Summary
מוצג כאן פרוטוקול עבור מודל לולאה מודינמית מתוקנן במבחנה. מודל זה מאפשר לבדוק את תאימות ההמו-תאימות של צינורות זינג'ן או סטנטים של כלי דם בהתאם לתקן ISO (הארגון הבינלאומי לתקינה) 10993-4.
Abstract
במחקר זה, ההמו-תאימות של צינורות בקוטר פנימי של 5 מ"מ עשוי פוליויניל כלוריד (PVC) ומצופה בהתייחדות ביואקטיבית שונה הושווה צינורות PVC לא מצופים, צינורות לטקס, סטנט ליישום תוך-וסקולרי שהוצב בתוך צינורות PVC. הערכת ההמו-תואם נעשתה באמצעות מודל לולאה המודינמית במבחנה המומלץ על-ידי תקן ISO 10993-4. הצינורות נחתכו למקטעים באורך זהה ונסגרו כדי ליצור לולאות הימנעות כל פער בעצם, לאחר מכן מלא בדם אנושי והסתובב באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לאחר מכן, הדם בתוך הצינורות נאסף לניתוח של ספירת תאי דם שלמים, המוליסיס (המוגלובין פלזמה חינם), מערכת משלימה (sC5b-9), מערכת קרישה (פיברינופטיד A), והפעלת לוקוציט (אלסטאז פולימורפונונלי, גורם נמק גידול interleukin-6). הפעלת תא מארח נקבעה עבור הפעלת טסיות דם, מצב רשת לאוציטים וצבירות טסיות דם מונוציט באמצעות ציתימת זרימה. ההשפעה של סגירת לולאה לא מדויקת נבדקה עם מיקרו-תומר ממוגרפיה של קרני רנטגן וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, שהראו היווצרות טרומבוס בסוף התמוסס. צינורות לטקס הראו את ההפעלה החזקה ביותר של רכיבים פלזמה ותלתיים של הדם, המציין תאימות hemocompatibility עני, ואחריו קבוצת סטנט וצינורות PVC לא מפוספלים. צינורות PVC מצופה לא הראה ירידה משמעותית במצב הפעלת טסיות דם, אבל הראה עלייה במפל משלים קרישה בהשוואה צינורות PVC לא מצופה. מודל הלולאה עצמו לא הוביל להפעלת תאים או גורמים מסיסים, ורימת ההמוליזה הייתה נמוכה. לכן, המודל המוצג בלולאה המודינמית שהוצגה במבחנה מונע הפעלה מוגזמת של רכיבי דם על ידי כוחות מכניים ומשמש כשיטה לחקור אינטראקציות חוץית בין דם תורם ומכשירים רפואיים כלי דם.
Introduction
בדיקת תאימות Hemocompatibility של מכשירים רפואיים היא צעד מכריע בפיתוח של מכשירים חדשים כגון סטנטים וסקולריים או צינורות זביה עבור חמצון קרום חוץ ג'אנל. עד היום, מודלים של בעלי חיים נחשבים ככלים סטנדרטיים כדי לסיים את ההליך לבדיקת המכשירים הרפואיים לפני יישומם בבני אדם. מעתה ואילך, יש למצוא חלופה במודלים של מבחנה המסייעת עוד יותר בצמצום החקירות על בעלי חיים. במחקר זה, לכן, חקרנו מודל לולאה מיניאטורית במבחנה המודינמית. המטרה של שיטה זו שהוצגה היא לבדוק את תאימות הדם במבחנה של מכשירים רפואיים בהתאם לתקן ISO 10993-4.
תקן ISO 10993-4 מתאר קבוצות מתוקנת של פרמטרים קליניים שיש לחקור על דגימת דם1. בקצרה, אלה הם פקקת (צבירה טסיות דם וספירה), קרישה (fibrinopeptide A, FPA), ניתוח המטולוגי (ספירת תאי דם שלמים), מדד המוליזה (המוגלובין פלזמה חינם) ואת המערכת המשלים (משלים מסוף מורכב, sC5b9). עם זאת, סמנים נוספים, כגון אלסטאז פולימורפונונלי נויטרופיל (PMN), interleukin 6 (IL-6) וגורם נמק הגידול - אלפא (TNF) המשקף את מצב ההפעלה של leukocytes יכול גם להיות אחראי למדידות. כדי לקבוע ולכמת את החלבונים ללא תאים במחזור כי הם קיימים פלזמת דם, כריך אנזימטי מקושר immunosorbent (ELISA) מייצג שיטה קונבנציונלית ואמינהביותר 2,3. כמו כן, ניתן לכמת את הפנוטיפ ומצב ההפעלה של התאים המארחים (לדוגמה, לוקוציטים) על-ידי זיהוי ביטוי פני התא של מולקולות על-ידי ציתימטריה זרימה (FACS) המספקת קראות מבוססות מתלה תא יחיד, כאשר נוגדנים ספציפיים המסומנו פלואורסצנטים נקשרים למולקולות משטחהתא הממוקעות 4. סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) מומלץ גם לקבוע היווצרות תרומוס על החומר שנבדק על ידי ISO 10993-4תקן 1. שיטה זו יכולה להיות משלימה עם מיקרוטומוגרפיה רנטגן (μCT), כדי לבצע ניתוח מבני של thrombus למשל, עוביו, גודלו ולוקליזציה בתמונה מעובדת 3D5.
הרציונל מאחורי השימוש במודל זה במבחנה המודינמית הוא לסנן את הביצועים הטובים ביותר והתקנים רפואיים תואמים על ידי הבנת הדינמיקה הפיזיולוגית הבסיסית של רכיבי דם כגון טסיות דם, המעורבים hemostasis הראשי או לוקוציטים ואת האינטראקציה שלהם עם סוגים שונים של מכשירי כלי דם. מערכות במבחנה כאלה דורשות מאוד כפי שהם להפחית את הצורך במחקרים בבעלי חיים.
מודל הלולאה המוצג כאן ממלא דרישות אלה. מודל זה תואר לראשונה על ידי א.B צ'נדלר בשנת 1958 לייצור תרבי דם, ולכן, נקרא גםצ'נדלר לופ מודל 6. עד כה, מודל זה שימש בסדרה של ניסויים ושינויים כדי לחקור את תאימות הדם של מכשירים רפואיים7,8,9,10,11,12,13,14. הוא מורכב מצינורות פולימר, אשר מלאים חלקית בדם וצורה ללולאה re-closable. לולאות אלה מסתובבות באמבט מים מבוקר טמפרטורה כדי לדמות תנאי זרימת כלי דם עם השפעותיו הדימורולוגיות. שיטות חלופיות כגון דגמים מונחי משאבה או דגמים המשתמשים שסתומי כדור מכני בתוך הלולאות כדי לגרום זרימת דם בתוך צינורות פולימרכבר תוארו 15,16. עם זאת, היתרון הכולל של השיטה המוצגת כאן הוא כי הכוח המכני החל על תאי הדם וחלבונים הוא נמוך, הימנעות המוליזה, ואין מגע בין דם ומחברים, זה יכול להוביל מערבולות זרימה והפעלה של רכיבי דם. גורמי ההפעלה העיקריים בתוך הלולאה הם חומר הבדיקה עצמו והנודה שבפנים. זה עוזר למזער מקורות של מדידת שגיאה ולספק רבייה גבוהה, גם אם ממשק אוויר הדם יכול להוביל לפירוק חלבון17. ניתן גם לחקור זנים של חומרי צינור וקוטר סטנט ללא הגבלות אורך או גודל ובכך לאפשר שימוש בצינורות באורך שונים וקוטר פנימי. יתר על כן, ניתן גם לחקור את ההמו-תואם המארח על סגירת לולאה לא מדויקת וחשיפה למשטח הצינור הלא מגולל. יישומים רפואיים דומים אחרים של מודל זה במבחנה המודינמיקה לולאה היא שזה יכול לשמש גם כדי ללמוד את האינטראקציות בין immunotherapeutics (תרופות) ורכיבי דם במהלך או פיתוח פרה-קליני או הקרנת בטיחות סמים בודדים לפני הראשון באדם שלב I ניסוי קליני, או עבור הדור של חומר thrombus שניתן להשתמש בניסויים נוספים18,19,20.
