayırt edecek kadar yüksek olmalıdır. - Arenayı uygun pozlama ortamıyla (planarian su veya kimyasal çözelti) maksimum yarı hacimle doldurun (buna banyo denir). Bu, 100 mm petri kabı için yaklaşık 25 mL'ye karşılık gelir. LED paneli açın ve kayıt kalitesini olumsuz etkileyebilecek diğer ışık kaynaklarını kapatın (örneğin, arenaya bir parlama sağlayan yakındaki ışık kaynakları).
DİkKAT: Tam kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyerek ve gerekirse deneysel kurulumu bir duman kaputuna taşıyarak tehlikeli kimyasal çözümleri uygun şekilde yönetin. Atık ların bertarafı ile ilgili federal ve eyalet yönetmeliklerine uyun. - Bir transfer pipeti kullanarak arenanın merkezine doğru bir planarian bırakın. Kaydetmeye başla. Verileri yerel Fiji31 biçiminde görüntü dizileri olarak kaydedin (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM veya FITS; bkz. görüntü analizi bölümü 1.2).
NOT: Davranışlar ve dış uyaranlara karşı duyarlılık bireysel plancılar arasında farklılık gösterdiğinden, teknik çoğaltmaların yanı sıra yeterli sayıda biyolojik çoğaltma hakkında veri toplamak da önemlidir. Aynı anda 100 mm Petri kabında 10'a kadar orta boy (4-7 mm) planarian ile çalıştık. Zaman verimli iken, Petri çanak aynı anda birden fazla planarians planarians yolları kesişebilir beri veri analizi daha zor hale getirir.- Süzülme denemeleri için saniyede en az 1 kare (FPS) kullanarak kaydedin. Scrunching/peristalsis deneyleri için, planarian türlerin scrunching/peristalsis frekansının en az iki katı olan bir FPS kullanarak kayıt edin. Planer türlerin inmeden scrunching/peristalsis frekansı varsa, başlangıç noktası olarak 10 FPS kullanın ve uygun olduğunca artış/azalış.
- Kimyasal bir solüsyon kullanırken, kimyasal çözeltinin konsantrasyonunun önemli ölçüde değişmemesi için planarian suyu mümkün olduğunca az damla kullanarak planarian'ı aktarın.
- Süzülme deneyleri için, 1-2 dakikalık kayma davranışı kaydedin. Scrunching/peristalsis deneyleri için, düz bir çizgide meydana gelen en az 3 ardışık salınımı yakalayacak kadar uzun bir kayıt. Deneme tamamlandıktan sonra kaydı sonlandırın.
NOT: Scrunching/peristalsis deneyleri için, bir planer, çoğaltmalar arasında tutarlı olması gereken ve uyarıcıya dayalı ampirik olarak belirlenen belirli bir süre içinde sonlandırma kriterini karşılamazsa, kaydı sonlandırın ve başka bir planlayıcıyı test edin.- Eğer planarian sonlandırma kriterini karşılamadan arenanın sınırına ulaşırsa, planarian'ı arenanın merkezine geri getirin.
NOT: Bu davranışını değiştirebileceğinden, bir bireyin kayıt için tekrarlanan pipetlemelerinden kaçının.
- Eğer planarian sonlandırma kriterini karşılamadan arenanın sınırına ulaşırsa, planarian'ı arenanın merkezine geri getirin.
- Planarian(lar)ı arenadan çıkarın ve planarian suyu veya kimyasal çözeltiyi uygun atık kaplarına atın. Planarian su vardı planarians ev konteyner iade edilebilir.
NOT: Farklı ortamlar için farklı arenalar kullanarak çapraz kontaminasyondan kaçının (örneğin, planer su deneylerinde kayma daha önce kimyasal maruzkalma ile scrunching/peristalsis deneyleri için kullanılan bir alanda çalıştırılmamalıdır).- Kimyasal çözeltiye maruz kalan planarianları seri olarak durulayın, 3 temiz 100 mm Petri kabında 25 mL planer su ile doldurularak herhangi bir kimyasalı iyice seyreltin. Scrunching veya peristalsis indüklenen ise, ayrı bir konteyner bu planarians yerleştirin. Çoğu hücre ozamanakadar teslim olurdu beri Planarians bir ay sonra kendi konteyner iade edilebilir 1 .
NOT: Aynı planer popülasyonu için birden fazla farklı deney gerekiyorsa, örneğin, bir RNAi popülasyonu için planerlerin bir sonraki denemeyi çalıştırmadan önce 24 saat boyunca kurtarmalarına izin verin. En az invaziv deneyin ilk ve en invaziv deney (örneğin, ampütasyon) en son çalıştırılır gibi deneyler sipariş edin. - Aynı arenada birden fazla deney yapıyorsanız, düzgün banyo çözeltisi atın ve çalışır arasında bir kağıt havlu ile arena silerek herhangi bir mukus izleri kaldırın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
- Kimyasal çözeltiye maruz kalan planarianları seri olarak durulayın, 3 temiz 100 mm Petri kabında 25 mL planer su ile doldurularak herhangi bir kimyasalı iyice seyreltin. Scrunching veya peristalsis indüklenen ise, ayrı bir konteyner bu planarians yerleştirin. Çoğu hücre ozamanakadar teslim olurdu beri Planarians bir ay sonra kendi konteyner iade edilebilir 1 .
