Summary
Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8+ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan TRM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.
Abstract
Doku da yerleşik bellek T hücresi (TRM)immünoloji araştırmalarının hızla genişleyen bir alanıdır. Çeşitli lenfoid olmayan dokulardan T hücrelerinin izole TRMaraştırmak için önemli adımlardan biridir. Farklı organlar için lenfosit izolasyon protokollerinde hafif farklılıklar vardır. Böbrek patojen maruziyet veya otoimmün aktivasyon özellikle sonra çok sayıda bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile önemli bir non-lenfoid organdır. Son yıllarda, bizim de dahil olmak üzere birden fazla laboratuvar fare ve insan çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda böbrek yerleşik CD8+ T hücreleri karakterize başlamıştır. T lenfositlerin bolluğu nedeniyle, böbrek non-mukozal veya non-bariyer dokularda TRMçalışmak için cazip bir model organ temsil eder. Burada, sistemik viral enfeksiyon sonrasında fare böbreklerinden CD8+ T hücrelerini izole etmek için TRModaklı laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir protokolü açıklayacağız. Kısaca, C57BL/6 farelerinde akut lenfositik koryomeningit (LCMV) enfeksiyon modeli kullanarak, örnekleri sonraki akış sitometri analizine hazır hale getirmek için fare böbreklerinden lenfositleri izole etmek ve zenginleştirmek için intravasküler CD8+ T hücre etiketleme, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyan santrifüjünü gösteriyoruz.
Introduction
Doku da yerleşik bellek (TRM)T hücreleri yetişkin insan ve enfekte farelerde en bol T hücre popülasyonlarından birini temsil eder. TRM hücreleri bağışıklık savunmasının ilk hattını sağlar ve çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik olarak yer alır1,2,3,4,5. Dolaşımdaki T hücreleri ile karşılaştırıldığında, TRM hücreleri benzersiz transkripsiyon programları6,7,8ile farklı yüzey belirteçleri taşır. TRM biyolojisi hakkındaki bilgimizi genişletmek, T hücre bazlı aşıların ve immünoterapilerin gelecekteki gelişimi için gerekli olan T hücre yanıtlarını anlamanın anahtarıdır.
Tüm lenfoid olmayan dokularda TRM'ninyaygın olarak paylaşılan moleküler belirteçlerine ek olarak, biriken kanıtlar dokuya özgü özelliklerin TRM biyolojisi 9'unmerkezi bir bileşeni olduğunu göstermektedir. Böbrek enfeksiyon sonrası TRM hücreleri de dahil olmak üzere birçok bağışıklık hücreleri barındırır ve olmayan bir mukozal dokuda TRM hücre biyolojisi çalışma için büyük bir fırsat sunuyor. İntraperitoneal yol ile akut LCMV (lenfositik koryomeningit virüsü) enfeksiyonu farelerde antijene özgü T hücre yanıtlarını incelemek için kurulmuş bir sistemik enfeksiyon modelidir. Enfeksiyon genellikle yabani tip farelerde 7-10 gün içinde çözülür ve böbrek10dahil olmak üzere çeşitli dokularda LCMV özgü bellek T hücrelerinin çok sayıda bırakın. P14 TCR (T hücre reseptörü) transgenik fareler CD8+ T hücreleri taşır, C57BL/6 farelerde MHC-I (sınıf I majör histokompatibilite kompleksi) molekülü H2-Db tarafından sunulan LCMV'nin immün dominant epitoplarından birini tanır. Farelerde konjenik olarak işaretlenmiş P14 T hücre evlat edinen transferi ve LCMV enfeksiyonu ile tom8+ efektör ve bellek T hücreleri, TRM farklılaşması ve homeostaz dahil olmak üzere izlenir.
Bağırsak intraepitelyal lenfositler (IEL) bölmesi ve tükürük bezleri gibi bazı bariyer dokularında, kurulan lenfosit izolasyon prosedürü fare LCMV modelinde en az kan kaynaklı T hücre kontaminasyonu ile TRM hücrelerinin yüksek yüzdesini verir11. Ancak, böbrek gibi bariyer olmayan dokularda, yoğun vasküler ağ dolaşımdaki CD8+ T hücrelerinin çok sayıda içerir. Başarılı perfüzyonun bile dolaşımdaki tüm CD8+ T hücrelerini verimli bir şekilde çıkaramadığı iyi belgelenmiştir. Bu teknik engeli aşmak için, intravasküler antikor boyama TRM laboratuvarlarında en sık kullanılan tekniklerden biri olarak kurulmuştur12. Kısaca, ötanaziden 3-5 dakika önce, 3 μg/mouse anti-CD8 antikor (CD8+ T hücrelerini etiketlemek için) intravenöz olarak teslim edilir. Sağlam kan damarı duvarı bu kısa sürede antikorların hızlı difüzyonunu önler (yani 3-5 dakika) ve sadece intravasküler hücreler etiketlenir. Standart lenfosit izolasyon protokolü takip, intravasküler karşı ekstravasküler hücreler kolayca akış sitometri kullanılarak ayırt edilebilir.