מחקר זה מתאר פרוטוקול מפורט לבדיקת ההמו-תואם של צינורות זב ו/או סטנטים. כאן, ההשוואה בין צינורות PVC לא מצופים ומצופה (hepPVC: ציפוי הפרין, polyPVC: ציפוי עם פולימר ביואקטיבי). הפעלה נמוכה של טסיות דם, אבל הפעלה גבוהה יותר של מערכת קרישה (FPA) נמצאו עבור שני צינורות מצופים בהשוואה לצינורות לא מצופים. צינורות hepPVC המשמשים כאן משתנים עם הפרין קוולנטי כבול כדי להפוך אותם thromboresistant21 כבר מועסקים במודל לולאה כדי לייעל ולאפיין פרמטרים שונים22. צינורות polyPVC המשמשים במחקר זה הם צינורות זמינים מסחרית בשימוש בהגדרות קליניות של עירוי דם מחוץ גרב, מצופים פולימר הפרין כדי להפחית את הפקקתשלהם 23. לפעמים, ביישומים קליניים אפילו צינורות PVC לא מפוסל משמשים. לכן, כללנו צינורות לטקס כקבוצה בקרה חיובית שהראתה הפעלה מוגזמת של טסיות דם, מערכת קרישה, גורמים מסיסים כמו IL-6, TNF ו PMN elastase. היווצרות טרומבוס הבחינה כאשר סגירת לולאה לא מדויקת הייתה מדומה. זה הוביל להפעלה של קרישה ומערכת משלימה, כמו גם לוקוציטים וטסיות דם בהשוואה לתנאי הבסיס. יתר על כן, מגע דם לחומר סטנט בשימוש כאן (סטנט ניטינול מתכת חשופה, מכוסה פחמן ספוג פוליטטפלואורואתילן) הוביל טסיות דם גבוהות יותר והפעלת leukocyte במונחים של אלסטאז PMN. בסך הכל, המודל המוצג לא לגרום המוליזה בכל אחד מהתקני כלי הדם שנבדקו כפי שהם היו דומים לתנאים הבסיסיים או סטטיים, למעט צינורות לטקס, שם תא דם אדום (RBC) המוליזה היה ברור. יתר על כן, צינורות עירוי אלה ניתן לבחון או על ידי הדמיה או על ידי היפטולוגיה. למרות הערכות היסטולוגיות עשוי להיות אפשרי, התמקדנו בעיקר על ELISA וציטומיה זרימה לבצע ניסויים אלה ובכך לאפשר את ההתגלות של עריכת ניסויים בהתבסס על המודל המוצג כאן עבור מעבדות רבות. לפיכך, שיטה זו מייצגת שיטה אפשרית כדי לבדוק את תאימות הדם של מכשירים רפואיים כלי דם בהתאם להמלצות של תקן ISO 10993-4. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש בכל פעם אינטראקציה בין דם וחומרים צריך להיבדק בתנאי זרימה, מחקה את תנאי vivo.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של בית החולים האוניברסיטאי מגדבורג (בקשה מספר 88/18) והנבדקים סיפקו הסכמה מושכלת בכתב לפני הליך רישום הדם.
1. הכנת מניות הפרין ותדגמת דם
- חשב את כמות הדם הדרושה לכל הניסויים.
הערה: כמעט, 5 מ"ל של דם heparinized נדרש עבור כל מכשיר כלי דם בכפילויות (לולאות). כמו כן, 5 מ"ל של דם נדרש עבור כל מצב בסיסי וסטטי אשר נשמר בצד בטמפרטורת החדר. - הכן פתרון מלאי הפרין בריכוז של 100 IU/mL על ידי דילול הפרין שלא שנפרא (למשל, Rotexmedia) במים deionized. השתמש 150 μL של פתרון זה עבור heparinization של דם טרי 10 מ"ל.
- לחשב את כמות הדם, כמו גם פלזמה הדרושים לספירת תאי דם שלמים, ELISA ו FACS assays.
הערה: המדידות המיוצגות במחקר זה מתקבלות משתי לולאות הפועלות במקביל (אחת ככפילה) עם נפח דם כולל של 10 מ"ל. - בהתבסס על הכמות הנדרשת של דם, למלא מזרקים 10 מ"ל עם 150 μL של תמיסת מלאי הפרין כדי למנוע קרישה בדם עם ריכוז הפארין הסופי של דם 1.5 IU/mL.
- יש דם באמצעות פרפר (גודל: 21 גרם). מלא את המזרקים בעדינות רבה כדי למנוע המוליזה או הפעלת תאים בשל ואקום מוגזם.
הערה: יש לקבל אישור מוועדת האתיקה המקומית לפני תחילת הניסויים. קבל הסכמה מדעת מכל תורם דם אנושי. ודא כי תורם הדם הוא בריא ולא לוקח תרופות, במיוחד אין חומרים נגדplatelet או תרופות אנטי דלקתיות שאינן סטרואידיות לפחות 10 ימים לפני הניסויים. הערה, אותו תורם מועדף בעת השוואת סוגים שונים של מכשירי כלי דם בפעם הראשונה כפי שמוצג בכתב יד זה. כדי להעריך עוד יותר את ההבדלים הבין-אינדיבידואליים, ניתן לחזור על הפרוטוקול עם תורמים שונים. - לאסוף דם ב זכוכית, למנוע תסיסה מוגזמת.
2. בהרכבת לולאה המודינמית במבחנה
- ממלאים את אמבט המים עד שמפלס המים מגיע למרכז יחידת הסיבוב. הגדר את טמפרטורת המים ל-37°C.
- מכלול לולאה לבדיקת חומרי צינורות שונים (polyPVC, hepPVC, PVC ולטקס)
- חותכים שתי חתיכות באורך 50 ס"מ של כל חומר צינור (קוטר פנימי 5 מ"מ) עם חותך הצינור. ודא כי משטח החיתוך הוא שטוח, כמו זה חשוב במיוחד עבור סגירה מושלמת עבור לולאות עם קטרים קטנים, כך הדם זורם ללא כל עיוות על הקצה הולם.
הערה: פרוטוקול זה כולו משתמש בצינורות בקוטר פנימי של 5 מ"מ. - כדי להקל על הטיפול ולהימנע מהשהיה לאחר עיבוד לאחר הסבב, הפעל רק ארבע לולאות (2 חומרים בכפילויות) במקביל.
- כדי ליצור צורת לולאה, חבר את הסוף הפתוח של הצינורות לפיסה קצרה של צינור סיליקון המתאימה לקצר הפנימי של צינור החקירה.
