Summary
Presenteras här är ett protokoll för en standardiserad in vitro hemodynamic loop modell. Denna modell gör det möjligt att testa hemocompatibility av perfusionsrör eller vaskulär stent vara i enlighet med ISO (International Organization for Standardization) standard 10993-4.
Abstract
I denna studie jämfördes hemocompatibilityen av rör med en inre diameter av 5 mm gjort av polyvinylchlorid (PVC) och belagt med olikt bioactive konjugates till obestruket PVC rör, latexrör, och en stent för intravaskulär applikation som placerades insida PVC-rören. Utvärdering av hemocompatibility gjordes med hjälp av en in vitro hemodynamic loop modell som rekommenderas av ISO-standarden 10993-4. Rören skars i segment av identisk längd och stängdes för att bilda slingor undvika eventuella gap vid skarv, sedan fylls med humant blod och roteras i ett vattenbad vid 37 °C i 3 timmar. Därefter samlades blodet inuti rören för analys av hela blodkroppar, hemolys (gratis plasma hemoglobin), komplementsystem (sC5b-9), koagulationssystem (fibrinopeptide A), och leukocyte aktivering (polymorfouklear elastase, tumörnekrosfaktor och interleukin-6). Host cell aktivering fastställdes för trombocyt aktivering, leukocyte integrin status och monocyter trombocyt aggregat med hjälp av flödescytometri. Effekten av felaktiga loop stängning undersöktes med röntgen mikrotomografi och scanning elektronmikroskopi, som visade trombbildning vid skarv. Latex rör visade den starkaste aktiveringen av både plasma och cellulära komponenter i blodet, vilket indikerar en dålig hemocompatibility, följt av stent gruppen och obestruket PVC rör. De belagda PVC-rören visade inte en signifikant minskning av trombocytaktiveringsstatus, men visade en ökad komplement och koagulationskaskad jämfört med obestrukna PVC-rör. Loopmodellen i sig ledde inte till aktivering av celler eller lösliga faktorer, och hemolysnivån var låg. Därför den presenterade in vitro hemodynamic loop modellen undviker överdriven aktivering av blodkomponenter av mekaniska krafter och fungerar som en metod för att undersöka in vitro-interaktioner mellan givaren blod och vaskulär medicintekniska produkter.
Introduction
Hemocompatibility testning av medicintekniska produkter är ett avgörande steg i utvecklingen av nya enheter såsom vaskulär stent eller perfusionsrör för extrakorporeal membran syresättning. Fram till idag betraktas djurmodeller som standardverktyg för att slutföra proceduren för att testa de medicintekniska enheterna innan det genomförs på människor. Hädanefter är det nödvändigt att finna alternativa in vitro-modeller som ytterligare stöd för att minimera undersökningar på djur. I denna studie har vi därför utforskat en miniatyr in vitro hemodynamic loop modell. Målet med denna presenterade metod är att testa medicintekniska produkters in vitro-blod i enlighet med standarden ISO 10993-4.
ISO 10993-4-standarden beskriver standardiserade uppsättningar kliniska parametrar som ska undersökas på blodexemplar1. Kortfattat är dessa trombos (trombocys (trombocytaggregation och räkning), koagulation (fibrinopeptide A, FPA), blodsjukdomar analys (hela blodkroppar), hemolysindex (fritt plasma hemoglobin) och komplementsystemet (terminal komplementkomplex, sC5b9). Ytterligare markörer, såsom neutrofil polymorfonuklear elastase (PMN), interleukin 6 (IL-6) och tumörnekrosfaktor - alfa (TNF) som återspeglar aktiveringsstatus av leukocyter kan dock också redovisas för mätningar. För att bestämma och att kvantifiera de cirkulerande cell fria proteiner som finns i blodplasma, sandwich enzymatisk länkade immunosorbent assay (ELISA) representerar en konventionell och mest tillförlitligametod 2,3. Likaså kan hostcellens fenotyp och aktiveringsstatus (t.ex. leukocyter) kvantifieras genom att detektera cellytan uttryck för molekyler genom flödescytometri (FACS) som ger encelliga suspension baserade avläsningar, där fluorescerade specifika antikroppar binder till de riktade cellytansmolekyler 4. Scanning elektronmikroskopi (SEM) rekommenderas också att bestämma trombbildning på det testade materialet av ISO 10993-4 standard1. Denna metod kan kompletteras med röntgenmikrotomografi (μCT), för att utföra strukturell analys av trombusen t.ex., dess tjocklek, storlek och lokalisering i en 3D-renderad bild5.
Logiken bakom med hjälp av denna in vitro-hemodynamiska modellen är att skärmen för de bästa och kompatibla medicintekniska produkter genom att förstå den grundläggande fysiologiska dynamiken i blodkomponenter såsom blodplättar, som är involverade i den primära hemostas eller leukocyter och deras interaktion med olika typer av kärltekniska produkter. Sådana in vitro-system är mycket efterfrågade eftersom de minskar behovet av djurstudier.