- Düz bir yüzeye soluk led panel yerleştirin. LED paneli iki amaca hizmet eder: (1) düzgün beyaz arka plan sağlamak ve (2) uygun kontrast elde etmek için ayarlanabilir bir ışık kaynağı olarak kullanılmak üzere. LED panelüzerine 100 mm Petri çanak arena yerleştirin.
- Planer davranışın nicel analizi
- Bölüm 1.1'de açıklandığı gibi planer davranış tahlillerini gerçekleştirin.
- Fiji'deki bir denemeiçin ham görüntü sırasını açın(Dosya > İçe Aktar > Görüntü Sırası)ve görüntü dizisindeki ilk görüntüyü seçin. Sıra Seçenekleri penceresinde, "Adları sayısal olarak sırala" kutusunu işaretleyin ve "Tamam"ı tıklatın. Görüntü sırası yüklendikten sonra, görüntü sırasını 8-bit 'e(Resim > Yazın > 8-bit)dönüştürün ve görüntü dizisini izlemek veya kaydırmak için görüntü yığınının altındaki ok aracını veya kaydırıcıyı kullanın.
NOT: Kayma denemeleri için, planer kayıt boyunca açıkça görülebildiği sürece tüm veriler kullanılabilir. Ancak, genellikle aşağıda açıklandığı gibi ilgili parça (lar) ayıklayarak arenanın merkezinde serbest hareket analiz etmek yeterlidir. - Bir zaman dilimini ve ilgi bölgesini ayıklamak için, dikdörtgen aracını kullanarak planacının tam yolunu kapsayan bir ilgi bölgesi çizin(Şekil 2A, 2B). Resim yığınına sağ tıklayın ve Yinelenen...'u seçin, Yinelenen yığıniçin kutuyu işaretleyin, ilgi sırasının ilk ve son karelerini girin ve Tamam'ıtıklatın. Birden fazla planarians aynı anda görüntülenmiş olsaydı, arenada planerler gibi çok sayıda açık görüntü yığınları var, böylece arenada her planarian için bu bölge seçimi ve çoğaltma adımı tekrarlayın. Aşağıdaki adımlar (Adımlar 1.2.4-1.2.10) her görüntü yığınıüzerinde teker teker gerçekleştirilmelidir.
- Süzülme deneyleri için, planörün vücut uzunluğunun en az iki katı hareket ettiği bir kayma dönemi ayıklayın.
NOT: Planarian başına ne kadar çok süzülen veri ayıklanırsa, veriler o kadar güvenilir olur. Planarian kayma analizi için düz bir çizgide hareket olması gerekmez. - Scrunching/peristalsis deneyleri için, planerin en az üç ardışık (ideal olarak daha fazla) vücut salınımı geçirdiği bir örneği düz bir çizgide ayıklayarak, her salınımın tam bir uzama-daralma döngüsü olduğundan emin olun, çünkü frekansı doğru bir şekilde belirlemek için tam salınımlar gereklidir.
NOT: Ne kadar çok salınım elde edilebilirse, veriler o kadar güvenilir olacaktır. Planlayıcının döndüğü sıraları kullanmayın, çünkü bunlar yanlış uzunluk ölçümlerine neden olacaktır.
- Süzülme deneyleri için, planörün vücut uzunluğunun en az iki katı hareket ettiği bir kayma dönemi ayıklayın.
- Görüntüyü binarize etmek ve planacıyı arka plandan ayıklamak için yinelenen görüntü yığınına(Resim > Ayarla > Eşik)bir eşik uygulayın. Tüm planarian kırmızı vurgulanır gibi gerektiği gibi sürgülü çubukları ayarlayın. Tam değerler görüntüleme kalitesine bağlıdır. Koyu arka planiçin kutuları bırakın , Yığın histogram, ve aralık işaretsiz sıfırlamayın. İyi bir eşik aralığı sağlamak için görüntü yığınında ilerleyin (örneğin, planer yığın boyunca arka plandan iyi ayrılmıştır) ve sonra Uygula'yıtıklatın.
- Yığın'ı İkili pencereye dönüştür penceresinde, Yöntem'i Varsayılan, Arka Planı Daışığaayarlayın. Bu penceredeki tüm kutuların işaretlerini kaldırın ve ardından Tamam'ıtıklatın. Beyaz arka plan üzerinde siyah bir planarian gösteren binarized görüntü görünür(Şekil 2C). Görüntü dizisinin tüm karelerinde tüm planacının görünür olduğundan emin olun.