- השתמשו בתחבושות המתח הפוליקרבונטיות כדי להבטיח סגירה נכונה של הלולאות. כאשר נעשה שימוש בפעם הראשונה, להתאים את אורך הלהקות כדי להתאים את הקוטר הפנימי של הלולאה על ידי חיתוך רצועה מתח עם מספריים באורך הנדרש ולאבטח אותו עם מפתח ברגים מומנט 3 מ"מ.
- הדק בזהירות את בורג הנעילה של מחבר רצועות המתח תחת בדיקה של סופי הצינור. כוונן את כוח הסגירה כך שלא יישאר פער בין סופי הצינור. אם בורג הנעילה מהודק לחלוטין והמתח של רצועה פוליקרבונט נראה נמוך מדי כדי לסגור את הפער בין סופי הצינור, לפתוח את הנעילה של המערכת ולחתוך כמה מ"מ של רצועה מתח. חזור על כך, עד להשגת סגירת לולאה מדויקת(איור 1A).
- אם חומר הצינורות רך מאוד ונוטה להחליק לתוך רצועות המתח, לתקן את הלולאה עם סרט חשמלי לרצועה מתח(איור 1B,C).
- הכן לולאה נוספת של PVC לבקרת טמפרטורה עם ממדים זהים לזה של לולאות הבדיקה.
- אבטחו את הלולאות בעריסה הלולאה של יחידת הסיבוב מחוץ לאמבט המים. לאחר מכן, לחבר את עריסת הלולאה ליחידת הסיבוב בתוך אמבט המים(איור 1E).
- לפרק את רצועה מתח חלקית מן הלולאות ולנתק קצה אחד של כל צינור כדי לפתוח את הלולאה.
- למלא בעדינות כל לולאה עם 5 מ"ל של דם עם פיפטה סרולוגית 5 מ"ל. מערבבים דם בעדינות פעמיים בשכבת הזכוכית על ידי התזת באיטיות למעלה ומטה לפני הטעינה לתוך הלולאות.
- קח את המדחום החד פעמי והניח אותו בתוך לולאת בקרת הטמפרטורה. אם המדחום גדול מדי, לחתוך אותו עם מספריים כדי להתאים צינורות קטנים יותר. מלאו את הלולאה ב-5 מ"ל של מים שהם דלים בטמפרטורת החדר.
- סגור את הלולאות ווודא אם הלולאות, רצועות המתח והמדף מותאמים כראוי.
- הגדר את מהירות הסיבוב ל- 30 סיבובים לדקה (סל"ד) וסובב למשך 3 שעות.
- חותכים שתי חתיכות באורך 50 ס"מ של כל חומר צינור (קוטר פנימי 5 מ"מ) עם חותך הצינור. ודא כי משטח החיתוך הוא שטוח, כמו זה חשוב במיוחד עבור סגירה מושלמת עבור לולאות עם קטרים קטנים, כך הדם זורם ללא כל עיוות על הקצה הולם.
- הרכבת לולאה לבדיקת ההשפעה של סגירת לולאה לא תקינה (פער)
- הכן ארבע לולאות (polyPVC) כמתואר ב- 2.2.
- סגור שתיים מהלולאות כראוי עם רצועות המתח ולהימנע מכל פער בין סופי הצינור.
- עבור שתי הלולאות האחרות לחבר את הסוף הפתוח לתוך הצינור גדול יותר כמתואר ב 2.2.3, אבל להשאיר פער של 1-2 מ"מ בין סיומת הלולאה. אין להשתמש ברצועות המתח עבור לולאות אלה(איור 1D).
- הכן לולאת בקרת טמפרטורה אחת כמתואר ב- 2.2.7 ו- 2.2.11.
- מלא את כל הלולאות בדם כמתואר ב- 2.2.10.
- הגדר את מהירות הסיבוב ל- 30 סל"ד וסובב למשך 3 שעות.
- מכלול לולאה לבדיקת סטנט
- הכן ארבע לולאות כמתואר ב- 2.2 ולאחר מכן.
הערה: כדי להעריך את תאימות הדם של סטנטים, החומר צינור עצמו צריך להיבדק להיות תואם ביולוגית על מנת למנוע מיסוכת של הפעלת התא. אם לא קיימים נתונים, ניתן לבדוק את חומר הצינור עצמו כמתואר ב- 2.2. יתר על כן, ניתן להחיל את טווח הקוטר בתוך סטנט (ראה הוראות היצרן) וצריך להתאים את הקוטר הפנימי של חומר הצינור. - פתח שתיים מהלולאות והצא את הצינור ממערכת רצועות המתח.
- הכנס את סטנט לאמצע הצינור בהתאם להוראות היצרן.
- השתמש בשתי הלולאות האחרות ללא סטנט כפקד. מלא את כל הלולאות בדם כמתואר ב- 2.2.10.
- הגדר את מהירות הסיבוב ל- 30 סל"ד וסובב למשך 3 שעות.
- הכן ארבע לולאות כמתואר ב- 2.2 ולאחר מכן.
- בקרת טמפרטורה
- בכל עת במהלך וכאשר הסיבוב נעצר, הטמפרטורה של הדם בתוך הלולאות מסומן על ידי המדחום בתוך לולאת בקרת הטמפרטורה. כדי לקרוא את הטמפרטורה, לעצור את הסיבוב ומיד לקרוא את הטמפרטורה המצוינת על ידי המדחום.
3. עיבוד דגימת דם
- לאחר הסיבוב, תן לולאות לעמוד בארון במשך 2 דקות במיקום כלפי מעלה כדי לאפשר לדם לצבור בתחתית הלולאות, הימנעות כל שפיכה בעת פתיחת הלולאות.
- בדוק את הדם שנותר לתנאים סטטיים: אם הדם הזה הוא קרישה, הפריניזציה לא תקין הוא בסופו של דבר חשוד. במקרה זה, חזור על הניסוי רצוי גם עם תורם דם אחר.
- בזהירות להוציא את הלולאות מהמדף. פתח את המחברים ותן לדם לזרום לתוך זכוכית של 10 מל.
- תסוגר את הדם מהצינורות שמרוצים בכפילויות.
- יש לשאוב דם טרי לניתוח בסיסי מאותו תורם כפי שתואר ב-1.5 וב-1.6.
- אוסף של דם ציטראט נתרן
- לאוסף של דם ציטראט נתרן, למלא ארבעה צינורות 1.5 מ"ל, כל אחד עם 111 μL נתרן ציטראט פתרון שנאסף מצינורות נתרן ציטראט, כדי ליצור ריכוז סופי של 3.2% של נתרן ציטראט.
- מלא כל שפופרת ב-1 מ"ל דם מזכוכיות הזכוכית כמתואר ב-1.6 וב-3.3.
- שמור את הדם בטמפרטורת החדר והשתמש בדם זה לניתוחי FACS כמתואר ב- 12.
הערה: כדי לשנות את אורך הלולאות עבור הגדרות ניסיוניות שונות, תכנן כראוי aliquots בהתבסס על כמות המידות שיש לבצע. ייתכן שיהיה צורך לקבוע את כל המדידות הנדרשות עם דם טרי לפני הניסויים האמיתיים כדי להבטיח את נפח הדם לולאות מספיק עבור כל המדידות.
- אוסף של חומצה אתילנדיאמין טראסטית (EDTA) דגימות דם ופלזמה.
- מכל זכוכית עם דם (ראה 1.6 ו 3.3) להעביר 4.5 מל של דם לתוך צינור EDTA אחד 5 מל. מלאו שתי צינורות EDTA מכל זכוכית של 10 מל בדם.
