Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

Published: June 27, 2020 doi: 10.3791/61559
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, School of Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Dermatology, Hunan Key Laboratory of Medical Epigenomics, The Second Xiangya Hospital, Central South University

Summary

בעקבות זיהום ויראלי, הכליות מטפחות מספר גדול יחסית של תאי CD8+ T ומציעות הזדמנות לחקור תאי TRM שאינם ריר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד לימפוציטים כליות העכבר לניתוח ציטומטריה זרימה.

Abstract

תא T זיכרון תושב רקמות (TRM)הוא תחום המתרחב במהירות של מחקר אימונולוגיה. בידוד תאי T מרקמות שונות שאינן לימפואידיות הוא אחד השלבים העיקריים לחקור TRMs. ישנן וריאציות קלות בפרוטוקולי בידוד לימפוציטים עבור איברים שונים. הכליה היא איבר חיוני שאינו לימפואידים עם חדירת תאים חיסוניים רבים במיוחד לאחר חשיפה לפתוגן או הפעלה אוטואימונית. בשנים האחרונות, מעבדות מרובות כולל שלנו החלו לאפיין תאי CD8+ T תושבי כליות במסגרות פיזיולוגיות ופתולוגיות שונות הן בעכבר והן בבני אדם. בשל שפע של לימפוציטים T, הכליה מייצגת איבר מודל אטרקטיבי ללמוד TRMs ברקמות שאינן ריר או לא מחסום. כאן, נתאר פרוטוקול נפוץ במעבדות ממוקדות TRMכדי לבודד תאי CD8+ T מכליות עכבר בעקבות זיהום ויראלי מערכתי. בקצרה, באמצעות מודל זיהום וירוס דלקת לימפוציטית חריפה (LCMV) בעכברים C57BL/6, אנו מדגימים CD8תוך וסקולרי + תיוג תא T, עיכול אנזימטי, צנטריפוגה שיפוע צפיפות לבודד ולהעשיר לימפוציטים מכליות העכבר כדי להפוך דגימות מוכנות לניתוח ציטומטריה זרימה הבאים.

Introduction

זיכרון תושב רקמות (TRM) תאי T מייצגים את אחת מאוכלוסיות תאי T הנפוצות ביותר בעכברים אנושיים ונדבקים בוגרים. תאיT RM מספקים את הקו הראשון של ההגנה החיסונית ומעורבים באופן קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגייםשונים 1,2,3,4,5. בהשוואה לתאי T במחזור, תאי T RM נושאיםסמני משטח ברורים עם תוכניות שעתוקייחודיות 6,7,8. הרחבת הידע שלנו בביולוגיה של TRM היא המפתח להבנת תגובות תאי T החיוניים לפיתוח עתידי של חיסונים ואימונותרפיות מבוססי תאי T.

בנוסף סמנים מולקולריים משותפים נפוצים של TRMs על פני כל הרקמות שאינן לימפואידיות, הצטברות ראיות עולה כי תכונות ספציפיותלרקמות הם מרכיב מרכזי של ביולוגיה T RM9. הכליות מחסה תאים חיסוניים רביםכולל תאי T RM לאחר ההדבקה ומציע הזדמנותמצוינת ללמוד ביולוגיה של תאי T RM ברקמה שאינה ריר. LCMV חריפה (וירוס choriomeningitis לימפוציטית) זיהום באמצעות מסלול תוך-פרטית הוא מודל זיהום מערכתי מבוסס היטב ללמוד תגובות תאי T ספציפיים אנטיגן בעכברים. הזיהום נפתר בדרך כלל ב 7-10 ימים בעכברים מסוג בר ולהשאיר מספר רב של תאי T זיכרון ספציפי LCMV במגוון של רקמות, כוללהכליה 10. P14 TCR (קולטן תא T) עכברים מהודקים לשאת CD8+ תאי T לזהות את אחד האפיטופים הדומיננטיים במערכת החיסון של LCMV שהוצגו על ידי MHC-I (סוג I מורכב היסטו-תאימות) מולקולה H2-Db בעכברים C57BL/6. שילוב של העברה מאמצת תא P14 T מסומן באופן מולד וזיהום LCMV בעכברים, CD8+ אפקט ותאי T זיכרון נמצאים במעקב, כוללהתביור T RM והומלוסטזיס.