NOT: Planarian daha küçük veya daha büyük binarized görüntü dizisinde istenmeyen nesneler bir boyut filtresi(Şekil 2Ciii)kullanılarak sonraki analizde filtre olabilir. - Analiz et > ÖlçümleriAyarla'yı tıklatarak ölçümleri ayarlayın. Alan, Kütle Merkezi, Yığın konumuve Fit elips için kutuları işaretleyin ve Tamam'ıtıklatın.
NOT: Bu parametrelerin Fiji oturumu başına yalnızca bir kez ayarlanmalıdır. - Açık görüntü yığınını seçin ve Analiz et > Parçacıkları Analiz Et'iseçin.
- Parçacıkları Çözümle penceresinde, seçilen parametrelerle algılanan tüm nesneleri gösteren yeni bir yığın açmak için Göster > Maskeler'i seçin. Bu, yalnızca planarian ölçümlerinin alınıp alındığını görsel olarak kontrol etmek için kullanılabilir. Bu adımda, planarian'ın yaklaşık alanını (piksel2 birimlerinde) sağlanan alana girerek istenmeyen gürültüyü gidermek için bir boyut filtresi ayarlanabilir. Görüntü sonuçları ve Netle sonuçları için kutuları işaretleyin ve Tamam'ıtıklatın. Clear results
NOT: Sonuçlar penceresinde, dizin (ilk sütun) tüm satırlar için dilim numarasına eşit değilse, bu çok fazla veya çok az nesnenin izlenmiş olduğu anlamına gelir. Bu tutarsızlık için bir olasılık planarian dışında diğer nesnelerin varlığı veya planarian belirli çerçevelerde izlenmedi. - Panelin altındaki kaydırıcıyı kullanarak maske görüntü yığınını kaydırın. Herhangi bir gürültü varsa veya planarian olmayan çerçeveler varsa, Sonuçlar penceresini ve maske görüntü yığınını kapatın. Alan filtresini yalnızca planarian dışındaki nesneleri kaldıracak şekilde ayarlayarak 1.2.7-1.2.8 adımlarını yineleyin.
NOT: Planlayıcı maskedeki çerçeveden eksikse, bu alan filtresinin alt sınırının çok yüksek ayarlandığını gösterir. - Sonuçlar penceresinde, Dosya>Farklı Kaydet'ikullanarak verileri kaydedin. Verileri virgülden ayrılmış değerler olarak kaydetmek için dosya adına .csv uzantısını ekleyin. Görüntü yığınına ait veriler kaydedildikten sonra, ilgili görüntü yığınını ve Sonuçlar ve Maske pencerelerini kapatın.
- Veri alma ve daha fazla herhangi bir elektronik tablo yazılımı veya freeware kullanarak analiz. Kayma hızını hesaplamak için bölüm 1.3'e bakın. Scrunching/peristalsis tam parametre kümesini hesaplamak için bölüm 1.4'e bakın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - Pikselin gerçek uzunluk dönüşümünün belirlenmesi için, Fiji'de referans uzunluğuyla (örn. arenanın çapı) bir görüntü açın. Çizgi aracını seçin ve bilinen uzunluğun üzerine bir çizgi çizin.
- Piksel birimlerini Analiz et > Ölçek Ayarla'yıtıklatarak standart uzunluk birimine dönüştürün. Bilinen mesafe kutusunda ki görüntüye çizilen çizgiye karşılık gelen uzunluğu girin ve uzunluk birimini pikselden seçilen standart uzunluk birimine değiştirin. Dönüştürme faktörü Ölçek'inyanına yazılır.
NOT: 1.3 ve 1.4 bölümlerindeki süzülme veya scrunching/peristalsis analizleri için piksel dönüştürme değeri gerekmez.
- Kayma hızının hesaplanması
- Bölüm 1.2'de kaydedilen veri dosyasını kullanarak, kütle (COM) x ve y koordinatlarının merkezini ve ana eksen verilerini yükleyin. Veriler virgülle ayrılmış değerler dosyası olarak kaydedilirse, bu listeler sırasıyla "XM", "YM" ve "Major" sütunlarına karşılık gelir.
- "XM" ve "YM" veri sütunlarını kullanarak, her kare için bir sonraki kare için planer kütle merkezinin (d) yer değiştirmesini hesaplayın. Deplasman (d) tarafından verilir:
x1 ve y1'in bir karenin COM koordinatlarına (XM, YM) ve x2 ve y2'nin sonraki çerçevenin COM koordinatlarına (XM, YM) atıfta bulunduğu durumlarda. - Planarian gövde uzunluğunu "Büyük" sütunun yüzde95'i olarak ayarlayın. Plancılar bir duvar tercihi davranışı sergileyen bu yana32, Bu hesaplanan planarian vücut uzunluğu planarian24uzamış olduğunda temsilcisi olmasını sağlar.
