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Biology

유해 자극 감지를 위한 양적 행동 판독으로 기획자 스크런싱

doi: 10.3791/61549 Published: July 30, 2020

Summary

민물 평면도는 정량적 행동 분석에 의해 구별 되는 세 가지 걸음걸이 (활공, 연동 및 scrunching)를 전시합니다. 당사는 다양한 유해 자극, 정량화, 연동 및 글라이딩으로부터의 구별을 이용하여 스크런치를 유도하는 방법을 설명합니다. 유전자 녹다운을 사용하여, 우리는 정량적 현상 읽기로 스크런치의 특이성을 보여줍니다.

Abstract

민물 플래니안들은 보통 복부 쪽의 섬모 추진을 통해 매끄럽게 미끄러집니다. 그러나 특정 환경 조건은 근육 중심의 운동 형태인 연동 또는 스런치를 유도할 수 있습니다. 연동은 섬모 결함에서 발생하지만, 스크런치는 섬모 기능과 독립적이며 절단, 유해 온도, 극단적 인 pH 및 에탄올을 포함한 특정 자극에 대한 특정 반응입니다. 따라서, 이 두 근육 중심의 걸음걸이는 기계적으로 구별된다. 그러나, 그들은 질적으로 구별하기 어려울 수 있습니다. 여기에서는 다양한 물리적 및 화학 자극을 사용하여 스크런치를 유도하는 프로토콜을 제공합니다. 우리는 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용하여 연연및 글라이딩과 구별하는 데 사용할 수있는 스크런치의 정량적 특성을 자세히 설명합니다. scrunching은 보편적 인 평면 걸음걸이이기 때문에, 특성 종 별 차이가이기는하지만,이 프로토콜은 광범위하게 적절한 고려 사항을 사용할 때, 평면의 모든 종에 적용 할 수 있습니다. 이를 입증하기 위해, 우리는 행동 연구에서 사용되는 두 개의 가장 인기있는 플라야 종, Dugesia japonicaSchmidtea 지중해의반응을 물리적 및 화학 적 자극의 동일한 세트와 비교합니다. 더욱이, scrunching의 특이성은 이 프로토콜이 관련된 분자 표적 및 신경 회로를 해부하기 위하여 RNA 간섭 및/또는 약리학적 노출과 함께 사용될 수 있게 해주며, 잠재적으로 노치프션과 신경 근육 통신의 중요한 양상에 기계론적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Introduction

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4줄기세포 및재생연구1,,2,,3,민물 평면주의에 대한 인기 외에도, 민물 평면도는4,5에서오랫동안 사용되어 왔으며, 비교적 큰 크기(길이가 몇 밀리미터), 실험실 유지 보수의 용이성과 저렴한 비용, 광범위한 관찰 가능한 동작을 활용하고 있다. 평면 행동 연구에 컴퓨터 비전과 자동 추적의 도입6,,7,,8,,9,,10,,11 행동 표현형의 정량적 분화를 가능하게했다. 동물 행동은 신경 기능의 직접적인 판독입니다. 기획자 신경계는 중간 크기와 복잡성이지만, 척추 동물뇌12,,13,,14,연구 평면 행동을 연구하는 것은 더 복잡한 유기체에서 직접 탐구하기 어려울 수 있습니다 신경 작용의 보존 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 따라서, 평면도는 비교 신경생물학 연구를 위한 귀중한모델이다8,12, 15,,15,16,,17,,18,,19,20,,,21. 또한, 수생 환경은 화학 물질에 신속하고 촉진노출되어 재생 및 성인 평면제에서 뇌 기능에 미치는 영향을 연구할 수 있게 해주며,신경독성학 22,,23,,24,,25,,26에대한 인기 있는 시스템으로 만들어 줍니다.

플래너리안은 글라이딩, 연동, 스런치라고 불리는 세 가지 뚜렷한 걸음걸이를 가지고 있습니다. 각 걸음걸이는 특정 상황에서 전시된다: 글라이딩은 기본 걸음걸이이며, 섬모 기능이77,27로손상될 때 연동이 발생하고, 스크런치는 탈출 걸음걸이 – 섬모 기능과 무관하게 – 특정 유해 자극7에대응하여. 우리는 스크런치가 극단적 인 온도 또는 pH, 기계적 상해, 또는 특정 화학 유도기를 포함하여 특정 화학적 또는 물리적 단서의 감각에7의해 유도되는 특정 반응이며, 따라서 일반적인 응력 반응7,28,,29가아니라는 것을 보여주었다.

이 프로토콜을 사용하여 쉽게 정량화 될 수있는 특이성 및 고정 관념 매개 변수로 인해, 스크런치는 연구원이 감각 경로 및 행동의 신경 제어를 해부하는 기계론 적 연구를 수행 할 수있는 강력한 행동표현형이다 25,,28. 또한, 스크런치는 신경 독성 학 연구에서 신경계 발달 및 기능에 대한 불리한 화학적 효과를 분석하는 민감한 종점으로 나타났다22,,24,,25,,30. 여러 가지 감각 경로는 다양한 메커니즘을 통해 스크런치를 유도하기 위해 수렴하는 것처럼28,scrunching은 다양하지만 특정, 자극이 다른 신경 회로를 해부하고 다른 신호가 스런치 표현형을 생성하기 위해 통합되는 방법을 연구하기 위해 사용할 수 있기 때문에 다른 평면 행동과 다릅니다.