ברקמות מחסום מסוימות, כגון תא לימפוציטים intraepithelial מעיים (IEL) ובלוטות הרוק, הליך בידוד לימפוציטים הוקמה מניב אחוז גבוה של תאי TRM עם זיהום תאי T נשא דם מינימלי בעכבר LCMVמודל 11. עם זאת, ברקמות שאינן מחסום, כגון הכליה, רשת כלי דם צפופה מכילה מספר רב של תאים CD8+ T במחזור. זה כבר מתועד היטב כי אפילו חיסון מוצלח לא יכול להסיר ביעילות את כל תאי CD8+ T במחזור. כדי להתגבר על משוכה טכנית זו, כתמי נוגדנים תוך וסקולריים הוקמה כ אחת הטכניקות הנפוצות ביותר במעבדות TRM 12. בקצרה, 3-5 דקות לפני המתת חסד, 3 מיקרוגרם / עכבר נוגדן נגד CD8 (כדי לסמן CD8+ תאי T) מועבר דרך הווריד. קיר כלי דם שלם מונע דיפוזיה מהירה של הנוגדן בתוך פרק זמן קצר זה (כלומר, 3-5 דקות) ורק תאים תוך-וסקולריים מסומנים. בעקבות פרוטוקול בידוד לימפוציטים סטנדרטי, תאים תוך וסקולריים לעומת חוץ וסקולריים ניתן להבדיל בקלות באמצעות ציטומטריית זרימה.

כאן, נתאר פרוטוקולסטנדרטי נפוץ במעבדות T RM לביצוע תיוג תוך וסקולרי, בידוד לימפוציטים וניתוח ציטומטריה זרימה של תאי CD8+ T בכליות באמצעות עכבר C57BL/6 שקיבל CD45.1+ תאי P14 T וזיהום LCMV 30 יוםלפני 13. ניתן להשתמש באותו פרוטוקול כדי ללמוד הן את תאי T משפיעים והן זיכרון T בכליה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המבוצעים על פי פרוטוקול זה חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC UT בריאות סן אנטוניו.

1. העברה מאמצת של תאי P14 T לנמעני C57BL/6 וזיהום LCMV

  1. השתמש בעכברים P14 בגיל 6-12 שבועות. ודא כי המין של עכבר טרנסגני P14 TCR התורם צריך להתאים את המין של עכברים נמען C57BL/6. אחרת, תאים כגון תאי T זכרים המעבירים לעכברים נקביים יגרמו לדחייה מתווכו של תאי T תורמים במחזור בסביבות 12 ימים14.
  2. לטהר תאים נאיביים CD8+ T מן הטחול ואת בלוטות הלימפה של עכבר מהונדס P14 TCR באמצעות עכבר CD8+ T ערכת טיהור תאים בעקבות פרוטוקול היצרן.
    1. בקצרה, לנתח טחול ובלוטות הלימפה, לרסק את הדגימות כדי ליצור השעיה תא יחיד.
    2. כדי להעשיר לתאי T נאיביים, הוסיפו נוגדן ביוטין-אנטי-CD44 במהלך שלב הדגירה הראשון של הנוגדנים13.
      הערה: ערכת בחירה מסחרית שלילית המשמשת בשלב זה מכילה שני מרכיבים עיקריים לשני שלבים של דגירה (כלומר, דגירה של תערובת ביוטין-נוגדנים ודגירה של חרוזים סטרפטוודין-מגנטי).
  3. השתמש hemocytometer לספור את התאים ולהזריק 1,000 כדי 10,000 תאי P14 T מטוהרים ב 200 μL של PBS לתוך כל מין תואם C57BL/6 נמען דרך וריד הזנב.
    הערה: פרוטוקול הזרקת וריד הזנב מפורט מתואר בשלב 2.
  4. ביום שלמחרת, כל מקבלי C57BL/6 מקבלים 2 x10 5 pfu LCMV ארמסטרונג מדולל ב 200 μL של PBS באמצעות מסלול תוך-פרטי.