- מערבבים בעדינות את הדם ולשמור אותו על קרח.
- להעביר 2 מ"ל של דם לתוך צינור צנטריפוגציה נעילה 2 מ"ל ולהשתמש בדם זה לספירת תאי דם ומדידה המוגלובין חינם כמתואר ב 5. ו-6.
- צנטריפוגה הדם הנותר ב 3,500 x גרם במשך 20 דקות.
- בזהירות לאסוף את הפלזמה supernatant ב 500 μL aliquots ומיד להקפיא ב -80 °C.
4. סריקת מיקרוסקופאלקטרונים ותמונות μCT
- לאחר עיבוד דגימת דם, לשטוף את הלולאות הרוקנות שהוכנו כמתואר ב 2.3 עם 10 מ"ל של תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) כל אחד.
- בזהירות לחתוך דגימה באורך 1 ס"מ מכל קצה של כל צינור עם אזמל.
- דגירה מדגם לילה ב 4 ° C בתמיסה גלוטראלדהייד 2%.
התראה: שאיפת אדי אלדהיד יכולה לגרום לתסמיני אף כגון מחניק מתמיד של עפרות נזלת וגירוי בדרכי הנשימה, ומגע עם העור גורם לדלקת עור. יש לטפל באלדהידות בכיפה בזמן שהן לובשות כפפות, שמלת מגן ומגף בטיחות. - לשטוף את המדגם (3 פעמים) עם PBS.
- הכן תמיסה של 1% של אוסמיום טטרוידיד (OsO4)במים deionized ודגירה מדגם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
התראה: OsO4 הוא סוכן חמצון חזק, זה יכול להיות מופחת על ידי חשיפה לאור. כדי למנוע הפחתה במהלך ההכנה, לאחסן OsO4 בבקבוק זכוכית חום. OsO4 הוא הפכפך מאוד, האדים שלו רעילים לעיניים, האף והגרון. תמיד לעבוד תחת מכסה המנוע אדים ולהשתמש בכפפות ולהגן על בגדים, להבטיח כי שום חלק של הגוף אינו חשוף OsO4. פנה להנחיות המוסד בנוגע לטיפול בפסולת ובאחסון. באופן כללי, OsO4 הוא לאחסון במשך כמה חודשים, אבל זה צריך בקבוקי זכוכית מיוחדים עם ליינר טפלון ויריד, כי OsO4 יכול לדהות משטחים פנימיים ותכולת המקרר בנוכחות אדים דולפים. - להוציא דגימות, להעביר אותם בצינורות צנטריפוגה חדשים 15 מ"ל ולשטוף דגימות 3 פעמים עם PBS.
- הכן סדרה של אתנול עם ריכוזים שונים (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
- דגימות התייבשות באתנול: דגירה במשך 20 דקות כל אחד ב-25%, 50%, 75% ו-90% ו-30 דקות ב-100%.
- קח דגימות מתוך 100% אתנול ולתת לו אוויר להתייבש לילה בטמפרטורת החדר.
- בדוק דגימות במיקרוסקופ האלקטרונים הסריקה במתח האצה של 5 kV ועם סורק μCT רנטגן.
5. ספירת תאי דם
- קח 2 מ"ל של דם EDTA שהושג כמתואר ב 3.7.3
- הכנס את הצינור למנתח ההמטולוגיה האוטומטי ובצע את הוראות היצרן.
6. מדידה של המוגלובין חינם (fHb) בפלזמה
- להפשיר דגימת פלזמה אחת מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5. לאחסן על קרח לאחר הפשרה.
הערה: תמיד להפשיר דגימות פלזמה קפואות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס ומיד להעביר לקרח, המכיל קצת מים, כדי להוריד את הטמפרטורה. חשוב להימנע מהפעלה של רכיבי דם במהלך הפשרה. - השתמש בריגנט fHb ובצע את הוראות היצרן. הימנע מזיהום לאחר הפתיחה והגן על הריגנט מפני אור ישיר (שמש, אור UV).
- השתמש ב- ערכת pipetting (ראה הוראות היצרן) עם דילול של 1:5.
- הוסף 1000 μL של reagent המוגלובין ב 1.6 מ"ל חצי מיקרו cuvette. השתמש בקובט זה כדי לקבוע את הערך הריק.
- להוסיף 1000 μL של reagent המוגלובין ו 250 μL של דגימת פלזמה ב cuvette חצי מיקרו אחר.
- מערבבים את התוכן בשתי הקוביות על ידי שטיפה יסודית של הפיפטה על ידי מילוי חוזר ונשנה בתערובת התגובה, ותדגם לפחות 3 דקות בטמפרטורת החדר.
- לקבוע את ההכחדה (E) של הדגימה נגד reagent fHb כמו ריק ריק reagent. חשב את ריכוז ה-fHb (mmol/l) של הדגימה: E540-E680 x 0.452.
7. מדידה של FPA
- להפשיר דגימת פלזמה מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5 ולאחסן על קרח לאחר הפשרה.
- השתמש בערכת FPA Elisa ובצע את הוראות היצרן.
8. מדידה של sC5b9
- להפשיר דגימת פלזמה מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5 ולאחסן על קרח לאחר הפשרה.
- השתמש בערכת ה-SC5b-9 ELISA ובצע את הוראות היצרן.
9. מדידה של PMN
- להפשיר דגימת פלזמה מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5 ולאחסן על קרח לאחר הפשרה.
- השתמש ערכת PMN-Elastase ELISA ובצע את הוראות היצרן.
10. מדידה של TNF
- יש לצופה במיקרו-לוחיות יום אחד לפני הפעלת ה-ELISA. לציפוי, להוסיף 100 μL של תמיסת נוגדנים ללכוד לכל בארות, צלחת אטום דגירה לילה ב 2 ° C-8 ° C.
- להפשיר דגימת פלזמה אחת מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5. לאחסן על קרח לאחר הפשרה.
- השתמש בערכת TNF ELISA ובצע את הוראות היצרן.
11. מדידה של IL-6
- מיקרו-לוחיות רישוי חייבות להיות מצופה בתרופות לכידה יום אחד לפני הניסוי. לציפוי, להוסיף 100 μL של תמיסת נוגדן ללכוד לכל בארות של המיקרופלטה המסופקת עם הסט, צלחת אטום דגירה לילה ב 4 ° C
- להפשיר דגימת פלזמה מכל מצב שהושג כמתואר ב 3.7.5. ולאחסן על קרח לאחר הפשרה.
- השתמש בערכת IL-6 ELISA ובצע את הוראות היצרן..
12. ניתוחי FACS
- הכן 500 מ"ל של מאגר FACS על-ידי הוספת 10 מ"ל של סרום עגל עוברי ו-2 מ"ל של תמיסת EDTA (0.5 M) ל-488 מ"ל של PBS אחד. ניתן לאחסן את מאגר FACS למשך 4 שבועות ב- 4°C.
- השתמש 100 μL של דם ציטראט נתרן (ראה 3.6.3) עבור כל הליך כתמים (אגרגטים טסיות דם מונוציט (MPA), הפעלת טסיות דם (הרשות הפלסטינית), integrins leukocyte (LI).).
- פיפט 100 μL של דם מכל דגימה לתוך צינור FACS 5 מ"ל. מכל דוגמה, הכינו 3 צינורות להכתמת נוגדנים ותווית עם לוח MPA (צבירה של טסיות דם מונוצייט), פאנל PA (צבירה טסיות דם) ולוח LI (leukocyte integrin).
- מערבבים את שאר 4 הדגימות לצינור FACS אחד של 5 מ"ל. השתמש בתמהיל זה עבור פקדים לא מוכתמים ופלואורסץ פחות פקד אחד (FMO).
- להכין 6 צינורות FACS על ידי pipetting 100 μL של הדם המדגם מעורב לתוך כל צינור. תווית 3 צינורות כמו לא מוכתם ו 3 צינורות כמו FMO-CD41, FMO-CD62P ו FMO-CD162.
- מוסיפים 100 μL של 4% תמיסת paraformaldehyde ותדנוד במשך 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
התראה: Paraformaldehyde רעיל לעור ולעיניים. זה יכול לגרום לגירוי ריאתי חמור כאשר שואפים והוא יכול להוביל לנזק לריאות לאחר חשיפה ממושכת. יתר על כן, הוא מסווג כמסרטן ורעלן רבייה. תמיד ללבוש כפפות ומשקפיים בטיחות ולעבוד מתחת למכסה המנוע אדים. - הוסף 1 מ"ל של מאגר כביסה לכל שפופרת וצנטריפוגה ב 287 x g במשך 5 דקות. בטל את שלב השטיפה וחזור פעמיים.
- עבור תאי דם אדומים (RBC) lysis, להוסיף 1 מ"ל של 1 מאגר RBC lysis מאגר (לדלל 10x RBC מאגר lysis במים deionized), לערבב על ידי לאט pipetting למעלה ולרדת דגירה במשך 5 דקות ב RT בחושך.
- הכינו חרוזי פיצוי לכתמים בודדים. ל-1 מ"ל של מאגר FACS להוסיף 4 טיפות של כל חרוזים חיוביים ושליליים. מערבולת יסודית ולהוסיף 100 μL של פתרון חרוזים אחד 5 מ"ל FACS שפופרת.
- הכן 4 צינורות עם חרוזים ותווית כ-CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC ו- CD62P-PE. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS לכל שפופרת וצנטריפוגה ב- 287 x g למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והמשיכו על הקרח.
- לאחר lysis RBC, להוסיף 1 מ"ל של מאגר FACS לכל צינור ולשטוף כמתואר ב 12.7. זרוק את הסופרנטנט.
- הכן קוקטיילים נוגדנים:
- החלונית MPA: להוסיף 4 μL של CD45-APC, 4 μL של CD14-FITC ו 4 μL של CD41-BV421 כדי 388 μL של מאגר FACS.
- פאנל הרשות הפלסטינית: להוסיף 1.6 μL של CD41-BV421 ו 12 μL של CD62P-PE ל 386.4 μL של מאגר FACS.
- החלונית LI: להוסיף 4 μL של CD45-APC ו 8 μL של CD162-BV421 כדי 388 μL של מאגר FACS. שמור על קרח.
- הכן כתמים בודדים: הוסף 0.5 μL ל- 499.5 μL של מאגר FACS כל אחד עבור CD14-FITC, CD41-BV421 ו- CD45-APC. עבור CD62P-PE להוסיף 0.3 μL ל 499.7 μL של מאגר FACS. שמור על קרח.
- הכן פקדי FMO: (i) החלונית MPA (FMO-CD41): הוסף נוגדן 1 μL CD14-FITC ו μL אחד של CD45-APC נוגדן למאגר FACS 98 μL. (ii) החלונית PA (FMO-CD62P): הוסף 0.4 μL של CD41-BV421 ל- 99.6 μL של מאגר FACS. (iii) החלונית LI (FMO-CD162): הוסף μL אחד של CD45-APC ל- 99 μL של מאגר FACS. שמור על בקרות FMO על קרח.
- קוקטיילים נוגדנים מערבולת ולהוסיף 100 μL של כל קוקטייל נוגדן כפי שהוכן ב 12.12 לכל אחד מהצינורות המסויגים בהתאמה (MPA, הרשות הפלסטינית ולוח LI) כמתואר 12.3 ולערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. תמשיך לעבוד על RT בחושך.
- מערבולת נוגדני כתם יחיד ולהוסיף 100 μL של דילול נוגדני כתם יחיד כפי שהוכן ב 12.13. לכל אחד מהצינורות המסוממים בהתאמה עם חרוזים כמתואר ב- 12.7 ומערבבים בעדינות על-ידי התזת למעלה ולמטה. תמשיך לעבוד על RT בחושך.
- קוקטיילים נוגדנים FMO מערבולת ולהוסיף 100 μL של כל קוקטייל נוגדן FMO-1 כפי שהוכן ב 12.14. לכל אחד מהצינורות המסויגים בהתאמה (פקדי FMO) כמתואר ב- 12.5. ומערבבים בעדינות על ידי התפתלות למעלה למטה. שמור על RT בחושך.
- דגירה כל הצינורות עם כתמים נוגדנים במשך 30 דקות ב RT בחושך.
- קח את שלושת הצינורות עבור שליטה לא מוכתמת (ראה 12.4) וגלולה resspend ב 250 μL של מאגר FACS. שמור על קרח.
- לאחר זמן הדגירה, שטפו את כל הצינורות למעט פקדים לא מוכתמים פעם אחת עם מאגר FACS כמתואר ב- 12.7. גלולת תולה מחדש ב 250 μL של מאגר FACS ולרכוש נתונים על ציטומטר זרימה.
- השתמש בתאים לא מוכתמים עבור הגדרות שליליות וחרוזי עכבר פיצוי עבור הגדרות חיוביות בתוכנה FACS. יתר על כן, השתמש FMO כדי לשלוט באסטרטגיית gating, שבו FMO-CD41 משמש בחלונית MPA, FMO-CD62P משמש בחלונית הרשות הפלסטינית FMO-CD162 משמש בחלונית LI.
- לרכוש כמעט 0.5 x 106 - 0.25 x 106 אירועים לכל שפופרת עבור FACS. שמור נתונים ונתח באמצעות תוכנת ניתוח (גירסה 9.9.6).
Representative Results
כל הנתונים המוצגים, למעט חלקות FACS, נותחו באמצעות תוכנת סטטיסטיקה. חלקות FACS נותחו באמצעות תוכנת ציתום זרימה.
הניתוח של ספירת תאי דם שלמים לא הראה הבדלים משמעותיים ביחס אריתרושיטים בין כל התנאים שנבדקו(איור 2). אבל, טסיות דם וleukocytes צומצמו באופן דרסטי בקבוצת לטקס, המציין תואם ביולוגי גרוע מאוד של לטקס. זה מודגש עוד יותר על ידי רמות מוגברות של המוגלובין חינם בקבוצת לטקס, המציין את העובדה כי למעט קבוצת לטקס, אף אחד מהמכשירים או התנאים האחרים כלי דם הוביל הממוליזה נרחבת(איור 2). יתר על כן, צינורות PVC מצופה, polyPVC ו hepPVC, כמו גם סטנט נבדק לא הוביל פקקת באמצעות פקקת ואובדן leukocyte, בעוד לטקס הציג את טסיות הדם הגבוהות ביותר ואובדן leukocyte, ואחריו צינורות PVC לא מצופים שהראו מגמה מופחתת.
בעוד כל התקני כלי הדם שנבדקו הובילו להפעלה מוגברת של מערכת קרישה (FPA) ורכיב משלים (sC5b-9), לולאות hepPVC הציגו מגמה של רמות מופחתות של FPA ו sC5b-9 בהשוואה ספציפית לולאות polyPVC(איור 3). מעניין, לולאות PVC וגאפ לא מפוספס הראו רמות נמוכות יותר של FPA לעומת polyPVC, אם כי לא להגיע לרמה של משמעות סטטיסטית. אף על פי כן, לולאות לטקס הציגו רמות מוגברות באופן משמעותי של FPA בהשוואה לתנאים בסיסיים וסטטיים.
בהתאם לכל ספירת תאי הדם, לולאות לטקס הציגו את הרמות הגבוהות ביותר של TNF, IL-6 ו- PMN elastase (איור 4), והגיעו לרמה של משמעות סטטיסטית בהשוואה לשאר הקבוצות במונחים של TNF ו- IL-6(איור 4A,B),ואילו תנאים סטטיים ובווה בסיס במונחים של אלסטאז PMN (איור 4C). תוצאות אלה מצביעות על הפעלה חזקה של לוקוציטים על ידי לטקס. רמות הבסיס של סמני ההפעלה תמיד היו דומות לתנאים סטטיים, המצביעים על התעבה נכונה של הדם.
מעניין, זה הוכח כי טסיות דם וleukocyte ספירות עבור לולאות המושרה פער היו רק מעט מופחת עם הפעלה מתונה של מערכת קרישה (FPA) ו leukocytes (אלסטאז PMN), אם כי סגירת לולאה לא תקין עם מערבולות זרימה וכתוצאה מכך מגע דם אל משטח חיתוך גס מקופס הוביל קרישי דם גלויים מאקרוסקופית בplice (איור 1F). קרישי הדם והתפלגותו על פני כל משטח ה-SPLICE היו ניכרים בתמונות μCT ו-SEM, בעוד שלא נמצא קריש דם כאשר הלולאות נסגרו עם התקן הסגירה החיצוני ולא השאירו רווח בין סופיהלולאה (איור 5).
ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי דם מארחים שהיו מוכתמים עם סמנים ספציפיים טסיות דם, CD41 וסמן הפעלת טסיות דם CD62P, מוצגים איור 6A,B. כאן, צינורות לטקס הפגינו עוצמה פלואורסצית חציון גבוה במיוחד (MFI) עבור CD62P על טסיות דם, ואחריו סטנט, בעוד שפופרות polyPVC מצופה הפרין הציגו הפעלה מינימלית של טסיות דם המתארות מאפיין אנטי טרומבוגני של צינורות polyPVC. יתר על כן, leukocytes סווגו בהתבסס על CD45 ו SSC (פיזור צד) מבוסס גרגריות לתוך (i) גרנולוקיטים; (ii) מונוציטים ו-(iii) לימפוציטים (איור 7), והביטוי CD162+ integrin זוהה בכל תת-אוכלוסיה של לוקוציטים הידועים כאינטראקציה עם CD62P על טסיותדם 24. הבחינו כי ביטויי integrin צומצמו באופן דרסטי על גרנולוציטים לימפוציטים לולאות לטקס. תוצאה זו הייתה בקנה אחד עם רמות נמוכות יותר של תדרים כוללים של לוקוציטים בלולאות לטקס (איור 2). באופן כללי, רמות integrin היו גבוהות יותר בקרב מונוציטים בהשוואה גרנולוטיטים לימפוציטים, המציין את הסבירות לאינטראקציה monocyte עם טסיות דם מופעלות. בהקשר זה, אגרגטים טסיות דם מונוצייט הוערכו גם על ידי הכתמת תאי הדם עם CD14 (כסמן monocyte) ו CD41 (כסמן טסיות דם) ובסופו של דבר לזהות תאים חיוביים כפולים כלומר CD14+CD41+MPA(איור 8). כאן, שמנו לב כי קבוצת סטנט הציג את הרמות הגבוהות ביותר של ביטוי CD41 על MPA, ואחריו קבוצת לטקס, המציין נטייה מוגברת ליצור MPA, למרות התדירות המופחתת של monocyte (<1 %) לולאות לטקס.
איור 1: מבט כולל על מודל הלולאה ההמודינמית במבחנה והשינויים שלו. (A)לולאה לניסוי הפער עם מערכת סגירת לולאה חיצונית, לא משאירה רווח בsplice. (ב)לולאה עשויה מפוליפ.וי.סי מצופה צינור PVC וסטנט בפנים (חץ). לולאהעשויה מחצוצרת לטקס. (D)לולאה לניסוי הפער ללא מערכת סגירת הלולאה החיצונית משאירה פער בין סופי הצינור (חץ). לולאותמונחות בעריסה בתוך אמבט המים ומלאות בדם. (F)טרומבוס וכתוצאה מכך פער בsplice (חץ) לאחר סיבוב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תוצאות לספירת תאי דם והמוגלובין פלזמה. אריתרושיטיםנחשבים. טסיותדם נחשבות. ספירתלוקוציטים. המוגלוביןפלזמה חינם. התוצאות מצביעות על התאמות הביולוגית הירויה של לטקס, מה שמוביל להמוליזה מוגזמת. הנתונים מוצגים כערך מתכוון; קווי השגיאה מציינים SEM. n = 1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תוצאות להפעלת קרישה ומערכת משלימה. (א)הפעלת מערכת קרישה, הנמדדת על ידי רמות של Fibrinopeptide A (FPA) (B) הפעלת מערכת משלימה, נמדד על ידי רמות של sC5b-9. בעוד צינורות לטקס עוררו רמות גבוהות משמעותיות של FPA, ההפעלה המשלים היה חזק עבור כל החומרים שנבדקו. הנתונים מוצגים כערך ממוצע, קווי שגיאה מציינים SEM. *p<0.05, n =1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: סמני הפעלה של לוקוצייט. (A)גורם נמק גידול אלפא (TNF). (ב)אינטרלוקין 6 (IL-6) (ג)PMN אלסטאז. התוצאות מצביעות על הפעלה מוגברת של leukocytes בשל רמות גבוהות של סמנים מנותחים, ואחריו לולאות סטנט, זה רק הוביל לרמות מוגברות עבור PMN אלסטאז אבל לא TNF או IL-6. הנתונים מוצגים כערך ממוצע, קווי שגיאה מציינים SEM. *p<0.5; **p<0.01, n=1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הדמיה של ההתמוססות של הלולאות. (א)μ מחשב (μCT) של לולאות עם סגירה לא תקינה (פער). האזורים האדומים מצביעים על חומר טרומבוס. (ב)עיבוד של הצד הזוהר של הצינור. הבחירה המלבנית מציינת את האזור לסריקת מיקרוסקופאלקטרונים (SEM) (C). (D)μCT של לולאות עם התקן סגירת לולאה חיצונית ואין פער בsplice, ו - (E) עיבוד ותצוגה של פני השטח הזוהר. לא נמצא חומר תרומבוס. (F)תמונת SEM של הבחירה המלבנית ב (E). לא נמצא חומר טרומבוס על משטח החיתוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: התוויית FACS להפעלת טסיות דם (CD62P). (א)מייצג FACS העלילה (מצב בסיסי) המציג את CD41 דם+ טסיות דם. (ב)גרף המציג את מצב הפעלת טסיות הדם משתקף בעוצמת הפלואורסצנס (MFI) המהותית של הסוגים השונים של התקני כלי דם בהשוואה ל-RT הסטטי ולתנאים הבסיסיים. תס"א הנתונים מציגים נתונים מידות בודדות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: התוויית FACS עבור leukocyte integrin (CD162). (A) נציג FACS העלילה (מצב בסיסי) המציג את CD45דם + leukocytes וקבוצות משנה (B) גרף המציג את cd162 leukocyte+ integrin אומר עוצמת פלואורסצנה (MFI) של סוגים שונים של התקני כלי דם בהשוואה לתנאים סטטיים ובסיסית. תס"א הנתונים מציגים נתונים מידות בודדות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: התוויית FACS עבור אגרגטים חד-צייטיים טסיות דם (CD41/CD14). (A) העלילה מייצג FACS (תנאי בסיסי) המציג את gating עבור מונוציטים דם (CD45+/CD14+), טסיות דם (CD41+) וצבירות טסיות דם מונוציט (CD41+/CD14+) (B) גרף המציג את CD41+ עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת (MFI) על צבירות טסיות דם מונוציט עבור התקנים השונים של כלי דם בהשוואה לתנאים הסטטיים ומצב הבסיס. תס"א הנתונים מציגים נתונים מידות בודדות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
מחקר זה הראה כי המודל המוצג בלולאה מודינמית שהוצגה במבחנה מציע שיטה אמינה לבדיקת תאימות הדם במבחנה של מכשירים רפואיים בהתאם לתקן ISO 10993-4.