- Kare başına piksel yer değiştirmelerini planer gövde uzunluğuna (l)bölerek planer gövde uzunluğuna göre yer değiştirmeleri normalleştirin. Normalleştirilmiş yer değiştirme (dn) tarafından verilir:
- Normalleştirilmiş yer değiştirmeleri kare başına geçen süreye (kaydedilen FPS'nin tersi) bölerek normalleştirilmiş hızların bir listesini oluşturun. Normalleştirilmiş kayma hızı (sn) tarafından verilir:
- Normalleştirilmiş hızlar listesinin ortalamasını (sn)alarak planerin normalleştirilmiş kayma hızını hesaplayın. Standart sapma planarian için bir belirsizlik ölçümü olarak kullanılabilir.
- Her planarian analiz edilecek için 1.3.1-1.3.6 adımları tekrarlayın. Ortalama ve planarian nüfus için sırasıyla, süzülen hız ve ilişkili belirsizlik almak için tüm planerler için kayma hızlarının standart sapma almak.
- Tam parametre kümesini kullanarak scrunching ve peristalsis gaits ayrımı
- Bölüm 1.2'den kaydedilen veri dosyasından ana eksen veri listesini yükleyin. Veriler virgülle ayrılmış değerler dosyası olarak kaydedilirse, bu büyük sütuna karşılık gelir.
- Büyük sütundaki her veri noktasını 0ile başlayan bir liste oluşturun. Kaydedilen FPS'ye bölerek bu listeyi kare başına geçen süreye dönüştürün.
- Bir scrunching/peristalsis salınım çizimi oluşturmak için geçen zamana göre Ana sütun verilerini çizin (Şekil 3A). Salınım çizimini kullanarak, verileri en az üç ardışık, düz çizgili salınıma göre kırpın(Şekil 3Bi). Verileri yerel zirvelerde (maksimum salınım uzaması) veya çukurlarda (minimum salınım uzaması) başlayıp bitecek şekilde kırpın.
NOT: Lokal ekstremalar yaklaşık olarak eşit değilse (tepe/çukurlar yüksekliklerde önemli ölçüde farklılık gösterir), bu salınımların düz çizgili olmadığını gösterir(Şekil 3Bii). En az üç ardışık, düz çizgili salınımlar başka bir dizi ayıklayın. Bölüm 1.2'ye bakın. - Zamana göre kesilmiş Ana verileri yeniden çizerek, faizin salınım sırasının ayıklandığını ve düzgün bir şekilde kırpıldığını doğrulayın. Sonraki tüm hesaplamalar için bu kesilmiş veri listesini kullanın.
- Salınım frekansını hesaplamak için (νm), kesilmiş ana eksen veri listesindeki (N)toplam veri noktası sayısına salınım sayısını (On) bölün. Saniyede salınımlarda frekans elde etmek için FPS'yi bu değerle çarpın.
- Maksimum uzamayı hesaplamak için (|Δε| max), mutlak minimum gövde uzunluğunu (ldk) mutlak maksimum gövde uzunluğundan (lmax)çıkarın. Mutlak maksimum vücut uzunluğuna bölünerek uzatılmış vücut uzunluğuna normalleştirin.
- Vücut uzunluğu başına hızı hesaplamak için(v*m),hesaplanan maksimum uzamayı salınım frekansı ile çarpın.
NOT: Hız tek başına scrunching ve peristalsis gaits7ayırt etmek için kullanılabilir. - Uzama (fuzaması)harcanan sürenin bir kısmını hesaplamak için, zamana göre kesilmiş ana eksen veri listesinin türevlerini alın. Pozitif veri noktalarının sayısını (örneğin, türev >0 (np)olduğunda, ana eksen veri listesindeki toplam veri noktası sayısına(nt)) bölün.
NOT: Scrunching planarians peristalsis gerçekleştiren planerler süre harcanan zaman asimetrik bir kısmını sergilerken, peristalsis gerçekleştiren planerler uzama ve sözleşme eşit miktarda harcamak7. - Her planarian analiz edilecek için 1.4.1-1.4.8 adımları tekrarlayın. Her parametrenin ortalama ve standart sapması alarak belirlenen planer bir popülasyon parametresini hesaplayın.
NOT: Parametre kümesi, salınım davranışının scrunching, peristalsis veya periyodik vücut şekli değişiklikleri ile başka bir hareket biçimi olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Hem scrunching ve peristalsis belirli bir tür için sabit parametreler var7, scrunching parametreleri genellikle peristalsis parametreleri daha büyük olan7. Parametrelerden birinin türe özgü aralığın dışına düşmesi mümkün olsa da, daha önce kimyasal indüksiyon28ile gözlemlediğimiz gibi, gözlenen davranış, peristalsis veya scrunching olarak kategorize edilecek 4 yayınlanmış parametreden en az 3'ünü kabul etmelidir.
2. Scrunching indüksiyon
- Fiziksel uyaranlar (zararlı sıcaklık, UV ışığı, ampütasyon)
- Tüm fiziksel uyaran deneyleri için, deneysel kurulum için Bölüm 1.1'e bakın.