2. תיוג תוך-וסקולרי של תאי CD8+ T

הערה: בהתאם לאינטרסים המחקריים, ניתן לבחור נקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. דוגמה של יום 30 לאחר זיהום (יום 30 לאחר שלב 1.4) הוא הפגין, אשר נחשב לעתים קרובות כנקודת זמן זיכרון מוקדם עבור תגובת תא CD8 T.

  1. לדלל נוגדן ביוטין נגד CD8α ל 15 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS. ודא שכל עכבר מקבל 200 μL של PBS המכיל נוגדן 3 מיקרוגרם.
    הערה: נוגדן ביוטין נגד CD8 משמש כאן, כך שהוא יהיה גמיש יותר לעצב את לוח הכתמים הסופי FACS. ניתן להשתמש ישירות בנוגדן המסוי בצבע פלואורסצנטי. עם זאת, חשוב להשתמש בשכפולים שונים של נוגדנים חד שבטיים לתיוג תוך ורידי לעומת כתמי FACS.
  2. מחממים כראוי את וריד הזנב של עכברים עם מנורת חום תקורה במשך 5-10 דקות כדי להפוך את הוורידים.
    הערה: יש לנקוט בזהירות נוספת כדי למנוע התחממות יתר של בעלי החיים. להפחית את החום או להסיר את מנורת החום אם העכברים הפסיקו לנוע.
  3. צייר 200 μL של תערובת נוגדנים נגד CD8α prediluted לתוך מזרק אינסולין 100 U (28G) ולהסיר את כל בועות האוויר על ידי הזזת הבוכנה למעלה ולמטה. לכופף את המחט כדי ליצור זווית 150 ° בין המחט למזרק, משופע, כך המחט תהיה מקבילה לווריד.
  4. לרסן את העכבר עם מרסן מכרסמים בגודל המתאים לרסס את הזנב עם 70% אתנול כדי להפוך את הווריד גלוי בבירור.
    הערה: יש לשמור על משך הריסון למינימום.
  5. החזק את הזנב בקצה הדיסטלי באגודל ובאצבעות האמצעיות של היד הלא דומיננטית. מניחים את האצבע המורה מתחת לאתר שבו המחט תוכנס.
  6. החזק את המזרק ביד הדומיננטית והכנס את המחט לווריד במקביל לכיוון הלב.
    הערה: בעת הצבת כראוי, המחט צריכה לנוע בצורה חלקה לתוך וריד.
  7. להזריק לאט 200 μL של נוגדן נגד CD8α דרך וריד הזנב.
    הערה: אם יש התנגדות או אזור לבן נראה מעל המחט על הזנב, המחט אינה בתוך וריד. התחל את הזריקה הראשונית קרוב לקצה הזנב. בעת הצורך, להתקדם לכיוון החלק התחתון של הזנב עבור זריקות הבאות.
  8. הסר את המחט בעדינות להחיל דחיסה עד הדימום מפסיק.
  9. להחזיר את העכבר לכלוב, ולהרים את העכבר לאחר 3-5 דקות.
    הערה: יש להמות את העכברים באמצעות תא isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם. שיטות אחרות, כגון שאיפת CO2 ייקח עד 5 דקות ועשויות להציג וריאציה מיותרת של זמן תיוג נוגדנים תוך ורידי.
  10. לנתח את הכליה באמצעות מספריים, להעביר את הכליה כולה 1.5 מ"ל של צינורות microcentrifuge ולהשאיר את הדגימות על הקרח עד עיבוד נוסף.
    הערה: כליה שלמה שלמה שלמה יכולה להיות מאוחסנת בבטחה על קרח במשך כמה שעות לפני העיבוד והעיכול הבאים.