Den här presenterade loopmodellen uppfyller dessa krav. Denna modell beskrevs först av A.B. Chandler 1958 för produktion av blod thrombi och är, därför, även kallad Chandler Loop modell6. Hittills har denna modell använts i en serie experiment och modifieringar för att undersöka blod biokompatibiliteten hos medicintekniskaprodukter 7,8,9,10,11,12,13,14. Den består av polymerrör, som delvis fylls med blod och formas till återklosbara slingor. Dessa slingor roterar i ett temperaturkontrollerat vattenbad för att simulera kärlflödesförhållanden med dess hemorheologiska effekter. Alternativa metoder som pumpdrivna modeller eller modeller som använder mekaniska kulventiler inuti slingorna för att framkalla ett blodflöde inuti polymerrören har redan beskrivits15,16. Den totala fördelen med den här presenterade metoden är dock att den mekaniska kraft som appliceras på blodkropparna och proteinerna är låg, undvika hemolys, och det finns ingen kontakt mellan blod och kontaktdon, som eventuellt kan leda till flödesturbulenser och aktivering av blodkomponenter. De viktigaste aktiverande faktorerna inuti slingan är själva testmaterialet och luften som är instängd. Detta bidrar till att minimera källor för mätning fel och att leverera en hög reproducerbarhet, även om blod-luft gränssnittet kan leda till protein denaturering17. Det är också möjligt att undersöka sorter av slangmaterial och stentdiametrar utan längd eller storleksbegränsningar och därigenom tillåta användning av rör av olika längd och innerdiameter. Dessutom är värd hemocompatibilities på felaktiga slinga stängning och exponering för den obelagda röret ytan är också möjligt att undersöka. Andra liknande medicinska tillämpningar av denna in vitro-hemodynamic loop modell är att det också skulle kunna användas för att studera samspelet mellan immunotherapeutics (läkemedel) och blodkomponenter under antingen preklinisk utveckling eller enskilda läkemedelssäkerhet screening före första-i-man fas I klinisk prövning, eller för generering av trombmaterial som kan användas i ytterligare experiment18,19,20.
Denna studie beskriver ett detaljerat protokoll för testning av hemocompatibilitiesna av perfusionsrör och/eller stent. Här, jämförelsen mellan obelagda och belagda PVC-rör (hepPVC: heparinbeläggning, polyPVC: beläggning med en bioaktiv polymer). Sänkt aktivering av trombocyter, men en högre aktivering av koagulationssystemet (FPA) hittades för båda belagda rören i jämförelse med de obelagda rören. De hepPVC-rör som används här modifieras med kovalent bundet heparin för att göra dem tromboresistanta21 och har redan varit anställda i en loopmodell för att optimera och karakterisera olika parametrar22. De polyPVC-rör som används i denna studie är kommersiellt tillgängliga rör som används i kliniska inställningar av extrakorporeal blodperfusion och är belagda med en heparinpolymer för att minska deras trombogenicitet23. Ibland, i kliniska tillämpningar även obestruket PVC-rör används. Därför inkluderade vi latexrör som en positiv kontrollgrupp som visade överdriven aktivering av trombocyter, koagulationssystem och lösliga faktorer som IL-6, TNF och PMN elastase. Thrombus bildandet märktes när felaktiga loop stängningen var simulerad. Detta ledde till aktivering av koagulering och komplementsystem samt leukocyter och trombocyter jämfört med baslinjeförhållandena. Vidare blod kontakt till här används stent material (bare metal nitinol stent, täckt med kol-impregnerade expanderade polytetrafluoreten) ledde till högre trombocyt och leukocyt aktivering i termer av PMN elastase. Sammantaget inducerar den presenterade modellen inte hemolys i någon av de testade kärlapparaterna eftersom de var jämförbara med baslinjen eller statiska förhållanden, utom för latexrören, där röda blodkroppar (RBC) hemolys var uppenbar. Dessa perfusionsrör kan dessutom undersökas antingen genom bildframställning eller genom histologi. Även om histologiska utvärderingar kan vara genomförbara, fokuserade vi främst på ELISA och flödescytometri för att utföra dessa experiment och därmed möjliggöra feasibilities att utföra experiment baserade på den här presenterade modellen för många laboratorier. Således representerar denna metod en genomförbar metod för att testa blod biokompatibiliteten hos vaskulär medicintekniska produkter i enlighet med rekommendationerna i ISO 10993-4-standarden. Vidare kan denna metod användas närhelst en interaktion mellan blod och material ska testas under flödesförhållanden, härma in vivo-förhållandena.
Protocol
Denna studie godkändes av etikkommittén för den medicinska fakulteten vid Universitetssjukhuset Magdeburg (ansökningsnummer 88/18) och försökspersonerna lämnade skriftligt informerat samtycke före blodritningsförfarandet.
1. Heparinlagerberedning och blodprovstagning
- Beräkna mängden blod som behövs för hela experimenten.
OBS: Nästan krävs 5 mL hepariniserat blod för varje kärlanordning i dubbletter (slingor). Likaså krävs 5 mL blod för varje baslinje och statiskt tillstånd som hålls åt sidan vid rumstemperatur. - Bered en heparin stamlösning vid koncentrationen av 100 IU/mL genom att späda det ofrfraktionerade heparin (t.ex. Rotexmedia) i avjoniserat vatten. Använd 150 μL av denna lösning för hepariniseringen av 10 mL färskt blod.
- Beräkna mängden blod samt plasma som behövs för helblodsantal, ELISA och FACS analyser.
OBS: De mätningar som representeras i denna studie erhålls från två slingor som löper parallellt (en som dubblett) med en total blodvolym på 10 mL. - Baserat på den erforderliga mängden blod, fyll 10 mL-sprutor med 150 μL heparin stamlösning för att förhindra blodkoagulation med en slutlig heparinkoncentration av 1,5 IU/mL blod.
- Rita blod med hjälp av en fjäril (storlek: 21 G). Fyll sprutorna mycket försiktigt för att undvika hemolys eller cellaktivering på grund av överdrivet vakuum.
OBS: Tillstånd från den lokala etiska kommittén bör erhållas innan experimenten påbörjas. Inhämta informerat samtycke från varje mänsklig blodgivare. Se till att blodgivaren är frisk och inte tar någon medicin, särskilt inga antiplatelet medel eller icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel i minst 10 dagar före experimenten. Att notera, är samma givare föredras när man jämför olika typer av vaskulära enheter för första gången som presenteras i detta manuskript. För att ytterligare utvärdera de inter-individuella skillnaderna kan protokollet upprepas med olika givare. - Samla blod i en glasbägare, undvik överdriven agitation.
