Summary
Presentert her er en protokoll for en standardisert in vitro hemodynamic loop modell. Denne modellen gjør det mulig å teste hemokompatibiliteten til perfusjonsrør eller vaskulære stenter for å være i samsvar med ISO (International Organization for Standardization) standard 10993-4.
Abstract
I denne studien ble hemokompatibiliteten av rør med en indre diameter på 5 mm laget av polyvinylklorid (PVC) og belagt med forskjellige bioaktive konjugater sammenlignet med ubestrøkede PVC-rør, lateksrør og en stent for intravaskulær bruk som ble plassert inne i PVC-rørene. Evaluering av hemokompatibilitet ble gjort ved hjelp av en in vitro hemodynamisk sløyfemodell som anbefales av ISO-standarden 10993-4. Rørene ble skåret i segmenter av identisk lengde og lukket for å danne løkker unngå eventuelle hull på skjøten, deretter fylt med menneskelig blod og rotert i et vannbad ved 37 ° C i 3 timer. Deretter ble blodet inne i rørene samlet inn for analyse av antall hele blodceller, hemolyse (gratis plasma hemoglobin), komplementsystem (sC5b-9), koagulasjonssystem (fibrinopeptid A) og leukocyttaktivering (polymorfotonukle elaastase, tumornekrosefaktor og interleukin-6). Vertscelleaktivering ble bestemt for blodplateaktivering, leukocyttintegrinsk status og monocyttplateaggregater ved hjelp av strømningscytometri. Effekten av unøyaktig sløyfelukking ble undersøkt med røntgenmikrotomografi og skanning av elektronmikroskopi, som viste trombedannelse ved skjøten. Lateksrør viste den sterkeste aktiveringen av både plasma- og cellulære komponenter i blodet, noe som indikerer dårlig hemokompatibilitet, etterfulgt av stentgruppen og ubestrøkede PVC-rør. De bebelagte PVC-rørene viste ikke en signifikant reduksjon i blodplateaktiveringsstatus, men viste en økning i komplement- og koagulasjonskaskade sammenlignet med ubestrøkede PVC-rør. Sløyfemodellen i seg selv førte ikke til aktivering av celler eller oppløselige faktorer, og hemolysenivået var lavt. Derfor unngår den presenterte in vitro hemodynamic loop-modellen overdreven aktivering av blodkomponenter av mekaniske krefter og fungerer som en metode for å undersøke in vitro interaksjoner mellom donorblod og vaskulær medisinsk utstyr.
Introduction
Hemokompatibilitetstesting av medisinsk utstyr er et avgjørende skritt i utviklingen av nye enheter som vaskulære stenter eller perfusjonsrør for ekstrakorporal membranoksygenering. Frem til i dag anses dyremodeller som standardverktøy for å fullføre prosedyren for testing av medisinsk utstyr før implementering hos mennesker. Heretter er det nødvendig å finne alternative in vitro-modeller som ytterligere hjelper til med å minimere undersøkelser på dyr. I denne studien har vi derfor utforsket en miniatyr in vitro hemodynamic loop modell. Målet med denne presenterte metoden er å teste in vitro blodkompatibiliteten til medisinsk utstyr i henhold til ISO 10993-4-standarden.
ISO 10993-4-standarden beskriver standardiserte sett med kliniske parametere som skal undersøkes på blodprøve1. Kort sagt, dette er trombose (blodplateaggregasjon og antall), koagulasjon (fibrinopeptid A, FPA), hematologiske analyser (antall blodlegemer), hemolyseindeks (gratis plasma hemoglobin) og komplementsystemet (terminal komplement kompleks, sC5b9). Imidlertid kan flere markører, som nøytrofil polymorfonukleær elaastase (PMN), interleukin 6 (IL-6) og tumornekrosefaktor - alfa (TNF) som reflekterer aktiveringsstatusen til leukocytter også redegjøres for målinger. For å bestemme og kvantifisere de sirkulerende cellefrie proteinene som finnes i blodplasma, representerer sandwich enzymatisk knyttet immunosorbent analyse (ELISA) en konvensjonell og mest pålitelig metode2,3. På samme måte kan fenotypen og aktiveringsstatusen til vertscellene (f.eks. leukocytter) kvantifiseres ved å oppdage celleoverflateuttrykket av molekyler ved strømningscytometri (FACS) som gir enkeltcellesuspensjon baserte avlesninger, hvor fluorescerende merkede spesifikke antistoffer binder seg til de målrettede celleoverflatemolekylene4. Skanning av elektronmikroskopi (SEM) anbefales også å bestemme trombedannelse på det testede materialet etter ISO 10993-4-standarden1. Denne metoden kan suppleres med røntgenmikrotomografi (μCT), for å utføre strukturell analyse av tromben, for eksempel tykkelsen, størrelsen og lokaliseringen i et 3D-gjengitt bilde5.
Begrunnelsen bak bruk av denne in vitro hemodynamic modellen er å screene for de beste og kompatible medisinske enheter ved å forstå den grunnleggende fysiologiske dynamikken i blodkomponenter som blodplater, som er involvert i den primære hemostase eller leukocytter og deres interaksjon med ulike typer vaskulære enheter. Slike in vitro-systemer er svært etterspurt da de reduserer behovet for dyrestudier.
Den her presenterte loop modellen oppfyller disse kravene. Denne modellen ble først beskrevet av A.B. Chandler i 1958 for produksjon av blod trombi og er derfor også kalt Chandler Loop modell6. Inntil nå har denne modellen blitt brukt i en rekke eksperimenter og modifikasjoner for å undersøke blodbiokompatibiliteten til medisinskutstyr 7,8,9,10,11,12,13,14. Den består av polymerrør, som delvis er fylt med blod og formet til re-closable løkker. Disse løkkene roterer i et temperaturkontrollert vannbad for å simulere vaskulære strømningsforhold med sine hemorhelogiske effekter. Alternative metoder som pumpedrevne modeller eller modeller som bruker mekaniske kuleventiler inne i løkkene for å indusere en blodstrøm inne i polymerrørene, er allerede beskrevet15,16. Imidlertid er den generelle fordelen med den her presenterte metoden at den mekaniske kraften som brukes på blodceller og proteiner er lav, unngår hemolyse, og det er ingen kontakt mellom blod og kontakter, som muligens kan føre til strømningsturbulenser og aktivering av blodkomponenter. De viktigste aktiveringsfaktorene inne i løkken er selve testmaterialet og luften som er fanget inne. Dette bidrar til å minimere kilder til målefeil og å levere en høy reproduserbarhet, selv om blodluftgrensesnittet kan føre til proteindeningenning17. Det er også mulig å undersøke varianter av rørmaterialer og stentdiametere uten lengde- eller størrelsesbegrensninger og dermed tillate bruk av rør av forskjellig lengde og indre diameter. Videre er vert hemokompatibilitet på unøyaktig sløyfelukking og eksponering for ubestrøket røroverflate også mulig å undersøke. Andre lignende medisinske anvendelser av denne in vitro hemodynamiske sløyfemodellen er at den også kan brukes til å studere interaksjonene mellom immunterapi (legemidler) og blodkomponenter under enten preklinisk utvikling eller individuell narkotikasikkerhetsscreening før første-i-mann fase I klinisk studie, eller for generering av trombemateriale som kan brukesi ytterligere eksperimenter 18,19,20.
