Summary
वायरल संक्रमण के बाद, गुर्दे सीडी 8+ टी कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या बंदरगाहों और गैर mucosal टीआरएम कोशिकाओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है । यहां, हम प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए माउस किडनी लिम्फोसाइट्स को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
ऊतक-निवासी स्मृति टी सेल (टीआरएम)इम्यूनोलॉजी अनुसंधान का एक तेजी से विस्तार क्षेत्र है। विभिन्न गैर-लिम्फोइड ऊतकों से टी कोशिकाओं को अलग करना टीआरएमएस की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। विभिन्न अंगों के लिए लिम्फोसाइट आइसोलेशन प्रोटोकॉल में मामूली भिन्नताएं हैं। गुर्दे विशेष रूप से रोगजनक जोखिम या ऑटोइम्यून सक्रियण के बाद कई प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ के साथ एक आवश्यक गैर-लिम्फोइड अंग है। हाल के वर्षों में, हमारे अपने सहित कई प्रयोगशालाओं दोनों माउस और मानव में विभिन्न शारीरिक और रोग सेटिंग्स में गुर्दे निवासी सीडी 8+ टी कोशिकाओं की विशेषता शुरू कर दिया है । टी लिम्फोसाइट्स की बहुतायत के कारण, गुर्दे गैर-म्यूकोसल या गैर-बाधा ऊतकों में टीआरएमएस का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल अंग का प्रतिनिधित्व करता है। यहां, हम प्रणालीगत वायरल संक्रमण के बाद माउस गुर्दे से सीडी 8+ टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए आमतौर पर टीआरएम-केंद्रितप्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे। संक्षेप में, C57BL/6 चूहों में एक तीव्र लिम्फोसिटिक कोरियोमेनिनाइटिस वायरस (एलसीएमवी) संक्रमण मॉडल का उपयोग करके, हम बाद के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने के लिए माउस गुर्दे से लिम्फोसाइट्स को अलग और समृद्ध करने के लिए इंट्रावैस्कुलर सीडी 8+ टी सेल लेबलिंग, एंजाइमैटिक पाचन, और घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र का प्रदर्शन करते हैं।
Introduction
ऊतक-निवासी स्मृति (टीआरएम)टी कोशिकाएं वयस्क मानव और संक्रमित चूहों में सबसे प्रचुर मात्रा में टी सेल आबादी में से एक का प्रतिनिधित्व करती हैं। टीआरएम कोशिकाएं प्रतिरक्षा रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करती हैं और विभिन्न शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में गंभीर रूप से शामिल होती हैं1,2,3,4,5. परिसंचारी टी कोशिकाओं के साथ तुलना करते हुए, टीआरएम कोशिकाओं अद्वितीय प्रतिलेखनकार्यक्रम6,7,8के साथ अलग सतह मार्कर ले । टीआरएम जीव विज्ञान के हमारे ज्ञान का विस्तार टी सेल प्रतिक्रियाओं को समझने की कुंजी है जो टी सेल आधारित टीकों और इम्यूनोथेरपी के भविष्य के विकास के लिए आवश्यक है ।
सभी गैर-लिम्फोइड ऊतकों में टीआरएमएस के आमतौर पर साझा आणविक मार्कर के अलावा, जमा करने वाले सबूत बताते हैं कि ऊतक-विशिष्ट विशेषताएं टीआरएम जीव विज्ञान9का एक केंद्रीय घटक हैं। गुर्दे संक्रमण के बाद टीआरएम कोशिकाओं सहित कई प्रतिरक्षा कोशिकाओं बंदरगाहों और एक महान एक गैर म्यूकोसल ऊतक में टीआरएम सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है । इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से तीव्र एलसीएमवी (लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनिनाइटिस वायरस) संक्रमण चूहों में एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रणालीगत संक्रमण मॉडल है। संक्रमण आमतौर पर जंगली प्रकार के चूहों में 7-10 दिनों में हल हो जाता