Burada, trm laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan standart bir protokolü,13gün önce 30 gün önce CD45.1+ P14 T hücreleri ve LCMV enfeksiyonu aldı C57BL/6 fare kullanarak böbrek CD8+ T hücrelerinin lenfosit izolasyonve akış sitometri analizi gerçekleştirmek için açıklayacağız. Aynı protokol böbrekte hem efektör hem de bellek T hücrelerini incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokole göre yapılan tüm hayvan deneyleri ilgili kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Burada açıklanan tüm prosedürler IACUC UT Health San Antonio tarafından onaylanmıştır.
1. P14 T hücrelerinin C57BL/6 alıcılarına ve LCMV enfeksiyonuna benimsendirici transferi
- 6-12 haftalık kenP14 farelerini kullanın. Donör P14 TCR transgenik farenin cinsiyetinin C57BL/6 alıcı farelerinin cinsiyetine uygun olduğundan emin olun. Aksi takdirde, erkek T hücreleri gibi kadın farelere transfer hücreleri yaklaşık 12 gün içinde dolaşan donör T hücrelerinin bağışıklık aracılı reddi neden olur14.
- Üreticiprotokolünden sonra fare CD8+ T hücre saflaştırma kiti nikullanarak p14 TCR transgenik farenin dalak ve lenf düğümlerinden saf CD8+ T hücrelerini arındırın.
- Kısaca, dalak ve lenf düğümleri incelemek, tek hücreli süspansiyon oluşturmak için örnekleri püre.
- Naif T hücreleri için zenginleştirmek için, ilk antikor kuluçka adım sırasında biotin-anti-CD44 antikor ekleyin13.
NOT: Bu adımda kullanılan negatif seçim ticari kiti kuluçka iki adım için iki ana bileşeni içerir (yani, biotin-antikor karışımı kuluçka ve streptavidin-manyetik boncuk kuluçka).
- Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve kuyruk damarı ile eşleşen Her cinsiyete 200 μL PBS'de 1.000 ila 10.000 saflaştırılmış P14 T hücresi enjekte edin.
NOT: Ayrıntılı kuyruk ven enjeksiyon protokolü adım 2'de tanımlanmıştır. - Ertesi gün, tüm C57BL/6 alıcıları intraperitoneal bir rota ile 200 μL PBS seyreltilmiş 2 x 105 pfu LCMV Armstrong alırsınız.
2. CD8+ T hücrelerinin intravasküler etiketleme
NOT: Araştırma ilgi alanlarına bağlı olarak enfeksiyon sonrası farklı zaman dilimleri seçilebilir. Gün 30 post enfeksiyon bir örnek (gün 30 sonra adım 1.4) genellikle CD8 T hücre yanıtı için erken bir bellek zaman noktası olarak kabul edilir gösterilmiştir.
- PBS'de biotin anti-CD8α antikorlarını 15 μg/mL'ye seyreltin. Her farenin 3 μg antikor içeren 200 μL PBS aldığından emin olun.
NOT: Biotin anti-CD8 antikor son FACS boyama paneli tasarımı için daha esnek olacak, böylece burada kullanılır. Floresan boya etiketli antikor doğrudan kullanılabilir. Ancak, intravenöz etiketleme ve FACS boyama için monoklonal antikorların farklı klonları kullanmak önemlidir. - Düzgün damarları dilate için 5-10 dakika için bir havai ısı lambası ile farelerin kuyruk damar ısı.
NOT: Hayvanların aşırı ısınmasını önlemek için ekstra özen izlenmelidir. Fareler hareket etmek için durduysa ısıyı azaltın veya ısı lambasını çıkarın. - Önceden seyreltilmiş anti-CD8α antikor karışımının 200 μL'ini 100 U insülin şırıngasına (28G) çekin ve pistonu yukarı ve aşağı hareket ettirerek hava kabarcıklarını çıkarın. İğne ve şırınga arasında 150° açı oluşturmak için iğneyi bükün, böylece iğne damara paralel olacak.