3. עיכול אנזימטי של הכליה

  1. הכינו 6 צלחות היטב המכילות 3 מ"ל של תמיסת העיכול (RPMI/2% FCS/1 מ"ג/מ"ל קולגנס B) לכל עכבר, אחסנו על קרח.
    הערה: ניתן להכין ולאחסן את פתרון קולגנס B בריכוז גבוה יותר (למשל, 20x) ב-20°C או מתחתיו. פתרון עבודה צריך להיות מוכן טרי. נא עיין בטבלה 1 לקבלת המתכונים עבור כל הפתרון/המאגר המשמשים בפרוטוקול הנוכחי.
  2. הוסף 300 μL של פתרון העיכול לתוך צינורות מדגם מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל טחון דגימות הכליה עם מספריים באביב ישר.
    הערה: רקמת הכליה צריכה להיות טחון לחתיכות אפילו עם גדלים לא יותר מ 1.5 מ"מ קטרים. אין צורך בשלב עריפת ראש.
  3. מעבירים את דגימות הכליות הטחון ל-6 צלחות היטב המכילות את פתרון העיכול
    הערה: 6 צלחות באר משמשות לנוחות רק כאשר יש דוגמאות מרובות לעיבוד.
  4. הדגירה את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה (סביב 60 סל"ד) במשך 45 דקות.
  5. לאחר העיכול, מועכים את הרקמה עם אוגן הבוכנה של מזרק 3 מ"ל ישירות בתוך המנה, ומעבירים לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל.
    הערה: בדרך כלל סינון באמצעות מסננת תאים אינו נדרש בשלב זה, כי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מבוצעת ליד לטהר לימפוציטים חיים.
  6. לסובב את הדגימות ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F).
  7. תן שימוש חוזר את גלולה ב 3 מ"ל של RPMI/10% FCS.

4. צנטריפוגה הדרגתית צפיפות להעשרת לימפוציטים מהכליות המתעכלות

  1. לסובב את המדגם ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F).
  2. הסר את supernatant ו resuspend גלולת התא עם 5 מ"ל של 44% פרקול / RPMI לערבב (44% פרקול + 56% RPMI ללא FBS).
  3. שים את הקצה של פיפטה 3 מ"ל המכיל 3 מ"ל של 67% פרקול / PBS (67% פרקול + 33% PBS) ישירות לתחתית של כל צינור, ולאט לאט לשחרר את הפתרון, כך הפתרון הכבד (67% פרקול / PBS) מהווה שכבה ברורה בתחתית פתרון האור (44% Percoll / RPMI) הוא הרים למעלה. יחד, שכבות קוקטייל ייווצור.
    הערה: עבור אמצעי הדרגתי צפיפות שהגיע לאחרונה מהספק, להוסיף 1/10 נפח של PBS סטרילי 10x לבקבוק, לערבב היטב ולשקול את המדיום שיפוע צפיפות מאוזנת PBS כמו 100% פתרון.
  4. סובב את הדגימות ב- 900 x g במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם האצה מופחתת והגדרת בלמים.
    הערה: עבור צנטריפוגות עם הגדרות מאיץ ובלמים (בסולם 1-9 (1 פירושו מינימום ו-9 פירושו מקסימום)), השתמש ב- 6 עבור מאיץ ו- 4 לבלמים.
  5. בזהירות להסיר את הצינורות מן הצנטריפוגה מבלי להפריע את השכבות;
    הערה: שכבת לימפוציטים ברורה מזוהה בין שכבת RPMI בצבע ורוד לשכבת PBS חסרת צבע.
  6. הסר את השכבה העליונה עם פיפטה העברה מבלי לגעת בשכבת הלימפוציטים.
  7. מעבירים את שכבת הלימפוציטים לצינור חדש של 15 מ"ל, ממלאים את הצינור ב- PBS/5% FCS ומערבבים על ידי היפוך הצינור 4-6x לאט כדי להבטיח ערבוב מספיק.
    הערה: שלב זה חשוב לשטוף את כל שאריות פרקול.
  8. לסובב את הדגימות ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F).
  9. הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולת התא עם 500 μL של מדיום RPMI מלא. התאים מוכנים להכתמת ציטומטריית זרימה.

5. כתמי ציטומטריה זרימה וניתוח

הערה: נא לפעול בהתאם לפרוטוקול הכתמת ציטומיית זרימה סטנדרטית עבור לימפוציטים T.