NOT: Bir pipet ve/veya jilet manevrası için daha fazla açık alan sağlamak için fiziksel uyaran deneyleri için 100 mm Petri kabı gibi büyük bir arena kullanmak en iyisidir. - Zararlı sıcaklıkta scrunching indüklemek için, bir cam kabında ısı planarian su (test edilecek planarian başına en az 100 μL) için 65 ° C bir sıcak plaka üzerinde.
- Arenanın ortasına bir planarian yerleştirin. Planarian kendini dik yönlendirir ve kayma yada kadar bekleyin. Kaydetmeye başla.
- P-200 pipet kullanarak, yavaş yavaş pipet 100 ° L 65 ° C planarian su post-faringal üzerine planarian kuyruk ucu üzerine scrunching neden.
NOT: Isıtmalı planer suyun 65°C'de kaldığından emin olun. Gerekirse, başka bir deneye başlamadan önce suyu 65°C'ye ısıtın. Basınç da scrunching neden olabilir bu yana, yavaş pipetleme gereklidir. Oda sıcaklığındaki suyu deneyde olduğu gibi pipetleme bir kontrol ve uygulama seçeneği olarak hizmet verebilir. - Scrunching sona erdiğinde kaydı durdurun. Bir kurtarma kabına planarian yerleştirin ve daha fazla deney çalışan eğer taze, oda sıcaklığında planarian su ile petri kabında medya değişimi.
- Ampütasyon yoluyla scrunching ikna etmek için, arenanın merkezine bir planarian transfer ve planarian kendini dik yönlendirir ve kayma başlar kadar bekleyin. Kaydetmeye başla.
- Planarian'ı temiz bir jilet kullanarak amputate edin. Kesme konumu deneyler arasında tutarlı olduğu sürece, kesme yeri planarian boyunca herhangi bir yerde verilebilir.
NOT: Scrunching parametreleri ön parçadan çıkarılır. Böylece, arka uçtan yaklaşarak kesme uygularken planarian bu bölümü kameranın görünümünü engellemekaçının. Plastik kapak fişleri de kesme için iyi çalışır ve özellikle bir öğretim ortamında, daha güvenli bir seçenektir. - Ön parça scrunching durdu ktan sonra kaydı durdurun. Her iki parçayı çıkarın, ayrı bir kapta yerleştirin ve 7 gün boyunca yeniden izin verin. Amputated planarians bir kez rejenere ev konteyner içine yeniden dahil edilebilir.
- Planarian'ı temiz bir jilet kullanarak amputate edin. Kesme konumu deneyler arasında tutarlı olduğu sürece, kesme yeri planarian boyunca herhangi bir yerde verilebilir.
- Yakın UV ışığı kullanarak scrunching ikna etmek için, kamera tarafından toplanan yansıyan yakın UV ışık miktarını azaltmak için kamera lensine uygun filtreler (örneğin, Roscolux filtreler) takın ve planacı nın tepkisini görüntüleme engelleyebilir. Bunun yerine aşağıdan arena aydınlatmak için LED paneli kullanarak, planerler duyarsız olduğu ortam kırmızı aydınlatma kullanın33.
- 100 mm'lik Petri çanak arenayı planarian suyla doldurun ve arenanın ortasına tek bir planarian (5-9 mm) yerleştirin. 10 FPS'de kayda başlayın.
- Arenadan yaklaşık 30 cm uzaklıkta sınıf II UV lazer işaretçisi (405 ± 10 nm, çıkış gücü <5 mW) tutun. Lazer işaretçisini planlayıcıdan 45° açıyla yerleştirin ve ardından lazer işaretçisini farinksin arka ucu ile kuyruk ucu arasında 5-10 saniye boyunca parlatarak scrunching'i tetikleyin.
NOT: Lazer işaretçisinin gücü uv ışınlarına duyarlı bir güç ölçer kullanılarak ölçülebilir. - Reaksiyonun tekrarlanabilirliğini test etmek için aynı kişi üzerinde iki uyarım daha denemeden önce planerin tekrar kaymaya başlamasını bekleyin. Planacı da aynı davranışı göstermeye devam ederse, kaydı durdurun ve planarian'ı konteynerine geri koyun. Davranış uyarımlar arasında değişirse, ek testler hangi yanıtın en belirgin olduğunu gösterir.
NOT: Planerler yakın UV ışığına duyarsızlaşabilir ve tepkivermeyi durdururlar. Ardışık stimülasyonlar 8-10 saniye dinlenme süresi gerektirir.
- Tüm fiziksel uyaran deneyleri için, deneysel kurulum için Bölüm 1.1'e bakın.
- Kimyasal uyarıcı (AITC)
- TrPA1 agonist AITC28,planarians ideal kimyasal bir banyo batırılmış bir kimyasal kullanarak scrunching ikna etmek için. Gerekirse bölüm 2.1.2.3'te açıklandığı şekilde pipetleme uygulanabilir.