2. In vitro hemodynamic loop församling
- Fyll vattenbadet tills vattennivån når upp till mitten av rotationsenheten. Ställ in vattentemperaturen på 37 °C.
- Loop-montering för provning av olika slangmaterial (polyPVC, hepPVC, PVC och latex)
- Skär två 50 cm långa bitar av varje rörmaterial (innerdiameter 5 mm) med rörskäraren. Se till att skärytan är plan, eftersom detta är särskilt viktigt för perfekt tillslutning för öglorna med små diametrar så att blodet flyter utan någon förvrängning på den passande kanten.
OBS: Hela detta protokoll utnyttjar rören med en innerdiameter på 5 mm. - För att underlätta hanteringen och för att undvika fördröjning efter provbearbetning efter rotation, kör du endast fyra slingor (2 material i dubbletter) parallellt.
- För att generera en slingform, plugga rörens öppna ändelser i en kort bit kiselrör som passar den yttre diametern på utredningsröret.
- Använd polykarbonatspänningsbanden för att säkerställa korrekt stängning av slingorna. När du används för första gången, justera längden på banden för att passa den yttre diametern på slingan genom att skära spänningsbandet med sax i erforderliga längder och säkra den med en 3 mm momentnyckel.
- Dra försiktigt åt spännskruven på spännbandskontakten under inspektion av röränddelarna. Justera stängningskraften så att inget mellanrum blir kvar mellan röränderna. Om låsskruven är helt åtdragen och spänningen i polykarbonatbandet verkar för låg för att stänga mellanrummet mellan röränderna, öppna låssystemet och skär några mm av spännbandet. Upprepa detta, tills korrekt slinga stängning uppnås (Bild 1A).
- Om slangmaterialet är mycket mjukt och tenderar att glida inuti spännbanden, fixera öglan med eltejp på spännbandet (Figur 1B,C).
- Förbered en extra slinga av PVC för temperaturkontroll med samma dimensioner som testslingorna.
- Säkra slingorna i rotationsenhetens slingvagga utanför vattenbadet. Därefter fäster du öglans vagga på rotationsenheten inne i vattenbadet (Bild 1E).
- Demontera spänningsbandet delvis från slingorna och dra ur kontakten ena änden av varje rör för att öppna slingan.
- Fyll varsamt varje slinga med 5 mL blod med en 5 mL serologisk pipett. Blanda blod försiktigt två gånger i glasbägaren genom att långsamt pipettera upp och ner innan du laddar i slingorna.
- Ta engångstermometern och placera den inuti temperaturkontrollslingan. Om termometern är för stor, klipp den med sax för att passa mindre rör. Fyll slingan med 5 mL avjoniserat vatten i rumstemperatur.
- Stäng slingorna och se till om slingorna, spännbanden och racket är ordentligt monterade.
- Ställ in rotationshastigheten på 30 omgångar per minut (varv/min) och rotera i 3 h.
- Skär två 50 cm långa bitar av varje rörmaterial (innerdiameter 5 mm) med rörskäraren. Se till att skärytan är plan, eftersom detta är särskilt viktigt för perfekt tillslutning för öglorna med små diametrar så att blodet flyter utan någon förvrängning på den passande kanten.
- Loop montering för provning av inverkan av felaktig slinga stängning (gap)
- Förbered fyra slingor (polyPVC) enligt beskrivningen i 2.2.
- Stäng två av slingorna ordentligt med spännbanden och undvik eventuellt mellanrum mellan rörändorna.
- För de andra två slingorna pluggar de öppna ändelserna i det större röret enligt beskrivningen i 2.2.3, men lämna ett mellanrum på 1-2 mm mellan slingändorna. Använd inte spännbanden för dessa slingor (bild 1D).
- Förbered en temperaturkontrollslinga enligt beskrivningen i 2.2.7 och 2.2.11.
- Fyll alla slingor med blod enligt beskrivningen i 2.2.10.
- Ställ in rotationshastigheten på 30 varv/min och rotera i 3 h.
- Loop-montering för stentprovning
- Förbered fyra slingor enligt beskrivningen i 2.2 och följande.
OBS: För att bedöma blodbiokompatibiliteten hos stent ska själva slangmaterialet testas för att vara biokompatibelt för att förhindra maskering av cellaktivering. Om inga data finns kan själva rörmaterialet testas enligt beskrivningen i 2.2. Vidare kan diameterområdet inom stenten appliceras (se tillverkarens anvisningar) och ska passa rörmaterialets innerdiameter. - Öppna två av slingorna och ta röret ut ur spänningsbandsystemet.
- Sätt in stenten i mitten av röret enligt tillverkarens anvisningar.
- Använd de andra två slingorna utan stent som kontroll. Fyll alla slingor med blod enligt beskrivningen i 2.2.10.
- Ställ in rotationshastigheten på 30 varv/min och rotera i 3 h.
- Förbered fyra slingor enligt beskrivningen i 2.2 och följande.
- Temperaturkontroll
- När som helst under varaktighet och när rotationen stoppas, indikeras blodets temperatur inuti slingorna med termometern inuti temperaturkontrollslingan. För att läsa av temperaturen, stoppa rotationen och omedelbart läsa av den temperatur som indikeras av termometern.
3. Bearbetning av blodprov
- Efter rotation, låt slingorna stå i racket i 2 min i ett uppåtgående läge för att låta blodet samlas i botten av slingorna, undvika eventuella spillande samtidigt som man öppnar slingorna.
- Inspektera blodet som lämnas för statiska förhållanden: Om detta blod är koagulerat, misstänks i slutändan en felaktig heparinisering. I detta fall, upprepa experimentet helst också med en annan blodgivare.
