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Biology

有害刺激センシングのための定量的行動読み出しとしてのプラナリアンスクランチング

doi: 10.3791/61549 Published: July 30, 2020

Summary

淡水プラナリアンは、定量的行動分析によって区別できる3つの歩行(滑空、蠕動、およびスクランチ)を示す。我々は、様々な有害刺激、その定量、および蠕動および滑空との区別を用いてスクランチを誘導する方法を記述する。遺伝子ノックダウンを用いて、定量的表現読み出しとしてスクランチングの特異性を実証する。

Abstract

淡水のプラナリアンは、通常、腹側の毛様体の推進力を通って滑らかに滑空します。しかし、特定の環境条件は、運動性主導の移動形態である蠕動またはスクランチを誘発する可能性がある。蠕動は毛様体欠損から生じるが、スクランチは繊毛機能から独立しており、切断、有害温度、極端なpH、エタノールを含む特定の刺激に対する特異的な反応である。したがって、これら2つの筋肉駆動の足取りは、機械学的に異なっている。しかし、質的に区別することは困難です。ここでは、様々な物理的および化学的刺激を用いてスクランチを誘導するためのプロトコルを提供します。自由に利用できるソフトウェアを用いて、蠕動や滑空と区別するために使用できるスクランチングの定量的特徴について詳しく説明します。スクランチは、特徴的な種固有の違いはあるものの普遍的なプラナリアン歩行であるため、このプロトコルは、適切な考慮事項を使用する場合、すべての種のプラナリアンに広く適用することができます。これを実証するために、行動研究で使用される2つの最も人気のあるプラナリアン種、 ドゥゲシア・ジャポニカシュミテア・メディテラニアの反応を、物理的および化学的刺激の同じセットと比較する。さらに、スクランチングの特異性により、このプロトコルをRNA干渉および/または薬理学的暴露と組み合わせて使用して、関係する分子標的および神経回路を解剖し、ノシセプションおよび神経筋コミュニケーションの重要な側面に対する機械的な洞察を提供する可能性がある。

Introduction

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,幹細胞や再生,研究1、2、32に人気の他1に、淡水プラナリアンは、比較的大きなサイズ(長さが数ミリメートル)、簡単で低コストの実験室のメンテナンス、および観察可能な行動の広いスペクトルを利用して、行動研究34、5で長い間使用されてきました。5コンピュータビジョンと自動追跡をプラナリアン行動研究676、7、8、9、10、11に導入すると、行動型の定量的分化が8,9,10,11可能になりました。,,動物の行動は、神経機能の直接の読み出しです。プラナリアン神経系は中規模で複雑であるが、脊椎動物の脳12、13、1413,14と共に保存された重要な要素を共有するため、プラナリアンの行動を研究することは、より複雑な生物で直接探査するのが難しいニューロン作用の保存されたメカニズムに関する洞察を提供することができる。12したがって、プラナリアンは、比較神経生物学研究,,,88、12、15、16、17、18、19、20、21,12,15,16の貴重なモデルです。,2119,201718さらに、水生環境は、再生および成人プラナリアンにおける脳機能への影響を研究するために化学物質への迅速かつ容易な暴露を可能にし、神経毒性22、23、24、25、26のための人気のシステムにする。,23,24,25,26

プラナリアンは、滑空、蠕動、スクランチと呼ばれる3つの異なる足取りを持っています。各歩行は、特定の状況下で展示されています:滑空はデフォルトの歩行であり、毛様体機能が損なわれると蠕動が起こり27シリア機能から独立したエスケープ歩行である - 特定の有害な刺激に応答して7。我々は、スクランチングは、極端な温度またはpH、機械的損傷、または特定の化学的誘導物質を含む特定の化学的または物理的手がかりの感覚によって引き起こされ、したがって一般的なストレス応答77、28、2928,29ではないことを示している。

このプロトコルを使用して容易に定量化することができるその特異性およびステレオタイプのパラメータのために、スクランチングは、研究者が行動25、28,28の感覚経路および神経制御を解剖する機械学的研究を行うことを可能にする強力な行動表現型である。さらに、スクランチングは,、神経毒性学研究22、24、25、30における神経系の発達および機能に対する22,24,有害な化学的影響をアッセイする敏感なエンドポイントであることが示されている。2530いくつかの異なる感覚経路が様々なメカニズム28を通してしゃがみを誘発するために収束するように見えるので、様々だが特定の刺激を使用して異なる神経回路を解剖し、異なる信号がどのように統合され、異なるシグナルタイプを産生するかを研究することができるので、スクランチは他のプラナリアン行動とは異なる。

重要なことに、種の違いは存在し、ある化学物質はあるプラナリアン種でスクランチを引き起こすかもしれないが、別のプラナリアン種では異なる行動反応を引き起こす可能性がある。例えば、アナンダミドは、平面種ドゥゲシア・ジャポニカでスクランチを誘発するが、シュミネア地中海28で蠕動を誘発することを発見した。この例では、異なる分子機構の明白な現れであるため、異なる歩行を確実に区別できることの重要性を強調しています。しかし、両足歩行は筋力主導であり、質的類似性,を共有するため、蠕動性と蠕動の区別は、質的観察データを使用して困難である。したがって、歩行を区別するには、繊毛イメージングまたは定量的行動研究を行う必要があり、これは特性パラメータ77,2828に基づく区別を可能にする。繊毛イメージングは実験的に困難であり、高倍率の化合物顕微鏡や高速カメラ77、2828などの特殊な装置を必要とするため、定量的行動分析ほど研究者が普及することは不可能です。

