Summary
Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.
Abstract
Kapsamlı çalışmalar, ikincil lenfoid organlarda murine B hücrelerinin gelişimini ve farklılaşmasını karakterize ederek karakterizedir. B hücreleri tarafından salgılanan antikorlar izole edilmiş ve köklü terapötikler haline geliştirilmiştir. Murine B hücre gelişiminin, otoimmün eğilimli fareler bağlamında veya değiştirilmiş bağışıklık sistemine sahip farelerde doğrulanması, farelerde terapötik ajanlar geliştirmenin veya test etmenin önemli bir bileşenidir ve akış sitometrisinin uygun bir kullanımıdır. İyi kurulmuş B hücre akışı sitometrik parametreleri, murine periton, kemik iliği ve dalaktaki B hücre gelişimini değerlendirmek için kullanılabilir, ancak bir dizi en iyi uygulamaya uyulmalıdır. Ek olarak, B hücre bölmelerinin akış sitometrik analizi de B hücre gelişiminin ek okumalarını tamamlamalıdır. Bu teknik kullanılarak üretilen veriler, vahşi tip, otoimmün eğilimli fare modelleri ve terapötik olarak antikor veya antikor benzeri moleküller üretmek için kullanılabilecek insanlaştırılmış fareler anlayışımızı daha da ileriye getirebilir.
Introduction
Monoklonal antikorlar, ana akım tıbbın bir parçası haline geldikçe birçok insan hastalığı için giderek daha fazla tercih tedavisi haline gelmiştir1,2. Daha önce, fare IgH sabitleri3,4 ile tamamen insan değişken bölgelerini barındıran antikorları verimli bir şekilde üreten genetik olarak tasarlanmış fareleri tanımladık. Son zamanlarda, farklı antijen bağlayıcısı olan antikor benzeri moleküller üreten genetik olarak tasarlanmış fareleri tanımladık5. Antikorlar B hücreleri tarafından salgılanır ve uyarlanabilir humoral bağışıklığın temelini oluşturur. B-1 ve B-2 olmak üzere iki farklı tip B hücresi vardır. Memelilerde B-1 hücreleri fetal karaciğerden kaynaklanır ve doğumdan sonra mukozal dokular ile plevral ve periton boşluklarında zenginleştirilirken, B-2 hücreleri doğumdan önce fetal karaciğerden ve daha sonra kemik iliğinde (BM) kaynaklanır. B-2 hücreleri dalak ve kan dahil sekonder lenfoid organlarda zenginleştirilir6,7,8. BM'de, B-2 hematopoetik progenitörler, Ig mu ağır zincir yeniden düzenlemesinin başlatılması üzerine B yanlısı hücrelere farklılaşmaya başlar9,10. Ig ağır zincirinin ve montajının B öncesi hücre reseptörüne (BCR öncesi) başarılı bir şekilde yeniden düzenlenmesi, sinyalizasyon ve proliferatif genişleme ile birlikte B öncesi hücrelere farklılaşmaya yol açar. B öncesi hücreler Ig kappalarını (Igφ) yeniden düzenledikten sonra veya verimsizse, Ig lambda (Igφ) ışık zincirleri, ağır μ zincirle eşleşerek yüzey IgM BCR ekspresyozunu elde ederler. IgM yüzey ekspresyonunun otoreaktivite koşullarında azaldığının bilindiğini, böylece fonksiyonel olarak yanıt vermeyen veya anjik B hücrelerinde kendine toleransa katkıda bulunduğunu belirtmek önemlidir11,12. Olgunlaşmamış B hücreleri daha sonra IgD'yi birlikte ifade etmeye ve BM'den dalağa göç etmeye başladıkları bir geçiş aşamasına girerler. Dalakta, IgD ekspresyasyonu daha da artar ve hücreler geçiş B hücrelerinin ikinci aşamasına olgunlaşır, ardından olgunlaşma durumlarının ve gelişimlerinin marjinal bölge (MZ) veya foliküler (Fol) hücrelere tamamlanması13,14,15. Yetişkin farelerde, hastalıklı olmayan bir ortamda, BM'de günlük 10-20 milyon olgunlaşmamış B hücresi üretilmesine rağmen olgun B hücrelerinin sayısı sabit kalır. Bunlardan sadece yüzde üçü olgun B hücrelerinin havuzuna girer. Periferik B hücre bölmesinin büyüklüğü, kısmen kendi kendine reaktivite ve eksik olgunlaşma dahil olmak üzere çeşitli faktörler nedeniyle hücre ölümü ile kısıtlanır16,17,18. Akış sitometrik analizi, insanlarda ve farelerde birçok bağışıklık hücresi alt bölmesini karakterize etmek ve numaralandırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. İnsan ve murine B hücre bölmeleri arasında bazı benzerlikler olsa da, bu protokol sadece murine B hücrelerinin analizi için geçerlidir. Bu protokol, genetik manipülasyonun B hücre gelişimini değiştirip değiştirmeyeceğini belirlemek için genetik olarak tasarlanmış fareleri fenotipleme amacıyla geliştirilmiştir. Akış sitometrisi, hücre aktivasyonu, fonksiyon, çoğalma, döngü analizi, DNA içerik analizi, apoptoz ve hücre sıralama 19,20'yi ölçmek de dahil olmak üzere birçok ek uygulamada çok popüler olmuştur.