- Ta försiktigt slingorna ut ur racket. Öppna kontakterna och låt blodet flöda in i en glasbägare på 10 mL.
- Pool blodet från rören som körs i dubbletter.
- Dra färskt blod för baslinjeanalys från samma donator som beskrivs i 1,5 och 1,6.
- Insamling av natriumcitratblod
- För insamling av natriumcitratblod, fyll fyra 1,5 mL-rör, var och en med 111 μL natriumcitratlösning som samlats in från natriumcitratrör, för att generera en slutlig koncentration på 3,2% av natriumcitrat.
- Fyll varje rör med 1 mL blod från glasbägarna enligt beskrivningen i 1.6 och 3.3.
- Håll blodet i rumstemperatur och använd detta blod för FACS-analyser enligt beskrivningen i 12.
OBS: För att ändra längden på slingorna för olika experimentella uppställningar, korrekt planera alikvoter baserat på mängden mätningar som skall göras. Det kan vara nödvändigt att fastställa alla erforderliga mätningar med färskt blod före de verkliga experimenten för att säkerställa att volymen av blod i slingorna är tillräckligt för alla mätningar.
- Insamling av etylendiamintetraättiksyra (EDTA) blod- och plasmaprover.
- Från varje glasbägare med blod (se 1.6 och 3.3) överför 4,5 ml blod till ett 5 ml EDTA-rör. Fyll två EDTA-rör från varje 10 ml glasbägare med blod.
- Blanda försiktigt blodet och håll det på is.
- Överför 2 mL blod till ett 2 mL låscentrifugationsrör och använd detta blod för blodcellsräkning och fri hemoglobinmätning enligt beskrivningen i 5. Och 6.
- Centrifugera det återstående blodet vid 3 500 x g i 20 min.
- Samla försiktigt upp plasman i supernatanten i 500 μL alikvoter och frys omedelbart vid -80 °C.
4. Scanningelektronmikroskopi och μCT-bilder
- Efter blodprovsbearbetning, skölj de tömda slingorna som beretts enligt beskrivningen i 2.3 med 10 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) vardera.
- Skär försiktigt av ett 1 cm långt prov från varje ände av varje rör med en skalpell.
- Inkubera prov över natten vid 4 °C i en 2% glutaraldehydlösning.
VARNING: Inandning av aldehydångor kan orsaka nasala symtom som en rinnande näsa malm ihållande stuffiness och luftvägarna irritation, och kontakt med huden orsakar dermatit. Aldehyder bör hanteras i en rök-huva medan du bär handskar, en skyddande klänning och skyddsglasögon. - Skölj provet (3 gånger) med PBS.
- Bered en 1% lösning av osmiumtetroxid (OsO4) i avjoniserat vatten och inkubera prov i 15 min vid rumstemperatur.
VAR FÖRSIKTIG: OsO4 är ett starkt oxiderande medel, det kan minskas genom exponering för ljus. För att undvika minskningen under beredningen, förvara OsO4 i en brun glasflaska. OsO4 är extremt flyktigt, dess ångor är giftiga för ögon, näsa och hals. Arbeta alltid under en fume-huva och använd handskar och skydda kläder, se till att ingen del av kroppen utsätts för OsO4. Kontakta din institutions riktlinjer gällande hantering av avfallshantering och förvaring. I allmänhet är OsO4 lagringsbar i flera månader, men det behöver speciella glasflaskor med Teflon liner och en exsiccator, eftersom OsO4 kan missfärga inre ytor och innehåll i kylskåpet i närvaro av läckande ångor. - Ta ut prover, överför dem i en ny 15 mL centrifugrör och skölj prover 3 gånger med PBS.
- Bered en serie etanol med varierande koncentrationer (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
- Torka prover i etanol: inkubera i 20 min vardera i 25%, 50%, 75% och 90% och 30 min i 100%.
- Ta prover av 100% etanol och låt den lufttorka över natten i rumstemperatur.
- Undersök prover i svepelektronmikroskopet vid en accelerationsspänning på 5 kV och med röntgen μCT-skannern.
5. Blodcellsräkning
- Ta 2 mL av EDTA-blodet som erhålls enligt beskrivningen i 3.7.3
- Sätt in röret i den automatiserade hematologianalysatorn och följ tillverkarens anvisningar.
6. Mätning av fritt hemoglobin (fHb) i plasma
- Tina ett plasmaprov från varje tillstånd som erhålls enligt beskrivningen i 3.7.5. Förvaras på is efter upptining.
OBS: Tina alltid frysta plasmaprover i ett vattenbad vid 37 °C och överför omedelbart till is, innehållande lite vatten, för att sänka temperaturen. Detta är viktigt för att undvika aktivering av blodkomponenter under upptining. - Använd fHb-reagensen och följ tillverkarens anvisningar. Undvik kontaminering efter öppning och skydda reagensen mot direkt ljus (sol, UV-ljus).
- Använd ett pipettschema (se tillverkarens anvisningar) med 1:5-utspädning.
- Tillsätt 1000 μL av hemoglobinreagensen i en 1,6 mL semi-mikro-cuvette. Använd den här cuvette för att bestämma det tomma värdet.
- Tillsätt 1000 μL av hemoglobinreagensen och 250 μL av plasmaprovet i en annan halvmikrisk cuvette.
- Blanda innehållet i båda cuvettes genom att spola pipetten noggrant genom att upprepade gånger fylla med reaktionsblandning, och inkubera minst 3 min i rumstemperatur.
- Bestäm provets utplåning (E) mot fHb-reagens som blankreagens. Beräkna provets fHb-koncentration (mmol/l) : E540-E680 x 0,452.
7. Mätning av FPA
- Tina ett plasmaprov från varje tillstånd som erhålls enligt beskrivningen i 3.7.5 och förvaras på is efter upptining.
- Använd FPA Elisa-kitet och följ tillverkarens anvisningar.
8. Mätning av sC5b9
- Tina ett plasmaprov från varje tillstånd som erhålls enligt beskrivningen i 3.7.5 och förvaras på is efter upptining.
- Använd sC5b-9 ELISA-kit och följ tillverkarens anvisningar.
9. Mätning av PMN
- Tina ett plasmaprov från varje tillstånd som erhålls enligt beskrivningen i 3.7.5 och förvaras på is efter upptining.
- Använd PMN-Elastase ELISA-kit och följ tillverkarens anvisningar.
10. Mätning av TNF
- Mikroplattor måste beläggas en dag innan elisa körs. För beläggning, tillsätt 100 μL avfångningsantikroppslösning till alla brunnar, tätningsplatta och inkubera över natten vid 2 °C-8 °C.
- Tina ett plasmaprov från varje tillstånd som erhålls enligt beskrivningen i 3.7.5. Förvaras på is efter upptining.
- Använd TNF ELISA-kitet och följ tillverkarens anvisningar.
11. Mätning av IL-6
- Mikroplattor måste beläggas med capture-antikroppar en dag före försöket. För beläggning, tillsätt 100 μL avfångningsantikroppslösning till alla brunnar i mikroplattan som medföljer setet, tätningsplattan och inkubera över natten vid 4 °C
- Tina ett plasmaprov från varje tillstånd som erhålls enligt beskrivningen i 3.7.5. och förvara på is efter upptining.
- Använd IL-6 ELISA-kit och följ tillverkarens anvisningar..
12. FACS-analyser
- Förbered 500 mL FACS buffert genom att lägga till 10 mL av fetala kalv serum och 2 mL EDTA lösning (0,5 M) till 488 mL av 1x PBS. FACS-bufferten kan förvaras i 4 veckor vid 4°C.
- Använd 100 μL av natriumcitratblodet (se 3.6.3) för varje färgningsförfarande (monocyter trombocytaggregat (MPA), trombocytaktivering (PA), leukocytintgrinor (LI)).
- Pipett 100 μL blod från varje prov till ett 5 mL FACS-rör. Från varje prov, förbereda 3 rör för antikropp färgning och etikett med MPA (monocyter trombocytaggregat) panel, PA (trombocytaggregat) panel och LI (leukocyte integrin) panel.
- Blanda resten av de 4 proverna i ett 5 mL FACS-rör. Använd denna mix för obefläckade och fluorescens minus en (FMO) kontroller.
- Förbered 6 FACS-rör genom pipettering av 100 μL av det blandade provblodet i varje rör. Etikett 3 rör som obefläckade och 3 rör som FMO-CD41, FMO-CD62P och FMO-CD162.
- Tillsätt 100 μL av 4% paraformaldehydlösning och inkubera i 15 min i mörker vid rumstemperatur.
FÖRSIKTIGHET: Paraformaldehyd är giftigt för hud och ögon. Det kan orsaka allvarlig lungirritation vid inandning och kan leda till lungskador efter långvarig exponering. Vidare klassificeras det som ett cancerframkallande ämne och ett reproduktionstoxin. Använd alltid handskar och skyddsglasögon och arbeta under draghuven. - Tillsätt 1 mL tvättbuffert till varje rör och centrifug vid 287 x g i 5 min. Kassera supernatanten och upprepa tvättsteget två gånger.
- För röd blodkropp (RBC) lys, tillsätt 1 mL 1x buffert RBC lysbuffert (späd 10x RBC lysbuffert i avjoniserat vatten), blanda genom att långsamt pipettera upp och ner och inkubera i 5 min vid RT i mörker.
- Förbered kompensationspärlor för enstaka fläckar. Till 1 mL FACS buffert tillsätt 4 droppar av varje positiva och negativa pärlor. Vortex grundlig och tillsätt 100 μL av pärlor lösning till en 5 mL FACS rör.
- Förbered 4 rör med pärlor och etikett som CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC och CD62P-PE. Tillsätt 1 mL FACS-buffert till varje rör och centrifug vid 287 x g i 5 min. Kassera supernatant och hålla på is.
- Efter RBC-lys, tillsätt 1 mL FACS-buffert till varje rör och tvätta enligt beskrivningen i 12.7. Kassera supernatant.
- Förbered antikroppscocktails:
- MPA-panel: Tillsätt 4 μL CD45-APC, 4 μL CD14-FITC och 4 μL CD41-BV421 till 388 μL av FACS-buffert.
- PA-panel: Tillsätt 1,6 μL CD41-BV421 och 12 μL CD62P-PE till 386,4 μL AV FACS-buffert.
- LI panel: Tillsätt 4 μL CD45-APC och 8 μL CD162-BV421 till 388 μL AV FACS buffert. Håll dig på is.
- Förbered enstaka fläckar: Tillsätt 0,5 μL till 499,5 μL FACS-buffert vardera för CD14-FITC, CD41-BV421 och CD45-APC. För CD62P-PE tillsätt 0,3 μL till 499,7 μL FACS buffert. Håll dig på is.
- Förbered FMO-kontroller: (i) MPA-panel (FMO-CD41): Tillsätt 1 μL CD14-FITC-antikropp och 1 μL CD45-APC-antikropp till 98 μL FACS-buffert. ii) PA-panel (FMO-CD62P): Tillsätt 0,4 μL CD41-BV421 till 99,6 μL FACS-buffert. iii) LI-panel (FMO-CD162): Tillsätt 1 μL CD45-APC till 99 μL FACS-buffert. Håll FMO kontroller på is.
- Vortex antikroppscocktails och tillsätt 100 μL av varje antikroppscocktail enligt berett i 12.12 till vart och ett av de respektive märkta rören (MPA, PA och LI panel) enligt beskrivningen i 12.3 och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner. Håll på RT i mörkret.
- Vortex enda fläck antikropp utspädningar och tillsätt 100 μL av den enda fläcken antikropp utspädningar som framställs i 12,13. till vart och ett av de respektive märkta rören med pärlor enligt beskrivningen i 12.7 och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner. Håll på RT i mörkret.
- Vortex FMO antikropp cocktails och tillsätt 100 μL av varje FMO-1 antikropp cocktail som beredd i 12,14. till var och en av de respektive märkta rören (FMO-kontroller) enligt beskrivningen i 12.5. och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner. Håll på RT i mörkret.
- Inkubera alla rör med antikroppsfärgning i 30 min vid RT i mörker.
- Ta de tre rören för ej fastställd kontroll (se 12.4) och resuspend pellet i 250 μL FACS buffert. Håll dig på is.
- Efter inkubationstiden tvätta alla rör utom obefläckade kontroller en gång med FACS buffert enligt beskrivningen i 12.7. Resuspend pellet i i 250 μL av FACS buffert och förvärva data om flödescytometern.
- Använd obefläckade celler för negativa inställningar och kompensationsmuspärlor för positiva inställningar i FACS-programvara. Vidare, använd FMO för att styra gating-strategin, där FMO-CD41 används i MPA-panelen, FMO-CD62P används i PA-panelen och FMO-CD162 används i LI-panelen.
- Förvärva nästan 0,5 x 106 - 0,25 x 106 händelser per rör för FACS. Spara data och analysera med en analysprogramvara (version 9.9.6).
Representative Results
Alla presenterade data, utom FACS tomter, analyserades med en statistik programvara. FACS tomter analyserades med hjälp av flöde cytometry programvara.
Analysen av helblodskroppsräkningen visade inte på några signifikanta skillnader med avseende på erytrocyter mellan alla testade tillstånd (figur 2). Men, trombocyter och leukocyter minskade drastiskt i latex gruppen, vilket tyder på en mycket dålig biokompatibilitet latex. Detta understryks ytterligare av ökade nivåer av fritt hemoglobin i latexgruppen, vilket indikerar det faktum att förutom för latexgruppen ledde ingen av de andra kärlapparaterna eller förhållandena till omfattande hemolys (Figur 2). Vidare ledde de belagda PVC-rören, polyPVC och hepPVC, liksom den testade stenten inte till trombos med hjälp av trombocyt- och leukocyteförlust, medan latex uppvisade den högsta förlusten av trombocyter och leukocyter, följt av obestrukna PVC-rör som visade en minskad trend.
Medan alla testade vaskulära enheter ledde till ökad aktivering av koagulationssystemet (FPA) och komplementkomponent (sC5b-9), uppvisade hepPVC-slingorna en trend för minskade nivåer av FPA och sC5b-9 när de jämfördes specifikt med polyPVC-slingor (figur 3). Intressant, obestruket PVC och Gap slingor visade lägre nivåer av FPA jämfört med polyPVC, men inte når nivån av statistisk signifikans. Trots detta uppvisade latexslingor betydligt ökade nivåer av FPA när de jämfördes med baslinje och statiska förhållanden.
I enlighet med helblodskroppstalet uppvisade latexslingor högsta nivåerna av TNF, IL-6 och PMN-elastas (Figur 4), som nådde nivån av statistisk signifikans när man jämför med resten av grupperna vad gäller TNF och IL-6 (figur 4A,B), medan det gäller statiska och utgångsläge i termer av PMN-elastas (Figur 4C). Dessa resultat indikerar den potenta aktiveringen av leukocyter genom latex. Baslinjenivåerna för aktiveringsmarkörer var alltid jämförbara med statiska förhållanden, vilket indikerar en korrekt heparinisering av blodet.
Intressant nog visades det att trombocyt- och leukocytetal för gapinducerade slingor endast reducerades något med måttlig aktivering av koagulatorsystemet (FPA) och leukocyter (PMN-elastas), fast felaktig loopförslutning med resulterande flödesturbulenser och blodkontakt till den obelagda, grova skärytan ledde till makroskopiskt synliga proppar vid skarvningen (Figur 1F). Propparna och dess fördelning över hela skarvytan var tydliga med μCT- och SEM-bilder, medan ingen propp hittades när slingorna stängdes med den externa stängningsanordningen som inte lämnade något mellanrum mellan slingändeänderna (figur 5).
Flödescytmetrisk analys av värdblodceller som färgats med blodplättsspecifika markörer, CD41 och trombocytaktiveringsmarkören CD62P, visas i figur 6A,B. Här uppvisade latexrören ytterst hög medianfluorescensintensitet (MFI) för CD62P på blodplättar, följt av stent, medan heparinbelagda polyPVC-rör uppvisade minimal aktivering av trombocyter som skildrar anti-thrombogenic egenskap hos polyPVC-rör. Vidare klassificerades leukocyter baserat på CD45 och SSC (sidosprid) baserad granularitet i (i) granulocyter; ii) monocyter och (iii) lymfocyter (figur 7), och uttrycket av CD162+ integrin upptäcktes på varje subpopulation av leukocyter som är kända för att interagera med CD62P på trombocyter24. Det märktes att de integrin uttrycken minskade drastiskt på granulocyter och lymfocyter i latex loopar. Detta resultat var i linje med sänkta nivåer av totala frekvenser av leukocyter i latexslingorna (Figur 2). I allmänhet var integrinnivåerna högre bland monocyter vid jämförelse med granulocyter och lymfocyter, vilket indikerar sannolikheten för monocytinteraktionen med aktiverade trombocyter. I detta avseende utvärderades även monocyter trombocytaggregat genom färgning av blodkropparna med CD14 (som monocytemarkör) och CD41 (som trombocytmarkör) och slutligen för att identifiera dubbla positiva celler d.v.s. CD14+CD41+MPA (Figur 8). Här märkte vi att stentgruppen uppvisade de högsta nivåerna av CD41-uttryck på MPA, följt av latexgruppen, vilket indikerar en ökad tendens att bilda MPA, trots den minskade frekvensen av monocyt (<1 %) i latexslingorna.
Figur 1: Översikt över den in vitro-hemodynamic loopmodellen och dess modifieringar. (A) Loop för gapet experiment med extern slinga stängningssystem, lämnar inget mellanrum vid skarv. (B) Slinga tillverkad av polyPVC belagt PVC-rör och stent inuti (pil). (C) Slinga tillverkad av latexrör. (D) Slinga för gapet experiment utan den yttre slingan stängningssystem lämnar ett mellanrum mellan röret ändelser (pil). (E) Slingor placerade i slingan vagga inuti vattenbadet och fylld med blod. (F) Tromb som resulterar i en lucka vid skarv (pil) efter rotation. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Resultat för blodcellsräkning och plasma hemoglobin. (A) Erytrocyter räknas. (B) Trombocyter räknas. (F) Leukocyter räknas. (D) Gratis plasma hemoglobin. Resultaten indikerar den dåliga biokompatibiliteten av latex, vilket leder till överdriven hemolys. Data presenteras som medelvärde; felstaplar indikerar SEM. n=1. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Resultat för aktivering av koagulerings- och komplementsystemet. (A) Aktivering av koagulationssystem, mätt med nivåer av Fibrinopeptide A (FPA) (B) Komplementsystemaktivering, mätt med nivåer av sC5b-9. Medan latex rör framkallat betydande förhöjda nivåer av FPA, var komplement aktiveringen stark för alla testade material. Data presenteras som medelvärde, felstaplar indikerar SEM. *p<0,05, n=1. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Leukocyte aktiveringsmarkörer. (A) Tumörnekrosfaktor alfa (TNF). (B) Interleukin 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Resultaten indikerar ökad aktivering av leukocyter på grund av förhöjda nivåer av de analyserade markörerna, följt av stentslingor, som bara ledde till ökade nivåer för PMN Elastase men inte TNF eller IL-6. Data presenteras som medelvärde, felstaplar indikerar SEM. *p<0.5; **p<0,01, n=1. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Avbildning av slingornas skarv. (A) μ-datortomografi (μCT) av slingor med felaktig stängning (gap). De röda områdena indikerar trombmaterial. (B) Återgivning av rörets luminala sida. Det rektangulära urvalet anger området för svepelektronmikroskopi (SEM) (C). (D) μCT av slingor med yttre slinga stängningsanordning och ingen lucka vid skarv, och (E) återgivning och vy av luminal ytan. Inget trombmaterial hittades. (F) SEM-bild av det rektangulära urvalet i (E). På skärytan hittades inget trombmaterial. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 6: FACS-plot för trombocytaktivering (CD62P). (A) Representativ FACS-plot (grundtillstånd) som visar blodet CD41 + trombocyter. (B) Diagram som visar aktiveringsstatus för trombocyter som återspeglas av medelvärdet för fluorescensintensentlighet (MFI) för de olika typerna av kärlanordningar i jämförelse med de statiska RT- och utgångsförhållandena. Datastaplarna presenterar data från enstaka mätningar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 7: FACS-plot för leukocyte integrin (CD162). (A) Representativt FACS-plot (grundtillstånd) som visar blodet CD45+ leukocyter och undergrupper (B) Graf som visar leukocyten CD162+ integrin medelvärde fluorescensintensitet (MFI) för de olika typerna av kärlapparater i jämförelse med de statiska och utgångsläge. Datastaplarna presenterar data från enstaka mätningar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 8: FACS-plot för trombocytmonocyteaggregat (CD41/CD14). (A) Representativa FACS-plot (grundförutsättningar) som visar gating för blodmonocyter (CD45+/CD14+), trombocyter (CD41+) och monocyter trombocytaggregat (CD41+/CD14+) (B) Graf som visar CD41+ medelvärdet för fluorescensintensitet (MFI) på monocytplättar för de olika kärlanordningarna jämfört med de statiska och utgångsförhållandena. Datastaplarna presenterar data från enstaka mätningar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Denna studie har visat att den presenterade in vitro-hemodynamic loop-modellen erbjuder en tillförlitlig metod för att testa in vitro-blod kompatibilitet av medicintekniska produkter i enlighet med ISO 10993-4 standard.
Kritiska steg i protokollet inkluderar ritning av blod och fyllning av rören med blod, där överdrivet vakuum eller agitation bör undvikas för att förhindra att blodkomponenterna aktiveras genom hanteringsproceduren. Vidare är det mycket viktigt att omedelbart frysa plasmaproverna och hålla dem på is efter upptining, eftersom komplement- och koagulationssystemets aktivering kan manipuleras genom att hålla proverna på rumstemperaturen under längre tid.
Eftersom denna modell har både förtjänster och nackdelar när man jämför med andra in vitro-modeller, måste flera faktorer beaktas samtidigt utforma experimenten.