है और गुर्दे10सहित विभिन्न ऊतकों में बड़ी संख्या में एलसीएमवी-विशिष्ट मेमोरी टी कोशिकाओं को छोड़ देता है। P14 TCR (टी सेल रिसेप्टर) ट्रांसजेनिक चूहों सीडी 8+ टी कोशिकाओं को ले जाने के लिए MHC-I (वर्ग मैं प्रमुख histocompatibility परिसर) C57BL/6 चूहों में अणु H2-Dबी द्वारा प्रस्तुत LCMV के प्रतिरक्षा प्रमुख epitopes में से एक को पहचान । चूहों में congenically चिह्नित P14 टी सेल दत्तक हस्तांतरण और एलसीएमवी संक्रमण के संयोजन, सीडी 8+ प्रभावक और स्मृति टी कोशिकाओं को ट्रैक किया जाता है, जिसमें टीआरएम भेदभाव और होमोस्टेसिस शामिल हैं।
कुछ बाधा ऊतकों में, जैसे आंतों के इंट्रापिहेलियल लिम्फोसाइट्स (आईईएल) डिब्बे और लार ग्रंथियों, स्थापित लिम्फोसाइट आइसोलेशन प्रक्रिया माउस एलसीएमवी मॉडल11में न्यूनतम रक्त जनित टी सेल संदूषण के साथ टीआरएम कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत पैदावार करती है। हालांकि, गैर-बाधा ऊतकों में, जैसे गुर्दे, घने संवहनी नेटवर्क में बड़ी संख्या में परिसंचारी सीडी 8+ टी कोशिकाएं होती हैं। यह अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है कि यहां तक कि सफल परफ्यूजन कुशलता से सभी परिसंचारी सीडी 8+ टी कोशिकाओं को दूर नहीं कर सकते हैं। इस तकनीकी बाधा को दूर करने के लिए, इंट्रावैस्कुलर एंटीबॉडी धुंधला टी आरएम लैब्स12में सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक के रूप मेंस्थापित किया गया है। संक्षेप में, इच्छामृत्यु से 3-5 मिनट पहले, 3 μg/माउस एंटी-सीडी8 एंटीबॉडी (सीडी 8+ टी कोशिकाओं को लेबल करने के लिए) नसों के द्वारा वितरित किया जाता है। अक्षुण्ण रक्त वाहिका दीवार इस कम समय (यानी, 3-5 मिनट) के भीतर एंटीबॉडी के तेजी से प्रसार को रोकती है और केवल इंट्रावैस्कुलर कोशिकाओं को लेबल किया जाता है। मानक लिम्फोसाइट आइसोलेशन प्रोटोकॉल के बाद, इंट्रावैस्कुलर बनाम एक्स्ट्रास्कुलर कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।
यहां, हम आमतौर पर टीआरएम लैब्स में इंट्रावैस्कुलर लेबलिंग, लिम्फोसाइट आइसोलेशन और फ्लो साइटोमेट्री एनालिसिस का इस्तेमाल करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे, जिसमें C57BL/6 माउस का उपयोग करके किडनी सीडी 8+ टी कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण किया गया है जिसे CD45.1+ P14 टी कोशिकाएं और एलसीएमवी संक्रमण13 से 30दिन पहले प्राप्त हुआ है । एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग गुर्दे में प्रभावक और मेमोरी टी कोशिकाओं दोनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल के बाद किए गए सभी पशु प्रयोगों को संबंधित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए । यहां वर्णित सभी प्रक्रियाओं को आईएसीयूसी यूटी हेल्थ सैन एंटोनियो ने मंजूरी दे दी है ।
1. C57BL/6 प्राप्तकर्ताओं और LCMV संक्रमण में P14 टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण
- 6-12 सप्ताह की उम्र में P14 चूहों का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि दाता P14 TCR ट्रांसजेनिक माउस का लिंग C57BL/6 प्राप्तकर्ता चूहों के लिंग से मेल नासी चाहिए। अन्यथा, मादा चूहों में स्थानांतरित होने वाली पुरुष टी कोशिकाओं जैसी कोशिकाओं के परिणामस्वरूप लगभग 12 दिनों में14दिनों में परिसंचारी दाता टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा-मध्यस्थता अस्वीकृति होगी।
- निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए माउस सीडी 8+ टी सेल शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पी14 टीसीआर ट्रांसजेनिक माउस की तिल्ली और लिम्फ नोड्स से भोली सीडी 8+ टी कोशिकाओं को शुद्ध करें।
- संक्षेप में, तिल्ली और लिम्फ नोड्स को काटना, एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए नमूनों को मैश करें।
- भोले टी कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए, पहले एंटीबॉडी इनक्यूबेशन चरण13के दौरान बायोटिन-एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी जोड़ें।
नोट: इस चरण में उपयोग की जाने वाली नकारात्मक चयन वाणिज्यिक किट में इनक्यूबेशन के दो चरणों (यानी बायोटिन-एंटीबॉडी मिश्रण इनक्यूबेशन और स्ट्रेप्टाविडिन-चुंबकीय मनका इनक्यूबेशन) के लिए दो प्रमुख घटक होते हैं।
- कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें और प्रत्येक सेक्स मिलान C57BL/6 प्राप्तकर्ता में पीबीएस के २०० μL में १,० से १०,० शुद्ध P14 टी कोशिकाओं सुई पूंछ नस के माध्यम से ।
नोट: विस्तृत पूंछ नस इंजेक्शन प्रोटोकॉल चरण 2 में वर्णित है। - अगले दिन, सभी C57BL/6 प्राप्तकर्ताओं को एक इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से पीबीएस के 200 माइक्रोन में पतला 2 x 105 pfu LCMV आर्मस्ट्रांग प्राप्त होता है।
2. सीडी 8+ टी कोशिकाओं की इंट्रावैस्कुलर लेबलिंग
नोट: अनुसंधान के हितों के आधार पर, संक्रमण के बाद विभिन्न समय बिंदुओं को चुना जा सकता है। दिन 30 पोस्ट संक्रमण का एक उदाहरण (चरण 1.4 के बाद 30 दिन) का प्रदर्शन किया जाता है, जिसे अक्सर सीडी 8 टी सेल प्रतिक्रिया के लिए प्रारंभिक स्मृति समय बिंदु माना जाता है।
- पीबीएस में 15 μg/mL के लिए तनु बायोटिन विरोधी CD8α एंटीबॉडी । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक माउस को 3 माइक्रोन एंटीबॉडी वाले पीबीएस के 200 माइक्रोन प्राप्त होते हैं।
नोट: बायोटिन एंटी-सीडी8 एंटीबॉडी का उपयोग यहां किया जाता है ताकि अंतिम FACS धुंधला पैनल को डिजाइन करना अधिक लचीला होगा। फ्लोरोसेंट डाई-लेबल एंटीबॉडी का उपयोग सीधे किया जा सकता है। हालांकि, नसों में लेबलिंग बनाम FACS धुंधला के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के विभिन्न क्लोनों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। - नसों को फैलाने के लिए 5-10 मिनट के लिए ओवरहेड हीट लैंप के साथ चूहों की पूंछ की नस को ठीक से गर्म करें।
नोट: जानवरों को ओवरहीटिंग से रोकने के लिए अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए। गर्मी को कम करें या यदि चूहों ने घूमना बंद कर दिया है तो गर्मी दीपक को हटा दें। - एक 100 यू इंसुलिन सिरिंज (28G) में पूर्वाचलित विरोधी CD8α एंटीबॉडी मिश्रण के 200 μL ड्रा और पिस्टन ऊपर और नीचे ले जाकर किसी भी हवा बुलबुले को दूर। सुई और सिरिंज के बीच 150 डिग्री कोण बनाने के लिए सुई को मोड़ें, ऊपर रहें, इसलिए सुई नस के समानांतर होगी।
- माउस को उचित आकार के कृंतक निरोधक के साथ नियंत्रित करें और नस को स्पष्ट रूप से दिखाई देने के लिए 70% इथेनॉल के साथ पूंछ स्प्रे करें।
नोट: संयम की अवधि कम से कम रखी जानी चाहिए। - गैर-प्रमुख हाथ के अंगूठे और मध्यम उंगलियों के साथ डिस्टल एंड पर पूंछ पकड़ो। साइट के नीचे इंडेक्स फिंगर रखें जहां सुई डाली जाएगी।
- सिरिंज को प्रमुख हाथ से पकड़ें और सुई को दिल की दिशा की ओर समानांतर में नस में डालें।
नोट: सही ढंग से रखने पर, सुई नस में आसानी से स्थानांतरित करना चाहिए। - धीरे-धीरे पूंछ नस के माध्यम से विरोधी CD8α एंटीबॉडी के 200 μL इंजेक्ट करें।