중요한 것은, 종 다름이 존재하며, 한 화학 물질이 한 마리의 평면 종에서 scrunching을 유도할 수 있지만 다른 화학 물질은 다른 종에서 다른 행동 반응을 유도할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 아난다미드가 플라니안 종 두게시아 자포니카에서 스크런치를 유도하지만, 슈미트메아 지중해28에서연골을 유도한다는 것을 발견했다. 이 예는 뚜렷한 분자 메커니즘의 표현성이기 때문에 다른 걸음걸이를 안정적으로 구별할 수 있다는 것의 중요성을 강조합니다. 그러나, 연골으로부터의 스쿼킹의 구별은 질적 관측 데이터를 사용하기 어렵다, 두 걸음 모두 근육 중심이며 질적 유사성을 공유하기 때문에7,,28. 따라서, 걸음걸이를 구별하기 위해서는 특징적인 파라미터7,,28에기초하여 구별을 허용하는 섬모 이미징 또는 정량적 행동 연구를 수행할 필요가 있다. 섬모 화상 진찰은 실험적으로 도전적이고 고배율 화합물 현미경 및 고속 카메라7,,28과같은 특수 장비가 필요하기 때문에, 정량적 행동 분석으로 연구원에 의해 광범위하게 접근할 수 없습니다.

여기서, 우리는 (1) 다양한 물리적 (유해 온도, 절단, 거의 UV 빛) 및 화학 (알릴 이소티오야네이트 (AITC), 계피 알데히드) 자극 및 (2) 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용하여 계획 행위의 정량적 분석을 사용하여 스크런치의 유도에 대한 프로토콜을 제시한다. 4개의 파라미터(체길이 진동, 상대속도, 최대 진폭 및 몸의 신장 및 수축의 비대칭)를 정량화함으로써7,스크런싱은 글라이딩, 연동 및 수축과 구별될 수 있으며, 뱀과 같은운동(15) 또는 간질같은 문헌에 보고된 기타 행동 상태로부터 분화될 수 있다. 또한, 위기는 다른 평면 종 중 보존하는 동안7,각 종은 자신의 특성 주파수와 속도를 가지고; 따라서 종의 글라이딩과 스크런싱 속도가 결정되면 속도만으로도 미끄러지기 및연공연산(29)과스크런딩을 구별하는 수단으로 사용할 수 있다. 이 프로토콜은 계산 이미지 분석 이나 행동 연구에서 사전 교육을 가정 하지 않습니다 따라서 또한 학부 수준에서 교육 실험실 컨텍스트에서 planarian 행동 실험에 적용할 수 있습니다. 프로토콜 적응을 용이하게 하는 예제 데이터는 보충 자료에 제공됩니다.