ここでは、(1)様々な物理的(有害温度、切断、近紫外線)および化学(アリルイソチオシアネート(AITC)、シナアルデヒド)刺激を用いたスクランチの誘導と(2)自由に入手可能なソフトウェアを用いたプラナリアン行動の定量分析のためのプロトコルを提示する。4つのパラメータ(身体長振動の周波数、相対速度、最大振幅、および体伸びと収縮の非対称性)を定量化することにより、スクランチングは、ヘビ様移動運動15やてんかん15などの文献で報告される滑空、蠕動、その他の行動状態と区別することができる。15さらに、スクランチングは、異なるプラナリアン種7の間で保存されているが、各種は、独自の特徴的な周波数と速度を有する。したがって、種の滑空速度とスクランチ速度が決定されると、速度だけでは滑空および蠕動29とスクランチを区別する手段として使用することができる。このプロトコルは、計算画像解析や行動研究における事前の訓練を前提としないため、学部レベルの教育研究室の文脈におけるプラナリアン行動実験にも適用することができます。プロトコルの適合を容易にするデータの例は補足資料に記載されている。

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Protocol

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1. 定量的プラナリアン行動アッセイ

  1. 実験用セットアップ
    1. 薄暗い LED パネルを平らな面に置きます。LEDパネルは、(1)均一な白色の背景を提供し、(2)適切なコントラストを得るために調整可能な光源として使用する2つの目的を果たします。LEDパネルの上に100 mmのペトリ皿アリーナを設置します。
      注: スループットを向上させるために、マルチウェル プレートをアリーナ23、24として使用できますが24大きなアリーナは、自動画像解析を容易にします。
    2. アリーナの上のリングスタンドにカメラを取り付けます(図1A)。必要に応じてカメラの位置、高さ、フォーカスを調整して、アリーナ全体が視野の中央に配置され、フォーカスが合うようにします (図 1B)。
      注: カメラの解像度は、LED パネルによって提供される同種の背景からプラナリアンを明確に区別するのに十分な高さである必要があります。
    3. 適切な露出媒体(プラナリアン水または化学溶液)を半分の最大体積(これはお風呂と呼ばれます)でアリーナを埋めます。これは100mmペトリ皿の約25 mLに相当します。LEDパネルをオンにし、記録品質に悪影響を及ぼす可能性のある他の光源(つまり、アリーナにまぶしさを生み出す近くの光源)をオフにします。
      注意:完全な個人的な保護具(PPE)を着用し、必要に応じてヒュームフードに実験セットアップを移動することにより、適切に危険な化学ソリューションを管理します。廃棄物処理に関する連邦および州の規制に従ってください。
    4. トランスファーピペットを使用してアリーナの中心に向かってプラナリアンをドロップします。録音を開始します。データをネイティブフィジー31 形式(TIFF、GIF、JPEG、PNG、DICOM、BMP、PGM、または FITS)で画像シーケンスとして記録します。
      注: 外部刺激に対する行動や感度は個々のプラナリアンによって異なるため、技術的な複製を実行することに加えて、十分に多くの生物学的複製に関するデータを収集することが重要です。100mmのペトリ皿で、最大10の中型(4~7mm)のプラナリアンと一度に取り組んできました。時間効率は高いが、ペトリ皿の複数のプラナリアンは、プラナリアンが道を渡る可能性があるため、データ分析をより困難にする。
      1. 滑空実験の場合は、1 秒あたり少なくとも 1 フレーム(FPS)を使用して記録します。スクランチング/蠕動性実験の場合は、プラナリアン種のスクランチング/蠕動頻度の少なくとも2倍のFPSを使用して記録します。プラナリアン種が未知のスクランチング/蠕動頻度を有する場合は、出発点として10 FPSを使用し、必要に応じて増減する。
      2. 化学溶液を使用する場合は、化学溶液の濃度が大きく変化しないように、できるだけ少ないプラナリアン水を使用してプラナリアンを移送します。
    5. 滑空実験では、1~2分間の滑空動作を記録します。スクランチ/蠕動性実験の場合は、直線で発生する少なくとも3つの連続振動をキャプチャするのに十分な長さ記録します。実験が完了したら、記録を終了します。
      注:スクランチング/蠕動性実験の場合、プラナリアンが反復間で一貫する必要があり、刺激に基づいて経験的に決定される一定期間内に終了基準を満たしていない場合は、記録を終了し、別のプラナリアンをテストします。
      1. プラナリアンが終了基準を満たさずにアリーナの境界に達した場合は、プラナリアンをアリーナの中心に戻します。
        注: 個人の動作が変わる可能性があるため、録音のために個人のピペット処理を繰り返さないようにしてください。
    6. 競技場からプラナリアンを取り除き、適切な廃棄物容器にプラナリアン水または化学溶液を処分する。プラナリアンの水の中にいたプラナリアンは、自宅の容器に戻すことができます。
      注:異なるメディアに異なるアリーナを使用してクロス汚染を避けてください(すなわち、プラナリアン水実験での滑空は、以前は化学物質暴露によるスクランチング/蠕動実験に使用されていたアリーナでは実行しないでください)。
      1. 25 mLのプラナリアン水で満たされた3つのクリーンな100 mmペトリ皿の化学溶液にさらされた連続的にプラナリアンを洗浄し、化学物質を徹底的に希釈します。スクランチまたは蠕動が誘発された場合は、これらのプラナリアンを別の容器に入れます。ほとんどの細胞がその時間1までにひっくり返っていたので、プラナリアンは1ヶ月後に自宅のコンテナに戻すことができます。
        注: 同じ平面図の集団に対して複数の異なる実験が必要な場合(例えば、RNAiの人口のために)、次の実験を実行する前に、プラナリアンが24時間回復することを可能にします。最も侵襲性の低い実験が最初に、最も侵襲的な実験(例えば切断)が最後に実行されるような実験を注文する。
      2. 同じアリーナで複数の実験を行う場合は、バス溶液を適切に処分し、ランニングの間にペーパータオルでアリーナを拭き取ることによって粘液を取り除きます。