नोट: यदि कोई प्रतिरोध है या पूंछ पर सुई के ऊपर कोई सफेद क्षेत्र देखा जाता है, तो सुई नस के अंदर नहीं होती है। पूंछ की नोक के करीब प्रारंभिक इंजेक्शन शुरू करें। आवश्यक होने पर, बाद के इंजेक्शन के लिए पूंछ के नीचे की ओर आगे बढ़ें। - सुई निकालें और धीरे से संपीड़न लागू जब तक खून बह रहा बंद हो जाता है।
- माउस को पिंजरे में लौटा दें, और 3-5 मिनट के बाद माउस को इच्छामृत्यु दें।
नोट: चूहों को आइसोफलुरेन कक्ष के माध्यम से इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए जिसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था होनी चाहिए। सीओ2 साँस लेने जैसे अन्य तरीकों में 5 मिनट तक का समय लगेगा और नसों में एंटीबॉडी लेबलिंग समय की अनावश्यक भिन्नता शुरू हो सकती है। - कैंची का उपयोग करके गुर्दे को विच्छेदन करें, पूरी किडनी को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के 1.5 एमएल में स्थानांतरित करें और नमूनों को आगे की प्रक्रिया तक बर्फ पर छोड़ दें।
नोट: बरकरार पूरी किडनी को बाद के प्रसंस्करण और पाचन से पहले कुछ घंटों के लिए बर्फ पर सुरक्षित रूप से संग्रहीत किया जा सकता है।
3. गुर्दे का एंजाइमेटिक पाचन
- प्रत्येक माउस के लिए पाचन समाधान (RPMI/2% FCS/1 मिलीग्राम/ml Collagenase B) के 3mL युक्त 6 अच्छी तरह से प्लेटें तैयार करें, बर्फ पर स्टोर करें ।
नोट: उच्च एकाग्रता (जैसे, 20x) पर स्टॉक कोलेजनेस बी समाधान तैयार किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर या नीचे संग्रहीत किया जा सकता है। वर्किंग सॉल्यूशन को नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए। कृपया वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी समाधान/बफर के लिए व्यंजनों के लिए तालिका 1 देखें । - 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज नमूना ट्यूबों में पाचन समाधान के 300 μL जोड़ें और एक सीधे वसंत कैंची के साथ गुर्दे के नमूनों कीमा।
नोट: गुर्दे के ऊतकों को भी आकार के साथ टुकड़ों में कीमा बनाया जाना चाहिए कोई व्यास में १.५ मिमी से बड़ा । किसी डेपुटेशन स्टेप की जरूरत नहीं है। - कीमा बनाया हुआ गुर्दे के नमूनों को पाचन समाधान युक्त 6 अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित करें
नोट: 6 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग सुविधा के लिए तभी किया जाता है जब कई नमूनों को संसाधित किया जाना है। - 45 मिनट के लिए कोमल कमाल (लगभग 60 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
- पाचन के बाद, ऊतक को सीधे डिश के अंदर 3 एमएल सिरिंज के प्लंजर फ्लैंज के साथ मैश करें, और 15 एमएल शंकु नलियों में स्थानांतरित करें।
नोट: आमतौर पर इस चरण में सेल छलनी के माध्यम से छानने की आवश्यकता नहीं होती है क्योंकि लाइव लिम्फोसाइट्स को शुद्ध करने के लिए घनत्व ढाल अपकेंद्रीकरण किया जाता है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नमूनों को नीचे स्पिन करें।
- आरपीएमआई/10% एफसीएस के 3 एमएल में पैलेट को रीसल्पेंड करें।
4. पचा गुर्दे से लिम्फोसाइट्स को समृद्ध करने के लिए घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नमूना नीचे स्पिन करें।
- सुपरनेट निकालें और 44% Percoll/RPMI मिश्रण (44% Percoll + 56% RPMI बिना FBS के) के 5 ml के साथ सेल गोली को फिर से खर्च करें।
- 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) के 3 ml युक्त एक 3 ml pipette की नोक सीधे प्रत्येक ट्यूब के नीचे करने के लिए रखो, और धीरे से समाधान जारी इतना है कि भारी समाधान (67% Percoll/PBS) तल पर एक अलग परत बनाता है और प्रकाश समाधान (44% Percoll/RPMI) उठाया है। साथ में, कॉकटेल परतों का गठन होगा ।