- Uygun boyutta bir kemirgen dizginleyici ile fareyi dizginlemek ve damar açıkça görünür hale getirmek için% 70 etanol ile kuyruk sprey.
NOT: Kısıtlama süresi minimumda tutulmalıdır. - Baskın olmayan elin başparmak ve orta parmakları ile distal ucunda kuyruk tutun. İşaret parmağını iğnenin takAcağı yerin altına yerleştirin.
- Şırıngayı baskın el ile tutun ve iğneyi kalbin yönüne paralel olarak damara takın.
NOT: Doğru yerleştirirken, iğne damariçine düzgün hareket etmelidir. - Kuyruk damarı üzerinden 200 μL anti-CD8α antikor enjekte edin.
NOT: Kuyruktaki iğnenin üzerinde bir direnç veya beyaz bir alan görülürse, iğne damarın içinde değildir. İlk enjeksiyonu kuyruğun ucuna yakın başlatın. Gerektiğinde, sonraki enjeksiyonlar için kuyruğun altına doğru ilerleyin. - İğneyi çıkarın ve kanama durana kadar hafifçe sıkıştırma uygulayın.
- Fareyi kafese geri döndürün ve 3-5 dk sonra fareyi ötenazi edin.
NOT: Fareler izofluran odası ve ardından servikal çıkış yoluyla ötenazi yapılmalıdır. CO2 inhalasyonu gibi diğer yöntemler 5 dakika kadar sürer ve intravenöz antikor etiketleme süresinin gereksiz değişimine neden olabilir. - Makas kullanarak böbreği inceleyin, tüm böbreği 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve numuneleri daha fazla işleme konana kadar buzda bırakın.
NOT: Bozulmamış tüm böbrek güvenli bir şekilde sonraki işleme ve sindirim önce birkaç saat buz üzerinde saklanabilir.
3. Böbrek enzimatik sindirim
- Her fare için 3mL sindirim çözeltisi (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Kollajenaz B) içeren 6 kuyu plakası hazırlayın, buz üzerinde saklayın.
NOT: Stok kollajenaz B çözeltisi daha yüksek konsantrasyonda (örn. 20x) -20°C'de veya altında hazırlanabilir ve saklanabilir. Çalışma çözümü taze olarak hazırlanmalıdır. Geçerli protokolde kullanılan tüm çözüm/arabellek tarifleri için lütfen Tablo 1'e bakın. - 1,5 mL mikrosantrifüj numune tüplerine 300 μL sindirim çözeltisi ekleyin ve böbrek örneklerini düz bir yay makasla dolayın.
NOT: Böbrek dokusu 1,5 mm'den büyük olmayan boyutlarda eşit parçalar halinde doğrılmalıdır. Decapsulation adım gereklidir. - Kıymalı böbrek örneklerini sindirim çözümlü içeren 6 kuyu plakasına aktarın
NOT: 6 kuyu plakası sadece işlenecek birden fazla örnek olduğunda kolaylık sağlamak için kullanılır. - Numuneleri 37 °C'de 45 dakika boyunca hafif sallayarak (yaklaşık 60 rpm) kuluçkaya yatırın.
- Sindirimden sonra, doğrudan çanak içinde bir 3 mL şırınga piston flanş ile doku püre, ve 15 mL konik tüpler içine transfer.
NOT: Canlı lenfositlerin arıtılması için yanında yoğunluk gradyan santrifüjü yapıldığından, genellikle hücre süzgecinden filtrasyon gerekli değildir. - 4 °C'de 5 dk için 500 x g'de numuneleri aşağı doğru çevirin.
- RPMI/10% FCS 3 mL pelet resuspend.
4. Sindirilmiş böbreklenfositler zenginleştirmek için yoğunluk gradyan santrifüj
- Numuneyi 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya çevirin.
- Supernatant çıkarın ve 5 mL ile hücre pelet resuspend 44% Percoll / RPMI karışımı (%44 Percoll + 56% RPMI FBS olmadan).