        注: プロトコルはここで一時停止することができます。
  2. プラナリアン行動の定量的分析
    1. セクション1.1に記載されているように、プラナリアン行動アッセイを実行する。
    2. フィジーで実験の生のイメージ シーケンスを開き (ファイル/読み込み/画像シーケンス)、イメージ シーケンスの最初のイメージを選択します。[シーケンス オプション] ウィンドウで、[名前を数値で並べ替える] チェック ボックスをオンにし、[OK] をクリックします。イメージ シーケンスが読み込まれたら、イメージ シーケンスを 8 ビット(Image> Type > 8 ビット) に変換し、イメージ スタックの下部にある矢印ツールまたはスライダーを使用して、イメージ シーケンスを見たり、画面移動します。
      注: 滑空実験では、記録全体で平面がはっきりと見える限り、すべてのデータを使用できます。しかし、通常は、以下に説明するように、関連する部分を抽出することによって、アリーナの中央で自由な動きを分析するだけで十分です。
    3. 対象となる期間と領域を抽出するには、矩形ツールを使用して、平面の完全なパスを含む対象領域を描画します (図 2A, 2B)。イメージ スタックを右クリックし、[ 複製..] を選択し、[ 重複スタック] のチェック ボックスをオンにして、対象となるシーケンスの最初と最後のフレームを入力して 、[OK]をクリックします。複数のプラナリアンが同時に画像化された場合は、アリーナ内の各プラナリアンに対してこの領域の選択と複製の手順を繰り返し、アリーナにプラナリアンがいるのと同じ数のオープンイメージスタックが存在するようにします。次の手順 (手順 1.2.4~1.2.10) は、各イメージ スタックに対して 1 つずつ実行する必要があります。
      1. 滑空実験の場合は、平坦な移動が少なくとも 2 倍の体長の滑空期間を抽出します。
        注: 平坦化ごとに抽出されるグライダーデータが多ければ多いほど、データの信頼性は高くなります。平滑図解析では、直線で移動する必要はありません。
      2. スクランチング/蠕動性実験では、プラナリアンが直線で最低3回連続(理想的にはそれ以上)の身体振動を受けた場合にインスタンスを抽出し、完全な振動が正確に周波数を決定するために必要であるため、各振動が完全な伸び縮みサイクルであることを確認します。
        注: より多くの振動を抽出できるほど、データの信頼性が高くなります。正確な長さの測定が行われなくなるので、平面が回転するシーケンスは使用しないでください。
    4. イメージを二項化し、背景から平面を抽出するには、複製したイメージ スタックにしきい値を適用します (Image > 調整 |しきい値) 。必要に応じてスライドバーを調整し、プラナリアン全体が赤色でハイライト表示されるようにします。正確な値は、イメージング品質に依存します。 [背景の濃い]、[ 履歴をスタック]、および [ 範囲をリセットしない] の 各ボックスはオフのままにします。イメージ スタックをスクロールして、良好なしきい値範囲 (つまり、スタック全体でプラナリアンが背景から十分に分離されていることを確認します) をクリックし、[ 適用] をクリックします。
    5. [ スタックをバイナリに変換 ] ウィンドウで、[メソッド] を [既定] に、[背景] を [ライト] に設定します。このウィンドウのすべてのボックスのチェックを外し 、[OK]をクリックします。白い背景に黒い平面図を示す二項化された画像が表示されます (図 2C)。イメージ シーケンスのすべてのフレームで、プラナリアン全体が表示されていることを確認します。
      注: 平坦化されたイメージ シーケンス内の不要なオブジェクトのうち、そのオブジェクトが平面よりも小さいか大きい場合は、サイズ フィルターを使用して後続の分析で除外できます (図 2Ciii)。
    6. [分析] > [計測値の設定] をクリックして、測定を設定します[面積]、[ 重心]、[ 重なりの位置]、[ 楕円に合わせる ] の各チェック ボックスをオンにして 、[OK]をクリックします。
      注: これらのパラメータはフィジーセッションごとに1回だけ設定する必要があります。
    7. 開いているイメージ スタックを選択し、[ 解析] → [パーティクルの解析] を選択します。
    8. [ パーティクルの解析] ウィンドウで、[ 表示] > [マスク ] を選択して、選択したパラメータで検出されたすべてのオブジェクトを表示する新しいスタックを開きます。これは、プラナリアンの測定値のみが取得されていることを視覚的に確認するために使用できます。このステップでは、用意された空間に平面図の近似領域(ピクセル2 単位)を入力して不要なノイズを除去するために、サイズフィルタを設定できます。 [結果を表示 ] および [ 結果をクリア] のチェック ボックスをオンにし 、[OK]をクリックします。
      注: [結果 ] ウィンドウで、インデックス (最初の列) がすべての行のスライス番号と同じでない場合、追跡されたオブジェクトが多すぎるか、または少なすぎることを意味します。この不一致の 1 つの可能性は、平面以外の他のオブジェクトの存在、または特定のフレームでプラナリアンが追跡されなかったことです。
    9. パネルの下部にあるスライダーを使用して、マスクイメージスタックをパンします。ノイズが発生した場合や、平面を欠いたフレームがある場合は、[ 結果] ウィンドウとマスク イメージ スタックを閉じます。平面以外のオブジェクトのみを削除するようにエリアフィルタを調整して、手順1.2.7~1.2.8を繰り返します。
      注: マスク内のフレームにプラナリアンが欠落している場合は、エリアフィルタの下限が高すぎることを示唆しています。
    10. [ 結果 ] ウィンドウで、[ ファイル] → [名前を付けて保存] を使用してデータを保存します。ファイル名に .csv 拡張子を追加して、データをコンマ区切り値で保存します。イメージ スタックのデータを保存したら、それぞれのイメージ スタックと [結果 ] ウィンドウと [マスク ] ウィンドウを閉じます。