नोट: विक्रेता से नए आने वाले घनत्व ढाल माध्यम के लिए, बोतल में बाँझ 10x पीबीएस की 1/10 मात्रा जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं और पीबीएस-संतुलित घनत्व ढाल माध्यम को 100% समाधान के रूप में मानते हैं। - कम त्वरक और ब्रेक सेटिंग के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 900 x ग्राम पर नमूनों स्पिन।
नोट: एक्सीलेटर और ब्रेक सेटिंग्स के साथ अपकेंद्री के लिए (1-9 पैमाने पर (1 का मतलब न्यूनतम और 9 का मतलब अधिकतम) है), एक्सीलेटर के लिए 6 और ब्रेक के लिए 4 का उपयोग करें। - परतों को परेशान किए बिना अपकेंद्रित्र से ट्यूबों को सावधानी से हटा दें;
नोट: गुलाबी रंग आरपीएमआई परत और बेरंग पीबीएस परत के बीच एक स्पष्ट लिम्फोसाइट परत की पहचान की जाती है। - लिम्फोसाइट परत को छूने के बिना एक हस्तांतरण पिपेट के साथ शीर्ष परत को हटा दें।
- लिम्फोसाइट परत को एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, ट्यूब को पीबीएस/5% एफसीएस के साथ भरें और पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब 4-6x को धीरे-धीरे उलटा करके मिलाएं।
नोट: यह कदम किसी भी अवशिष्ट Percoll बाहर धोने के लिए महत्वपूर्ण है । - 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नमूनों को नीचे स्पिन करें।
- सुपरनेट निकालें और पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के 500 माइक्रोन के साथ सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें। कोशिकाएं प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला करने के लिए तैयार हैं।
5. फ्लो साइटोमेट्री धुंधला और विश्लेषण
नोट: कृपया टी लिम्फोसाइट्स के लिए मानक प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला प्रोटोकॉल का पालन करें।
- प्रत्येक FACS धुंधला के लिएलगभग 1 x 10 6 कोशिकाओं को ले लो।
नोट: FACS धुंधला के लिए एक यू-बॉटम 96 अच्छी तरह से प्लेट का प्रयोग करें। हालांकि, अगर केवल सीमित संख्या में नमूने शामिल हैं, तो 5 एमएल FACS ट्यूब का भी उपयोग किया जा सकता है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें। सुपरनेट को त्याग दें।
- 2.4G2 FcR अवरोधक (एफसीआर के साथ जोड़ा FACS एंटीबॉडी के बीच बातचीत को अवरुद्ध करने के लिए एक एंटी-सीडी16/32 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) के 10 μg/ml युक्त FACS बफर के 50 माइक्रोन में प्रत्येक नमूना Resuspend। 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
- आगे अपकेंद्री के बिना, प्रत्येक नमूने के लिए सतह धुंधला एंटीबॉडी मिश्रण के ५० μL जोड़ें ताकि अंतिम धुंधला मात्रा १०० μL/प्रत्येक नमूना है । अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
नोट: सभी सीडी 8 टी कोशिकाओं को लेबल करने के लिए एंटीबॉडी मिश्रण में फ्लोरोसेंटी लेबल स्ट्रेप्टाविडिन (2 माइक्रोग्राम/एमएल या फॉलो निर्माता की सिफारिश) को शामिल करें और सभी सीडी8 टी कोशिकाओं को लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट लेबल एंटी-सीडी8 एक्स एंटीबॉडी लेबल करें। एंटीबॉडी मिश्रण FACS बफर में रुचि एंटीबॉडी की वांछित मात्रा जोड़कर बनाया जाता है। - नमूनों को दो बार पीबीएस से धोएं। प्रत्येक धोने के लिए, ठंडे पीबीएस के साथ 96 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं को भरें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर स्पिन करें और सुपरनैंट को त्यागें।
- कोशिकाओं को पतला लाइव/डेथ डाई के 100 μL/well में फिर से खर्च करें। अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
नोट: घनत्व ढाल मध्यम स्पिन के साथ भी, एंजाइमेटिक पाचन कदम अक्सर ARTC2.2/P2RX7 सिग्नलिंग15के कारण ऊतक-निवासी टी कोशिकाओं में महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है । फिक्सेशन से पहले लाइव/डेथ डाई धुंधला करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है । विरोधी ARTC2 ना कोई भी इच्छामृत्यु से पहले चूहों में प्रशासित किया जा सकता है सेल अलगाव प्रेरित सेल मौत को रोकने के लिए । - नमूनों को दो बार FACS बफर से धोएं। प्रत्येक धोने के लिए, ठंडे FACS बफर के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं को भरें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर स्पिन करें और सुपरनेट को त्यागें।
- 100 μL/ 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
नोट: फिक्सिंग बफर को पीबीएस के साथ फॉर्मलडिहाइड को 2% फॉर्मलडिहाइड की अंतिम एकाग्रता के लिए कमजोर करके हौसले से बनाया जाता है। - नमूनों को दो बार FACS बफर से धोएं। प्रत्येक धोने के लिए, ठंडे FACS बफर के साथ 96 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं को भरें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर स्पिन करें और सुपरनैंट को त्यागें।
- कोशिकाओं को 250 μL/वेल एफएस बफर में फिर से खर्च करें। प्लेट को सील करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और FACS विश्लेषण तक प्रकाश से बचाएं।
नोट: FACS विश्लेषण से पहले, संभावित सेल क्लस्टर को हटाने के लिए 70 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से नमूनों को फ़िल्टर करें जो FACS मशीन को रोक सकते हैं।
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Representative Results
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक प्रवाह चार्ट(चित्रा 1A)में संक्षेप में है । 30 पोस्ट एलसीएमवी संक्रमण के दिन, हमने सीडी 8+ टी कोशिकाओं की इंट्रावैस्कुलर लेबलिंग का प्रदर्शन किया। 5 मिनट बाद, जानवर के दोनों गुर्दे विच्छेदित, कीमा बनाया हुआ और कोलेजन पाचन के अधीन थे। लिम्फोसाइट्स को परकोल अपकेंद्रित्र के माध्यम से पचाए गए नमूनों से और शुद्ध किया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया था। जैसा कि चित्रा 1 Bमें दिखाया गया है, घनत्व अपकेंद्रित्र-मध्यस्थता लिम्फोसाइट संवर्धन के बाद भी, अंतिम उत्पाद में गैर-लिम्फोसाइट्स का एक बड़ा हिस्सा देखना बहुत आम था। हालांकि, लाइव लिम्फोसाइट्स पर गेटिंग के बादसीडी8+ टी लिम्फोसाइट्स की पहचान करना आसान था। हम इंट्रावैस्कुलर बनाम एक्स्ट्रावैस्कुलर सीडी 8+ टी कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं। सीडी 8+ टी कोशिकाओं पर सीडी 8α और CD8ο के अत्यधिक सहसंबद्ध अभिव्यक्ति पैटर्न के कारण, यह उम्मीद की जाती है कि इंट्रावैस्कुलर सीडी 8+ टी कोशिकाएं CD8α-CD8ο FACS प्रोफ़ाइल पर एक विकर्ण पैटर्न प्रदर्शित करती हैं। जैसा कि अपेक्षित था, केवल पाठ्येतर सीडी8 + टी सेल ने कुशलतापूर्वक टी आरएम फेनोटाइप का अधिग्रहण किया, जैसे सीडी 69 का अपरेगुलेशन और Ly6C(चित्रा 1B)का डाउनरेगुलेशन। हमारे प्रयोगों में, हम कॉन्जेनिक मार्कर CD45.1 के साथ दाता P14 टी कोशिकाओं में रुचि रखते थे। एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, अंतर्जात मेजबान व्युत्पन्न सीडी 8+ टी कोशिकाओं की भी जांच की जा सकती है। संक्रमित चूहों के विपरीत, एसपीएफ सुविधा में रखे युवा भोले चूहों से अलग सीडी 8+ टी कोशिकाओं के विशाल बहुमत i.v. CD8α एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था और, इसलिए, इंट्रावैस्कुलर डिब्बे(चित्रा 1C)के थे ।
चित्रा 1: प्रतिनिधि परिणाम।
(A)प्रोटोकॉल का फ्लोचार्ट। (ख)30 पोस्ट इंफेक्शन के दिन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किडनी लिम्फोसाइट्स का विश्लेषण किया गया । प्रतिनिधि FACS प्रोफाइल और गेटिंग रणनीति दिखाई जाती है। संख्या उनके माता पिता की आबादी में gated सबसेट के प्रतिशत का संकेत मिलता है । (ग)एक भोले माउस से अलग गुर्दे सीडी 8+ टी कोशिकाओं के प्रतिनिधि FACS प्रोफ़ाइल । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | नुस्खा | नोट |
| 100% Percoll | परकोल के 9 वॉल्यूम + 10xPBS की 1 मात्रा | |
| 44% Percoll/RPMI | 44% Vol के 100% Percoll + 56% वोल सीरम मुक्त RPMI | 100% Percoll से ताजा बनाया |
| 67% Percoll/PBS | 100% परकोल + 33% Vol PBS के 67% Vol | 100% Percoll से ताजा बनाया |
| पाचन बफर | आरएमआई + 2% एफसीएस + 1mg/ml कोलेजनेस बी | कोलेजनेस स्टॉक से ताजा किया |
| PBS/5% FCS वाशिंग बफर | पीबीएस + 5% एफसीएस | |
| FACS बफर | पीबीएस + 2% एफसीएस + 0.02% एनएएन3 | 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत |
| बफर फिक्सिंग | पीबीएस + 2% फॉर्मलडिहाइड | आरटी पर संग्रहीत और प्रकाश से संरक्षित |
तालिका 1: वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी समाधान और बफर के लिए व्यंजनों की सूची।
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Discussion
चूंकि ऊतक विशिष्ट प्रतिरक्षा अनुसंधान का एक तेजी से विस्तार क्षेत्र है, सबूत जमा करने से पता चलता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विशेष रूप से लिम्फोसाइट्स आबादी वयस्क मानव या संक्रमित या प्रतिरक्षित चूहों में लगभग सभी अंगों में पहचाना जा सकता है। एलसीएमवी माउस संक्रमण मॉडल कई ऊतकों में टी आरएम जीव विज्ञान सहित एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रिया, प्रभावक और मेमोरी टी सेल भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह सेस्थापित मॉडल है। यहां हमने किडनी मेंसीडी8+ टी सेल्स का विश्लेषण करने का प्रोटोकॉल बताया। यह प्रोटोकॉल काफी हद तक टीआरएम12पर केंद्रित प्रकाशनों से अनुकूलित है । संभवतः उच्च स्तरीय P2RX7 अभिव्यक्ति और एंजाइमेटिक पाचन प्रेरित सेल डेथ15के कारण, वर्तमान प्रोटोकॉल से लिम्फोसाइट्स उपज तत्काल फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त है। हालांकि, P2RX7 प्रेरित सेल डेथ16को बाधित करने के लिए स्थापित प्रोटोकॉल के साथ, यह बोधगम्य है कि वर्तमान प्रोटोकॉल को आसानी से संशोधित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, P2RX7 सिग्नलिंग को ब्लॉक करने के लिए अवरोधकों के अलावा) सेल अस्तित्व को बढ़ाने और अन्य दीर्घकालिक कार्यात्मक परख के लिए अनुकूल है। यह सुनिश्चित करने के लिए उचित नियंत्रण समूहों को शामिल किया जाना चाहिए कि P2RX7 अवरोधक इच्छुक कार्यात्मक परख में हस्तक्षेप न करें।
किडनी सीडी 8+ टीआरएम कोशिकाएं काफी हद तक संक्रमण या पर्यावरणीय एंटीजन के जवाब में उत्पन्न होती हैं। हम सीधे गुर्दे CD8+ टी 5-6 सप्ताह पुराने भोले C57BL/6 चूहों से अलग कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए इंट्रावैस्कुलर लेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग किया है । प्रकाशित परिणामों के अनुरूप17,इन "स्वच्छ" चूहों(चित्रा 1C)में लगभग कोई पाठ्येतर सीडी 8+ टी कोशिकाएं नहीं हैं। एक सुरुचिपूर्ण अध्ययन से पता चला है कि गैर-लिम्फोइड ऊतकों में पहचानी गई अधिकांश स्मृति सीडी 8+ टी कोशिकाएं टीआरएम10हैं। इसके विपरीत, इसी तरह की संक्रमण प्रणाली का उपयोग करके, हम अक्सर सीडी 69 की एक महत्वपूर्ण आबादी का पता लगाते हैं- कोशिकाएं (सबसे अधिक संभावना टीईएम कोशिकाओं या सीडी 69- टीआरएम कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं) यहां तक कि पाठ्येतर डिब्बे में भी। विसंगति तथ्यों के कारण हो सकती है कि 1) विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया जाता है, यानी माइक्रोस्कोप बनाम प्रवाह साइटोमेट्री; 2) जल्दी बनाम देर से स्मृति समय अंक ध्यान केंद्रित कर रहे है और 3) CD69 टीआरएमकी पहचान करने के लिए एक आदर्श मार्कर नहीं है । एंजाइमेटिक पाचन और प्रवाह साइटोमेट्री टीआरएम कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान लगाने में काफी कम होगा। हालांकि, एक सुविधाजनक और गैर श्रम-गहन प्रोटोकॉल के रूप में, इसे अभी भी आमतौर पर अधिकांश टी आरएम अध्ययनों में स्वीकार कियाजाता है।
निश्चित रूप से टीआरएम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए सोने के मानक पैराबायोसिस प्रयोग करने के लिए है। हालांकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल गुर्दे के निवासी टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है, इस प्रोटोकॉल से परिणाम केवल यह साबित करते हैं कि जिस समय चूहों को इच्छामृत्यु दी जाती है, उस समय टी कोशिकाएं गुर्दे में रक्त वाहिकाओं के बाहर रह रही होती हैं । अकेले यह प्रोटोकॉल टी कोशिकाओं के प्रवासी इतिहास के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करता है।
संक्रमण के अलावा, ऑटोइम्यून प्रतिक्रियाओं सहित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को लक्षित करने वाला कोई भी गुर्दा इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग करके गुर्दे के निवासी टी कोशिकाओं के एक महत्वपूर्ण सबसेट के भेदभाव को प्रेरित कर सकता है। इसके अलावा, जैसा कि12से पहले वर्णित है, अन्य गुर्दे-निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी (सभी हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को लेबल करने के लिए) का उपयोग करने के लिए इस प्रोटोकॉल को आसानी से संशोधित किया जा सकता है। साथ में, हमने गुर्दे से सीडी 8+ टी कोशिकाओं को अलग और विश्लेषण करने के लिए अपेक्षाकृत सुविधाजनक तरीका प्रदर्शित किया, जिसे संक्रमण और ऑटोयियुसन सहित विभिन्न मॉडलों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास कोई प्रासंगिक वित्तीय खुलासे नहीं हैं ।
Acknowledgments
यह काम NIH अनुदान AI125701 और AI139721, कैंसर अनुसंधान संस्थान क्लिप कार्यक्रम और अमेरिकन कैंसर सोसायटी अनुदान RSG-18-222-01-LIB द्वारा समर्थित है N.Z. हम कार्ला गोरेना और सेबेस्टियन मोंटाग्निनो को फ्लो साइटोमेट्री फैसिलिटी से धन्यवाद देते हैं । फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन सुविधा में उत्पन्न डेटा को सैन एंटोनियो (UTHSCSA), NIH/NCI अनुदान P30 CA054174-20 (यूटीएचएससीएसए में नैदानिक और अनुवाद अनुसंधान केंद्र [सीटीआरसी] में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, और UL1 TR001120 (नैदानिक और अनुवाद विज्ञान पुरस्कार) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