Denne studien beskriver en detaljert protokoll for testing av hemokompatibilitetene til perfusjonsrør og/eller stenter. Her er sammenligningen mellom ubestrøkede og bestrøkede PVC-rør (hepPVC: heparinbelegg, polyPVC: belegg med en bioaktiv polymer). Senket aktivering av blodplater, men en høyere aktivering av koagulasjonssystemet (FPA) ble funnet for begge bebelagte rør i forhold til de ubestrøkede rørene. HepPVC rørene som brukes her er modifisert med kovalent bundet heparin for å gjøre dem tromboresistant21 og har allerede vært ansatt i en sløyfe modell for å optimalisere og karakterisere ulike parametere22. PolyPVC rørene som brukes i denne studien er kommersielt tilgjengelige rør som brukes i kliniske innstillinger av ekstrakorporal blodperfusjon og er belagt med en heparinpolymer for å redusere trombogeniteten23. Noen ganger, i kliniske applikasjoner brukes selv ubestrøkede PVC-rør. Derfor inkluderte vi lateksrør som en positiv kontrollgruppe som viste overdreven aktivering av blodplater, koagulasjonssystem og oppløselige faktorer som IL-6, TNF og PMN-elaastase. Trombedannelse ble lagt merke til da unøyaktig sløyfelukking ble simulert. Dette førte til aktivering av koagulasjons- og komplementsystem samt leukocytter og blodplater sammenlignet med baselineforholdene. Videre førte blodkontakt til her brukt stentmateriale (bare metall nitinolstet, dekket med karbonimpregnert utvidet polytetrafluoretylen) til høyere blodplate- og leukocyttaktivering når det gjelder PMN-elaastase. Samlet sett induserte den presenterte modellen ikke hemolyse i noen av de testede vaskulære enhetene, da de var sammenlignbare med baseline eller statiske forhold, med unntak av lateksrørene, hvor røde blodlegemer (RBC) hemolyse var åpenbare. Videre kan disse perfusjonsrørene undersøkes enten ved avbildning eller ved histologi. Selv om histologiske evalueringer kan være gjennomførbare, fokuserte vi hovedsakelig på ELISA og flytcytometri for å utføre disse eksperimentene og dermed muliggjøre muligheten for å gjennomføre eksperimenter basert på den her presenterte modellen for mange laboratorier. Dermed representerer denne metoden en mulig metode for å teste blodbiokompatibiliteten til vaskulærmedisinsk utstyr i samsvar med anbefalingene fra ISO 10993-4-standarden. Videre kan denne metoden brukes når en interaksjon mellom blod og materialer skal testes under strømningsforhold, etterligne in vivo forholdene.
Protocol
Denne studien ble godkjent av etikkkomiteen ved det medisinske fakultetet ved Universitetssykehuset Magdeburg (søknadsnummer 88/18) og fagene ga skriftlig informert samtykke før blodprøveprosedyren.
1. Heparin lager forberedelse og blodprøvetaking
- Beregn mengden blod som trengs for hele eksperimentene.
MERK: Nesten, 5 ml heparinisert blod er nødvendig for hver vaskulær enhet i duplikater (løkker). På samme måte er det nødvendig med 5 ml blod for hver baseline og statisk tilstand som holdes til side ved romtemperatur. - Forbered en heparin lagerløsning ved konsentrasjonen av 100 IE/ml ved å fortynne det upålagte heparin (f.eks. Rotexmedia) i deionisert vann. Bruk 150 μL av denne oppløsningen for heparinisering av 10 ml friskt blod.
- Beregn mengden blod samt plasma som er nødvendig for fullblodscelleantall, ELISA og FACS-analyser.
MERK: Målingene som er representert i denne studien er hentet fra to løkker som kjører parallelt (en som duplikat) med et totalt blodvolum på 10 ml. - Basert på den nødvendige mengden blod, fyll 10 ml sprøyter med 150 μL heparin lagerløsning for å forhindre blodkoagulasjon med en endelig heparinkonsentrasjon på 1,5 IE /ml blod.
- Tegn blod ved hjelp av en sommerfugl (størrelse: 21 G). Fyll sprøytene veldig forsiktig for å unngå hemolyse eller celleaktivering på grunn av overdreven vakuum.
MERK: Tillatelse fra det lokale etiske utvalget bør innhentes før forsøkene starter. Innhente informert samtykke fra hver human blodgiver. Sørg for at blodgiveren er sunn og ikke tar medisiner, spesielt ingen platehemmende midler eller ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler i minst 10 dager før forsøkene. Merk at samme donor foretrekkes når man sammenligner ulike typer vaskulære enheter for første gang som presentert i dette manuskriptet. For ytterligere å evaluere de mellom individuelle forskjellene, kan protokollen gjentas med forskjellige givere. - Samle blod i et glassbeger, unngå overdreven agitasjon.
2. In vitro hemodynamic loop montering
- Fyll vannbadet til vannstanden når opp til midten av rotasjonsenheten. Still inn vanntemperaturen til 37 °C.
- Loop montering for testing av forskjellige rørmaterialer (polyPVC, hepPVC, PVC og latex)
- Klipp to 50 cm lange stykker av hvert rørmateriale (indre diameter 5 mm) med rørkutteren. Sørg for at skjæreflaten er flat, da dette er spesielt viktig for perfekt lukking for løkkene med små diametere, slik at blodet strømmer uten forvrengning på monteringskanten.
MERK: Hele denne protokollen benytter rørene med en innvendig diameter på 5 mm. - For å lette håndteringen og unngå forsinkelse etter prøvebehandling etter rotasjon, kjør bare fire løkker (2 materialer i duplikater) parallelt.