- 3 mL içeren 3 mL'lik pipetin ucunu %67 Percoll/PBS (%67 Percoll + %33 PBS) doğrudan her tüpün altına koyun ve ağır çözeltinin (%67 Percoll/PBS) alt tabakada ayrı bir tabaka oluşturduğu ve ışık çözeltisinin (%44 Percoll/RPMI) yükseltilmesi için solüsyonu yavaşça bırakın. Birlikte, kokteyl katmanları oluşturacaktır.
NOT: Satıcıdan yeni gelen yoğunluk gradyan ortamı için şişeye 1/10 hacim steril 10x PBS ekleyin, iyice karıştırın ve PBS dengeli yoğunluk gradyan ortamını %100 çözüm olarak düşünün. - Azaltılmış gaz ve fren ayarı ile oda sıcaklığında 20 dk için 900 x g'de numuneleri döndürün.
NOT: Hızlandırıcı ve fren ayarlı santrifüjler için (1-9 ölçekte (1 minimum ve 9 maksimum anlamına gelir)), gaz pedalı için 6 ve fren için 4 kullanın. - Tüpleri katmanları rahatsız etmeden santrifüjden dikkatlice çıkarın;
NOT: Pembe renk RPMI tabakası ile renksiz PBS tabakası arasında net bir lenfosit tabakası tanımlanır. - Lenfosit tabakası dokunmadan bir transfer pipet ile üst tabaka çıkarın.
- Lenfosit tabakasını yeni bir 15 mL tüpe aktarın, tüpü PBS/5% FCS ile doldurun ve yeterli karıştırmayı sağlamak için tüpü 4-6x yavaşça ters çevirerek karıştırın.
NOT: Bu adım herhangi bir artık Percoll yıkamak için önemlidir. - 4 °C'de 5 dk için 500 x g'de numuneleri aşağı doğru çevirin.
- Supernatant çıkarın ve tam RPMI orta 500 μL ile hücre pelet yeniden askıya. Hücreler akış sitometri boyama için hazırdır.
5. Akış sitometri boyama ve analizi
NOT: T lenfositler için standart akış sitometri boyama protokolünü uygulayın.
- Her FACS boyama için yaklaşık 1 x 106 hücre alın.
NOT: FACS boyama için bir U-alt 96 kuyu plakası kullanın. Ancak, sadece sınırlı sayıda örnek söz konusu ise, 5 mL FACS tüpleri de kullanılabilir. - Hücreleri 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya çevirin. Supernatant atın.
- 10 μg/mL 2.4G2 FcR bloker (fcr ile eklenen FACS antikorları arasındaki etkileşimi engellemek için bir anti-CD16/32 monoklonal antikor) içeren 50 μL FACS tamponundaki her numuneyi yeniden askıya alın. 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
- Daha fazla santrifüj olmadan, son boyama hacminin 100 μL/her numune olması için her numune için 50 μL yüzey boyama antikor karışımı ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
NOT: ANTIKor karışımına floressentçe etiketli streptavidin (2 g/mL veya üreticinin tavsiyesine uyun) ekleyin ve tüm CD8 T hücrelerini etiketlemek için floresan etiketli anti-CD8β antikor kullanın. Antikor karışımı FACS tampon içine ilgilenen antikorların istenilen miktarda ekleyerek yapılır. - Örnekleri iki kez PBS ile yıkayın. Her yıkama için, 96 kuyu plakasının kuyularını soğuk PBS ile doldurun, 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'da döndürün ve süpernatantı atın.
- Seyreltilmiş canlı/ölüm boyası 100 μL/well'deki hücreleri yeniden askıya alın. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
NOT: Yoğunluk gradyan orta spin bile, enzimatik sindirim adımı genellikle ARTC2.2/P2RX7 sinyalizasyon15nedeniyle doku yerleşik T hücrelerinde önemli hücre ölümü neden olur. Canlı/ölüm boyası boyama, fiksasyondan önce şiddetle tavsiye edilir. Anti-ARTC2 nanobody hücre izolasyonuna bağlı hücre ölümünü önlemek için ötanaziden önce farelere yönetilebilir. - Örnekleri iki kez FACS arabelleği ile yıkayın. Her yıkama için, 96 kuyulu plakanın kuyularını soğuk FACS tamponuyla doldurun, 5 000 x g'de 4 °C'de 5 dk'da döndürün ve süpernatantı atın.
- Hücreleri 100 μL/iyi sabitleme tamponunda yeniden askıya alın. 37 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
NOT: Tampon sabitleme% 2 formaldehit nihai konsantrasyonp PBS ile formaldehit seyreltilmesi ile taze yapılır. - Örnekleri iki kez FACS arabelleği ile yıkayın. Her yıkama için, 96 kuyu plakasının kuyularını soğuk FACS tamponuyla doldurun, 5 000 x g'de 4 °C'de 5 dk'da döndürün ve süpernatantı atın.