  1. קח בערך 1 x 106 תאים עבור כל כתמי FACS.
    הערה: השתמש בצלחת באר U-bottom 96 עבור כתמי FACS. עם זאת, אם רק מספר מוגבל של דגימות מעורבים, 5 צינורות FACS mL ניתן להשתמש גם.
  2. לסובב את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F). השלך את העל-טבעי.
  3. תן מחדש כל מדגם ב 50 μL של מאגר FACS המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל של חוסם FCR 2.4G2 (נוגדן חד שבטי נגד CD16/32 כדי לחסום את האינטראקציה בין נוגדן FACS הוסיף עם FcR). דגירה על קרח במשך 15 דקות.
  4. ללא צנטריפוגה נוספת, להוסיף 50 μL של תערובת נוגדנים מכתים פני השטח עבור כל מדגם, כך נפח הכתמים הסופי הוא 100 μL / כל מדגם. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך.
    הערה: כלול סטרפטבידין עם תווית פלואורסצנטית (2 מיקרוגרם/מ"ל או בהתאם להמלצת היצרן) בתערובת הנוגדנים כדי לסמן CD8α+ תאי CD8 + Tתוך וסקולריים ולהשתמש בנוגדן פלואורסצנטי שכותרתו אנטי CD8β כדי לסמן את כל תאי CD8 T. תערובת הנוגדנים מיוצרת על ידי הוספת כמויות רצויות של נוגדנים מעוניינים למאגר FACS.
  5. לשטוף את הדגימות עם PBS פעמיים. עבור כל לשטוף, למלא את בארות של 96 צלחת גם עם PBS קר, להסתובב ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F) ולהשליך את העל טבעי.
  6. תן שימוש חוזר בתאים ב 100 μL / גם של צבע חיים / מוות מדולל. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך.
    הערה: אפילו עם ספין בינוני שיפוע צפיפות, שלב עיכול אנזימטי לעתים קרובות גורם למוות תאי משמעותי בתאי T תושב רקמות עקב ARTC2.2/P2RX7איתות 15. כתמי צבע חיים / מוות מומלץ מאוד לפני קיבעון. ננו-בודי Anti-ARTC2 יכול להיות administrated לתוך העכברים לפני המתת חסד כדי למנוע מוות תאי הנגרמת על ידי בידוד התא.
  7. שטפו את הדגימות עם מאגר FACS פעמיים. עבור כל לשטוף, למלא את הבארים של צלחת 96 גם עם חיץ FACS קר, להסתובב ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F) ולהשליך את העל טבעי.
  8. תן שימוש חוזר בתאים במאגר תיקון μL/well של 100 μL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    הערה: חיץ תיקון נעשה טרי על ידי דילול פורמלדהיד עם PBS לריכוז סופי של 2% פורמלדהיד.
  9. שטפו את הדגימות עם מאגר FACS פעמיים. עבור כל לשטוף, למלא את הבארים של 96 צלחת גם עם חיץ FACS קר, ספין ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (69 °F) ולהשליך את העל-טבעי.
  10. תן שימוש חוזר בתאים במאגר FACS של 250 μL/well. לאטום את הצלחת, לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס ולהגן מפני אור עד ניתוח FACS.
    הערה: לפני ניתוח FACS, לסנן את הדגימות דרך רשת שינוי ניילון 70 μM כדי להסיר אשכולות תאים אפשריים שעלולים לסתום את מכונת FACS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן מסוכם בתרשים זרימה (איור 1A). ביום 30 לאחר זיהום LCMV, ביצענו תיוג תוך וסקולרי של תאי CD8+ T. 5 דקות לאחר מכן, שתי הכליות של החיה נותו, טחנו ונפלטו לעיכול קולגנס. לימפוציטים טוהרו עוד יותר מהדגימות המתעכלות באמצעות צנטריפוגה פרקול ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה. כפי שמוצג איור 1B, גם לאחר העשרת לימפוציטים בתתיווך צנטריפוגה בצפיפות, היה נפוץ מאוד לראות חלק גדול מהלימפוציטים שאינם לימפוציטים במוצר הסופי. עם זאת, לאחר gating על לימפוציטים חיים, זה היה קל לזהותלימפוציטים CD8 + T. אנחנו יכולים להבחין בין תאיCD8 + T תוך וסקולריים לעומת בזבזניים. בשל דפוס ביטוי מתאם מאוד של CD8α ו CD8β על CD8+ T תאים, צפוי כי תאים CD8 + T תוךוסקולרי להפגין דפוס אלכסוני על פרופיל FACS CD8α-CD8β. כצפוי, רק תא CD8+ T בזבזני רכשביעילות פנוטיפים T RM, כגון רגולציה של CD69 ו downregulation של Ly6C (איור 1B). בניסויים שלנו, התעניינו בתאי P14 T תורמים עם סמן מולד CD45.1. באמצעות אותו פרוטוקול, ניתן לבחון גם תאי CD8+ T של מחשב מארח אנדוגני. בניגוד לעכברים נגועים, הרוב המכריע של תאי CD8+ T המבודדים מעכברים נאיביים צעירים ששוכו במתקן SPF תויגו בנוגדן i.v. CD8α ולכן היו שייכים לתא הבין-וסקולרי (איור 1C).