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Protocol

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1. 양적 평면 행동 분석

  1. 실험 설정
    1. 희미한 LED 패널을 평평한 표면에 놓습니다. LED 패널은 두 가지 목적을 제공합니다: (1) 균일한 흰색 배경을 제공하고 (2) 적절한 콘트라스트를 얻기 위해 조정 가능한 광원으로 사용된다. LED 패널에 100mm 페트리 디쉬 아레나를 배치합니다.
      참고: 처리량을 늘리기 위해 멀티 웰 플레이트를 아레나23,,24로사용할 수 있지만, 더 큰 경기장은 자동화된 이미지 분석을 용이하게 합니다.
    2. 경기장 위의 링 스탠드에 카메라를장착합니다(그림 1A). 카메라 위치, 높이 및 초점을 필요에 따라 조정하여 전체 경기장이 시야 내에 중심이 되고 초점이 집중되도록합니다(그림 1B).
      참고: 카메라 해상도는 평면을 LED 패널에서 제공하는 균일한 배경과 명확하게 구별할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다.
    3. 적절한 노출 매체(평면 수또는 화학용액)로 경기장을 최대 최대 량으로 채우면 됩니다(이는 목욕이라고 합니다). 이것은 100mm 페트리 접시에 대한 약 25 mL에 해당합니다. LED 패널을 켜고 녹음 품질(즉, 경기장에 눈부심을 생성하는 근처의 광원)에 부정적인 영향을 줄 수 있는 다른 광원을 끕니다.
      주의: 완전한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 필요한 경우 실험 용 설정을 연기 후드로 이동하여 유해 화학 솔루션을 적절하게 관리합니다. 폐기물 처리에 대한 연방 및 주 규정을 따릅니다.
    4. 전사 파이펫을 사용하여 경기장 중앙에 평면을 놓습니다. 녹음을 시작합니다. 네이티브 피지31 형식(TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM 또는 FITS; 이미지 분석 섹션 1.2 참조)에서 이미지 시퀀스로 데이터를 기록합니다.
      참고: 외부 자극에 대한 행동과 민감도는 개별 평면주마다 다르기 때문에 기술적 복제를 수행하는 것 외에도 충분히 많은 수의 생물학적 복제에 대한 데이터를 수집하는 것이 중요합니다. 우리는 한 번에 100mm 페트리 접시에 최대 10 중간 크기 (4-7mm) 평면과 함께 일했습니다. 시간 효율적이지만, 페트리 접시의 여러 플래니언들은 플래니언이 길을 건너는 것을 볼 수 있기 때문에 데이터 분석을 한 번에 더 어렵게 만듭니다.
      1. 글라이딩 실험의 경우 초당 최소 1프레임(FPS)을 사용하여 기록합니다. scrunching/연반 실험을 위해, 적어도 두 배의 scrunching/연근 주파수인 FPS를 사용하여 기록할 수 있습니다. 평면 종은 알 수없는 scrunching / 연동 주파수가있는 경우, 시작 점으로 10 FPS를 사용하고 적절하게 증가 / 감소.
      2. 화학용액을 사용하는 경우, 가능한 한 적은 방울의 평면수로 플라니안 물을 사용하여 플라니안을 전송하여 화학용액의 농도가 크게 변하지 않도록 한다.
    5. 글라이딩 실험의 경우 1-2분간의 글라이딩 동작을 기록합니다. 스크런치/연동 실험의 경우, 직선으로 발생하는 3회 연속 진동을 캡처할 수 있을 만큼 충분히 오래 기록하십시오. 실험이 완료되면 레코딩을 종료합니다.
      참고: 스크런싱/연무 실험의 경우, 플래너어가 복제판에서 일관되어야 하고 자극에 따라 경험적으로 결정되는 고정된 기간 내에 종료 기준을 충족시키지 못하면 기록을 종료하고 다른 평면동물을 테스트합니다.
      1. 플래니언이 종료 기준을 충족하지 않고 경기장 경계에 도달하면, 플래니언을 경기장 중앙으로 되돌려 보라고 한다.
        참고: 이 동작이 변경될 수 있기 때문에 기록용 개인의 반복적인 파이펫팅을 피하십시오.
    6. 경기장에서 평면을 제거하고 적절한 폐기물 용기에 평면 물 또는 화학 용액을 폐기하십시오. 평면 수에 있던 플래너리인들은 집 컨테이너로 돌아갈 수 있습니다.
      참고: 다른 매체에 대해 다른 경기장을 사용하여 교차 오염을 피하십시오(즉, 평면 수질 실험에서 미끄러지는 것은 이전에 화학 적 노출로 분쇄 / 연연 실험에 사용되는 경기장에서 실행되어서는 안됩니다).
      1. 화학 용액에 노출된 플래너리(3깨끗한 100mm 페트리 접시)에 25mL의 플라나리안 워터가 들어있어 화학물질을 철저히 희석시합니다. 크런치 또는 연설이 유도된 경우, 이러한 평면도를 별도의 용기에 배치합니다. 대부분의 세포가 그 시간1로인계했기 때문에 Planarians는 한 달 후에 홈 컨테이너로 돌아갈 수 있습니다.
        참고: RNAi 인구와 같은 평면 인집단에 대해 여러 가지 실험이 필요한 경우 다음 실험을 실행하기 전에 planarians가 24 시간 동안 회복할 수 있습니다. 가장 침습적 실험이 먼저 이고 가장 침습적인 실험(예를 들어, 절단)이 마지막으로 실행되도록 실험을 주문한다.
      2. 같은 경기장에서 여러 실험을 실행하는 경우, 제대로 목욕 솔루션을 처분하고 실행 사이에 종이 타월로 경기장을 닦아 어떤 점액 흔적을 제거합니다.
        참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
  2. 평면 행동의 정량적 분석
    1. 섹션 1.1에 설명된 대로 평면 행동 에세이를 수행합니다.