- 250 μL/well FACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın. Plakayı kapatın, 4 °C'de saklayın ve FACS analizine kadar ışıktan koruyun.
NOT: FACS analizinden önce, FACS makinesini tıkayabilecek olası hücre kümelerini kaldırmak için numuneleri 70 μM naylon kafesten filtreleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokol bir akış grafiğinde özetlenmiştir (Şekil 1A). 30. gün sonrası LCMV enfeksiyonunda CD8+ T hücrelerinin intravasküler etiketlemesini yaptık. 5 dakika sonra, hayvanın her iki böbrek leri kesildi, kıyıldı ve kollajenaz sindirime tabi tutuldu. Lenfositler Percoll santrifüj yoluyla sindirilmiş örneklerden daha fazla saflaştırılmış ve akış sitometri sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 1B'degösterildiği gibi , yoğunluk santrifüj aracılı lenfosit zenginleştirme sonra bile, son üründe lenfosit olmayan ların büyük bir bölümünü görmek çok yaygındı. Ancak, canlı lenfositler gating sonra, CD8+ T lenfositler tanımlamak kolay oldu. İntravasküler vs ekstravasküler CD8+ T hücrelerini ayırt edebilirdik. CD8+ T hücrelerinde CD8α ve CD8β'nın yüksek korelasyonel ekspresyon deseni nedeniyle, intravasküler CD8+ T hücrelerinin CD8α-CD8β FACS profilinde diyagonal desen göstermesi beklenmektedir. Beklendiği gibi, sadece ekstravasküler CD8+ T hücresi verimli tRM fenotipler, CD69 upregülasyonu ve Ly6C downregulation gibi(Şekil 1B)elde etti. Deneylerimizde, konjenik marker CD45.1 ile donör P14 T hücreleri ile ilgilendi. Aynı protokol kullanılarak, endojen konak türetilmiş CD8+ T hücreleri de incelenebilir. Enfekte farelerin aksine, SPF tesisinde bulunan genç naif farelerden izole edilen CD8+ T hücrelerinin büyük çoğunluğu i.v. CD8α antikor ile etiketlenmiş ve bu nedenle intravasküler bölmeye aittir(Şekil 1C).
Şekil 1: Temsili sonuçlar.
(A) Protokolün akış şeması. (B) Gün 30 post enfeksiyon, böbrek lenfositler akış sitometri ile analiz edildi. Temsilci FACS profilleri ve gating stratejisi gösterilir. Sayılar, ebeveyn popülasyonlarındaki geçitli alt kümelerin yüzdesini gösterir. (C) Naif bir fareden izole böbrek CD8+ T hücrelerinin temsili FACS profili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Tarifi | Not |
| %100 Percoll | 9 cilt Percoll + 1 birim 10xPBS | |
| %44 Percoll/RPMI | %44 Vol %100 Percoll + %56 Vol serumsuz RPMI | %100 Percoll'dan taze üret |
| %67 Percoll/PBS | %67 Vol %100 Percoll + %33 Vol PBS | %100 Percoll'dan taze üret |
| Sindirim tamponu | RPMI + %2 FCS + 1mg/ml kollajenaz B | Kollajenaz stoğundan taze olarak üretmiş |
| PBS/%5 FCS yıkama tamponu | PBS + %5 FCS | |
| FACS arabelleği | PBS + %2 FCS + %0.02 NaN3 | 4°C'de saklanır |
| Arabelleği sabitleme | PBS + %2 formaldehit | RT'de saklanır ve ışıktan korunur |
Tablo 1: Geçerli protokolde kullanılan tüm çözüm ve arabellek için yemek tarifleri listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dokuya özgü bağışıklık araştırma hızlı genişleyen bir alan olduğu gibi, kanıt birikmesi bağışıklık hücreleri, özellikle lenfositler nüfus yetişkin insan veya enfekte veya aşılanmış farelerde hemen hemen tüm organlarda tespit edilebilir öneririz. LCMV fare enfeksiyonu modeli, antijene özgü T hücre yanıtı, efektör ve bellek T hücre farklılaşmasını incelemek için kurulmuş bir modeldir. Burada böbrekteki CD8+ T hücrelerini analiz etmek için bir protokol tanımladık. Bu protokol büyük ölçüde TRM12odaklı yayınlardan uyarlanmıştır. Muhtemelen yüksek düzeyde P2RX7 ekspresyonu ve enzimatik sindirim indüklenen hücre ölümünedeniyle 15, mevcut protokolden lenfositler verim en iyi acil fenotipik analiz için uygundur. Ancak, P2RX7 indüklenen hücre ölümü inhibe etmek için kurulan protokol ile16, bu mevcut protokol kolayca değiştirilebilir düşünülebilir (örneğin, P2RX7 sinyal engellemek için inhibitörlerin eklenmesi ile) hücre sağkalımını artırmak ve diğer uzun vadeli fonksiyonel tahliller için uygun olması. P2RX7 inhibitörlerinin ilgili fonksiyonel tahlillere müdahale etmediğinden emin olmak için uygun kontrol grupları eklenmelidir.
Böbrek CD8+ TRM hücreleri büyük ölçüde enfeksiyon veya çevresel antijenlere yanıt olarak oluşturulur. 5-6 haftalık naif C57BL/6 farelerinden izole edilen böbrek CD8+ T hücrelerini doğrudan analiz etmek için intravasküler etiketleme protokolü kullandık. Yayınlanan sonuçlar la tutarlı17, bu "temiz" farelerde hemen hemen hiç ekstravasküler CD8+ T hücreleri yoktur(Şekil 1C). Zarif bir çalışma, lenfoid olmayan dokularda tanımlanan bellek CD8+ T hücrelerinin çoğunluğu TRM10olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, benzer bir enfeksiyon sistemi kullanarak, sık sık CD69 önemli bir popülasyon tespit- hücreler (büyük olasılıkla TEM hücreleri veya CD69 temsil- TRM hücreleri) hatta ekstravasküler bölmesi. Tutarsızlık 1) farklı teknikler, yani, mikroskop vs akış sitometri kullanılır gerçekleri nedeniyle olabilir; 2) erken vs geç bellek zaman noktaları odaklanmış ve 3) CD69 TRMtanımlamak için mükemmel bir belirteç değildir . Enzimatik sindirim ve akış sitometrisi, toplam TRM hücrelerinin sayısını önemli ölçüde az tahmin edecektir. Ancak, uygun ve emek yoğun olmayan bir protokol olarak, hala yaygın olarak en TRM çalışmalarda kabul edilir.
TRM hücrelerini kesin olarak tanımlamak için altın standart parabiyoz deneyi yapmaktır. Burada açıklanan protokol böbrek yerleşik T hücrelerini tanımlamak için uygun bir yol sağlar rağmen, Bu protokol sonuçları sadece fareler ötenazi zaman, T hücreleri böbrek kan damarları dışında ikamet olduğunu kanıtlamak. Bu protokol tek başına T hücrelerinin göç geçmişi hakkında herhangi bir bilgi sağlamaz.
Enfeksiyonlara ek olarak, otoimmün yanıtlar da dahil olmak üzere immün yanıtları hedefleyen herhangi bir böbrek böbrek yerleşik T hücrelerinin önemli bir alt kümesinin farklılaşmasına neden olabilir benzer bir protokol kullanılarak çalışılabilir. Ayrıca, önce açıklandığıgibi 12, Bu protokol kolayca anti-CD45 antikor kullanmak için değiştirilebilir (tüm hematopoetik hücreleri etiketlemek için) diğer böbrek yerleşik bağışıklık hücreleri çalışma. Birlikte, biz izole etmek ve böbrek, enfeksiyon ve otoimmünite de dahil olmak üzere çeşitli modellere adapte edilebilir CD8+ T hücreleri analiz etmek için nispeten uygun bir yol gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların konuyla ilgili herhangi bir mali açıklamaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe AI125701 ve AI139721, Kanser Araştırma Enstitüsü CLIP programı ve Amerikan Kanser Derneği hibe RSG-18-222-01-LIB n.z tarafından desteklenir. Flow Sitometri Tesisi'nden Karla Gorena ve Sebastian Montagnino'ya teşekkür ederiz. Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Tesisi'nde oluşturulan veriler San Antonio'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (UTHSCSA), NIH/NCI hibe P30 CA054174-20 (UTHSCSA'daki Klinik ve Çeviriaraştırma Merkezi [CTRC] ve UL1 TR001120 (Klinik ve ÇeviriBilim Ödülü) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