- For å generere en løkkeform, koble de åpne endene av rørene til et kort stykke silisiumrør som passer til den ytre diameteren på det undersøkende røret.
- Bruk polykarbonatspenningsbåndene for å sikre riktig lukking av løkkene. Når de brukes for første gang, juster lengden på båndene slik at de passer til den ytre diameteren på løkken ved å kutte spenningsbåndet med saks i nødvendige lengder og fest den med en 3 mm momentnøkkel.
- Trekk forsiktig låseskruen til spenningsbåndkontakten under inspeksjon av rørendene. Juster lukkekraften slik at det ikke er noe mellomrom mellom rørendene. Hvis låseskruen er helt strammet og spenningen i polykarbonatbåndet virker for lav til å lukke gapet mellom rørendene, åpner du låsesystemet og kutter noen mm av spenningsbåndet. Gjenta dette til nøyaktig sløyfelukking oppnås (figur 1A).
- Hvis rørmaterialet er veldig mykt og har en tendens til å gli inn i spenningsbåndene, fest løkken med elektrisk tape til spenningsbåndet (figur 1B, C).
- Forbered en ekstra løkke av PVC for temperaturkontroll med samme dimensjoner som testløkkene.
- Fest løkkene i sløyfeholderen til rotasjonsenheten utenfor vannbadet. Deretter fester du sløyfeholderen til rotasjonsenheten inne i vannbadet (figur 1E).
- Demonter spenningsbåndet delvis fra løkkene og koble fra den ene enden av hvert rør for å åpne løkken.
- Fyll forsiktig hver løkke med 5 ml blod med en 5 ml serologisk pipette. Bland blod forsiktig to ganger i glassbegeret ved sakte pipettering opp og ned før du laster inn i løkkene.
- Ta engangstermometeret og plasser det inne i temperaturkontrollsløyfen. Hvis termometeret er for stort, kutt det med saks for å passe mindre rør. Fyll løkken med 5 ml avionisert vann ved romtemperatur.
- Lukk løkkene og kontroller om løkkene, spenningsbåndene og stativet er riktig montert.
- Sett rotasjonshastigheten til 30 runder per minutt (rpm) og roter i 3 timer.
- Klipp to 50 cm lange stykker av hvert rørmateriale (indre diameter 5 mm) med rørkutteren. Sørg for at skjæreflaten er flat, da dette er spesielt viktig for perfekt lukking for løkkene med små diametere, slik at blodet strømmer uten forvrengning på monteringskanten.
- Loop montering for testing virkningen av feil loop nedleggelse (gap)
- Forbered fire løkker (polyPVC) som beskrevet i 2.2.
- Lukk to av løkkene riktig med spenningsbåndene og unngå eventuelle mellomrom mellom rørendene.
- For de to andre løkkene plugg de åpne endene inn i det større røret som beskrevet i 2.2.3, men la et gap på 1-2 mm mellom loopendene. Ikke bruk spenningsbåndene for disse løkkene (figur 1D).
- Forbered en temperaturkontrollsløyfe som beskrevet i 2.2.7 og 2.2.11.
- Fyll alle løkker med blod som beskrevet i 2.2.10.
- Sett rotasjonshastigheten til 30 o/min og roter i 3 timer.
- Sløyfemontering for stenttesting
- Forbered fire løkker som beskrevet i 2.2 og følgende.
MERK: For å vurdere blodbiokompatibiliteten til stenter, bør selve slangematerialet testes for å være biokompatibelt for å forhindre maskering av celleaktivering. Hvis det ikke finnes data, kan selve rørmaterialet testes som beskrevet i 2.2. Videre kan diameterområdet i stenten påføres (se produsentens instruksjoner) og bør passe til rørmaterialets indre diameter. - Åpne to av løkkene og ta røret ut av spenningsbåndsystemet.
- Sett stenten inn i midten av røret i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk de to andre løkkene uten stent som kontroll. Fyll alle løkker med blod som beskrevet i 2.2.10.
- Sett rotasjonshastigheten til 30 o/min og roter i 3 timer.
- Forbered fire løkker som beskrevet i 2.2 og følgende.
- Temperaturkontroll
- Når som helst under varighet og når rotasjonen stoppes, indikeres temperaturen i blodet inne i løkkene av termometeret inne i temperaturkontrollsløyfen. For å lese av temperaturen, stopp rotasjonen og les umiddelbart av temperaturen som indikeres av termometeret.
3. Blodprøvebehandling
- Etter rotasjon, la løkkene stå i stativet i 2 min i en oppadgående stilling for å la blodet akkumuleres på bunnen av løkkene, unngå søling mens du åpner løkkene.
- Inspiser blodet igjen for statiske forhold: Hvis dette blodet er koagulert, mistenkes en feil heparinisering til slutt. I dette tilfellet gjentar du eksperimentet fortrinnsvis også med en annen blodgiver.
- Ta forsiktig løkkene ut av stativet. Åpne kontaktene og la blodet strømme inn i et 10 ml glassbeger.
- Pool blodet fra rørene som kjøres i duplikater.
- Tegn friskt blod for baselineanalyse fra samme donor som beskrevet i 1,5 og 1,6.
- Innsamling av natriumsitratblod
- For innsamling av natriumsitratblod, fyll fire 1,5 ml rør, hver med 111 μL natriumsitratoppløsning samlet inn fra natriumsitratrør, for å generere en endelig konsentrasjon på 3,2% natriumsitrat.
- Fyll hvert rør med 1 ml blod fra glassbegeret som beskrevet i 1,6 og 3,3.
- Hold blodet ved romtemperatur og bruk dette blodet til FACS-analyser som beskrevet i 12.
MERK: Hvis du vil endre lengden på løkkene for ulike eksperimentelle oppsett, planlegger du aliquots på riktig måte basert på mengden målinger som skal gjøres. Det kan være nødvendig å etablere alle nødvendige målinger med friskt blod før de virkelige eksperimentene for å sikre at blodvolumet i løkkene er nok for alle målinger.
- Innsamling av blod- og plasmaprøver av etylendiamintetrakesyre (EDTA).
- Fra hvert glassbeger med blod (se 1,6 og 3,3) overfører du 4,5 ml blod til ett 5 ml EDTA-rør. Fyll to EDTA-rør fra hvert 10 ml glassbeger med blod.
- Bland forsiktig blodet og hold det på is.
- Overfør 2 ml blod til et 2 ml låsesentrigeringsrør og bruk dette blodet til blodcelletall og gratis hemoglobinmåling som beskrevet i 5. Og 6.