    11. データをインポートし、任意のスプレッドシートソフトウェアやフリーウェアを使用してさらに分析します。滑空速度を計算するには、セクション 1.3 を参照してください。スクランチング/ペリスタルシスのフルパラメータセットを計算するには、セクション1.4を参照してください。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
    12. ピクセルから実際の長さへの変換を決定するには、参照長 (アリーナの直径など) を持つ画像をフィジーで開きます。線ツールを選択し、既知の長さに沿って線を引きます。
    13. [ 分析] > [尺度の設定] をクリックして、ピクセル単位を標準の長さの単位に変換します。[ 既知の距離 ] ボックスにイメージに描画される線分に対応する長さを入力し、[ 長さの単位]ピクセル から選択した標準長の単位に変更します。変換係数は、スケール の横に書き込 まれます
      注: セクション 1.3 および 1.4 での滑空解析やスクランチング/蠕動解析には、ピクセル変換値は必要ありません。
  3. 滑空速度の計算
    1. セクション 1.2 で保存したデータ ファイルを使用して、重心 (COM) の x 座標と y 座標と長軸データを読み込みます。データをカンマ区切り値ファイルとして保存する場合、これらのリストはそれぞれ「XM」、「YM」、「メジャー」の各列に対応します。
    2. 「XM」および「YM」データ列を使用して、次のフレームに対して、各フレームの平坦な質量の中心の変位 (d) を計算します。変位 (d)は 次の式で与えられます。
      Equation 1
      ここで、x1 と y1 は 1 つのフレームの COM 座標 (XM、YM) を参照し、x2 と y2 は後続のフレームの COM 座標 (XM、YM) を参照します。
    3. 「メジャー」列の95 パーセンタイルとして、平面の体の長さを設定します。プラナリアンは壁の嗜好行動32を示すので、これは計算された平面の体長が、平面が24に伸びる時を表すであることを保証する。
    4. フレームあたりのピクセル変位を平面体の長さ (l)で割ることにより、平面体の長さによって変位を正規化します。正規化された変位 (dn) 次の式で指定されます。
      Equation 2
    5. 正規化された変位をフレーム当たりの経過時間(記録されたFPSの逆)で割って、正規化された速度のリストを生成します。正規化された滑空速度(s n) は、次の式で指定されます。
      Equation 3
    6. 正規化された速度リストの平均を取ることによって、平坦化の正規化された滑空速度を計算します ( sn)。標準偏差は、平面の不確定測定として使用できます。
    7. 分析する各プラナリアンについて、ステップ 1.3.1 ~ 1.3.6 を繰り返します。すべての平面図の滑空速度の平均と標準偏差を取り、それぞれ平面集団の滑空速度と関連する不確実性を得る。
  4. フルパラメータセットを用いたスクランチングと蠕動性の区別
    1. セクション 1.2 から保存したデータ ファイルから、主軸データ リストを読み込みます。データをコンマ区切り値ファイルとして保存する場合、これは メジャー 列に対応します。
    2. [メジャー ] 列の各データ ポイントに 0 から番号を付け、リストを作成します。記録された FPS で割って、このリストをフレームごとの経過時間に変換します。
    3. メジャー列データを経過時間に対してプロットして、スクランチング/蠕動振動プロットを生成します (図 3A)。振動プロットを使用して、データを少なくとも3つの連続した直線振動にトリミングします(図3Bi)。ローカルピーク(振動の最大伸び)またはトラフ(最小振動の伸び)で開始および終了するデータをトリミングします。
      注意: 局所極値がほぼ等しくない場合(高さがピーク/トラフによって大きく異なる)、振動が直線ではないことを示唆しています(図3Bii)。少なくとも3つの連続した直線振動の別のシーケンスを抽出します。セクション1.2を参照してください。
    4. 時間に関してトリミングされた メジャー データを再印刷して、対象の振動シーケンスが適切に抽出およびトリミングされていることを確認します。このトリミングされたデータリストは、以降のすべての計算に使用します。
    5. 振動周波数m)を計算するには、振動数(On)、トリミングされた長軸データ リスト(N)のデータ ポイントの総数で除算します。FPS にこの値を掛けて、1 秒あたりの振動数を求めます。
      Equation 4
    6. 最大伸びを計算するには(|Δε|max)を指定し、絶対最大体長(lmax)から絶対最小ボディ長(lmin)引きます。絶対最大体長で除算して、細長いボディ長に正規化します。
      Equation 5
    7. ボディ長さあたりの速度を計算するには(v*m)、計算された最大伸びに振動周波数を掛けます。
      Equation 6
      注:速度だけでは、スクランチとペリスタルシスの足取り7を区別するために使用することができます。
    8. 伸長に費やされた時間の割合を計算するには(felong)、時間に関してトリミングされた長軸データリストの微分を取ります。正のデータポイントの数 (つまり、微分が >0 (np)場合は、長軸データ リストのデータ ポイントの総数 (nt) で除算します。
      Equation 7
      注:スクランチプラナリアンは、蠕動を行うプラナリアンが7を伸縮するために等しい時間を費やすのに対し、伸びるのに費やす時間の非対称的な割合を示す。
    9. 分析する各プラナリアンについて、ステップ 1.4.1 ~ 1.4.8 を繰り返します。各パラメータの平均と標準偏差を求めることで、設定された平面母集団パラメータを計算します。
      注: パラメータセットは、振動動作が周期的な体形の変化を伴う振動、蠕動、または他の形態の移動性であるかどうかを判断するために使用できます。スクランチングと蠕動性の両方は、与えられた種7の固定パラメータを有し、スクランチングパラメータは一般的に蠕動パラメータ7よりも大きい。パラメータの1つが種特異的範囲外に落ちる可能性がありますが、以前に化学誘導28で観察したように、観察された行動は、蠕動またはスクランチのいずれかに分類される4つの公表されたパラメータのうち少なくとも3つに同意する必要があります。