Figure 1
איור 1: תוצאות מייצגות.
(א)תרשים זרימה של הפרוטוקול. (B) ביום 30 לאחר זיהום, לימפוציטים בכליות נותחו על ידי ציטומטריה זרימה. מוצגים פרופילי FACS ואסטרטגיית גת. המספרים מציינים את אחוז קבוצות המשנה המגודרות באוכלוסיית ההורים שלהן. (C) פרופיל FACS מייצג של תאי CD8+ T בכליות מבודדים מעכבר נאיבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מגיב מתכון הערה
100% פרקול 9 כרכים של פרקול + 1 נפח של 10xPBS
44% פרקול/RPMI 44% Vol של 100% פרקול + 56% Vol סרום חינם RPMI עשוי טרי מ 100% פרקול
67% פרקול/PBS 67% כרך של 100% פרקול + 33% Vol PBS עשוי טרי מ 100% פרקול
מאגר עיכול RPMI + 2% FCS + קולגנס B 1 מ"ג/מ"ל עשוי טרי ממלאי קולגן
מאגר כביסה FCS PBS/5% PBS + 5% FCS
מאגר FACS PBS + 2% FCS + 0.02% NaN3 מאוחסן ב- 4°C
מתקן מאגר PBS + 2% פורמלדהיד מאוחסן ב- RT ומוגן מפני אור

טבלה 1: רשימת מתכונים עבור כל הפתרון והמאגר המשמשים בפרוטוקול הנוכחי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כמו חסינות ספציפית לרקמות הוא אזור מתרחב במהירות של מחקר, הצטברות ראיות עולה כי תאים חיסוניים, במיוחד אוכלוסיית לימפוציטים ניתן לזהות כמעט בכל האיברים בעכברים אנושיים או נגועים או מחוסנים. מודל זיהום עכבר LCMV הוא מודל מבוסס היטב ללמוד תגובת תאי T ספציפיים אנטיגן, מחולל ובידול תאי T זיכרון כולל ביולוגיה T RM על פנירקמות מרובות. כאן תיארנו פרוטוקול לניתוח תאי CD8+ T בכליה. פרוטוקול זה מותאם במידה רבה מפרסומים המתמקדים ב- TRM12. ככל הנראה בשל ביטוי P2RX7 ברמה גבוהה ועיכול אנזימטיהמושרה מוות תאי 15, תשואת לימפוציטים מהפרוטוקול הנוכחי מתאימה ביותר לניתוח פנוטיפי מיידי. עם זאת, עם פרוטוקול הוקמה כדי לעכב P2RX7המושרה מוות תאי 16, זה מתקבל על הדעת כי הפרוטוקול הנוכחי ניתן לשנות בקלות (למשל, עם תוספת של מעכבים לחסום P2RX7 איתות) כדי להגדיל את הישרדות התא להיות מתאים בדיקות תפקודיות ארוכות טווח אחרות. יש לכלול קבוצות בקרה מתאימות כדי להבטיח שמעכבי P2RX7 לא יפריעו לתהדקות תפקודיות מעוניינות.