צעדים קריטיים בפרוטוקול כוללים את הרישום של דם ומילוי הצינורות בדם, שבו ואקום מוגזם או תסיסה יש להימנע כדי למנוע את רכיבי הדם מהפעלה על ידי הליך הטיפול. יתר על כן, חשוב מאוד להקפיא באופן מיידי את דגימות הפלזמה ולשמור אותם על קרח לאחר הפשרה, כמו מערכת משלימה והפעלת קרישה ניתן לחבל על ידי שמירה על הדגימות על טמפרטורת החדר לזמן ארוך יותר.
מאז מודל זה יש גם יתרונות וחסרונות בהשוואה למודלים אחרים במבחנה, מספר גורמים יש לקחת בחשבון בעת עיצוב הניסויים.
ראשית, הלולאות יכולות להיות מגוונות באורך וקוטר כדי להתאים לתכננות ניסיוניות שונות. במקרה ההתקנה כוללת צינורות מנוגדים בקוטרים פנימיים שונים, יש לזכור כי ההבדלים בקוטר יגרום כוחות גהה שונים, ובכך להשפיע על קרישה ולהשלים מפל7. שנית, מהירות הסיבוב נקבעה ל-30 סל"ד בניסוי זה. כתוצאה מכך זרימת דם של כ 25 ס"מ / s, אשר דומה למהירות זרימת הדם בשתלים מעקפים עורקים כלילייםאנושיים 25. קצב הזן, שנוצר על ידי סיבוב הלולאות, הוא הפרמטר העיקרי שיתחיל מפלים ביוכימיים של רכיבי דם, כולל תאים וחלבונים ללא תאים. אבל כמו דם הוא נוזל שאינו ניוטוני, קצב המתח יושפע גם עקמומיות הצינור, בהתאמה אורך הצינורות הסגוריםלולאות 10. בכל פעם שמהירות הסיבוב או גודל הלולאה משתנים, חשוב לקחת בחשבון שהקורלציה בין קצב המאמץ למהירות הסיבוב אינה ליניארית. המתאם בין מהירות הסיבוב לקצב המאמץ אינו נבדק מספיק עד היום, ונדרשים מחקרים נוספים כדי לחקור אתהפרמטרים הספציפיים הללו 10,26,27. עם זאת, בהתבסס על מודל לשכבת גבול למינאר, קוטר הצינור הנתון של 5 מ"מ ומהירות הסיבוב של 25 ס"מ/ים, הערכה גסה של הלחץ גה הקיר (WSS) יציין ערכים בין 2.20-22.00 פסקל למרחק של 1,00-0,01 מ"מ לקיר הצינור כאשר צפיפות הדם מוערכת להיות 1060 ק"ג * מ'-3 ואת צמיגות קינטי מוגדר 0.0025 פסקל * s28,29. מעניין, גם ניתוח חישובי מפורט יותר של דינמיקת זרימה עקמומיות של עורקים כליליים אנושיים הראה ערכי WSS החל 11.33 כדי 16.77 פסקל בפרמטרים דומים בערך עבור מהירות, צפיפות וצמיגות שלהדם 30.
לצד מגבלה זו, מודל הלולאה המוצגת הוא מערכת פחות לחץ, זה לא לחקות את יחסי לחץ הדם התוך-וסקולרי של מערכת כלי הדם האנושית.
המגבלה החשובה הבאה היא שהדם נמצא במגע עם האוויר בתוך הלולאות, מה שמביא הפרעות נוספות. מגע כזה של אוויר-דם מושפע משני פרמטרים, הכוללים את חדירות הגז של הצינורות ושמירה על האוויר בתוך הלולאות תוך מילוין בדם. לכל חומר צינור יש חחללות גז מסוימת שיכולה להוביל לשינויים משמעותיים בריכוזי הגז בתוך הצינורות. בעוד כמה מחברים למדינה כי ההשפעה של חרנטיות הגז על הפעלת רכיבי דם נשארלא ברור 31, ידוע כי הפונקציה של קרישי הדם רגיש מאוד pH-shift, זה יכוללהיגרם על ידי CO 2 דיפוזיה32,33,34. כאן, בדקנו את תאימות ביולוגית של צינורות עירוי דם בתנאי אוויר פנימיים, בדומה לתרחישים קליניים של זרימת דם חוץ ג'כית. עבור שיפורים עתידיים של המודל המוצג, דגירה של הדגם כולו בדגמה CO2 וביצוע אימות pH בדם לפני ואחרי הדגירה עשוי להיות שימושי כדי לתקנן עוד יותר מודל זה.
כמו כן, ממשק אוויר הדם בתוך הלולאות יכול להוביל להפעלה של חלבוני פלזמה ושברים תאשל הדם 35,36. משאבת רולר מונע מכשירים ללא אוויר בתוך הצינורות עשוי למנוע את הבעיה של ממשק אוויר בדם, אבל הם בהחלט לגרום נזק לתאי דם עם רמות גבוהות משמעותיות של המוגלובין בהשוואה למודל הלולאה המוצג כאן, ואת המוגלובין בפלזמה יכול להפריע לרגישות של אנליטים שנבדקו ב ELISA16. במחקר זה הבחנו כי ההשפעה ההמולית של מודל הלולאה עצמה נשאר מינימלי תוך שימוש בחומרים תואמים ביולוגית כגון שפופרות PVC מצופה הפרין. לכן, המודל הוא, מצד אחד, לא גורם נזק מוגזם לתא בהשוואה למודלים מונעי משאבה, אבל מצד שני גרימת חלבוני פלזמה בשל מגע אוויר בדם. שימו לב, ואן אוברן ואח' פיתחו דגם לולאה מבוסס שסתום כדור ההימנעות מאוויר בתוך הלולאות16. חלופה מבטיחה זו למודל הלולאה המוצג כאן עשוי להתגבר על הבעיה של ממשק אוויר-דם, עם זאת, בהשוואה למודל המוצג כאן, הדבקת טסיות דם הוא עדיין גבוה יותר עבור מודל לולאה מבוסס שסתום כדור.