2. スクランチング誘導

  1. 物理的刺激(有害温度、UV光、切断)
    1. すべての物理的な刺激実験については、実験のセットアップのためのセクション1.1を参照してください。
      注:ピペットやカミソリの刃を操縦するためのより多くのオープンスペースを可能にするために物理的な刺激実験のために、100ミリメートルペトリ皿などの大きなアリーナを使用することをお勧めします。
    2. 有害温度でスクランチを誘発するために、ガラスビーカー(テストするプラナリアンあたり少なくとも100 μL)の熱平板水をホットプレート上で65°Cに加熱します。
      1. アリーナの中央にプラナリアンを配置します。プラナリアンが直立して滑空を開始するまで待ちます。録音を開始します。
      2. P-200ピペットを使用して、65°Cプラナリアン水のピペット100 μLを後咽頭にプラナリアンの尾端にゆっくりとピペットしてスクランチを誘発する。
        注:加熱されたプラナリアンウォーターが65°Cにとどまることを確認してください。 必要に応じて、別の実験を開始する前に、水を65°Cに再加熱します。圧力もスクランチを誘発することができるので、ゆっくりとしたピペットが必要です。実験と同様に室温水をピペット化することは、制御および練習の選択肢として役立つことができる。
      3. しゃがみなくなったら録音を停止します。プラナリアンを回収容器に入れ、より多くの実験を行う場合は、シャーレのメディアを新鮮な室温のプラナリアンウォーターと交換します。
    3. 切断を介してスクランチを誘発するには、プラナリアンをアリーナの中心に移し、プラナリアンが直立して滑空を開始するまで待ちます。録音を開始します。
      1. きれいなカミソリの刃を使用してプラナリアンを切断します。切断は、切断場所が実験間で一貫している限り、プラナリアンに沿ってどこでも行うことができます。
        注:スクランチングパラメータは、前部片から抽出されます。したがって、後端から接近してカットを適用する際に、プラナリアンのこの部分のカメラの視界を妨げないようにします。プラスチックカバースリップも切断のためにうまく機能し、特に教職の設定で、より安全なオプションです。
      2. 前部の部分がしゃがみなくなったら録音を停止します。両方の部分を取り出し、別の容器に入れ、7日間再生させます。切断されたプラナリアンは、再生後にホームコンテナに再組み込むことができます。
    4. 近紫外線を使用してスクランチを誘発するには、カメラレンズに適切なフィルタ(例えば、ロスコラックスフィルター)を取り付けて、カメラが収集する反射された近紫光の量を減らし、プラナリアンの応答を撮影するのを妨げる可能性があります。LEDパネルを使用してアリーナを下から照らす代わりに、プラナリアンが無神経なアンビエントレッド照明を使用してください。
      1. 100 mm ペトリ皿アリーナにプラナリアンウォーターを充填し、アリーナの中央に単一のプラナリアン (5~9 mm) を配置します。10 FPS から録画を開始します。
      2. クラス II の UV レーザー ポインター (405 ± 10 nm、出力電力 <5 mW) を持ち、アリーナから約 30 cm 離します。レーザーポインターを滑空平面から45°の角度に置き、咽頭の後端と尾端の中間に5〜10秒間レーザーポインターを照らし、スクランチを誘発します。
        注: レーザー ポインターのパワーは、UV に近い電力計を使用して測定できます。
      3. プラナリアンが再び滑空を開始するのを待ってから、同じ個体にさらに2つの刺激を試みて反応の再現性をテストします。プラナリアンが同じ動作を示し続ける場合は、記録を停止し、そのコンテナーに戻すプラナリアンを置きます。刺激の間で動作が変化した場合、追加のテストでは、どの応答が最も顕著であるかが示されます。
        注:プラナリアンは、ほぼUV光に鈍感になり、反応を停止します。連続した刺激は8-10秒の休息期間を必要とする。
  2. 化学刺激(AITC)
    1. 化学物質を用いてスクランチを誘導するために、例えば、TRPA1アゴニストAITC28は、プラナリアンが理想的には、化学物質の浴に浸漬される。必要に応じて、ピペット処理はセクション2.1.2.3に記載されているように適用することができます。
      注意:AITCは可燃性、急性毒性、皮膚および眼の刺激、呼吸および皮膚感作を引き起こす可能性があり、水生生物に危険である。AITCオイルはヒュームフードで取り扱う必要があります。AITCのストックソリューションを製造する前に、適切なPPE(ニトリル手袋とラボコート)を着用し、適切な固体および液体有害廃棄物処理容器を設置してください。