- Sentrifuger det gjenværende blodet ved 3500 x g i 20 min.
- Samle nøye plasmaet i supernatanten i 500 μL aliquots og umiddelbart fryse ved -80 °C.
4. Skanne elektronmikroskopi og μCT-bilder
- Etter blodprøvebehandling skyll de tømte løkkene som er utarbeidet i 2,3 med 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) hver.
- Klipp forsiktig av en 1 cm lang prøve fra hver ende av hvert rør med en skalpell.
- Inkuber prøve over natten ved 4 °C i en 2% glutaraldehyd oppløsning.
FORSIKTIG: Innånding av aldehyddamp kan forårsake nesesymptomer som en rennende nesemåhold vedvarende stuffiness og luftveisirritasjon, og kontakt med hud forårsaker dermatitt. Aldehyder bør håndteres i en røykhette mens du bruker hansker, en beskyttende kjole og vernebriller. - Skyll prøven (3 ganger) med PBS.
- Forbered en 1% løsning av osmiumtetroksid (OsO4) i deionisert vann og inkuber prøven i 15 min ved romtemperatur.
FORSIKTIG: OsO4 er et sterkt oksidasjonsmiddel, det kan reduseres ved eksponering for lys. For å unngå reduksjon under tilberedning, oppbevar OsO4 i en brun glassflaske. OsO4 er ekstremt flyktig, røyken er giftig for øyne, nese og hals. Arbeid alltid under en røykhette og bruk hansker og verneklær, slik at ingen del av kroppen utsettes for OsO4. Ta kontakt med institusjonens retningslinjer for håndtering av avfallshåndtering og lagring. Generelt er OsO4 oppbevarbar i flere måneder, men den trenger spesielle glassflasker med Teflon liner og en desiccator, fordi OsO4 kan misfarge indre overflater og innhold i kjøleskapet i nærvær av lekkende røyk. - Ta ut prøver, overfør dem i en ny 15 ml sentrifuge rør og skyll prøver 3 ganger med PBS.
- Forbered en serie etanol med varierende konsentrasjoner (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
- Dehydrere prøver i etanol: inkubere i 20 min hver i 25%, 50%, 75% og 90% og 30 min i 100%.
- Ta prøver ut av 100% etanol og la den lufttørke over natten ved romtemperatur.
- Undersøk prøver i skanneelektronmikroskopet med en akselerasjonsspenning på 5 kV og med røntgen-μCT-skanneren.
5. Antall blodceller
- Ta 2 ml EDTA-blodet som er oppnådd som beskrevet i 3.7.3
- Sett røret inn i den automatiserte hematologianalysatoren og følg produsentens instruksjoner.
6. Måling av gratis hemoglobin (fHb) i plasma
- Tin en plasmaprøve fra hver tilstand oppnådd som beskrevet i 3,7,5. Oppbevares på is etter tining.
MERK: Tine alltid frosne plasmaprøver i et vannbad ved 37 °C og overfør umiddelbart til is, som inneholder litt vann, for å senke temperaturen. Dette er viktig for å unngå aktivering av blodkomponenter under tining. - Bruk fHb-reagensen og følg produsentens anvisninger. Unngå kontaminering etter åpning og beskytt reagensen mot direkte lys (sol, UV-lys).
- Bruk en pipetteringsordning (se produsentens anvisninger) med 1:5 fortynning.
- Tilsett 1000 μL hemoglobinreagens i en 1,6 ml semimikro cuvette. Bruk denne cuvette til å bestemme den tomme verdien.
- Tilsett 1000 μL hemoglobinreagens og 250 μL av plasmaprøven i en annen semimikro cuvette.
- Bland innholdet i begge cuvettes ved å skylle pipetten grundig ved gjentatte ganger å fylle med reaksjonsblanding, og inkubere minst 3 min ved romtemperatur.
- Bestem utryddelse (E) av prøven mot fHb reagens som blank reagens. Beregn fHb-konsentrasjonen (mmol/l) av prøven: E540-E680 x 0,452.
7. Måling av FPA
- Tin en plasmaprøve fra hver tilstand oppnådd som beskrevet i 3.7.5 og oppbevares på is etter tining.
- Bruk FPA Elisa-settet, og følg produsentens instruksjoner.
8. Måling av sC5b9
- Tin en plasmaprøve fra hver tilstand oppnådd som beskrevet i 3.7.5 og oppbevares på is etter tining.
- Bruk sC5b-9 ELISA-settet, og følg produsentens anvisninger.
9. Måling av PMN
- Tin en plasmaprøve fra hver tilstand oppnådd som beskrevet i 3.7.5 og oppbevares på is etter tining.
- Bruk PMN-Elastase ELISA-settet, og følg produsentens anvisninger.
10. Måling av TNF
- Mikroplater må være belagt en dag før elisa kjøres. For belegg, tilsett 100 μL av fangst antistoffoppløsning til alle brønner, tetningsplate og inkuber over natten ved 2 °C-8 °C.
- Tin en plasmaprøve fra hver tilstand oppnådd som beskrevet i 3,7,5. Oppbevares på is etter tining.
- Bruk TNF ELISA-settet, og følg produsentens instruksjoner.
11. Måling av IL-6
- Mikroplater må være belagt med fange antistoffer en dag før eksperimentet. For belegg, tilsett 100 μL av fangst antistoffoppløsning til alle brønner av mikroplaten som følger med settet, tetningsplaten og inkuber over natten ved 4 °C
- Tin en plasmaprøve fra hver tilstand oppnådd som beskrevet i 3,7,5. og oppbevares på is etter tining.
- Bruk IL-6 ELISA-settet, og følg produsentens instruksjoner..
12. FACS-analyser
- Forbered 500 ml FACS-buffer ved å tilsette 10 ml føtalkalvenserum og 2 ml EDTA-oppløsning (0,5 M) til 488 ml 1x PBS. FACS-bufferen kan lagres i 4 uker ved 4 °C.
- Bruk 100 μL av natriumsitratblodet (se 3.6.3) for hver fargingsprosedyre (monocyttplateaggregater (MPA), blodplateaktivering (PA), leukocytterintegrins (LI)).
- Pipette 100 μL blod fra hver prøve til et 5 ml FACS-rør. Fra hver prøve, forberede 3 rør for antistoff farging og etikett med MPA (monocytt blodplate aggregater) panel, PA (blodplate aggregater) panel og LI (leukocytt integrin) panel.
- Bland resten av de 4 prøvene i ett 5 ml FACS-rør. Bruk denne blandingen for uopphetede og fluorescens minus en (FMO) kontroller.
- Forbered 6 FACS-rør ved å pipetter 100 μL av det blandede prøveblodet i hvert rør. Merk 3 rør som uopphetede og 3 rør som FMO-CD41, FMO-CD62P og FMO-CD162.
- Tilsett 100 μL av 4% paraformaldehydløsning og inkuber i 15 min i mørket ved romtemperatur.
FORSIKTIG: Paraformaldehyd er giftig for hud og øyne. Det kan forårsake alvorlig lungeirritasjon ved innånding og kan føre til lungeskade etter langvarig eksponering. Videre er det klassifisert som et kreftfremkallende og et reproduktivt toksin. Bruk alltid hansker og vernebriller og arbeid under røykhetten. - Tilsett 1 ml vaskebuffer i hvert rør og sentrifuge ved 287 x g i 5 min. Kast det overnaturlige og gjenta vasketrinnet to ganger.
- For røde blodlegemer (RBC) lysis, tilsett 1 ml 1x buffer RBC lysis buffer (fortynne 10x RBC lysis buffer i deionisert vann), bland ved sakte pipettering opp og ned og inkubere i 5 min ved RT i mørket.
- Forbered kompensasjonsperler for enkle flekker. Til 1 ml FACS-buffer legger du til 4 dråper av hver positive og negative perler. Vortex grundig og tilsett 100 μL perler løsning til en 5 ml FACS rør.
- Forbered 4 rør med perler og etikett som CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC og CD62P-PE. Tilsett 1 ml FACS buffer til hvert rør og sentrifuge ved 287 x g i 5 min. Kast overnaturlig og hold på isen.
- Etter RBC lysis, tilsett 1 ml FACS-buffer til hvert rør og vask som beskrevet i 12.7. Kast overnaturlig.
- Forbered antistoffcocktailer:
- MPA-panel: Tilsett 4 μL CD45-APC, 4 μL CD14-FITC og 4 μL CD41-BV421 til 388 μL FACS-buffer.
- PA-panel: Tilsett 1,6 μL CD41-BV421 og 12 μL CD62P-PE til 386,4 μL FACS-buffer.
- LI-panel: Tilsett 4 μL CD45-APC og 8 μL CD162-BV421 til 388 μL FACS-buffer. Hold deg på isen.
- Klargjør enkeltflekker: Tilsett 0,5 μL til 499,5 μL FACS-buffer hver for CD14-FITC, CD41-BV421 og CD45-APC. For CD62P-PE legg til 0,3 μL til 499,7 μL FACS-buffer. Hold deg på isen.
- Klargjør FMO-kontroller: (i) MPA-panel (FMO-CD41): Tilsett 1 μL CD14-FITC-antistoff og 1 μL CD45-APC-antistoff til 98 μL FACS-buffer. (ii) PA-panel (FMO-CD62P): Tilsett 0,4 μL CD41-BV421 til 99,6 μL FACS-buffer. (iii) LI-panel (FMO-CD162): Tilsett 1 μL CD45-APC til 99 μL FACS-buffer. Hold FMO-kontroller på is.
- Vortex antistoffcocktailer og tilsett 100 μL av hver antistoffcocktail som tilberedt i 12,12 til hver av de respektive merkede rørene (MPA, PA og LI-panel) som beskrevet i 12.3 og bland forsiktig ved å pipetter opp og ned. Hold på RT i mørket.
- Vortex single stain antistoff fortynninger og tilsett 100 μL av enkelt flekk antistoff fortynninger som tilberedt i 12,13. til hver av de respektive merkede rørene med perler som beskrevet i 12,7 og bland forsiktig ved å pipetter opp og ned. Hold på RT i mørket.
- Vortex FMO antistoffcocktailer og tilsett 100 μL av hver FMO-1 antistoffcocktail tilberedt i 12.14. til hver av de respektive merkede rørene (FMO-kontroller) som beskrevet i 12,5. og bland forsiktig ved å pipetter opp og ned. Hold på RT i mørket.
- Inkuber alle rør med antistofffarging i 30 min ved RT i mørket.
- Ta de tre rørene for uopphetet kontroll (se 12.4) og gjenoppliv pellet i 250 μL FACS buffer. Hold deg på isen.
- Etter inkubasjonstid, vask alle rør unntatt uopphetede kontroller en gang med FACS-buffer som beskrevet i 12.7. Resuspend pellet i 250 μL FACS buffer og skaffe data om strømningscytometeret.
- Bruk uopphetede celler for negative innstillinger og kompensasjon museperler for positive innstillinger i FACS programvare. Videre bruker du FMO til å kontrollere gating strategien, hvor FMO-CD41 brukes i MPA-panelet, FMO-CD62P brukes i PA-panelet og FMO-CD162 brukes i LI-panelet.
- Skaff deg nesten 0,5 x 106 - 0,25 x 106 hendelser per rør for FACS. Lagre data og analyser med en analyseprogramvare (versjon 9.9.6).
Representative Results
Alle presenterte data, unntatt FACS-plott, ble analysert med en statistikkprogramvare. FACS-plottene ble analysert ved hjelp av strømningscytometriprogramvare.
Analysen av antall hele blodceller viste ingen signifikante forskjeller med hensyn til erytrocytter mellom alle testede forhold (figur 2). Men blodplater og leukocytter ble drastisk redusert i lateksgruppen, noe som indikerer en svært dårlig biokompatibilitet av lateks. Dette understrekes videre av økte nivåer av fritt hemoglobin i lateksgruppen, noe som indikerer at bortsett fra latexgruppen førte ingen av de andre vaskulære enhetene eller forholdene til omfattende hemolyse (figur 2). Videre førte de belagte PVC-rørene, polyPVC og hepPVC, samt den testede stenten ikke til trombose ved hjelp av blodplate- og leukocytttap, mens lateks viste det høyeste blodplate- og leukocytttapet, etterfulgt av ubestrøkede PVC-rør som viste en redusert trend.
Mens alle testede vaskulære enheter førte til økt aktivering av koagulasjonssystemet (FPA) og komplementkomponenten (sC5b-9), viste hepPVC-løkkene en trend for reduserte nivåer av FPA og sC5b-9 sammenlignet spesifikt med polyPVC-løkker (figur 3). Interessant, ubestrøket PVC og Gap looper viste lavere nivåer av FPA sammenlignet med polyPVC, men ikke nå nivået av statistisk signifikans. Likevel viste latekssløyfer signifikant økte nivåer av FPA sammenlignet med baseline og statiske forhold.
I samsvar med antall hele blodceller viste lateksløkker de høyeste nivåene av TNF, IL-6 og PMN-elaastase (figur 4), og nådde nivået av statistisk signifikans sammenlignet med resten av gruppene når det gjelder TNF og IL-6 (figur 4A,B), mens statiske og baselineforhold i form av PMN-elaastase (figur 4C). Disse resultatene indikerer den potente aktiveringen av leukocytter ved lateks. Baseline nivåer av aktiveringsmarkører var alltid sammenlignbare med statiske forhold, noe som indikerer en riktig heparinisering av blodet.
Interessant, det ble vist at blodplate- og leukocytter for gapinduserte løkker bare ble litt redusert med moderat aktivering av koagulatorisk system (FPA) og leukocytter (PMN-elaastase), selv om feil sløyfelukking med resulterende strømningsturbulenser og blodkontakt til ubestrøket, grov skjæreflate førte til makrooskopisk synlige blodpropper ved skjøten (figur 1F). Blodproppene og fordelingen over hele skjøteoverflaten var tydelige med μCT- og SEM-bilder, mens det ikke ble funnet blodpropp da løkkene ble lukket med den eksterne lukkeenheten, slik at det ikke var noe gap mellom sløyfeendene (figur 5).
Flow cytometrisk analyse av vertsblodceller som var farget med blodplatespesifikke markører, CD41 og blodplateaktiveringsmarkør CD62P, er vist i figur 6A, B. Her viste lateksrørene svært høy median fluorescensintensitet (MFI) for CD62P på blodplater, etterfulgt av stent, mens heparinbelagte polyPVC-rør viste minimal aktivering av blodplater som viser antitrombogen egenskap av polyPVC-rør. Videre ble leukocytter klassifisert basert på CD45 og SSC (side scatter) basert detaljnivå i (i) granulocytter; (ii) monocytter og (iii) lymfocytter (figur 7), og uttrykket av CD162+ integrin ble oppdaget på hver underpopulasjon av leukocytter som er kjent for å samhandle med CD62P på blodplater24. Det ble lagt merke til at de integrinske uttrykkene ble drastisk redusert på granulocytter og lymfocytter i lateksløkker. Dette resultatet var i tråd med senket nivåer av totale frekvenser av leukocytter i lateksløkkene (figur 2). Generelt var integrinske nivåer høyere blant monocytter sammenlignet med granulocytter og lymfocytter, noe som indikerer sannsynligheten for monocyttinteraksjonen med aktiverte blodplater. I denne forbindelse ble monocyttplateaggregater også evaluert ved å farge blodcellene med CD14 (som monocyttmarkør) og CD41 (som blodplatemarkør) og til slutt å identifisere doble positive celler, det vil si CD14+CD41+MPA (figur 8). Her la vi merke til at stentgruppen viste de høyeste nivåene av CD41-uttrykk på MPA, etterfulgt av latexgruppen, noe som indikerer en økt tendens til å danne MPA, til tross for redusert frekvens av monocytt (<1 %) i lateksløkkene.
Figur 1: Oversikt over in vitro hemodynamisk sløyfemodell og modifikasjoner. (A) Loop for gapet eksperiment med ekstern loop lukke system, slik at ingen gap på skjøten. (B) Loop laget av polyPVC belagt PVC rør og stent inne (pil). (C) Loop laget av lateksrør. (D) Loop for gapet eksperiment uten ekstern sløyfe lukke systemet forlater et gap mellom rørender (pil). (E) Løkker plassert i sløyfen vugge inne i vannbadet og fylt med blod. (F)Trombe resulterer i et hull på skjøten (pilen) etter rotasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Resultater for blodcelleantall og plasmahemoglobin. (A) Erytrocytter teller. (B) Blodplater teller. (F)Leukocytter teller. (D)Gratis plasma hemoglobin. Resultatene indikerer dårlig biokompatibilitet av lateks, noe som fører til overdreven hemolyse. Data presenteres som gjennomsnittsverdi; feilfelt indikerer SEM. n=1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Resultater for aktivering av koagulasjons- og komplementsystemet. (A) Aktivering av koagulasjonssystem, målt etter nivåer av Fibrinopeptide A (FPA) (B) Komplementsystemaktivering, målt ved nivåer av sC5b-9. Mens lateksrør fremkalte betydelige forhøyede nivåer av FPA, var komplementaktiveringen sterk for alle testede materialer. Data presenteres som gjennomsnittsverdi, feilfelt indikerer SEM. *p<0,05, n=1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Leukocyttaktiveringsmarkører. (A)Tumor nekrose faktor alfa (TNF). (B) Interleukin 6 (IL-6) (C) PMN Elase. Resultatene indikerer økt aktivering av leukocytter på grunn av forhøyede nivåer av de analyserte markørene, etterfulgt av stentløkker, som bare førte til økte nivåer for PMN Elastase, men ikke TNF eller IL-6. Data presenteres som gjennomsnittsverdi, feilfelt indikerer SEM. *p<0.5; **p<0,01, n=1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bilde av spleisen på løkkene. (A) μ-computer tomografi (μCT) av løkker med feil lukking (gap). De røde områdene indikerer trombemateriale. (B)Gjengivelse av armatursiden av røret. Det rektangulære valget indikerer området for skanning av elektronmikroskopi (SEM) (C). (D) μCT av løkker med ekstern sløyfe lukkeenhet og ingen mellomrom på skjøten, og (E) gjengivelse og visning av armaturoverflaten. Ingen trombemateriale ble funnet. (F) SEM bilde av det rektangulære valget i (E). Det ble ikke funnet noe trombemateriale på skjæreoverflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: FACS-plott for blodplateaktivering (CD62P). (A)Representativ FACS plott (grunnleggende tilstand) som viser blodet CD41+ blodplater. (B) Graf som viser blodplateaktiveringsstatusen som gjenspeiles av gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av de forskjellige typene vaskulære enheter sammenlignet med de statiske RT- og baselineforholdene. Datastolper viser data fra enkeltmålinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: FACS tomt for leukocytter integrin (CD162). (A)Representativ FACS plot (grunnleggende tilstand) som viser blodet CD45+ leukocytter og undergrupper (B) Graf som viser leukocytter CD162+ integrin gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) av de ulike typer vaskulære enheter i forhold til statiske og baseline forhold. Datastolper viser data fra enkeltmålinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: FACS-plott for blodplatemoncyttaggregater (CD41/CD14). (A)Representativ FACS plot (grunnleggende tilstand) som viser gating for blod monocytter (CD45+/ CD14+), blodplater (CD41+) og monocytt blodplateaggregater (CD41+/ CD14+) (B) Graf som viser CD41+ gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) på monocytt blodplateaggregater for de ulike vaskulære enheter sammenlignet med statiske og baseline forhold. Datastolper viser data fra enkeltmålinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne studien har vist at den presenterte in vitro hemodynamic loop modellen tilbyr en pålitelig metode for å teste in vitro blodkompatibilitet av medisinsk utstyr i samsvar med ISO 10993-4 standard.
Kritiske trinn i protokollen inkluderer tegning av blod og fylling av rørene med blod, hvor overdreven vakuum eller agitasjon bør unngås for å hindre blodkomponentene fra aktivering ved håndteringsprosedyren. Videre er det svært viktig å umiddelbart fryse plasmaprøvene og holde dem på is etter tining, da komplement- og koagulasjonssystemet aktivering kan tukles ved å holde prøvene på romtemperatur i lengre tid.
Siden denne modellen har både fortjeneste og demerits sammenlignet med andre in vitro-modeller, må flere faktorer tas i betraktning mens du utformer eksperimentene.
For det første kan løkkene varieres i lengde og diameter for å passe ulike eksperimentelle oppsett. I tilfelle oppsettet inkluderer kontrastrør med varierende indre diameter, bør det holdes i bakhodet at forskjellene i diameter vil resultere i forskjellige skjærkrefter, og dermed påvirker koagulasjonen og utfyller kaskade7. For det andre ble rotasjonshastigheten satt til 30 rpm i dette eksperimentet. Dette vil resultere i en blodstrøm på ca 25 cm / s, noe som kan sammenlignes med blodstrømmen hastighet i menneskelig koronar bypass grafts25. Belastningshastigheten, generert av rotasjonen av løkkene, er den viktigste parameteren som vil initiere biokjemiske kaskader av blodkomponenter, inkludert celler og cellefrie proteiner. Men siden blod er en ikke-newtonsk væske, vil belastningshastigheten også bli påvirket av rørkurven, henholdsvis lengden på rørene som er lukket for løkker10. Når rotasjonshastigheten eller sløyfestørrelsen endres, er det viktig å tenke på at korrelasjonen mellom belastningshastighet og rotasjonshastighet ikke er lineær. Sammenhengen mellom rotasjonshastigheten og belastningshastigheten undersøkes ikke tilstrekkelig før i dag, og videre studier er nødvendig for å undersøke disse spesielleparametrene 10,26,27. Men basert på en modell for laminær grenselag, den gitte rørdiameteren på 5 mm og rotasjonshastigheten på 25 cm/s, en grov estimering av veggskjærstresset (WS S) ville indikere verdier mellom 2,20-22,00 pascal for en avstand på 1,00-0,01 mm til veggen av røret når blodtettheten er anslått til å være 1060 kg * m-3 og kinetical viskositet er satt til 0,0025 pascal * s28,29. Interessant, også en mer detaljert beregningsanalyse av flytdynamikk i krumningen av menneskelige koronararterier viste WSS-verdier fra 11,33 til 16,77 pascal ved omtrent sammenlignbare parametere for hastigheten, tettheten og viskositeten til blodet30.
Ved siden av denne begrensningen er den presenterte sløyfemodellen et trykk mindre system, som ikke etterligner de intravaskulære blodtrykksforholdene i det menneskelige vaskulære systemet.
Neste viktige begrensning er at blodet er i kontakt med luft inne i løkkene, noe som gir ekstra forstyrrelser. En slik blod-luftkontakt påvirkes av to parametere, som inkluderer gasspermeabiliteten til rørene og beholder luft inne i løkkene mens du fyller dem med blod. Hvert rørmateriale har en viss gasspermeabilitet som kan føre til betydelige endringer i gasskonsentrasjoner inne i rørene. Mens noen forfattere sier at den resulterende effekten av gasspermeabiliteten på aktivering av blodkomponenter forbliruklart 31,er det kjent at funksjonen til blodkoagulatorene er svært følsom for et pH-skift, som kan skyldes CO2 diffusjon32,33,34. Her har vi testet biokompatibiliteten av blodperfusjonsrør under innendørs luftforhold, sammenlignbare med kliniske scenarier av ekstrakorporal blodperfusjon. For fremtidige forbedringer av den presenterte modellen kan inkubasjon av hele modellen i en CO2 inkubator og utføre blod pH-validering før og etter inkubasjon være nyttig for å ytterligere standardisere denne modellen.
Også blod-luft-grensesnittet inne i løkkene kan føre til aktivering av plasmaproteiner og cellefraksjoner av blodet35,36. Rullepumpedrevne enheter uten luft inne i rørene kan unngå problemet med blod-luft-grensesnitt, men de sikkert indusere skade på blodceller med betydelige forhøyede nivåer av hemoglobin sammenlignet med her presentert loop modell, og hemoglobin i plasma kan forstyrre følsomheten av testede analytter i ELISA16. I denne studien har vi vist at den hemolytiske effekten av sløyfemodellen i seg selv forblir minimal mens du bruker biokompatibele materialer som heparinbelagte PVC-rør. Dermed er modellen på den ene siden ikke forårsaker overdreven celleskade sammenlignet med pumpedrevne modeller, men på den annen side induserer plasmaproteiner på grunn av blodluftkontakt. Av notatet, van Oeveren et al. utviklet en kuleventil basert sløyfe modell unngå luft inne i løkkene16. Dette lovende alternativet til den her presenterte sløyfemodellen kan overvinne problemet med blod-luft-grensesnittet, men sammenlignet med modellen som presenteres her, er blodplateadhesjon fortsatt høyere for kuleventilbasert sløyfemodell.
Når det gjelder statisk kontroll, er det av oppmerksom på at glass i seg selv har vist seg å være en potent aktivator av koagulatorsystemet37. I det presenterte oppsettet førte imidlertid ikke inkubasjon i et glassbeger (statisk kontroll) til overdreven vertscelleaktivering eller aktivering av koagulatorisk system sammenlignet med baselinenivåene rett etter at blodet ble trukket. Til slutt kan det være nyttig å bruke for eksempel polypropylenrør, hvis den statiske kontrollen viser høye aktiveringsnivåer.
Uansett om det er en sløyfebasert eller en pumpedrevet modell, mangler disse in vitro-modellene helt de autentiske biologiske interaksjonene som hovedsakelig bidrar av et intakt endotel, som er en ideell blodkontaktoverflate. Begrunnelsen bak dette problemet er tydeligere når en medisinsk enhet som en stent blir testet, noe som kan gi forskjellige resultater, når det gjelder aktivering og plasmaproteiner, under samspillet med blodkomponenter i nærvær av endotel. Dette erklærer å være en stor ulempe for alle diskuterte in vitro-systemer som etterligner sirkulasjonssystemet. Derfor, for å overvinne dette problemet, nye mikrofluidiske systemer som er helt dekket med endotel får enorm interesse, men likevel i forhold til loop modellen presenteres her, de er fortsatt begrenset til å imøtekomme mindre blodvolumer og minimale strømningshastigheter38,39
Dermed konkluderer vi med at Chandler Loop-modellen gjenstår å være en robust modell for å gjennomføre standardiserte tester på blodbiokompatibiliteten til vaskulær medisinsk utstyr innen kardiovaskulær forskning.
Disclosures
Funder [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Tyskland] ga en økonomisk støtte i form av forbruksvarer og publiseringsavgifter til forfatteren av dette manuskriptet [Max Wacker]. Funders hadde ingen ytterligere rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeide av manuskriptet.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige til Ms. Elena Denks for hennes tekniske hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
| BD LSR Fortessa II cell analyzer | Becton Dickinson | 647465 | |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | Becton Dickinson | 369714 | |
| BD Vacutainer one-use holder | Becton Dickinson | 364815 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
| Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
| Beaker glass ROTILABO short 50 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X688.1 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
| Centrifuge ROTINA 420 | 420 R | Hettich Zentrifugen | 4701 | 4706 | |
| Centrifuge tubes, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| CHC Super modified, 5mm PVC tubing | Corline Sweden | 1807-148 | Referred to as hepPVC tube |
| Circular Precision Cutter | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 007-20 | |
| Closing Unit (complete with tension bands) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 008-20 | |
| Electric tape Scotch Super 33+ | VWR | MMMA331933 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 | BioLegend | 430504 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a | BioLegend | 430204 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000012 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000020 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000047 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue | Eppendorf AG | 3123000063 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000055 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet | Eppendorf AG | 3123000071 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom | Corning BV | 352052 | |
| Fetal bovine serum Gold Plus | Bio-Sell | FBS.GP.0500 | |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 367116 | |
| Fluency plus stent 13.5 x 60 mm | Angiomed GmbH & Co | FVM14060 | |
| Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
| Gibco PBS Tablets | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Gloves Vasco Nitril white L | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208437 | |
| Gloves Vasco Nitril white M | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208429 | |
| Glutaraldehyde 25% aequous solution | Sigma Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, 25.000 IE in 5 ml | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN 3862340 | |
| Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit | Hölzel Diagnostika | abx253234 | |
| Kodan tincture forte colourless | Schülke & Mayr GmbH | 104012 | |
| Latex tube, ID 5 mm | Laborhandel24 GmbH | 305 0507 | |
| Loop Stand | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 009-20 | |
| Medimex venous tourniquet classic | ROESER Medical GmbH | 310005 | |
| Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex | Tecan | TEC006418I | |
| Microplate shaker PMS-1000i | VWR | 444-0041 | |
| Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm | VWR | NALG8703-0508 | Referred to as PVC tube |
| NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
| Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
| Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| PE anti-human CD16Antibody | BioLegend | 302008 | |
| PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody | BioLegend | 304906 | |
| Pipette controller, pipetus | VWR | 612-1874 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5186480 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 9409410 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.870 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000µl blue | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.919 | |
| PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
| Probe stand ROTILABO combi | CARL ROTH | K082.1 | |
| Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 011-20 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
| Reagent reservoirs | VWR | 613-1184 | |
| Rotation Unit | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 010-20 | |
| Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409320 | |
| Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409331 | |
| sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
| Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG | Philips | n.a. | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X715.1 | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X714.1 | |
| Semi-micro cuvette 1.6 ml | Sarstedt | 67.746 | |
| Serological pipette 10.0 ml | Corning BV | 4488 | |
| Serological pipette, 25.0 ml | Corning BV | 4489 | |
| Serological pipette, 5.0 ml | Corning BV | 4487 | |
| Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm | VWR | BURK8803-0812 | |
| Sprout mini centrifuge | Biozym | 552034 | |
| Stop Solution for TMB Substrate | BioLegend | 77316 | |
| Swabs, sterile | Fuhrmann GmbH | 32055 | |
| Syringe, 10 ml | Becton Dickinson | 300296 | |
| Temperature controlled water basin | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 020-20 | |
| tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | 10000730 | |
| TMB Substrate Set | BioLegend | 421101 | |
| Trillium PVC tube, 5 mm ID | Medtronic | 161100107100103 | Referred to as polyPVC tube |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0250 | |
| UV-Vis Spektrometer Lambda 2 | Perkin Elmer | 33539 | |
| Vornado Mini Vortexer | Biozym | 55BV101-B-E | |
| XN-3000 workstation blood analyzer | Sysmex Europe | n.a. | |
| μ-CT Phoenix Nanotom S | GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany | n.a. |
References
- International Organisation for Standardisation. DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood. International Organisation for Standardisation. , (2017).
- Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum. Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).
- Maiolini, R., et al. A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor. Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).
- Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
- Betke, U., et al. Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study. Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus. Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).
- Fink, H., et al. An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).
- Lenz-Habijan, T., et al. Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model. Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).
- Olsen, A. L., Long, M. Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
- Feyerabend, F., et al. Blood compatibility of magnesium and its alloys. Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).
- Lukas, K., et al. Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane. Materials. 10 (4), Basel, Switzerland. 355 (2017).
- Paul, A., et al. Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).
- Link, A., et al. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. Journal of Visualized Experiments. (157), e60610 (2020).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. 2012, 673163 (2012).
- Maa, Y. F., Hsu, C. C. Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface. Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).
- Fletcher, E. A. K., et al. Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics. International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue. Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).
- Gong, J., et al. Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model. Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).
- Tevaearai, H. T., et al. Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility. The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).
- Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils. Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).
- Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries. Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).
- Gardner, R. A. An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).
- Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis. Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).
- Böswirth, L. Technische Strömungslehre. 8 edn. , Springer Vieweg. (2010).
- Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers. Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).
- Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis. Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).
- Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space. Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).
- Foley, M. E., McNicol, G. P. An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage. The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).
- Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study. The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).
- Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood. Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).
- Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface. Micromachines. 11 (1), Basel. 18 (2019).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