DİkKAT: AITC yanıcı, akut toksik, cilt ve göz tahrişine, solunum ve cilt hassasiyetine neden olabilir ve sucul yaşam için tehlikelidir. AITC yağı bir duman başlık ele alınmalıdır. AITC'nin stok çözümlerini yapmadan önce, uygun PPE(nitril eldivenve laboratuvar önlüğü) takın ve uygun katı ve sıvı tehlikeli atık bertaraf kapları ayarlayın. - Bir duman kaputunda, 50 mL'lik bir santrifüj tüpte planer suda 10 mM'lik bir ait stok çözeltisi yapın. Bu stok çözümü, 4°C'de depolandığında bir aya kadar kullanılabilir.
- Bu stoktan, 50 mL'lik bir santrifüj tüpte planer suda 100 μM AITC'lik 25 mL çalışma çözeltisi hazırlayın. Bu 100 μM AITC çözeltisi plancılarda çıtırtıyı tetiklemek için kullanılacaktır.
NOT: 100 μM AITC D. japonica ve S. mediterranea planarians28tutarlı scrunching neden olur. Diğer su planlayıcıları için, 100 μM başlangıç konsantrasyonu olarak hizmet verebilir ve buna göre ayarlanabilir. - Deneysel kurulumu ayarlayın (Bölüm 1.1'e bakın). Arenayı AITC çalışma çözümüyle doldurun ve ikincil bir konteynere yerleştirin. İkincil konteyner arenanın en az iki katı hacimde olmalıdır.
NOT: Ekstra güvenlik için bir duman başlığı içinde deneyler yapılabilir. - 10 planarians kadar arenanın merkezine transfer ve kayıt başlar.
- Plancılar duyarsızlaştıktan ve çıtırtıyı bıraktıktan sonra, kayıt yapmayı bırakın. Planlayıcıları AITC çözümünden çıkarın ve durulayın (Bölüm 1.1'e bakın). Katı ve sıvı AITC atıklarını uygun atık kaplarında atın.
- Standart protokolleri izleyerek RNAi'yi TRPA128'e kullanarak AITC'ye verilen yanıtın özgüllüğünü doğrulayın.
- Bu stoktan, 50 mL'lik bir santrifüj tüpte planer suda 100 μM AITC'lik 25 mL çalışma çözeltisi hazırlayın. Bu 100 μM AITC çözeltisi plancılarda çıtırtıyı tetiklemek için kullanılacaktır.
- TrPA1 agonist AITC28,planarians ideal kimyasal bir banyo batırılmış bir kimyasal kullanarak scrunching ikna etmek için. Gerekirse bölüm 2.1.2.3'te açıklandığı şekilde pipetleme uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S. mediterranea planarians ekstraoküler yakın UV algısı TRPA1 bağımlı ve H2O2 serbest17bağlantılı olduğu önerilmiştir. H2O2 maruziyeti S. mediterranea ve D. japonica planarians28TRPA1 bağımlı scrunching neden olduğundan, Bölüm 2.1.4 adımları yakın UV ışık maruziyeti her iki türde de scrunching neden olup olmadığını test etmek için kullanılabilir. D. japonica planarians scrunch iken (10/10) yakın UV ışığına maruz kaldığında, S. mediterranea planarians ya daha önce açıklandığı gibi kuyruk inceltme (7/10) sergiler17 veya hiç yanıt (3/10)(Şekil 4A,4B). Bölüm 1.4'te belirtildiği gibi, en az 3 ardışık düz çizgi scrunches sergileyen D. japonica planarians için scrunching parametrelerinin bir nicelik, bu tür için karakteristik scrunching parametreleri ortaya7,28 (νm = 0.84 ± 0.14, | Δε| max = 0,56 ± 0,06, v*m = 0,07 ± ve f elong = 0,56 ± 0,03, n=7 için standart sapma ± ortalama olarak bildirilen değerler).
Buna karşılık, 250 μM cinnamaldehit maruz kalma, farelerde bilinen bir TRPA1 agonist34, S. mediterranea7scrunching nedenolur ,28 (νm = 0.46 ± 0.08, | Δε| maksimum = 0,36 ± 0,08, v*m = 0,16 ± 0,04 ve f elong = 0,08 ± 0,04, n=8 için ortalama n ± standart sapma olarak bildirilen değerler (Şekil 5A)ise, D. japonica planarians aynı (ve 1.6x konsantrasyon) yılan benzeri ve salınım hareketi karışımı, kayma ve / veya güçlü kafa döner tarafından kesilen bir karışımını görüntüler(Şekil 5A). (8/24) numunelerin ardışık olarak en az üç salınımiçeren bir niceliği, bu türde scrunching için beklenenden 4 parametrenin 3'ü için önemli ölçüde daha düşük değerler verir (νm = 0,43 ± 0,08, | Δε| max = 0,39 ± 0,03, v*m = 0,02 ± ve f elong = 0,54 ± 0,06, n=8 için standart sapma ± ortalama olarak bildirilen değerler). Böylece, D. japonica cinnamaldehit maruziyeti üzerine scrunch gibi görünse de, hesaplanan parametrelerin bu tür için literatür değerleri ile karşılaştırılması7,28 gözlenen salınım hareketinin scrunching olmadığını göstermektedir. Bu örnek, gözlenen davranışları doğru yorumlamak için ham davranışsal verilerin dikkatli bir şekilde incelenmesi ile birlikte nicel ölçümlerin önemini vurgulamaktadır.
RNAi S. mediterranea cinnamaldehit maruziyetine yanıt olarak scrunching özgüllüğünü doğrular. Planarian suda 250 μM cinnamaldehit maruz kalma 180 saniye içinde 15/15 unc22 (kontrol) RNAi S. mediterranea planarians scrunched, oysa 0/16 SmTRPA1 RNAi planarians scrunched(Şekil 5B), gösteren S. mediterranea scrunching cinnamalde scrunching Sinnamaldea scrunching SmTRPA1 gerektirir. SmTRPA1 knockdown 100 μM AITC banyo28bir 60 saniye maruz kalma ile doğrulandı.
Şekil 1: Planer davranış deneysel kurulum.
(A) Planer davranışı incelemek için örnek deneysel kurulum. (B) 100 mm Petri çanak arena kameranın görüş alanında ortalanmış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Arenadaki planerlerin Fiji görüntü analizinin temsili örnekleri.
(A) Seçilen ilgi bölgesi, sarı dikdörtgen ile gösterilen tam planer yolu kapsayan. (B) Çoğaltma sonrası ilgi çeken bölgeden örnek çerçeveler. (C) Planarian'ı arka plandan çıkarma ve eşik leme yoluyla gürültü (i) yıldız işaretiyle gösterilen, gürültülü planarian'ın 8 bitlik görüntüsü. (ii) Eşik sonra planarian Binarized görüntü. (iii) Paraziti gidermek için boyuta göre filtreleme ayarladıktan sonra planarian maskesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Planer uzunluğunun zamana göre çizilmesi.
(A) Bir scrunching S. mediterranea planarian için zaman karşı planarian uzunluğu Ham arsa. Yıldız işareti, planacının scrunching yaparken döndüğü bir anı ifade eder. (B) Buruşma verilerini kesmenin olası yolları. (i) Tornalama olay verilerini kaldıran doğru kesilmiş bir çizim. (ii) Tornalama olay verilerini kaldırmayan yanlış kesilmiş bir çizim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yakın UV ışığına özgü türler.
(A) D. japonica scrunching ve S. mediterranea kuyruk örnek çerçeveleri yakın UV ışığına yanıt olarak inceltme. (B) Yakın UV ışığına tepki olarak S. mediterranea ve D. japonica'nın temsili salınım arazileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bir TRPA1 agoninisti olan 250 μM cinnamaldehit'e özgü türler.
(A) 250 μM cinnamaldehit banyosunda D. japonica ve S. mediterranea planarians için temsili salınım arazileri. (B) SmTRPA1 RNAi S. mediterranea planarians 250 μM cinnamaldehit scrunching kaybı gösteren temsili salınım parselleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Malzemeler. Bu materyalleri indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolü kullanarak, bir nicel fiziksel ve kimyasal uyaranların etkilerini inceleyebilirsiniz7,28,29 veya genetik manipülasyon (RNAi)28,29 planarian hareket üzerinde. Mekansal çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için kamerayı arenaya mümkün olduğunca yakın hareket ettirirken tüm arenanın görüş alanında olmasını sağlamak en iyisidir. İş bilgililiği artırmak için, birden çok planerin davranışı aynı anda birden fazla planer kaydedilerek taranabilir. Tek bir alanda birden fazla planarian tarama, ilgi bölgeleri fiji olarak burada açıklandığı gibi bireysel planarians izole çizilebilir veya daha gelişmiş çok nesne izleme istihdam edilebilir. Aynı alanda birden fazla planarians sahip ile ilgili bir sorun, yolları kesişebilir olmasıdır. Bu sorun, planerleri birbirinden izole etmek için çok kuyulu plakalar aracılığıyla çözülebilir ken, birçok bireyin aynı anda kaydedilmesini sağlayarak davranışları ölçmek için23,24. Ancak, plancılar küçük alanlarda duvarda nispeten daha fazla zaman geçirecek, görüntü analizi ayarlamaları gerektiren ve scrunching / peristalsis nicelleştirme için çözünürlük sınırlayan.