Akış sitometrisi, dalak, BM ve kan gibi karmaşık organlar da dahil olmak üzere farelerde ve insanlarda çeşitli lenfosit bölmelerini karakterize etmek için tercih edilen araçtır. Akış sitometrisi için yaygın olarak bulunan fareye özgü antikor reaktifleri nedeniyle, bu teknik sadece hücre yüzey proteinlerini değil, aynı zamanda hücre içi fosfoproteinleri ve sitokinleri ve fonksiyonel okumaları araştırmak için de kullanılabilir21. Burada, akış sitometri reaktiflerinin ikincil lenfoid organlarda olgunlaştıkça ve farklılaştıkça B hücreleri alt kümelerini tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Boyama koşullarının optimizasyonu, numune işleme, doğru cihaz kurulumu ve veri toplama ve son olarak veri analizinden sonra, farelerdeki B hücre bölmesinin kapsamlı akış sitometrik analizi için bir protokol kullanılabilir. Bu tür kapsamlı analizler, Gelişmekte olan BM B-2 hücrelerinin B220, CD43, BP-1, CD24, IgM ve IgD22 ifadelerine bağlı olarak farklı fraksiyonlara (Fraksiyon) ayrılabileceği Hardy ve meslektaşları tarafından tasarlanan onlarca yıllık bir isimlendirmeye dayanmaktadır. Hardy ve ark., B220+ CD43 BM B hücrelerinin BP-1 ve CD24 (30F1) ekspresyerine dayanarak dört alt kümeye (Fraksiyon A-C') bölünebileceğini, B220+ CD43-(sönük ila neg) BM B hücrelerinin igd ve yüzey IgM23'ün farklı ifadesine dayanarak üç alt kümeye (Fraksiyon D-F) çözülebileceğini göstermiştir. Kesir A (B öncesi hücreler) BP-1- CD24 (30F1)-, Kesir B (erken B öncesi hücreler) BP-1- CD24 (30F1)+, Fraksiyon C (geç pro-B hücreleri) BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraksiyon C' (erken B öncesi hücreler) ise BP-1+ ve CD24high olarak tanımlanır. Ayrıca, Kesir D (B öncesi hücreler) B220+ CD43- IgM- B hücreleri, Kesir E (yeni oluşturulan B hücreleri, olgunlaşmamış ve geçiş kombinasyonu) B220+ CD43- IgM+ B hücreleri ve Fraksiyon F (olgun, yaslanan B hücreleri) B220high CD43- IgM+ B hücreleri olarak tanımlanır. Buna karşılık dalakta bulunan naif B hücrelerinin çoğunluğu CD93, CD23 ve IgM ekspresyonuna bağlı olarak olgun (B220+ CD93-) B hücrelerine ve geçiş (T1, T2, T3) hücrelere ayrılabilir. Olgun B hücreleri, IgM ve CD21/CD35 ekspresyonuna göre marjinal bölge ve foliküler alt kümelere çözülebilir ve foliküler alt kümeler, IgM ve IgD yüzey ekspresyonlarının seviyesine bağlı olarak olgun foliküler tip I ve foliküler tip II B hücre alt kümelerine ayrılabilir24. Bu dalak B hücre popülasyonları ağırlıklı olarak Igφ ışık zincirini ifade eder. Son olarak, fetal karaciğerden kaynaklanan ve esas olarak yetişkin farelerin periton ve plevral boşluklarında bulunan B-1 B hücre popülasyonları literatürde tanımlanmıştır. Bu periton B hücreleri, CD23 ekspresyonu eksikliği ile daha önce tanımlanmış B-2 B hücrelerinden ayırt edilebilir. Daha sonra B-1a veya B-1b popülasyonlarına ayrılırlar, birincisi CD5'in varlığı ve ikincisi yokluğu25 ile tanımlanır. B-1 hücreli atalar fetal karaciğerde bol miktarda bulunur, ancak yetişkin BM'de bulunmaz. B-1a ve B-1b hücreleri farklı progenitörlerden kaynaklanırken, her ikisi de periton ve plevral boşlukları tohumlar24. B-2 hücrelerinin aksine, B-1 hücreleri benzersiz bir şekilde kendini yenileyebilir ve doğal IgM antikorlarının üretiminden sorumludur.
B hücre gelişimindeki kusurlar, BCR26,27 bileşenlerindeki eksiklikler, BCR sinyal gücünü etkileyen sinyal moleküllerinin pertürbasyonları14,28,29 veya B hücre sağkalımını modüle eden sitokinlerin bozulması dahil olmak üzere birçok durumda ortaya çıkabilir30,31 . Lenfoid bölmelerin akış sitometri analizi, bu farelerde ve diğer birçok kişide B hücre gelişim bloklarının karakterizasyonuna katkıda bulunmuştur. Lenfoid bölmelerin akış sitometrik analizinin bir avantajı, canlı ayrışmış dokudan elde edilen tek tek hücreler üzerinde ölçüm yapma yeteneği sunmasıdır. Reaktiflerin sürekli genişleyen bir florofor aralığında bulunması, birden fazla parametrenin eşzamanlı olarak analizini sağlar ve B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, B hücrelerinin akış sitometrik analizi ile numaralandırılması, lenfoid organlarda hücre lokalizasyonunu görselleştiren immünhistokimya yöntemleri, dolaşımdaki antikor seviyelerinin humoral bağışıklık ölçüsü olarak tespiti ve B hücre yanıtlarını gerçek uzay ve zamanda ölçmek için iki foton mikroskopisi gibi diğer immünolojik tahlilleri tamamlar32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fare çalışmaları Regeneron'un Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından denetlendi ve onaylandı. Deney, Jackson Laboratuvarları'ndan üç C57BL/6J dişi fareden (17 haftalık) dokular üzerinde yapıldı. İdeal konsantrasyonu belirlemek için deneye başlamadan önce tüm antikorları titratın. Tek renk telafisi için kompanzasyon boncukları kullanırken, numunelerinizden daha parlak veya parlak lekeler aldıklarından emin olun. Tüm tamponları, antikorları ve hücreleri buzda veya 4 °C'de tutun. Canlılık boyasının eklenmesinden sonra, tüm adımları ve inkübasyonları 4°C'de düşük ışıkta veya karanlıkta gerçekleştirin.
1. Periton hücre hasadı ve tek hücre izolasyonu
- Fareyi CO2 kullanarak veya onaylanmış protokole göre ötenazi.
- Fareyi sırtına yatırın,% 70 etanol ile püskürtün ve peritonları kesmemeye dikkat derek dış karın derisini makasla kesin.
- 25 kalibrelik iğne ile donatılmış 3 mL şırınga ile periton boşluğuna 3 mL buz gibi yıkama tamponu (DPBS'de %0,5 sığır serum albümini (BSA) enjekte edin.
- Peritona parmak uçlarıyla hafifçe masaj yapın.
- 1.3 ve 1.4.
- Organları ve yağları önlemek için dikkatli olarak peritondan 18 G iğne ile donatılmış 3 mL şırınga yerleştirin.
- Şimdi periton hücreleri içeren yıkama tamponu çıkarın ve buz üzerinde 15 mL konik tüpe aktarın.
- 1.3 ve 1.4.
- Cımbızla tutarken peritonda küçük bir delik açın.
- Deliğe tek kullanımlık bir transfer pipet yerleştirin ve kalan yıkama tamponu toplayın, bir kez daha yağ ve organlardan kaçının.
- Toplanan periton hücrelerini buz üzerindeki 15 mL konik tüpe aktarın.
NOT: Kan kirlenmesi belirginse numuneyi atın. - Dalak ve kemik ekstraksiyonu tamamlanana kadar hücreleri buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Üst sıraları aspire edin.
- Hücre peletini 1 mL yıkama tamponunda yeniden dirildi.
- Hücreleri 70 μM hücre süzgecinden buz üzerinde temiz bir 15 mL konik tüpe filtreleyin.
- Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirleyin.
2. Dalak hasadı ve tek hücre izolasyonu
- Fareyi karnına yatırın ve temiz makas kullanarak sol arka taraftaki peritonları kesin. Dalağını kesin, yağ ve bağ dokusunu çıkarın.
- Dalağını buz üzerinde 1 mL yıkama tamponu içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Kemik çıkarma işlemi tamamlanana kadar dalağını buzda kuluçkaya yatır.
- Dalağını 5 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponu ile otomatik ayrışma tüpüne taşıyın. Tüpü doku ayrıştırıcı cihazına yerleştirin ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için 60 sn ayrışın.
NOT: Yıkama tamponunda buzlu cam slaytlar arasında parçalama gibi tek hücreli dalak süspansiyonları elde etmek için diğer rutin yöntemlerin kullanılmasına da izin verilir. Başka bir ayrışma yöntemi kullanılırsa, 2.5 adımına devam etmeden önce santrifüjleme, aspirasyon ve ardından 5 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponunda resüspensiyon ile ayrışma izleyin. - Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
- 2mM EDTA içeren 10 mL 4 °C yıkama tamponu ekleyin.
- Temiz bir 15 mL konik tüpe aktarın.
- Hücreleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Üst sıraları aspire edin.
- Hücre peletini 5 mL 4 °C yıkama tamponunda yeniden sakla.
- Hücreleri 70 μM hücre süzgecinden buz üzerinde temiz bir 15 mL konik tüpe filtreleyin.
- Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirleyin.
3. BM hasadı ve tek hücre izolasyonu
- Cildi fare gövdesinin alt yarısından çıkarın. Bacaktan fazla kası kesin. Uyluk kemiğini kesmemeye dikkat derek tüm bacağı makasla çıkarın. Kalan kas, yağ ve ayakları çıkararak uyluk kemiğini ve kaval kemiğini temizleyin.
- Kemikleri buz üzerinde 1 mL yıkama tamponu içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünün tabanını delin ve bacak kemiklerinin çıkıntı yapmaması için yeterince küçük bir delik bırakın. 0,5 mL'lik tüpü temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Femur ve kaval kemiği proksimal ucunu dizine kesin ve kesik uçları 0,5 mL'lik tüpe bakacak şekilde yerleştirin.
- Hücreleri 4 °C'de 2 dakika boyunca 6.780 x g'da santrifüj edin.
- Hücre peletini 1 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponunda yeniden dirildi ve ek 3 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponu içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatır.
- 2mM EDTA içeren 10 mL 4 °C yıkama tamponu ekleyin.
- Hücreleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Üst sıraları aspire edin.
- Hücre peletini 3 mL 4 °C yıkama tamponunda yeniden sakla.
- Hücreleri 70 μM hücre süzgecinden buz üzerinde temiz 15 mL konik tüpe filtreleyin.
- Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirleyin.
4. Hücreleri lekele ve telafi hazırla
- Her hayvandan 96 kuyu U alt plakasına kadar her hücre türünden Aliquot 106 hücresi.
- Tam leke, floresan eksi bir (FMO), el değmemiş ve son olarak kullanılan her florofor için isteğe bağlı tek renk telafisi de dahil olmak üzere tüm numuneler ve kontroller için yeterli kuyuları ekleyin.
- BM olgunlaşma paneli ve dalak olgunlaşma paneli için, her tam leke örneği için kuyu başına 106 hücre olmak üzere 2 kuyuya aliquot hücreleri. Tek renk telafisi canlılık kontrolleri için, tek tek kuyulara her hücre türünden 2 x 106 hücre ekleyin.
- Plakayı 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin. Kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.
- Hücreleri 200 μL DPBS'de (BSA veya FBS olmadan) yeniden biriktirin. Bu adım, amin reaktif canlılık boyası ile lekelemeden önce proteini çıkarmak için önemlidir.
- 4.2 ve 4.3.
- 4.2. adımı yineleyin.
- DPBS'de 1:1.000 seyreltilmiş 100 μL canlılık boyasında hücreleri yeniden biriktirin.
NOT: Hücreleri tek renk telafisi için kullanıyorsanız, bu kuyulara canlılık boyası eklemeyin.- Her leke seti için, tamamen yersiz bir örnek ve ihtiyacınız olabilecek diğer kontroller için birkaç lekesiz kuyu bırakın.
- Her leke seti için, uygulanabilirlik FDO kontrolü için ek bir bozulmamış kuyu bırakın.
- Tek renkli canlılık telafisi kontrolleri için: 4.1 adımda aliquoted 2 x 106 hücrelerini 200 μL seyreltilmiş canlılık boyasında yeniden biriktirin. 100 μL hücreyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne, ısı hücrelerini 65 °C'de 5 dakika ısıtın ve 100 μL ısıdan ölen hücreleri kalan 100 μL canlı hücrelerle orijinal kuyuya geri aktarın.
- Hücreleri 4 °C'de kuluçkaya yatır, ışıktan korunarak 30 dakika boyunca.
- Plakayı 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin. Kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.
- Hücreleri 200 μL DPBS'de (BSA veya FBS olmadan) yeniden biriktirin.
- 4.8 ve 4.9.
- 4.8. adımı yineleyin.
- Hücreleri 50 μL Fc bloğunda 1:50 (son konsantrasyon=10 μg/mL) leke tamponunda (DPBS'de %0,5 BSA [vol/vol]) yeniden kullanın.
- Periton hücreleri için - ayrıca spesifik olmayan lekelenmeyi azaltmak için 5 μL monosit bloker ekleyin.
- Hücreleri 4 °C'de, ışıktan korunarak 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 106 hücre başına 100 μl'lik son hacim için leke tamponunda tam leke ana karışımları ve IPO'lar hazırlayın. Antikor listeleri için Tablo 1-Tablo 4'e bakın.
NOT: IPO'lar, biri hariç tüm antikorlar bir leke setine dahil sunularak yapılır. Bir leke kümesindeki her antikor için bir FDO hazırlayın. Bir leke seti birden fazla parlak boya içerdiğinde, numune başına leke tamponu için 50 μL parlak leke tamponu değiştirin - Fc bloğunu çıkarmadan, seçilen kuyulara 100 μL tam leke karışımları ve IPO'lar ekleyin.
- Bir leke kümesindeki her antikor için tek renk kompanzasyon kontrolleri hazırlayın.
- Kompanzasyon boncukları kullanılıyorsa, üretim kullanım talimatlarını izleyin.
- Hücreleri kullanıyorsanız, daha önce 4.6.1 adımında canlılık boyası olmadan ayrılmış 106 hücreye 100 μL leke tamponunda titratlı antikor ekleyin. Numunedeki tüm hücreler belirli bir işaretleyici için pozitifse, akış sitometresinde kompanzasyon verileri elde edilirken kullanılacak lekesiz hücreleri bir kenara bırakın.
- Hücreleri ve boncukları ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakayı 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin. Kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.
- Hücreleri ve boncukları 200 μL leke tamponunda yeniden biriktirin.
- 4.18 ve 4.19 adımlarını iki kez yineleyin.
- 4.18.
- Analiz için numuneleri 48 saat içinde sabitlemek için, DPBS'de %2 paraformaldehitin 200 μL'sinde hücreleri ve boncukları yeniden biriktirin.
DİkKAT: Parafomaldehit ciddi bir sağlık tehlikesidir ve yanıcıdır. Kullanmadan önce Safty Veri Sayfası'na bakın. - Hücreleri ve boncukları ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- 4.18 ve 4.19 adımlarını iki kez yineleyin.
- Temiz bir 96 kuyu U-alt plaka üzerine bir filtre plakası yerleştirin. Çoklu pipet kullanarak, her numuneyi filtre plakasının bir kuyusuna aktarın.
- Filtre plakasını santrifüjleyin-96 kuyu U-alt plaka kurulumu 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika boyunca. Filtre plakasını çıkarın ve kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.
- BM ve dalak olgunlaşma panelleri için tamamen lekeli hücreleri 100 μL leke tamponunda yeniden biriktirin. Her hayvan için 2 kuyuyu 1 kuyuda birleştirin. Kalan panelleri, IPO'ları ve kontrolleri 200 μL leke tamponunda yeniden dirileyin.
- Sabit hücreleri ve boncukları 4 °C'de kuluçkaya yatırın, ışıktan bir gecede korunmaktadır.
5. Akış sitometrik veri toplama
- Üretici talimatlarına göre akış sitometresini başlatın ve QC' ye edin.
- Her panele özgü şablonu yükleyin.
- Verileri kaydetmeden önce, her örnek için tüm olayların ölçek üzerinde olduğundan ve nokta çizimlerinde görünür olduğundan emin olun.
- Adım 4.16'da hazırlanan tek leke kompanzasyonlarını kullanarak her leke paneli için telafi kontrollerini kaydedin. Her örnek için pozitif ve negatif kapılar ayarlayın. Yazılımın ücret matrisini hesaplamasını salayın.
- İlk örneği almaya başlayın ve kapıların uygun şekilde ayarlandığından emin olun.
- Makineyi periton B hücre paneli ve dalak Igφ ve Igφ paneli için en az 50.000 B hücre olayını kaydedecek şekilde ayarlayın; BM olgunlaşma paneli için 150.000 B hücre olayı; ve dalak olgunlaşma paneli için 300.000 B hücre olayı.
- Her leke paneli için, her hayvan için tamamen lekeli örnekleri, lekelenmemiş bir örneği ve IPO'ları çalıştırın ve kaydedin.
6. Verileri analiz edin
- Akış sitometri analiz yazılımını kullanarak veri analizine devam edin. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3,Şekil 4'te özetlenen gating stratejilerini izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada fare periton, BM ve dalak B hücre gelişimini karakterize etmek için gating stratejisini sunuyoruz. Analizin temeli canlı boya ile boyama kavramı etrafında oluşur, daha sonra İleri-Dağılım Alanı (FSC-A) ve İleri-Dağılım Yüksekliğine (FSC-H) dayalı çiftleri dışarı çıkarmak ve son olarak hücreleri FSC-A ve Yan Dağılım Alanı (SSC-A) özelliklerine göre seçerek kalıntıların gating' i, burada göreli hücre boyutunu ve hücre ayrıntı düzeyini yansıtan boyut kapısı olarak adlandırılır, ilgi çekici nüfusa kapılmadan önce.
PeritonEal B hücrelerinin akış sitometrik analizi, Tablo 1'de özetlenen bir boyama paneli kullanarak, uygulanabilir periton hücrelerinin, toplam B hücrelerinin, B-1 ve B-2 alt kümelerinin yanı sıra C57BL/6J farelerdeki B-1a ve B-1b hücrelerinin frekanslarını göstermektedir (Şekil 1). Bu frekansların ortalama mutlak hücre sayısı Tablo 5'te gösterilmiştir. B-1 hücrelerindeki pertürbasyonlar, hücre alt kümelerinin hücre frekansına veya fare başına mutlak hücre sayısına göre dağılımıyla tanımlama yapılabilir.
BM B hücrelerinin akış sitometrik analizi uygulanabilir BM hücrelerinin frekanslarını gösterir, toplam B hücreleri, Kesir A (B öncesi hücreler ve kontamine lenfositler), pre-pro-B hücreleri, Fraksiyon B, Fraksiyon C, Kesir C', Kesir D, olgunlaşmamış (Kesir E'de alt küme), geçiş (Kesir E'de alt küme) ve C57BL/6J farelerde Fraksiyon F B hücreleri (Şekil 2), Tablo 2'de özetlenen bir boyama paneli kullanılarak. Bu frekansların ortalama mutlak hücre sayısı Tablo 6'da gösterilmiştir. BM B hücrelerindeki pertürbasyonlar, hücre alt kümelerinin hücre frekansı veya bacak başına mutlak hücre sayısına göre dağılımı ile tanımlama yapılabilir.
Dalak B hücrelerinin akış sitometrik analizi, canlı dalak hücrelerinin frekanslarını gösterir, toplam B hücreleri, geçiş B hücreleri, T1, T2, T3 hücreleri, olgun B hücreleri, foliküler I hücreleri (Fol I), foliküler II (Fol II) hücreleri, marjinal bölge (MZ) öncü hücreleri, olgun MZ hücreleri ve C57BL/6J farelerde B-1 hücreleri (Şekil 3), Tablo 3'te özetlenen bir boyama paneli kullanılarak. Bu frekansların ortalama mutlak hücre sayısı Tablo 7'de gösterilmiştir. Dalak B hücrelerindeki pertürbasyonlar, hücre alt kümelerinin hücre frekansı veya dalak başına mutlak hücre sayısı ile dağılımı ile tanımlama yapılabilir.
Benzer şekilde, dalak akış sitometrik analizi, Tablo 4'te özetlenen bir boyama paneli kullanarak C57BL/6J farelerdeki Igφ+ ve Igφ+ B hücrelerinin frekanslarını göstermektedir (Şekil 4). Bu frekansların ortalama mutlak hücre sayısı Tablo 8'de gösterilmiştir. Igφ+ ve Igφ+ B hücrelerindeki pertürbasyonlar, hücre alt kümelerinin hücre frekansı veya dalak başına mutlak hücre sayısına göre dağılımı ile tanımlama yapılabilir.
| Antikor | Florofor | Klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | S7 |
| CD23 | BUV395 | B3B4 |
| CD11b | BV711 | M1/70 |
| CD5 | BV605 | 53-7.3 |
Tablo 1: Periton B Hücre Paneli
| Antikor | Florofor | Klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | 1B11 |
| CD24 (HSA) | PE | 30-F1 |
| C-Kiti | BUV395 | 2B8 |
| BP-1 | BV786 | BP-1 |
| CD93 | BV711 | AA4.1 |
| döküm kanalı | ||
| CD3 | AF700 | 17-A2 |
| CD11b | AF700 | M1/70 |
| GR1 (Ly6C/6G) | AF700 | RB6-8C5 |
| Ter119 | AF700 | TER-119 |
Tablo 2: Kemik İliği Olgunlaşma Paneli
| Antikor | Florofor | Klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | S7 |
| CD23 | BUV395 | B3B4 |
| CD21/35 | BV421 | 7G6 |
| CD11b | AF700 | M1/70 |
| CD5 | BV605 | 53-7.3 |
| CD93 | PE | AA4.1 |
Tablo 3: Dalak Olgunlaşma Paneli
| Antikor | Florofor | Klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD3 | PB | 17-A2 |
| Kappa | FITC | 187.1 |
| Lambda | PE | RML-42 |
Tablo 4: Dalak Igφ ve Igφ Paneli
Şekil 1: Peritondaki B hücre popülasyonlarının karakterizasyonu. Uygulanabilir, tek hücreli, boyut kapılı periton B hücreleri ilk olarak IgM+ hücrelerine gating yapılarak kontamine hücrelerden ayrılır. B-1 ve B-2 hücreleri daha sonra yokluk (B-1) veya CD23 (B-2) varlığı ile birbirinden ayırt edilir. Sonraki CD5 ifadesi, B-1a hücrelerini (CD5+) B-1b hücrelerinden (CD5-) tanımlamak için kullanılır. FMO'lar kapıların nereye çizileceğine ampirik olarak belirlemek için kullanıldı. Sayılar, aynı yoğunluk grafiği içindeki her popülasyonun yüzdeleridir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BM'de B hücre alt kümelerinin karakterizasyonu. Uygulanabilir, tek hücreli, boyut kapılı BM B hücreleri B220+ dump- (dökümün CD3/GR-1/CD11b/TER119 anlamına geldiği) hücrelerin üzerine kapılarak B olmayan hücrelerden ayrılır. CD43 ve B220 ifadesi ayrıca Hardy Fraction A-C' (CD43+ B220+) ve Hardy Fraction D-F (CD43low/neg B220+/++) tanımlar. Kesir A-C' bp-1 ve CD24 ifadesi ile daha da ayrılır. Kesir A (BP-1- CD24-), kontamine hücrelerle birlikte B öncesi hücrelere karşılık gelir. B öncesi hücreleri Kesir A'daki kontamine hücrelerden ayırmak için CD93 ifadesi ve CD19'un yokluğu kullanılır. Kesir B (BP-1- CD24int) ve Fraksiyon C (BP-1+ CD24int) sırasıyla erken ve geç B yanlısı hücrelere, Kesir C' (BP-1+/- CD24+) ise erken B öncesi hücrelere karşılık gelir. Kesir D-F'yi ayırmak için IgM ve IgD ifadesi kullanılır. Kesir D, geç B öncesi hücrelere karşılık gelir (IgM-/düşük IgD-); Kesir E (mavi kapı, IgMint/yüksek IgD-) hem olgunlaşmamış (Imm, IgMint IgD-) hem de geçiş (Tran, IgMhigh IgD-) B hücrelerine; ve Olgun B hücrelerinin devridaimine F Fraksiyonu (IgMint/yüksek IgD+). FMO'lar kapıların nereye çizileceğine ampirik olarak belirlemek için kullanıldı. Sayılar, aynı yoğunluk grafiği içindeki her popülasyonun yüzdeleridir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Dalak B hücre olgunlaşmasının karakterizasyonu. Uygulanabilir, tek hücreli, boyut kapılı dalak B hücreleri B220+ hücrelere kapılanarak B olmayan hücrelerden ayrılır. B-1 alt kümesini tanımlamak için CD23- CD19+ hücreleri CD43 ekspresy ekspresyatı ile tanımlanır ve tanımlanır. B-2 popülasyonlarını sınıflandırmak için CD19+ hücreleri geçiş (CD93+ B220+) ve olgun (CD93- B220+) B hücrelerine ayrılır. Geçiş (CD93+ B220+) hücreleri daha çok T1 (IgM+ CD23-), T2 (IgM+ CD23+) ve T3 (IgMint CD23+) popülasyonlarına ayrılır. Olgun (CD93- B220+) hücreler marjinal bölgeye (CD21/35+ IgM+) ve foliküler (CD21/35int IgMint/+) B hücrelerine ayrılır. CD23 ifadesi, MZ öncül (CD23+ B220+) hücrelerini daha olgun MZ (CD23- B220+) hücrelerinden ayırmak için daha fazla kullanılır. Foliküler popülasyonlar daha sonra Fol I (IgD+ IgMint) ve Fol II (IgD+ IgM+) hücrelerine ayırır. FMO'lar kapıların nereye çizileceğine ampirik olarak belirlemek için kullanıldı. Sayılar, aynı yoğunluk grafiği içindeki her popülasyonun yüzdeleridir Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Dalak B hücrelerinin Igφ ve Igφ ekspresy. Uygulanabilir, tek hücreli, boyut kapılı dalak B hücreleri B220+ CD3- hücrelerine kapılarak B olmayan hücrelerden ayrılır. B hücreleri daha sonra Igφ ve Igφ ifadesi ile ayırt edilir. Sayılar, aynı yoğunluk grafiği içindeki her popülasyonun yüzdeleridir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Mutlak Hücre Numarası | |||||
| Hayvan Numarası | Uygulanabilir periton hücreleri | B hücreleri | B-1a hücreleri | B-1b hücreleri | B-2 hücreleri |
| 1 | 1.02E+07 | 4.67E+06 | 1.28E+06 | 8,95E+05 | 2.35E+06 |
| 2 | 9.92E+06 | 4.52E+06 | 1.49E+06 | 9.60E+05 | 1,91E+06 |
| 3 | 1.15E+07 | 4.56E+06 | 1.71E+06 | 9.19E+05 | 1.78E+06 |
| Ortalama | 1.05E+07 | 4.58E+06 | 1.49E+06 | 9.25E+05 | 2.01E+06 |
Tablo 5: Periton B Hücre Alt Kümelerinin Mutlak Hücre Sayıları
| Mutlak Hücre Numarası | |||||||||||
| Hayvan Numarası | Uygulanabilir kemik iliği hücreleri | B hücreleri | Kesir A | Pro Öncesi | Kesir B | Kesir C | Kesir C' | Kesir D | Olgunlaşmamış | Geçiş | Kesir F |
| 1 | 5.05E+07 | 9.70E+06 | 1.13E+06 | 1.95E+05 | 2.22E+05 | 9.14E+04 | 6.31E+05 | 1.59E+06 | 4.56E+05 | 7.81E+05 | 4.03E+06 |
| 2 | 5.39E+07 | 1.03E+07 | 1.14E+06 | 2.29E+05 | 2.89E+05 | 1.22E+05 | 8.40E+05 | 2.11E+06 | 5.39E+05 | 8.07E+05 | 3.67E+06 |
| 3 | 5.93E+07 | 1.01E+07 | 1.10E+06 | 2.12E+05 | 2.84E+05 | 1.05E+05 | 9.02E+05 | 2.72E+06 | 5.94E+05 | 7.62E+05 | 2.59E+06 |
| Ortalama | 5.46E+07 | 1.00E+07 | 1.12E+06 | 2.12E+05 | 2.65E+05 | 1.06E+05 | 7.91E+05 | 2.14E+06 | 5.29E+05 | 7.83E+05 | 3.43E+06 |
Tablo 6: Kemik İliği B Hücre Alt Kümelerinin Mutlak Hücre Sayıları
| Mutlak Hücre Numarası | ||||||||||||
| Hayvan Numarası | Uygulanabilir Dalak Hücreleri | B hücreleri | Geçiş B hücreleri | T1 hücreleri | T2 hücreleri | T3 hücreleri | Olgun B hücreleri | Foliküler I hücreleri | Foliküler II hücreler | Öncü marjinal bölge hücreleri | Olgun marjinal bölge hücreleri | B-1 hücreleri |
| 1 | 9.16E+07 | 4.61E+07 | 3.66E+06 | 1.55E+06 | 1.10E+06 | 7.16E+05 | 4.06E+07 | 2.39E+07 | 5.27E+06 | 2.17E+06 | 3.98E+06 | 8.83E+05 |
| 2 | 9,97E+07 | 5.18E+07 | 4.88E+06 | 1.97E+06 | 1.57E+06 | 1.00E+06 | 4.49E+07 | 2.68E+07 | 7.33E+06 | 3.42E+06 | 3.84E+06 | 8.15E+05 |
| 3 | 1.02E+08 | 5.34E+07 | 4.64E+06 | 1.98E+06 | 1.41E+06 | 8.54E+05 | 4.62E+07 | 2.81E+07 | 5.84E+06 | 3.58E+06 | 4.02E+06 | 1.01E+06 |
| Ortalama | 9.77E+07 | 5.04E+07 | 4.39E+06 | 1.83E+06 | 1.36E+06 | 8.58E+05 | 4.39E+07 | 2.63E+07 | 6.15E+06 | 3.06E+06 | 3.94E+06 | 9.02E+05 |
Tablo 7: Dalak B Hücre Alt Kümelerinin Mutlak Hücre Numaraları
| Mutlak Hücre Numarası | ||||
| Hayvan Numarası | Canlı dalak hücreleri | B hücreleri | Igφ+ B hücreleri | Igφ+ B hücreleri |
| 1 | 9.16E+07 | 4.97E+07 | 4.51E+07 | 2.46E+06 |
| 2 | 9,97E+07 | 5.63E+07 | 5.08E+07 | 3.16E+06 |
| 3 | 1.02E+08 | 5,91E+07 | 5.33E+07 | 3.24E+06 |
| Ortalama | 9.77E+07 | 5.50E+07 | 4.97E+07 | 2,95E+06 |
Tablo 8: Igφ ve Igφ B Hücre Alt Kümelerinin Mutlak Hücre Sayıları
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lenfoid ve lenfoid olmayan dokuların akış sitometrik analizi, 1980'lerden beri farelerde ve insanlarda B hücre alt popülasyonlarının eşzamanlı tanımlanmasını ve numaralandırmasını sağlamıştır. Mizahi bağışıklığın bir ölçüsü olarak kullanılmıştır ve B hücre işlevselliğini değerlendirmek için daha fazla uygulanabilir. Bu yöntem, nadir popülasyonlarda bile B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlayan birden fazla parametrenin eşzamanlı analizi yoluyla farelerde ve insanlarda B hücre olgunlaşmasının farklı aşamalarını değerlendirmek için reaktif kullanılabilirliğinden yararlanır. Karmaşık heterojen örnekleri ölçmek için kullanılırsa, alt popülasyonları dakikalar içinde, tek tek hücrelerde tespit edebilir33. Akış sitometrik analizine en sık uygulanan sıralı gating analizi stratejisi, belirli bir popülasyon tanımlandığında basit ve sezgisel olabilir34. Son olarak, akış sitometrisinin bir başka avantajı, deneyimli kullanıcıların rehberliğindeyken, çoğu akademik laboratuvarda kolayca uyarlanabilir olmasıdır. Protokolümüz, B-1 popülasyonlarını tanımlayarak ve numaralandırarak ve B-2 pro-B hücrelerinin, B öncesi hücrelerin, olgunlaşmamış, geçiş ve olgun B hücrelerinin yanı sıra Igφ veya Igφ ışık zincirlerinin yüzey ekspresyonunu araştırarak farelerin peritonu, BM ve dalaklarındaki B hücre popülasyonlarının değerlendirilmesini başarıyla açıklar. Akış sitometrisi, farelerde B hücre gelişimini araştırırken en yaygın kullanılan ve uygulanması en kolay yöntemdir.
Akış sitometrisi paha biçilmez veriler üretirken, bağışıklık B hücre bölmesinin heterojenliğini araştırmak için kullanıldığında bu teknolojinin bazı sınırları vardır. 10 renk boyama, 1.024'ten fazla farklı hücre popülasyonunun tanınmasına izin verdiğinden büyük veri kümeleri ezici olabilir34. Yaygın olarak kullanılan bazı lenfoid hücre belirteçlerinin başlangıçta düşünülenden daha az spesifik olduğunu kanıtladığını göz önünde bulundurmak gerekir. Bu, istenen popülasyonlar üzerinde gating tespit etmek için çok sayıda hücre yüzeyi işaretleyicisi kullanılarak çözülebilir. Akış sitometrik analizi basit ve sezgisel olsa da, akış sitometrik analizinin bir başka kısıtlaması, genellikle aynı anda yalnızca iki parametrenin görselleştirilmesine izin verdiğidir, ancak t-SNE gibi veri görselleştirme araçları, yüksek parametre akış sitometrisi kullanırken hücre popülasyonlarını daha verimli bir şekilde kümelemek için kullanılabilir. Bir diğer önemli sınırlama, hem satın alma hem de analiz sırasında kullanılan kapıların bazen operatörün öznelliğine bağlı olmasıdır.
Bu protokolün başarılı bir şekilde uyarlanıp çoğaltılması için dikkate alınması gereken birkaç kritik parametre vardır35. Panel tasarımına ve florokrom seçimine dikkat edilmelidir. Loş veya önemli antijenleri parlak florokromlarla eşleştirmek zorunludur. Antikor titrasyonu, hücrelere spesifik olmayan aşırı antikor bağlanmasını önlemek, potansiyel olarak artan arka plan lekelenmesini ve çözünürlüğü azaltmak için yapılmalıdır. Antikor titrasyonu, en iyi ayırma indeksini belirlemek için bilinen sayıda hücrenin azalan antikor konsantrasyonlarıyla boyanmasıyla gerçekleştirilir36. Bu her antikor için tekrarlanmalıdır. Numune hazırlama ve boyama sırasında Ca++ ve Mg++ 'dan kaçınarak tek hücreli süspansiyon sağlamak önemlidir. Ek olarak, EDTA'nın eklenmesi, antikor aracılı stimilülasyona ve etiketli belirteçlerin içselleştirilmesine yol açabilecek hücre toplama ve enzimmatik aktiviteyi önlemeye yardımcı olabilir. Veri toplamadan önce, örneklerin düzgün bir şekilde askıya alınması, filtrelenmesi ve toplama içermemesi gerekir. Sinyalin bir parametreden diğerine dökülmesi, tek lekeli hücreler veya ticari olarak kullanılabilir kompanzasyon boncukları35 şeklinde kompanzasyon kontrolleri kullanılarak çözülür. Bir diğer önemli husus, her deneyde uygun kontrollere sahip olmaktır. Elde edilmeyen hücreler otomatik horlamanın temelini oluşturur. İzotip denetimleri artık spesifik olmayan bağlama nedeniyle gating için uygun denetimler olarak kabul edilmiyor. Doğru kapılar yapılmasına yardımcı haline getirmenin en önemli adımı FDO kontrollerinin kullanılmasıdır. Bir FDO kontrolünde, tüm konjuge antikorlar lekede bulunur. FDO kontrolleri, tüm floroforların eksik kanala yayılmasının ölçülmesini sağlar ve bu nedenle kapıların buna göre kurulmasına izin verir. Daha fazla doğruluk için yeterli hücrenin elde edilmiş olması önemlidir. Genel bir kural olarak, ilgi çekici nüfusun en az 2.000 olayı toplanmalıdır. Son olarak, boncuklar veya hücreler olsun, kompanzasyon kontrolleri, kullanılan florokromlarla tam olarak eşleşmeli ve kontroller en az deneysel örnekler kadar parlak olmalıdır37.
Genel olarak, B hücre bölmelerinin düşük sitometrik analizi immünoloji alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknik, hem vahşi tipte hem de genetiği değiştirilmiş farelerde, hastalık dışı durumlar altında ve immünolojik zorluk üzerine humoral bağışıklıktaki pertürbasyonları araştırmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar Regeneron Pharmaceuticals, Inc.'in çalışanları ve hissedarlarıdır.
Acknowledgments
Matthew Sleeman'a makaleyi eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz. Regeneron'daki Vivarium Operations and Flow Cytometry Core bölümlerine de bu araştırmayı desteklediğimiz için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).