    2. ヒュームフードで、50 mL遠心チューブにプラナリアンウォーターでAITCの10 mMストック溶液を作ります。このストックソリューションは、4°Cで保存すると最大1ヶ月間使用できます。
      1. このストックから、50 mL遠心分離管内のプラナリアン水に100 μM AITCの25 mLの作業ソリューションを準備します。この100 μM AITCソリューションは、プラナリアンのスクランチを誘発するために使用されます。
        注:100 μM AITC は 、D. ジャポニカS. 地中海 プラナリアン28で一貫したスクランチを誘発します。他の水生プラナリアンの場合、100 μMは開始濃度として機能し、それに応じて調整することができます。
      2. 実験用セットアップをセットアップします(セクション1.1を参照)。アリーナに AITC の作業ソリューションを入力し、セカンダリ コンテナーに配置します。セカンダリ コンテナは、アリーナの少なくとも 2 倍のボリュームを保持する必要があります。
        注:実験は、余分な安全性のためにヒュームフードの内側で行うことができます。
      3. アリーナの中心に最大10のプラナリアンを転送し、記録を開始します。
      4. プラナリアンが鈍感になり、しゃがみなくなると、録音を停止します。AITC ソリューションからプラナリアンを削除し、すいすりします (セクション 1.1 を参照)。適切な廃棄物容器に固形および液体のAITC廃棄物を処分する。
      5. 標準プロトコルに続く TRPA128 に対する RNAi を使用して AITC に対する応答の特異性を確認します。

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Representative Results

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S.地中海プラナリアンにおける外眼近紫外知覚はTRPA1依存性であり、H2O2リリース17にリンクすることが提案2されている。H2O2露光はS.地中海およびD.ジャポニカプラナリアン28でTRPA1依存的なスクランチを誘発するので、セクション2.1.4のステップは、近紫外光暴露が両方の種でスクランチを誘発するかどうかをテストするために使用することができる。D.ジャポニカプラナリアンは、ほぼUV光にさらされると(10/10)しゃがむが、S.地中海のプラナリアンは、前述の17のように尾間引き(7/10)を示すか、応答なし(3/10)を示す(図4A,4B)。セクション1.4で概説されているように、少なくとも3つの連続した直線スクランチを示したD.ジャポニカプラナリアンのためのスクランチングパラメータの定量化は、この種特徴的なスクランチングパラメータ7、28(ν28 m = 0.84±0.14、|Δε|max = 0.56 ± 0.06、v *m = 0.47 ± 0.07、f elong = 0.56 ± 0.03、N=7 の標準偏差±平均として報告される値)。

対照的に、マウス34の既知のTRPA1アゴニストである250 μMシンナムアルデヒドへの暴露は、S.地中海7、28(ν28 7m = 0.46 ± 0.08、|Δε|max = 0.36 ± 0.08, v*m = 0.16 ± 0.04, f elong = 0.58 ± 0.04, 平均 n ± 標準偏差として報告される値 N= 8) ( 図5A), D. ジャポニカプラナリアンは同じ (および 1.6 倍Figure 5Aの濃度).のヘビ様と振動運動の混合物を表示します。(8/24)サンプルを少なくとも3つの連続振動で定量すると、この種のスクランチで予想されるよりも4つのパラメータのうち3つのパラメータに対して有意に低い値が得られますm = 0.43 ± 0.08、 |Δε|max = 0.39 ± 0.03、v *m = 0.17 ± 0.02、f elong = 0.54 ± 0.06 で、値は N=8 の標準偏差±平均として報告されます。したがって、D.ジャポニカはシナアルデヒド暴露時にスクランチしているように見えるが、この種の文献値と計算されたパラメータを比較すると、この種7、2828は観察された振動運動が収縮していないことを示している。この例では、観察された動作を適切に解釈するために、生の行動データを注意深く検査して定量的測定の重要性を強調しています。

RNAiは、S.地中海におけるシナアルデヒド暴露に応答してスクランチの特異性を確認する。プラナリアン水中の250 μMシナマルデヒドへの暴露から180秒以内に15/15 unc22(コントロール)RNAi S.地中海プラナリアンがしゃがんだのに対し、0/16 SmTRPA1 RNAiプラナリアンはスクランチ(図5B)、S.地中海がシナマルデヒドでスクランチすることを示すSmTR1PAPAを必要とする。SmTRPA1のノックダウンは、100 μM AITC浴28への60秒露光を通して確認された。

Figure 1
図1:プラナリアン動作実験のセットアップ
(A) プラナリアンの動作を研究するための実験用の設定例(B)カメラの視野を中心とした100mmペトリ皿アリーナ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:アリーナにおけるプラナリアンのフィジー画像分析の代表的な例。
(A) 黄色の四角形で示される完全な平面パスを含む、対象となる選択された領域。(B) 重複後の対象領域からのサンプルフレーム。(C) しきい値(i)8 ビットのノイズを伴う平坦化イメージを使用して、背景とノイズからプラナリアンを引き算し、アスタリスクで示す。(ii) 閾値化後の平坦化された平坦化イメージ。(iii) ノイズを除去するためにサイズでフィルタリングを設定した後のプラナリアンのマスク。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:時間に関して平面の長さをプロットする。
(A)プラナリアンの長さの生のプロット対スクランチング S.地中海 プラナリアンのための時間。アスタリスクは、プラナリアンがスクランチ中に曲がった瞬間を示しています。(B) スクランチングデータをトリムする方法(i) 回転イベントデータを削除する、正しくトリミングされたプロット。(ii) 曲がりイベントデータを削除しない、誤ってトリミングされたプロット。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:近紫外線に対する種特異的応答
(A) D.ジャポニカスクランチングとS.地中海尾のサンプルフレームは、ほぼUV光に応答して薄くなります。(B)近紫外線に応答するS.地中海D.ジャポニカの代表的な振動プロット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:TRPA1アゴニストである250μMシンナムアルデヒドに対する種特異的応答。
(A)250 μM シンナマルデヒド浴中のD.ジャポニカS.地中海プラナリアンの代表的な振動プロット。(B) SmTRPA1 RNAi S. 地中海プラナリアンにおける250 μMシンナムアルデヒドにおけるスクランチの損失を示す代表的な振動プロット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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このプロトコルを使用すると、物理および化学的刺激,7、28、29または遺伝子操作(RNAi)28、29のプラ28,29ナリアン移動の影響を定量的に研究することができます。72829空間解像度を最大限に高めるには、アリーナ全体が視野に入っていることを確認しながら、カメラをできるだけアリーナの近くに移動することをお勧めします。スループットを向上させるために、複数のプラナリアンを同時に記録することで、複数のプラナリアンの動作を一度にスクリーニングできます。1つのアリーナで複数のプラナリアンをスクリーニングする場合、フィジーで関心のある地域を描き、ここで説明するように個々のプラナリアンを隔離するか、より高度なマルチオブジェクト追跡を採用することができます。同じアリーナに複数のプラナリアンを持つことの1つの問題は、彼らがパスを横断できることです。この問題は、多くの個人の同時記録を可能にしながら、多くの個人の同時記録を可能にしながら、複数のウェルプレートを使用して、行動23、24,24を定量化することによって解決できる。しかし、プラナリアンは、より小さなアリーナで壁に比較的多くの時間を費やし、画像分析の調整を必要とし、スクランチング/蠕動定量の解像度を制限します。

刺激が局所的に投与される場合(例えば、ピペット7、切断77、28、28レーザーポインタ17)、他の身体領域を刺激すると潜在的に異なる行動を誘発する可能性があるため、プラナリアンが同じ領域で一貫して刺激することが重要である。7異なる送達方法(例:ピペットまたは化学物質の浴など)は、行動表現型の一貫性にも影響を及ぼす。さらに、プラナリアンはすぐに28を脱感作することができ、同じプラナリアンと同じプラナリアンとしての実験を直ちに再利用してはならない場合に考慮する必要があります。最後に、ほぼUV曝露とシナアルデヒドについてここに示すように、同じ刺激が異なるプラナリアン種で異なる行動を誘発することができることに注意することが重要です。D.ジャポニカは尾端付近のUV近くの光で刺激されるとしゃがみ、S.地中海のプラナリアンは尾の間引きを示した。対照的に、シナアルデヒド暴露はS.地中海ではスクランチを誘発したが、D.ジャポニカプラナリアンでは誘発しなかったこのように、スクランチングは有害刺激7に対する様々なプラナリアン種の保存応答であるが、種固有のパラメータ7、28、28感度28、および誘導体28を有する。7したがって、スクランチがまだパラメータ化されていない新種については、切断7のような十分に保存された誘導物質から始めて、他の刺激に対する応答をテストする前に種固有のパラメータを決定するのが最善です。

ここで説明する分析の 1 つの制限は、頭の揺れ、滑空、またはその他の体型の変化による断続的なスクランチなどのターンや混合動作を考慮しないことです。ただし、 図 3に示すように、これらのインスタンスを手動で分析から除外した場合、生データを綿密に検査することでこれらの問題を軽減できます。さらに、ここで説明する質量と長さの追跡の中心に体型解析を追加し、これらの他の平面的な行動を定量化するプロトコルを拡張することができます。分析が研究された生物について何の仮定もしないことを考えると、プロトコルは原則として同様のタイプの行動を示す他の生物にも適用することができる。

ここで説明されているように、異なるプラナリアンの足元を定量化し、蠕動と識別する方法は、計算画像解析や行動研究における事前の訓練を前提とせず、特殊な機器やソフトウェアを必要としません。プロトコルの適合を容易にするために、データ例は補足資料に提供される。プラナリアンの入手と培養の容易さ、および特殊な機器なしで行動を記録する能力により、小学校の教室から学術研究室まで、あらゆるレベルの研究にプラナリアン行動研究が広くアクセスできるようになります。このプロトコルの修正版は、主に新入生と2年生で構成され、将来のSTEMと非STEMの両方の専攻を含む教育研究所の設定で正常に使用されています。

分子(RNAi)と化学ツールと定量的行動分析の組み合わせは、このプロトコルに記載されているように、研究者が行動の分子制御に関する機械主義的洞察を得ることを可能にする。このような研究9は、プラナリアン滑空19、20、光スタキシー17、35、36、熱積,35,369、37、およびスクランチ17,,99、28、2928,29に関与する主要なメディエーターおよび神経回路のいくつかを発見しました。20プラナリアンの行動は、人間のような高等生物において直接的なカロリー行動を持たないかもしれないが、これらの行動は、すべての生物にとって重要な基本的な神経機能を表す- 特定の刺激を感知し、処理し、適切に反応する能力。異なる生物間の主要な神経機能の保全のために、プラナリアンの機械学的研究は、行動の神経制御についてより広く教えてくれます。さらに、化学物質暴露に応じたプラナリアン行動を分析して、人間の脳に対する潜在的なリスクを知らせる可能性のあるプラナリアン神経系23、24、25に対する化学物質の影響を研究するために使用することができる。23,24,25特に、有害熱によって誘発されるスクランチは、神経毒性をアッシングするための敏感かつ特異的なエンドポイントであることが判明22,24,25,した。最後に、プラナリアンのユニークな再生能力は、研究者が神経再生中に異なる行動がどのように回復されるかのダイナミクスを解剖することを可能にする。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

著者らは、原稿に関するコメントに対するタタン・ゴエル氏に感謝する。この作品は、NSFキャリアグラント1555109によって資金提供されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) Sigma-Aldrich 377430-5G CAUTION:  Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4  Tamron 23FM25SP
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated Genesee Scientific  25-105
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile MedSupply Partners 62-1019-2
Cinnamaldehyde, >95% Sigma-Aldrich W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box Amazon B07HD631RP
Flea3 USB3 camera FLIR FL3-U3-13E4M
Heat resistant gloves Fisher Scientific 11-394-298
Hot plate Fisher Scientific HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water Instant Ocean SS15-10 Prepare in deionized water at 0.5 g/L.
Montjüic salts, prepared in Milli-Q water Sigma-Aldrich various Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.
Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene Simport D210-7
Pipette, 20-200 μL range Rainin 17008652
PYREX 150 mL beaker Sigma-Aldrich CLS1000150
Razor blade, 0.22 mm VWR 55411-050
Roscolux color filter:  Golden Amber Rosco R21 Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.
Roscolux color filter:  Medium Red Rosco R27
Roscolux color filter:  Storaro Red Rosco R2001
Samco transfer pipette, 62 µL large aperture Thermo Fisher 691TS
Support stand  Fisher Scientific 12-947-976
Thermometer VWR 89095-600
UV laser pointer Amazon B082DGS86R This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW.

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References

  1. Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
  2. Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
  3. Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
  4. Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. 2-46 (1903).
  5. Mc Connell, J. A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. Planarian Press. (1967).
  6. Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
  7. Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
  8. Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
  9. Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
  10. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
  11. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
  12. Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
  13. Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. 116-204 (2002).
  14. Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
  15. Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
  16. Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
  17. Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
  18. Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
  19. Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. 1-8 (2014).
  20. Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
  21. Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
  22. Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
  23. Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
  24. Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. 26-44 (2019).
  25. Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
  26. Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
  27. Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
  28. Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. 753244 (2019).
  29. Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
  30. Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. (2019).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  32. Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
  33. Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
  34. Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
  35. Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
  36. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
  37. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
有害刺激センシングのための定量的行動読み出しとしてのプラナリアンスクランチング
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Sabry, Z., Rabeler, C., Ireland, D., Bayingana, K., Collins, E. M. S. Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing. J. Vis. Exp. (161), e61549, doi:10.3791/61549 (2020).More

Sabry, Z., Rabeler, C., Ireland, D., Bayingana, K., Collins, E. M. S. Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing. J. Vis. Exp. (161), e61549, doi:10.3791/61549 (2020).

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