Uyaranlar yerel olarak uygulandığında (örneğin, pipetting7, amputasyon7,28, lazer işaretçi17), diğer vücut bölgeleri uyarıcı potansiyel olarak farklı davranışlara neden olabilir, çünkü planerler sürekli olarak aynı bölgede uyarılır çok önemlidir. Farklı teslim yöntemleri (pipetleme veya kimyasal banyo gibi) aynı zamanda davranışsal fenotiptutarlılığını etkileyebilir. Ayrıca, plancılar hızlı bir şekilde duyarsızlaştırmak28, aynı planarians hemen birden fazla deney için yeniden kullanılmamalıdır olarak deneyler planlarken dikkate alınması gereken, ya da aynı veya farklı uyaranları kullanarak. Son olarak, yakın UV maruziyeti ve cinnamaldehit için burada gösterildiği gibi, aynı uyarıcı farklı planarian türlerde farklı davranışlar neden olabilir farkında olmak önemlidir. D. japonica kuyruk ucu na yakın uv ışığı ile uyarıldığında scrunched, S. mediterranea planarians kuyruk inceltme görüntülenirken. Buna karşılık, sinnamaldehit maruziyeti S. mediterranea scrunching indüklenen ama D. japonica planariansdeğil . Böylece, scrunching zararlıuyaranlaraçeşitli planer türlerin korunmuş bir tepki iken 7 , bu türler özelparametreleri vardır 7,28, hassasiyetleri28, ve indükleyiciler28. Bu nedenle, hangi scrunching henüz parametreli olmamıştır yeni bir tür için, diğer uyaranlara yanıt test etmeden önce türlere özgü parametreleri belirlemek için, ampputasyon7gibi iyi korunmuş bir indükleyici ile başlamak en iyisidir.
Burada açıklanan analizin bir sınırlaması, kafa kıpırdama, kayma veya diğer vücut şekli değişiklikleri ile aralıklı scrunching gibi dönüşler ve / veya karışık davranışlar için hesap değildir. Ancak, bu örnekler Şekil 3'tegösterildiği gibi, bu örnekler el ile analizin dışında tutulursa, ham verilerin yakından incelenmesi bu sorunların hafifletilen yardımcı olabilir. Buna ek olarak, burada açıklanan kütle ve uzunluk izleme merkezine vücut şekli analizi eklemek ve bu diğer planarian davranışları ölçmek için protokolü genişletmek mümkündür. Analizin incelenen organizma hakkında herhangi bir varsayımda bulunmadığı göz önüne alındığında, protokol prensipte benzer davranış tipleri gösteren diğer organizmalara da uygulanabilir.
Burada açıklandığı gibi, farklı planer gaitleri ölçme ve peristalsisten ayırt etme yöntemi, hesaplamalı görüntü analizi veya davranış sallaması konusunda önceden eğitim almamaktadır ve özel ekipman veya yazılım gerektirmez. Protokol uyarlamasını kolaylaştırmak için Ek Malzeme'de örnek veriler sağlanır. Planarians edinme ve kültür kolaylığı, hem de özel ekipman olmadan davranışları kaydetmek için yeteneği, planarian davranış çalışmaları geniş tüm düzeylerde araştırma için erişilebilir hale getirir, ilkokul sınıfları akademik laboratuvarlar için. Bu protokolün değiştirilmiş bir versiyonu, öncelikle birinci sınıf ve ikinci sınıf öğrencilerinden oluşan ve hem stem hem de STEM üyesi olmayan branşları içeren bir öğretim laboratuarı ortamında başarıyla kullanılmıştır.
Moleküler (RNAi) ve kimyasal araçların nicel davranış analizi ile birleşimi, bu protokolde açıklandığı gibi, araştırmacıların davranışın moleküler kontrolü hakkında mekanik bilgiler edinmelerine olanak sağlar. Bu tür çalışmalar bazı önemli aracılar ve nöronal devreler planarian kayma dahil ortaya çıkarmıştır19,20, fototaksis17,35,36, termotaksis9,37, ve scrunching9,28,29. Planer davranışlar, insanlar gibi daha yüksek organizmalarda doğrudan korollary davranışlara sahip olmasa da, bu davranışlar tüm organizmalar için önemli olan temel nöronal fonksiyonları temsil eder - belirli uyaranları algılama ve işleme ve uygun şekilde tepki verme yeteneği. Farklı organizmalar arasında temel nöronal fonksiyonların korunması nedeniyle, planarians mekanistik çalışmalar davranış nöronal kontrolü hakkında daha geniş bize öğretebilir. Ayrıca, kimyasal maruzkalma yanıt olarak planarian davranış analiz planarian sinir sistemi üzerinde kimyasal etkilerini incelemek için kullanılabilir23,24,25, hangi insan beyni için potansiyel riskler hakkında bilgilendirmek olabilir. Özellikle, zararlı ısı tarafından indüklenen scrunching nörotoksisite tespit etmek için hassas ve özel bir uç noktası olduğu tespit edildi, kimyasalların belirli sınıflara maruz kalma tarafından bozulur çünkü22,24,25,30. Son olarak, planarian benzersiz rejeneratif yetenekleri araştırmacılar nörorejenerasyon sırasında farklı davranışların nasıl geri dinamikleri incelemek için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, tapan Goel'e el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ediyor. Bu çalışma NSF CAREER Grant 1555109 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , Planarian Press. (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