    2. 피지(파일 > 가져오기 > 이미지 시퀀스)에서실험에 대한 원시 이미지 시퀀스를 열고 이미지 시퀀스에서 첫 번째 이미지를 선택합니다. 시퀀스 옵션 창에서 "숫자로 이름 정렬"에 대한 확인란을 확인하고 "확인"을 클릭합니다. 이미지 시퀀스가 로드되면 이미지 시퀀스를8비트(이미지> Type > 8비트)로변환하고 이미지 스택 하단의 화살표 도구 또는 슬라이더를 사용하여 이미지 시퀀스를 통해 보거나 이동합니다.
      참고: 글라이딩 실험의 경우 모든 데이터를 기록 전체에서 평면을 명확하게 볼 수 있는 한 사용할 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 아래에 설명된 바와 같이 관련 부분을 추출하여 경기장 중앙에서 자유 모션을 분석하기에 충분하다.
    3. 기간 및 관심 영역을 추출하려면 직사각형도구(그림 2A, 2B)를사용하여 평면주의의 전체 경로를 포괄하는 관심 영역을 그립니다. 이미지 스택을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 중복을 선택하고 중복 스택에대한 상자를 선택하고 관심 시퀀스의 첫 번째 및 마지막 프레임을 입력하고 확인을 클릭합니다. 여러 평면도가 동시에 이미지화되었다면 경기장에 평면이 있는 만큼 많은 오픈 이미지 스택이 있도록 경기장에 있는 각 플래너에 대해 이 지역 선택 및 복제 단계를 반복하십시오. 다음 단계(단계 1.2.4-1.2.10)는 각 이미지 스택에서 한 번에 하나씩 수행해야 합니다.
      1. 글라이딩 실험을 위해, 평면이 신체 길이의 두 배 이상 이동하는 글라이딩 기간을 추출합니다.
        참고: 플래나리안당 글라이딩 데이터가 많을수록 데이터가 더 신뢰할 수 있습니다. 플래니언은 글라이딩 분석을 위해 직선으로 이동할 필요가 없습니다.
      2. scrunching/연동 실험의 경우, 평면이 직선으로 최소 3회 연속(이상적으로 더 많은) 신체 진동을 겪는 경우, 각 진동이 전체 진동이 주파수를 정확하게 결정하는 데 필요하므로 완전한 연신 수축 주기인지 확인합니다.
        참고: 추출할 수 있는 진동이 많을수록 데이터가 더 신뢰할 수 있습니다. 이 부정확한 길이 측정을 초래할 수 있기 때문에 planarian이 회전하는 시퀀스를 사용하지 마십시오.
    4. 중복된 이미지스택(이미지 > Adjust > threshold)에임계값을 적용하여 이미지를 비나이즈하고 백그라운드에서 평면을 추출합니다. 전체 평면주의가 빨간색으로 강조 표시될 수 있도록 필요에 따라 슬라이딩 바를 조정합니다. 정확한 값은 이미징 품질에 따라 다릅니다. 어두운 배경에대한 상자를 두고 히스토그램을 쌓고범위를 선택 취소하지 마십시오. 이미지 스택을 스크롤하여 좋은 임계값 범위(예: 평면이 스택 전체의 배경에서 잘 분리됨)를 확인한 다음 적용을 클릭합니다.
    5. 변환 스택에서 바이너리 창으로 변환하면 메서드를 기본값으로 설정하고 배경을 라이트로 설정합니다. 이 창의 모든 확인란을 선택 취소한 다음 확인을 클릭합니다. 흰색 배경에 검은 색 평면을 보여주는 비나화된 이미지가나타납니다(그림 2C). 전체 평면주의가 이미지 시퀀스의 모든 프레임에 표시되는지 확인합니다.
      참고: 평면보다 작거나 큰 바이너리이미지 서열의 원치 않는 물체는 크기필터(그림 2Ciii)를사용하여 후속 분석에서 필터링될 수 있다.
    6. 분석 및 측정 설정을 클릭하여 측정을 설정합니다. 영역, 질량 중심, 스택 위치타원을 입력하고 확인을 클릭하려면 상자를 확인합니다.
      참고: 이러한 매개 변수는 피지 세션당 한 번만 설정하면 됩니다.
    7. 열린 이미지 스택을 선택하고 분석 및 gt를 선택하고 파티클을 분석합니다.
    8. 파티클 분석 창에서 표시 > 마스크를 선택하여 선택한 매개 변수로 검색된 모든 개체를 보여주는 새 스택을 엽니다. 이 것을 사용하여 평면주의 측정만 수행되고 있는지 시각적으로 확인할 수 있습니다. 크기 필터는 제공된 공간에서 평면주의(픽셀2 단위)의 대략적인 영역을 입력하여 원치 않는 노이즈를 제거하기 위해 이 단계에서 설정할 수 있다. 표시 결과에 대 한 상자를 확인 하 고 결과 지우기 하 고 확인을클릭 합니다.
      참고: 결과 창에서 인덱스(첫 번째 열)가 모든 행의 슬라이스 번호와 같지 않은 경우 너무 많거나 너무 적은 개체가 추적되었다는 것을 의미합니다. 이러한 불일치의 한 가지 가능성은 평면 주의자 외에 다른 개체의 존재 또는 평면이 특정 프레임에서 추적되지 않았다는 것입니다.
    9. 패널 하단의 슬라이더를 사용하여 마스크 이미지 스택을 통과합니다. 노이즈가 있거나 평면이 없는 프레임이 있는 경우 결과 창과 마스크 이미지 스택을 닫습니다. 단계 1.2.7-1.2.8을 반복하여 지역 필터를 조정하여 평면이 아닌 다른 객체만 제거합니다.
      참고: 평면이 마스크의 프레임에서 누락된 경우 영역 필터의 하한이 너무 높게 설정되어 있음을 나타냅니다.
    10. 결과 창에서 File>Save 를사용하여 데이터를 저장합니다. 파일을 이름에 .csv 확장 프로그램을 추가하여 데이터를 쉼표 구분값으로 저장합니다. 이미지 스택에 대한 데이터가 저장되면 각 이미지 스택및 결과마스크 창을 닫습니다.
    11. 스프레드시트 소프트웨어 또는 프리웨어를 사용하여 데이터를 가져오고 분석할 수 있습니다. 글라이딩 속도를 계산하려면 섹션 1.3을 참조하십시오. 스크런치/연차 전체 매개변수 집합을 계산하려면 섹션 1.4를 참조하십시오.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