לגבי השליטה הסטטית, יש לציין כי הזכוכית עצמה הוצגה כמופעל חזק של מערכת קרישה37. עם זאת, בהתקנה המוצגת, דגירה בפיק זכוכית (בקרה סטטית) לא הובילה להפעלה או הפעלה מוגזמת של תא מארח או הפעלה של מערכת קרישה בהשוואה לרמות הבסיסיות מיד לאחר שרטוט הדם. לסיכום, זה עשוי להיות מועיל לשימוש למשל צינורות פוליפרופילן, אם הפקד הסטטי מראה רמות גבוהות של הפעלה.
בין אם מדובר בלולאה המבוססת או במודל מונחה משאבה, מודלים אלה במבחנה חסרים לחלוטין את האינטראקציות הביולוגיות האותנטיות אשר נתרמו בעיקר על ידי אנדותל שלם, שהוא משטח אידיאלי ליצירת קשר עם דם. הרציונל מאחורי בעיה זו ניכר יותר כאשר מכשיר רפואי כמו סטנט נבדק, אשר עשוי להקנות תוצאות שונות, במונחים של הפעלה וחחלוני פלזמה, במהלך האינטראקציה שלה עם רכיבי דם בנוכחות אנדותל. זה מצהיר להיות החיסרון העיקרי של כל הנדונים במערכות חוץ המחקות את מערכת הדם. לפיכך, כדי להתגבר על בעיה זו, מערכות מיקרופלוידיק חדשות המכוסות לחלוטין אנדותל צוברות עניין עצום, אבל בכל זאת בהשוואה למודל הלולאה המוצג כאן, הם עדיין מוגבלים כדי להכיל נפחי דם קטנים יותר ו שיעוריזרימה מינימליים 38,39
לכן, אנו מסיקים כי המודל צ'נדלר לופ נשאר להיות מודל חזק לביצוע בדיקות מתוקננים על תאימות ביולוגית הדם של מכשירים רפואיים כלי דם בתחום המחקר לב וכלי דם.
Disclosures
ה-funder [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Germany] סיפק תמיכה כספית בצורה של חומרים מתכלים ודמי פרסום למחבר כתב יד זה [מקס וואקר]. למימון לא היה כל תפקיד נוסף בעיצוב המחקר, באיסוף וניתוח נתונים, בהחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה לגברת אלנה דנקס על עזרתה הטכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
| BD LSR Fortessa II cell analyzer | Becton Dickinson | 647465 | |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | Becton Dickinson | 369714 | |
| BD Vacutainer one-use holder | Becton Dickinson | 364815 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
| Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
| Beaker glass ROTILABO short 50 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X688.1 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
| Centrifuge ROTINA 420 | 420 R | Hettich Zentrifugen | 4701 | 4706 | |
| Centrifuge tubes, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| CHC Super modified, 5mm PVC tubing | Corline Sweden | 1807-148 | Referred to as hepPVC tube |
| Circular Precision Cutter | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 007-20 | |
| Closing Unit (complete with tension bands) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 008-20 | |
| Electric tape Scotch Super 33+ | VWR | MMMA331933 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 | BioLegend | 430504 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a | BioLegend | 430204 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000012 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000020 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000047 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue | Eppendorf AG | 3123000063 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000055 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet | Eppendorf AG | 3123000071 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom | Corning BV | 352052 | |
| Fetal bovine serum Gold Plus | Bio-Sell | FBS.GP.0500 | |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 367116 | |
| Fluency plus stent 13.5 x 60 mm | Angiomed GmbH & Co | FVM14060 | |
| Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
| Gibco PBS Tablets | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Gloves Vasco Nitril white L | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208437 | |
| Gloves Vasco Nitril white M | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208429 | |
| Glutaraldehyde 25% aequous solution | Sigma Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, 25.000 IE in 5 ml | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN 3862340 | |
| Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit | Hölzel Diagnostika | abx253234 | |
| Kodan tincture forte colourless | Schülke & Mayr GmbH | 104012 | |
| Latex tube, ID 5 mm | Laborhandel24 GmbH | 305 0507 | |
| Loop Stand | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 009-20 | |
| Medimex venous tourniquet classic | ROESER Medical GmbH | 310005 | |
| Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex | Tecan | TEC006418I | |
| Microplate shaker PMS-1000i | VWR | 444-0041 | |
| Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm | VWR | NALG8703-0508 | Referred to as PVC tube |
| NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
| Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
| Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| PE anti-human CD16Antibody | BioLegend | 302008 | |
| PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody | BioLegend | 304906 | |
| Pipette controller, pipetus | VWR | 612-1874 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5186480 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 9409410 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.870 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000µl blue | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.919 | |
| PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
| Probe stand ROTILABO combi | CARL ROTH | K082.1 | |
| Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 011-20 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
| Reagent reservoirs | VWR | 613-1184 | |
| Rotation Unit | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 010-20 | |
| Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409320 | |
| Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409331 | |
| sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
| Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG | Philips | n.a. | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X715.1 | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X714.1 | |
| Semi-micro cuvette 1.6 ml | Sarstedt | 67.746 | |
| Serological pipette 10.0 ml | Corning BV | 4488 | |
| Serological pipette, 25.0 ml | Corning BV | 4489 | |
| Serological pipette, 5.0 ml | Corning BV | 4487 | |
| Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm | VWR | BURK8803-0812 | |
| Sprout mini centrifuge | Biozym | 552034 | |
| Stop Solution for TMB Substrate | BioLegend | 77316 | |
| Swabs, sterile | Fuhrmann GmbH | 32055 | |
| Syringe, 10 ml | Becton Dickinson | 300296 | |
| Temperature controlled water basin | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 020-20 | |
| tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | 10000730 | |
| TMB Substrate Set | BioLegend | 421101 | |
| Trillium PVC tube, 5 mm ID | Medtronic | 161100107100103 | Referred to as polyPVC tube |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0250 | |
| UV-Vis Spektrometer Lambda 2 | Perkin Elmer | 33539 | |
| Vornado Mini Vortexer | Biozym | 55BV101-B-E | |
| XN-3000 workstation blood analyzer | Sysmex Europe | n.a. | |
| μ-CT Phoenix Nanotom S | GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany | n.a. |
References
- International Organisation for Standardisation. DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood. International Organisation for Standardisation. , (2017).
- Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum. Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).
- Maiolini, R., et al. A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor. Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).
- Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
- Betke, U., et al. Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study. Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus. Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).
- Fink, H., et al. An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).
- Lenz-Habijan, T., et al. Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model. Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).
- Olsen, A. L., Long, M. Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
- Feyerabend, F., et al. Blood compatibility of magnesium and its alloys. Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).
- Lukas, K., et al. Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane. Materials. 10 (4), Basel, Switzerland. 355 (2017).
- Paul, A., et al. Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).
- Link, A., et al. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. Journal of Visualized Experiments. (157), e60610 (2020).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. 2012, 673163 (2012).
- Maa, Y. F., Hsu, C. C. Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface. Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).
- Fletcher, E. A. K., et al. Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics. International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue. Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).
- Gong, J., et al. Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model. Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).
- Tevaearai, H. T., et al. Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility. The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).
- Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils. Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).
- Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries. Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).
- Gardner, R. A. An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).
- Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis. Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).
- Böswirth, L. Technische Strömungslehre. 8 edn. , Springer Vieweg. (2010).
- Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers. Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).
- Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis. Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).
- Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space. Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).
- Foley, M. E., McNicol, G. P. An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage. The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).
- Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study. The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).
- Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood. Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).
- Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface. Micromachines. 11 (1), Basel. 18 (2019).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