תאי CD8+ TRM בכליות נוצרים במידה רבה בתגובה לזיהום או אנטיגנים סביבתיים. יש לנו להשתמש בפרוטוקול תיוג תוך וסקולרי כדי לנתח ישירות תאי CD8+ T בכליות מבודדים מעכברים נאיביים בני 5-6 שבועות C57BL/6. בהתאם לתוצאות שפורסמו17, אין כמעט תאי CD8+ T ראוותניים בעכברים "נקיים" אלה (איור 1C). מחקר אלגנטי הראה כי רוב תאי CD8 + T הזיכרוןמזוהים ברקמות שאינן לימפואידיות הם TRM10. לעומת זאת, באמצעות מערכת זיהום דומה, אנו מזהים לעתים קרובות אוכלוסייה משמעותית של CD69- תאים (ככל הנראהמייצגים תאי T EM או תאי CD69- TRM) אפילו בתא החוץ-וסקולרי. הפער יכול להיות בגלל העובדות כי 1) טכניקות שונות משמשות, כלומר, מיקרוסקופ לעומת ציטומטריה זרימה; 2) מוקדם לעומת נקודות זמן זיכרון מאוחר ממוקדים 3) CD69 אינו סמן מושלם לזהות TRM. עיכול אנזימטי וציטומטריית זרימה יפחיתו באופן משמעותי את המספר הכולל של תאיT RM. עם זאת, כפרוטוקול נוח ולא עתיר עבודה, הוא עדיין מקובל ברוב מחקרי TRM.

תקן הזהב לזיהוי מוחלט של תאיT RM הוא לבצע ניסוי פרביוזיס. למרות שהפרוטוקול המתואר כאן מספק דרך נוחה לזהות תאי T תושבי כליות, התוצאות מפרוטוקול זה רק מוכיחות כי בזמן שבו העכברים מתים, תאי T נמצאים מחוץ לכלי הדם בכליה. פרוטוקול זה לבדו אינו מספק מידע כלשהו אודות ההיסטוריה הנודדת של תאי T.

בנוסף לזיהומים, כל כליה המכוונת לתגובות חיסוניות, כולל תגובות אוטואימוניות עלולה לגרום להתברות של תת-קבוצה משמעותית של תאי T תושבי הכליות באמצעות פרוטוקול דומה. יתר על כן, כפישתואר לפני 12, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות להשתמש בנוגדן נגד CD45 (כדי לתייג את כל התאים hematopoietic) כדי לחקור תאים חיסוניים אחרים תושבי כליות. יחד, הדגמנו דרך נוחה יחסית לבודד ולנתח תאי CD8+ T מהכליה, אשר ניתן להתאים מודלים שונים כולל זיהום אוטואימוניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין גילויים פיננסיים רלוונטיים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מעניק AI125701 ו AI139721, תוכנית CLIP המכון לחקר הסרטן האגודה האמריקנית לסרטן להעניק RSG-18-222-01-LIB כדי N.Z. אנו מודים לקרלה גורנה וסבסטיאן מונטנינו ממתקן Flow Cytometry. נתונים שנוצרו במתקן המשאבים המשותפים של Cytometry זרימה נתמכו על ידי המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו (UTHSCSA), NIH / NCI מענק P30 CA054174-20 (מרכז מחקר קליני ותרגום [CTRC] ב UTHSCSA), ו UL1 TR001120 (פרס מדע קליני ותרגום).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisherbrand 05-408-130
15 ml Conical Tubes Corning 431470
3 ml syringe BD 309657
37C incubator VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) Tonbo Biosciences 30-0081-U025
Calf Serum GE Healthcare Life Sciences SH30073.03
Collegenase B Millipore Sigma 11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-9AM
Insulin Syringe BD 329424
Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit Biolegend 480043
overhead heat lamp Amazon B00333PZZG
PBS
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17089101
rocker VWR
RPMI GE Healthcare Life Sciences SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer Braintree Scientific, Inc SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate Corning 3516

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
  2. Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
  3. Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
  4. Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
  5. Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
  6. Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
  7. Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
  8. Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
  9. Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
  10. Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
  11. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  12. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
  13. Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
  14. Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
  15. Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
  16. Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
  17. Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).

Tags

החודש ב JoVE בעיה 160 CD8 תושב כליות LCMV ציטומטריית זרימה עכבר תיוג תוך וסקולרי
בידוד של עכבר כליות תושב CD8<sup>+</sup> תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liao, W., Ma, C., Zhang, N.… More

Liao, W., Ma, C., Zhang, N. Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (160), e61559, doi:10.3791/61559 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter