دينامية القياس والتصوير من الشعيرات الدموية، والشريين، و Pericytes في قلب الماوس
Summary
هنا هو بروتوكول لدراسة الأوعية الدقيقة التاجية في أنسجة القلب المورين الحية عن طريق مراقبة الجسم الحي السابق لضغط الأوعية الدموية وتدفق الشرايين التي تحافظ على الضغط ، وكذلك مكونات شجرة الأوعية الدموية بما في ذلك أسرة الشعيرات الدموية و pericytes ، كما يتم رص الشريان الحاجز وضغط.
Abstract
نبرة الشريان التاجي جنبا إلى جنب مع فتح أو إغلاق الشعيرات الدموية إلى حد كبير تحديد تدفق الدم إلى عضلة القلب في ضغط ضخ مستمر. ومع ذلك ، من الصعب مراقبة التغيرات الديناميكية في الشرايين التاجية والشعيرات الدموية في القلب كله ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى حركته وضربه دون توقف. هنا وصفنا طريقة تمكن من رصد معدل الضخ الشرياني والضغط والتغيرات في قطر الشرايين والشعيرات الدموية في عضلات البطين الأيمن الماوس. يتم قذف الشريان الحاجز الماوس و pered في تدفق مستمر أو الضغط مع غيرها يقاس بشكل حيوي. بعد التسريب مع الليكتين المسمى الفلورسنت (على سبيل المثال، اليكسا فلور-488 أو -633 المسمى القمح الجرثوم Agglutinin، WGA)، والشريول والشعيرات الدموية (وغيرها من السفن) في عضلة البطين الحق وصفح يمكن بسهولة صورة. ويمكن بعد ذلك قياس التغيرات في قطر السفينة في وجود أو عدم وجود تقلصات القلب. وعندما يتم التعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة وراثياً، يمكن رصد سمات محددة. على سبيل المثال، تم تصور pericytes في قلوب الماوس التي أعرب عن NG2-DsRed. وقد وفرت هذه الطريقة منصة مفيدة لدراسة الوظائف الفسيولوجية من بيريايري بيريكيت في القلب. كما أنها مناسبة لدراسة تأثير الكواشف على تدفق الدم في القلب عن طريق قياس قطر الأوعية الدموية / الشعيرات الدموية وضغط الشريان اللمعان في وقت واحد. هذا الإعداد، جنبا إلى جنب مع أحدث نظام التصوير البصري، يسمح للمرء أن دراسة تدفق الدم ورقابة على المستوى الخلوي والجزيئي في القلب في ظل ظروف شبه فسيولوجية.
Introduction
المناسبة تنظيم ضغط الشريان التاجي تدفق يضمن إمدادات كافية من الدم إلى القلب لتلبية مطالبها الأيضية1. ومع ذلك، إلا أنه أصبح من الواضح كيف يتم تنظيم تدفق الضغط التاجي بشكل حيوي في القلب، على الرغم من الدراسات المستفيضة التي أجريت في الجسم الحي وفي المختبر على مدى العقود الماضية. أحد الأسباب هو صعوبة في إنشاء نموذج عمل الفسيولوجية لمثل هذه الدراسات بسبب النبض المستمر للقلب. بغض النظر عن ذلك، تم وضع مجموعة متنوعة من الطرق لمراقبة الأوعية الدقيقة التاجية في الأنسجة الحية أو الحيوانات، ولكن أيا من هذه الأساليب كانت قادرة على تحقيق التركيز ثابت / مستقر وقياسات الضغط والتدفق وقطر الأوعية الدموية الدقيقة في نفس الوقت2،3. تم تقديم التصور المباشر لأوعية الشرايين التاجية الدقيقة في القلب النابض منذ عقود4،3، ولكن قياسات القطر في الأوعية الصغيرة كانت صعبة وكانت الوظائف المحددة للعديد من أنواع الخلايا المتخصصة المرتبطة بالدوران المجهري أمرًا صعبًا بنفس القدر. حتى طريقة stroboscopic ونظام الهدف العائمة لا يمكن أن توفر المعلومات المذكورة أعلاه في وقت واحد5. ومع ذلك، تم الحصول على كمية كبيرة من المعلومات القيمة باستخدام التكنولوجيات المذكورة أعلاه، والتي ساعدتنا على فهم المزيد حول تنظيم تدفق الدم التاجي6. الطريقة التي نقدمها في هذه الورقة سوف تساعد على التحقيق في المرء وفهم بالتفصيل كيف مكونات الشرايين التاجية, الشرايين وvavasculature تستجيب بشكل مختلف للتحفيز والمطالب الأيضية.
وقد بني نموذج العمل الذي أنشأناه لمتابعة هذه الدراسات على العمل السابق لWesterhof وآخرون2. بعد تحبيب الشريان الحاجز لقلب الماوس ، تم استخدام محلول ملحي فسيولوجي لضخ هذا الشريان للحفاظ على myocytes ومكونات أخرى من أنسجة القلب مغذية. تم رصد ضغط الانسياب الشرياني والتدفق وقطر الأوعية الدموية من بين الوظائف الفسيولوجية الأخرى باستخدام مؤشرات الفلورسنت المناسبة. هذه الطريقة تمكننا من تصور سريري الأوعية الدموية التاجية تحت الضغط الفسيولوجي في الأنسجة الحية ودراسة الآليات الخلوية الكامنة تحت تنظيم دوران الأوعية الدقيقة للمرة الأولى.
Protocol
Representative Results
Discussion
في العمل الحالي، قدمنا طريقة بسيطة بشكل ملحوظ ولكن عملية للغاية السابقين فيفو لدراسة دوران الأوعية الدقيقة التاجية في القلب في ظل ظروف فسيولوجية. تم تعديل هذه الطريقة من التحقيقات الميكانيكية باستخدامالفئران 2. وكانت إضافة تحديا تكنولوجيا التصوير مع سرعة عالية ودقة بصرية عا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل جزئيا مركز الهندسة والتكنولوجيا الطبية الحيوية؛ المعاهد القومية للصحة (1U01HL116321) و (1R01HL142290) وجمعية القلب الأمريكية 10SDG4030042 (GZ)، 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