    12. 실제 길이 변환에 픽셀을 확인하려면 참조 길이(예: 경기장 직경)가 있는 피지에서 이미지를 엽니다. 선 도구를 선택하고 알려진 길이에 선을 그립니다.
    13. 분석 및 설정 배율분석을클릭하여 픽셀 단위를 표준 길이 단위로 변환합니다. 알려진 거리 상자에서 이미지에 그려진 선에 해당하는 길이를 입력하고 pixel 픽셀에서 선택한 표준 길이 단위로 길이 단위를 변경합니다. 변환 계수는 배율옆에 기록됩니다.
      참고: 1.3및 1.4 절에서 글라이딩 또는 스크런싱/연연분석에서는 픽셀 변환 값이 필요하지 않습니다.
  3. 글라이딩 속도 계산
    1. 섹션 1.2에 저장된 데이터 파일을 사용하여 질량(COM) x 및 y 좌표 및 주요 축 데이터를 로드합니다. 데이터가 쉼표 구분값 파일로 저장되는 경우 이러한 목록은 각각 "XM", "YM" 및 "Major" 열에 해당합니다.
    2. "XM" 및 "YM" 데이터 열을 사용하여 다음 프레임에 대해 각 프레임에 대해 평면 질량 중심의 변위(d)를 계산합니다. 변위(d)는 다음과 같은 경우
      Equation 1
      여기서 x1 및 y1은 한 프레임및 x 2 및 y2의 COM 좌표(XM, YM)를 참조하여 후속 프레임의 COM 좌표(XM, YM)를 지칭한다.2
    3. "메이저" 열의 95번째 백분위수로 평면 체 길이를 설정합니다. 평면도는 벽 선호도행동(32)을나타내기 때문에, 이는 계산된 평면 체길이가24의길어지면를 대표합니다.
    4. 평면 체길이에 의해 변위를 정규화하여 프레임당 픽셀 변위를 평면 체길이(l)로나눈다. 정규화 된 변위 (dn)는 다음을 제공합니다.
      Equation 2
    5. 정규화된 변위를 프레임당 경과시간(기록된 FPS의 역)으로 나누어 정규화된 속도 목록을 생성합니다. 정규화 된 글라이딩 속도 (sn)는 다음을 제공합니다.
      Equation 3
    6. 정규화된 속도 목록(sn)의평균을 취하여 평면주의의 정규화된 글라이딩 속도를 계산한다. 표준 편차는 평면주의에 대한 불확실성 측정으로 사용될 수 있습니다.
    7. 각 평면도에 대해 1.3.1-1.3.6단계를 반복한다. 모든 평면 주의자가 각각 미끄러지는 속도와 관련 불확실성을 평면 인구에 대한 글라이딩 속도 및 관련 불확실성을 얻을 수있는 글라이딩 속도의 표준 편차를 가지고.
  4. 전체 매개 변수 세트를 사용하여 스크런치 및 연골 걸음걸이의 구별
    1. 섹션 1.2에서 저장된 데이터 파일에서 주요 축 데이터 목록을 로드합니다. 데이터가 쉼표 구분값 파일로 저장되는 경우 이는 주요 열에 해당합니다.
    2. 0으로 시작하는 주요 열의 각 데이터 포인트에 숫자가 있는 목록을 만듭니다. 이 목록을 기록된 FPS로 나누어 프레임당 경과시간으로 변환합니다.
    3. 경과된 시간에 대하여 주요 열 데이터를 플롯하여 스크런치/연동 진동 플롯(그림3A)을생성합니다. 진동 플롯을 사용하여 데이터를 3회 연속 직선진동(그림 3Bi)으로트리밍합니다. 로컬 피크(진동의 최대 연신) 또는 쓰루(진동의 최소 신장)에서 시작 및 종료하도록 데이터를 트리밍합니다.
      참고: 로컬 엑트레마가 거의 같지 않은 경우(피크/트로프는 높이가 크게 다르며), 이는 진동이 직선이 아님을 시사합니다(그림3Bii). 적어도 3개의 연속, 직선 진동의 또 다른 순서를 추출합니다. 섹션 1.2를 참조하십시오.
    4. 트리밍된 주요 데이터를 시간에 대해 다시 플로팅하여 관심 있는 진동 순서를 추출하고 올바르게 트리밍되었는지 확인합니다. 모든 후속 계산에 대해 이 트리밍된 데이터 목록을 사용합니다.
    5. 진동 주파수(θm)를계산하려면, 트리밍된 주요 축 데이터 목록(N)에서 총 데이터 포인트 수로 진동 수(On)를 나눈다. (N) 이 값으로 FPS를 곱하여 초당 진동의 빈도를 얻습니다.
      Equation 4
    6. 최대 신장을 계산하려면(|Δθ| 최대)절대 최대 체길이(lmax)로부터 절대 최소 체길이(lmin)를min 빼는다. max 절대 최대 체길이로 나누어 길쭉한 체길이로 정상화한다.
      Equation 5
    7. 체거리(v*m)당*m속도를 계산하려면 진동 주파수에 따라 계산된 최대 신장을 곱합니다.
      Equation 6
      참고 : 속도 만으로도 스크런치와 연동 보행7을구별하는 데 사용할 수 있습니다.
    8. 길게 하는 데 소요된 시간의 일부를 계산하려면(flong),시간과 관련하여 트리밍된 주요 축 데이터 목록의 유도체를 가져 가라. 양수 데이터 포인트의 개수(즉, 유도체가 >0(n p)때, 주요 축 데이터 목록(nt)의총 데이터 포인트 수로 나눈다.
      Equation 7
      참고: 스크런싱 플래니언은 장시간 시간을 보내는 비대칭적인 부분을 나타내고, 연골을 수행하는 플래니언들은 7을 연장하고계약하는데 동등한 시간을 소비합니다.
    9. 각 평면도에 대해 1.4.1-1.4.8단계를 반복한다. 각 매개 변수의 평균 및 표준 편차를 사용하여 설정된 평면 채우기 매개 변수를 계산합니다.
      참고: 매개 변수 세트를 사용하여 진동 동작이 주기적인 신체 모양 변경으로 진동, 연동 또는 다른 형태의 운동인지 확인할 수 있습니다. 스크런치와 연무성 모두 주어진 종7에대한 고정 매개 변수를 가지고 있으며, 일반적으로 연막 매개 변수7보다크므로 스런치 매개 변수가 있습니다. 파라미터 중 하나가 종별 범위 밖으로 떨어질 수 있지만, 이전에 화학유도(28)로관찰한 바와 같이, 관찰된 동작은 4개의 발표된 매개변수 중 적어도 3개에 동의하여 연동또는 스크런치로 분류되어야 한다.

2. 스런치 유도

  1. 물리적 자극 (유해 온도, 자외선, 절단)
    1. 모든 물리적 자극 실험의 경우 실험 용 설정에 대한 섹션 1.1을 참조하십시오.
      참고: 100mm 페트리 접시와 같은 대형 경기장을 물리적 자극 실험을 통해 파이펫 및/또는 면도날을 조종할 수 있는 더 개방적인 공간을 제공하는 것이 가장 좋습니다.
    2. 유해 한 온도를 통해 스크런치를 유도하기 위해, 유리 비커에 열 평면 물 (테스트 할 평면 당 적어도 100 μL) 에 65 °C 뜨거운 플레이트에.
      1. 경기장 중앙에 평면을 배치합니다. 평면 오리엔트 자체가 똑바로 서서 미끄러지기 시작할 때까지 기다립니다. 녹음을 시작합니다.
      2. P-200 파이펫을 사용하여, 65°C 의 플라나리안 워터의 천천히 피펫 100 μL을 플라나리안의 꼬리 끝에 인두 후 로 하여 스크런치를 유도한다.
        참고: 가열된 평면 수는 65°C에 머물러 있는지 확인합니다. 필요한 경우 다른 실험을 시작하기 전에 물을 65°C로 다시 가열합니다. 압력은 또한 스크런치를 유도 할 수 있기 때문에, 느린 파이펫팅이 필요합니다. 실험에서와 동일한 방식으로 실내 온도 물을 파이프팅하는 것은 제어 및 연습 옵션으로 사용될 수 있습니다.
      3. 스크런치가 중단되면 녹음을 중지합니다. 플래니언을 복구 용기에 넣고 더 많은 실험을 실행하는 경우 신선한 실온 평면 수와 페트리 접시에 미디어를 교환합니다.
    3. 절단을 통해 스크런치를 유도하기 위해, 경기장의 중심으로 평면을 전송하고 평면 오리엔트 자체가 똑바로 똑바로 시작하고 글라이딩을 시작할 때까지 기다립니다. 녹음을 시작합니다.
      1. 깨끗한 면도날을 사용하여 평면을 절단합니다. 절단 위치는 실험 전반에 걸쳐 일관된 한 절단은 평면을 따라 어디서나 수행 될 수있다.
        참고: 스크리치 매개변수는 전방 조각에서 추출됩니다. 따라서 후방 끝에서 접근하여 컷을 적용 할 때 평면주의이 부분의 카메라보기를 방해하지 마십시오. 플라스틱 커버 슬립은 절단에도 잘 작동하며 특히 교육 환경에서 더 안전한 옵션입니다.
      2. 전방 조각이 스크런치를 중단하면 녹음을 중지합니다. 두 조각을 제거하고 별도의 용기에 넣고 7 일 동안 재생 할 수 있습니다. 절단 된 평면도는 일단 재생되면 홈 컨테이너에 재통합 할 수 있습니다.
    4. 거의 UV 광을 사용하여 스크런치를 유도하기 위해 카메라 렌즈에 적절한 필터(예: Roscolux 필터)를 부착하여 카메라에 의해 수집되는 거의 UV 광의 양을 줄이고 평면주의 반응을 이미징하는 데 방해가 될 수 있습니다. LED 패널을 사용하여 아래에서 경기장을 비추는 대신, 평면도가 둔감한33인주변 빨간색 조명을 사용하십시오.
      1. 100mm 페트리 접시 경기장을 평면물로 채우고 경기장 중앙에 단 하나의 평면(5-9mm)을 배치합니다. 10FPS에서 녹화를 시작합니다.
      2. 경기장에서 약 30cm 떨어진 클래스 II UV 레이저 포인터(405± 10nm, 출력 출력 출력 및 lt;5 mW)를 잡으십시오. 레이저 포인터를 글라이딩 플래니언에서 45° 각도로 배치한 다음 인두의 후방 끝과 꼬리 끝 사이의 중간 지점에서 5-10초 동안 레이저 포인터를 비춥니다.
        참고: 거의 UV에 민감한 파워 미터를 사용하여 레이저 포인터의 힘을 측정할 수 있습니다.
      3. 평면이 반응의 재현성을 테스트하기 위해 같은 개인에 두 번 더 자극을 시도하기 전에 다시 글라이딩을 시작할 때까지 기다립니다. 평면도가 동일한 동작을 계속 표시하면 녹음을 중단하고 계획계획을 컨테이너에 다시 넣습니다. 자극 사이에 동작이 변경되면 추가 테스트에 가장 눈에 띄는 응답이 표시됩니다.
        참고: 평면은 거의 UV 빛에 둔감해질 수 있으며 반응을 멈출 수 있습니다. 연속 자극은 8-10초의 휴식 기간이 필요합니다.
  2. 화학 자극 (AITC)
    1. 화학 물질을 사용하여 스크런치를 유도하기 위해, 예를 들어, TRPA1 아고니스트 AITC28,평면은 이상적으로 화학 물질의 목욕에 침지된다. 필요한 경우 피펫팅은 섹션 2.1.2.3에 설명된 대로 적용할 수 있습니다.
      주의: AITC는 가연성, 급성 독성, 피부와 눈 자극, 호흡기 및 피부 감광을 일으킬 수 있으며 수생 생활에 유해합니다. AITC 오일은 연기 후드로 처리해야합니다. AITC의 스톡 솔루션을 만들기 전에 적절한 PPE(니트릴 장갑 및 실험실 코트)를 착용하고 적절한 고체 및 액체 유해 폐기물 처리 용기를 설정합니다.
    2. 연기 후드에 50mL 원심분리기 튜브에 플라나리안 워터에서 AITC의 10mM 스톡 솔루션을 만드세요. 이 스톡 솔루션은 4°C에 보관할 때 최대 1개월 동안 사용할 수 있습니다.
      1. 이 스톡에서, 50 mL 원심분리기 튜브에 평면 수에 100 μM AITC의 25 mL 작업 용액을 준비합니다. 이 100 μM AITC 솔루션은 평면에서 스크런치를 유도하는 데 사용됩니다.
        참고: 100 μM AITC는 D. japonicaS. 지중해 평면도 28에서일관된 스크런치를 유도합니다. 다른 수중 평면의 경우 100 μM은 시작 농도로 작용할 수 있으며 그에 따라 조정할 수 있습니다.
      2. 실험 설정 설정(섹션 1.1 참조)을 설정합니다. AITC 작업 솔루션으로 경기장을 채우고 보조 컨테이너에 배치합니다. 보조 컨테이너는 경기장의 볼륨의 적어도 두 배를 보유해야합니다.
        참고: 추가 안전을 위해 연기 후드 내부에서 실험을 수행할 수 있습니다.
      3. 최대 10명의 플래타리안을 경기장 중앙으로 옮기고 녹음을 시작합니다.
      4. 기획자가 둔감해지고 스크런치를 중단하면 녹음을 중단하십시오. AITC 솔루션에서 평면을 제거하고 헹구기(섹션 1.1 참조). 적절한 폐기물 용기에 고체 및 액체 AITC 폐기물을 폐기하십시오.
      5. 표준 프로토콜에 따라 RNAi에서 TRPA128에 대한 응답의 특이성을 확인합니다.

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Representative Results

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S. 지중해 평면도에서 비외-UV 지각은 TRPA1 에 의존하 고 H2O2 릴리스17에연결 될 제안 되었습니다. H22O2 노출은 S. 지중해D. japonica planarians28에서TRPA1 의존적인 스크런치를 유도하기 때문에, 섹션 2.1.4의 단계는 거의 UV 빛 노출이 두 종모두에서 스크런치를 유도하는지 여부를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. D. japonica planarians scrunch (10/10) 가까운 UV 빛에 노출 될 때, S. 지중해 평면도 는 이전에설명 된 대로 꼬리 숱이 (7/10)를 전시하거나 응답 없음 (3/10)(그림 4A,4B). 섹션 1.4에 설명된 바와 같이, 적어도 3연속 직선 스크런치를 전시한 D. japonica planarians에 대한 스크런치 매개변수의 정량화는 이 종7,,28 (m = 0.84 ± 0.14) 특징적인 스크런치 파라미터를 드러낸다. Δθ| 최대 = 0.56 ± 0.06, v*m = 0.47 ± 0.07, f 연림 = 0.56 ± 0.03, 값은 N=7에 대한 표준 편차에 대한 평균 ± 표준 편차로 보고).

대조적으로,마우스(34)에서알려진 TRPA1 작용제인 250 μM 계피알데히드에 노출되면, S. 지중해7,,28(m = 0.46 ± 0.08)m Δθ| 최대 = 0.36 ± 0.08, v*m = 0.16 ± 0.04, f 연평 = 0.58 ± 0.04, N=8에 대한 ± 표준 편차로 보고된 값(도 5A) (도 5A)반면, D. japonica planarians는 같은 (및 1.6. 배 농도)에서 뱀과 같은 진동 운동의 혼합물을 표시합니다.Figure 5A (8/24) 샘플의 정량화는 3회 이상 연속 진동을 가진 샘플의 정량화는 이 종에서 스크런치에 대해 예상보다 4개의 매개변수 중 3개에 대해 현저하게 낮은 값을산출합니다(m = 0.43 ± 0.08 | Δθ| 최대 = 0.39 ± 0.03, v*m = 0.17 ± 0.02, flong = 0.54 ± 0.06, 값은 N=8에 대한 표준 편차 ±평균으로 보고된다. 따라서, D. japonica는 계피 알데히드 노출시 스크런치하는 것처럼 보이지만, 이종7,,28에 대한 문헌 값과 계산된 파라미터의 비교는 관찰된 진동 운동이 분쇄되지 않는다는 것을 보여준다. 이 예제에서는 관찰된 동작을 적절하게 해석하기 위해 원시 행동 데이터를 주의 깊게 검사하는 것과 함께 정량적 측정의 중요성을 강조합니다.

RNAi는 S. 지중해에서 계피 알데히드 노출에 대한 응답으로 스크런치의 특이성을 확인합니다. 플래너리워터 15/15 unc22(대조군) RNAi S. 지중해 플래너리안에control노출된 지 180초 이내에, 0/16 SmTRPA1 RNAi 플래니안이Figure 5Bs.mediterraneassccrunchsscctrasccrunchingsTRas.kr1 S. mediterranea SmTRPA1. SmTRPA1의 녹다운은 100 μM AITC목욕(28)에60초 노출을 통해 확인되었다.

Figure 1
그림 1: 평면 행동 실험 설정.
(A)평면 행동 연구를 위한 샘플 실험 설정. (B)카메라의 시야를 중심으로 100mm 페트리 접시 아레나. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 경기장에서 평면의 피지 이미지 분석의 대표적인 예.
(A)노란색 사각형으로 표시된 전체 평면 경로를 포괄하는 관심 영역을 선택합니다. (B)복제 후 관심 영역으로부터의 샘플 프레임. (C)플라나디언을 문턱을 통해 배경과 소음으로부터 빼는소음(i)8비트 이미지, 별표에 의해 표시된다. (ii)임계값 후 평면의 비나화 이미지. (iii)노이즈를 제거하기 위해 크기별로 필터링을 설정 한 후 평면의 마스크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 시간에 관하여 평면 길이플롯.
(A)평면 길이의 원시 플롯과 s. 지중해 평면에 대한 시간. 별표는 기획자가 으르렁이면서 돌아섰던 순간을 나타냅니다. (B)스크런싱 데이터를 트리밍하는 가능한 방법. (i)터닝 이벤트 데이터를 제거하는 올바르게 트리밍된 플롯입니다. (ii)터닝 이벤트 데이터를 제거하지 않는 잘못 손질된 플롯입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 거의 UV 광에 대한 종 별 반응.
(A) D. japonica scrunching및 S. 지중해 꼬리의 샘플 프레임은 거의 UV 빛에 대한 응답으로 얇아집니다. (B)거의 UV 빛에 대한 응답으로 S. 지중해D. japonica의 대표적인 진동 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 250 μM 계피알데히드, TRPA1 작용제에 대한 종 특이적 반응.
(A)250 μM 계피알데히드 목욕에서 D. japonicaS. 지중해 평면을 위한 대표적인 진동 플롯. (B) SmTRPA1 RNAi S. 지중해 플래터니안에서 250 μM 계피 알데히드에서 스크런치의 손실을 보여주는 대표적인 진동 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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이 프로토콜을 사용하여, 하나는 물리 및 화학 자극7,,28,,29 또는 유전자 조작 (RNAi)28, 29,29 의 효과 의 효과 평면 운동에서 정량적으로 연구 할 수 있습니다. 공간 해상도를 최대화하기 위해 카메라를 경기장과 최대한 가깝게 이동시키면서 전체 경기장이 시야에 있는지 확인하는 것이 가장 좋습니다. 처리량을 높이기 위해 여러 평면의 동작을 동시에 기록하여 한 번에 선별할 수 있습니다. 단일 경기장에서 하나 이상의 평면을 선별할 때, 피지에서 관심 있는 지역을 그려 서 여기에 설명된 대로 개별 평면인을 격리하거나 더 진보된 다중 물체 추적을 사용할 수 있습니다. 같은 경기장에서 여러 평면을 갖는 한 가지 문제는 경로를 교차 할 수 있다는 것입니다. 이 문제는 다중 우물 판을 사용하여 평면인을 서로 격리하는 동시에 많은 개인의 동시 기록을 사용하여 동작23,,24를정량화할 수 있도록 할 수 있습니다. 그러나, 평면도는 작은 경기장에서 벽에 상대적으로 더 많은 시간을 보낼 것입니다, 이미지 분석에 조정을 요구하고 scrunching / 연반 적 정량화에 대한 해상도를 제한.

자극이 로컬로 투여될 때(예를 들어, 피펫팅7,절단7,,28,레이저 포인터17),다른 신체 부위를 자극하는 것이 잠재적으로 다른 행동을 유도할 수 있기 때문에 평면도가 동일한 영역에서 일관되게 자극되는 것이 중요합니다. 다른 전달 방법(예: 화학 물질의 파이펫팅 또는 목욕)은 행동 표현형의 일관성에도 영향을 줄 수 있다. 또한, 평면도는28을신속하게 둔감하게 할 수 있으며, 동일한 평면과 같은 실험을 계획할 때 동일한 또는 다른 자극을 사용하여 여러 실험을 즉시 재사용해서는 안 됩니다. 마지막으로, 거의 UV 노출과 계피알데히드에 대해 여기에서 보여 준 바와 같이, 동일한 자극이 다른 평면 종에서 뚜렷한 행동을 유도할 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요합니다. D. japonica는 꼬리 끝 근처에 거의 UV 빛으로 자극할 때, S. 지중해 플래터리인들이 꼬리숱이 줄었다. 대조적으로, 계피 알데히드 노출은 S. 지중해에서 scrunching을 유도하지만 D. japonica 플래니언에서하지.. 따라서, 스크런치는 유해 자극7에다양한 평면 종의 보존 된 반응이지만, 종 별 파라미터7,,28,감도(28)유도자(28)를가지고 있다. 따라서, 스크런싱이 아직 매개변수화되지 않은 새로운 종의 경우, 다른 자극에 대한 반응을 테스트하기 전에 종별 파라미터를 결정하기 위해 절단7과같은 잘 보존된 유도체로 시작하는 것이 가장 좋습니다.

여기에 설명된 분석의 한 가지 제한은 머리 흔들림, 글라이딩 또는 기타 신체 모양 변화와 간헐적인 스크런싱과 같은 회전 및/또는 혼합 동작을 고려하지 않는다는 것입니다. 그러나 원시 데이터의 면밀한 검사는 그림 3에서설명한 대로 이러한 인스턴스가 분석에서 수동으로 제외되는 경우 이러한 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 여기에 설명된 질량 및 길이 추적의 중심에 체형 분석을 추가하고 이러한 다른 평면 적 행동을 정량화하기 위해 프로토콜을 확장할 수 있다. 분석이 연구된 유기체에 관하여 어떤 가정을 하지 않는다는 것을 감안할 때, 프로토콜은 또한 행동의 유사한 모형을 보여주는 그밖 유기체에 원칙적으로 적용될 수 있었습니다.

여기에 설명된 바와 같이, 다양한 평면 도면현상을 정량화하고 연동과 구별하는 방법은 전산 이미지 분석 이나 행동 연구에서 사전 교육을 받지 않으며 특수 장비 또는 소프트웨어가 필요하지 않습니다. 프로토콜 적응을 용이하게 하기 위해 예제 데이터는 보충 자료에 제공됩니다. 기획자 확보 및 배양의 용이성뿐만 아니라 특수 장비없이 행동을 기록하는 능력은 초등학교 교실에서 학술 실험실에 이르기까지 모든 수준에서 연구에 광범위하게 접근 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 수정 된 버전은 주로 신입생과 소포모어 학생으로 구성되고 예비 STEM 및 비 STEM 전공을 모두 포함하는 교육 실험실 설정에서 성공적으로 사용되었습니다.

이 프로토콜에 설명된 바와 같이 분자(RNAi)와 화학 도구와 정량적 행동 분석의 조합은 연구원이 행동의 분자 제어에 대한 기계적 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다. 이러한 작업은 평면 글라이딩,19,20,포토택시 17,,35,36,열탁9,,37,및 스크런치,3799,28,,29에관련된 주요 중재자 및 뉴런 회로의 일부를 발견했다.9 평면 행동은 인간과 같은 높은 유기체에서 직접적인 응성 행동이 없을 수 있지만, 이러한 행동은 모든 유기체에 중요한 기본 신경 기능을 나타냅니다 - 특정 자극을 감지하고 처리하고 적절하게 반응할 수있는 능력. 다른 유기체에 걸쳐 주요 신경 기능의 보존 때문에, 평면에 기계학 연구는 행동의 신경 제어에 대해 더 광범위하게 우리를 가르 칠 수 있습니다. 또한, 화학 적 노출에 대한 응답으로 평면 행동을 분석하는 것은 인간의 뇌에 잠재적 인 위험에 알릴 수있는 planarian 신경계23,,24,,25에대한 화학 물질의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 특히, 유해열에 의해 유도된 스크런싱은 특정 등급의,화학물질(22,24,25,,30)에노출되어 인해 신경독성을 속이는 민감하고 특이적인 종점인 것으로 나타났다., 마지막으로, 플래니언의 독특한 재생 능력은 연구원이 신경 재생 중에 다른 행동이 회복되는 방법의 역학을 해부 할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 원고에 대한 의견에 대한 씨 타완 골에게 감사드립니다. 이 작품은 NSF 커리어 그랜트 1555109에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) Sigma-Aldrich 377430-5G CAUTION:  Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4  Tamron 23FM25SP
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated Genesee Scientific  25-105
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile MedSupply Partners 62-1019-2
Cinnamaldehyde, >95% Sigma-Aldrich W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box Amazon B07HD631RP
Flea3 USB3 camera FLIR FL3-U3-13E4M
Heat resistant gloves Fisher Scientific 11-394-298
Hot plate Fisher Scientific HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water Instant Ocean SS15-10 Prepare in deionized water at 0.5 g/L.
Montjüic salts, prepared in Milli-Q water Sigma-Aldrich various Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.
Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene Simport D210-7
Pipette, 20-200 μL range Rainin 17008652
PYREX 150 mL beaker Sigma-Aldrich CLS1000150
Razor blade, 0.22 mm VWR 55411-050
Roscolux color filter:  Golden Amber Rosco R21 Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.
Roscolux color filter:  Medium Red Rosco R27
Roscolux color filter:  Storaro Red Rosco R2001
Samco transfer pipette, 62 µL large aperture Thermo Fisher 691TS
Support stand  Fisher Scientific 12-947-976
Thermometer VWR 89095-600
UV laser pointer Amazon B082DGS86R This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW.

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References

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유해 자극 감지를 위한 양적 행동 판독으로 기획자 스크런싱
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Sabry, Z., Rabeler, C., Ireland, D., Bayingana, K., Collins, E. M. S. Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing. J. Vis. Exp. (161), e61549, doi:10.3791/61549 (2020).More

Sabry, Z., Rabeler, C., Ireland, D., Bayingana, K., Collins, E. M. S. Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing. J. Vis. Exp. (161), e61549, doi:10.3791/61549 (2020).

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