Först kan slingorna varieras i längd och diameter för att passa olika experimentella uppställningar. I fall att uppställningen omfattar kontrasterande rör av varierande innerdiametrar, bör man hålla i minnet att skillnaderna i diameter kommer att resultera i olika skjuvkrafter och därigenom påverka koagulation och komplementkaskad7. För det andra var rotationshastigheten inställd på 30 rpm i detta experiment. Detta kommer att resultera i ett blodflöde på cirka 25 cm/s, vilket är jämförbart med blodflödeshastigheten i människans kranskärlsbypasstransplantat25. Töjningshastigheten, som genereras av rotationen av slingorna, är den stora parametern som kommer att initiera biokemiska kaskader av blodkomponenter, inklusive celler och cellfria proteiner. Men eftersom blod är en icke-Newtonsk vätska, kommer stamhastigheten också att påverkas av rörkrökningen, respektive längden på de rör som är stängda för slingor10. Närhelst rotationshastigheten eller slingans storlek ändras är det viktigt att tänka på att korrelationen mellan töjningshastighet och rotationshastighet inte är linjär. Sambandet mellan rotationshastighet och töjningshastighet är inte tillräckligt undersökt förrän idag och ytterligare studier krävs för att undersöka dessa särskilda parametrar10,26,27. Baserat på en modell för laminärgränsskikt kan dock den givna rördiametern på 5 mm och rotationshastigheten på 25 cm/s, en grov uppskattning av väggskjuvningsstressen (WS S) skulle ange värden mellan 2,20-22,00 pascal för en sträcka av 1,00-0,01 mm till väggen av röret när blodtätheten beräknas vara 1060 kg * m-3 och kinetical viskositet är inställd på 0,0025 pascal * s28,29. Intressant, också en mer detaljerad beräkningsanalys av flödesdynamiken i krökning av mänskliga kranskärl visade WSS värden som sträcker sig från 11,33 till 16,77 pascal vid ungefär jämförbara parametrar för hastighet, densitet och viskositet av blodet30.
Bredvid denna begränsning är den presenterade loopmodellen ett tryck mindre system, som inte efterliknar de intravaskulära blodtryckskvoterna i det mänskliga kärlsystemet.
Nästa viktiga begränsning är att blodet är i kontakt med luft inuti slingorna, vilket medför ytterligare störningar. En sådan blod-luftkontakt påverkas av två parametrar, vilket inkluderar rörens gaspermeabilitet och kvarhålla luft inuti slingorna medan de fylls med blod. Varje rörmaterial besitter en viss gaspermeabilitet som kan leda till betydande förändringar i gaskoncentrationer inuti rören. Medan vissa författare uppger att den resulterande effekten av gasen permeabilitet på aktivering av blodkomponenter förbliroklart 31, är det känt att funktionen av blodet koagulatorer är mycket känslig för ett pH-skift, som kan orsakas av CO2 diffusion32,33,34. Här har vi testat biokompatibiliteten av blodperfusionsrör under inomhusluftsförhållanden, jämförbara med kliniska scenarier av extrakorporeal blodperfusion. För framtida förbättringar av den presenterade modellen, inkubation av hela modellen i en CO2 inkubator och utför blod pH validering före och efter inkubation kan vara lämpligt att ytterligare standardisera denna modell.
Också, blod-luft gränssnittet inuti slingorna kan leda till aktivering av plasmaproteiner och cellfraktioner av blodet35,36. Rullpumpen drivna enheter utan luft inuti rören kan undvika frågan om blod-luft gränssnitt, men de säkert framkalla skador på blodkroppar med betydande förhöjda nivåer av hemoglobin jämfört med den här presenterade loop modell, och hemoglobin i plasma kan störa känsligheten hos testade analyter i ELISA16. I denna studie har vi visat att den hemolytiska effekten av loopmodellen själv förblir minimal medan du använder biokompatibla material som heparinbelagda PVC-rör. Således är modellen, å ena sidan, inte orsakar alltför stora cellskador jämfört med pumpdrivna modeller, men å andra sidan inducera plasmaproteiner på grund av blod luftkontakt. Att notera, van Oeveren et al. utvecklat en kul-ventil baserad slinga modell undvika luft inuti slingorna16. Detta lovande alternativ till den här presenterade loop modellen kan övervinna problemet med blod-luft gränssnittet, dock jämfört med den modell som presenteras här, trombocytadhesion är fortfarande högre för kulventilen baserad loop modell.
När det gäller den statiska kontrollen är det av not att glas självt har visat sig vara en potent aktivator av koagulatorsystemet37. I den presenterade setup, inkubation i en glasbägare (statisk kontroll) ledde dock inte till överdriven värdcell aktivering eller aktivering av koagulatoriska systemet jämfört med baslinjen nivåer direkt efter ritning av blodet. Sammanfattningsvis kan det vara bra att använda till exempel polypropylenrör, om den statiska kontrollen visar höga nivåer av aktivering.
Oavsett om det är en slinga baserad eller en pumpdriven modell, saknar dessa in vitro-modeller helt de autentiska biologiska interaktioner som huvudsakligen bidrar med ett intakt endotel, som är en idealisk blodkontaktyta. Logiken bakom denna fråga är mer uppenbar när en medicinteknisk produkt som en stent testas, vilket kan ge olika resultat, när det gäller aktivering och plasmaproteiner, under dess interaktion med blodkomponenter i närvaro av endotel. Detta förklarar vara en stor nackdel av alla diskuterade in vitro-system härma cirkulationssystemet. Därav, för att övervinna denna fråga, nya mikrofluidiska system som är helt täckta med endotel vinner enormt intresse, men ändå i jämförelse med loop modell som presenteras här, de är fortfarande begränsade för att rymma mindre blodvolymer och minimala flödeshastigheter38,39
Således drar vi slutsatsen att Chandler Loop modellen återstår att vara en robust modell för att genomföra standardiserade tester på blodet biokompatibilitet av vaskulär medicintekniska produkter inom området kardiovaskulär forskning.
Disclosures
Finansiären [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Tyskland] gav ett ekonomiskt stöd i form av förbrukningsvaror och publiceringsavgifter till författaren till detta manuskript [Max Wacker]. Finansiärerna hade inte någon ytterligare roll i studiedesignen, datainsamlingen och analysen, beslutet att publicera, eller utarbetande av manuskriptet.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma till Ms Elena Denks för hennes tekniska hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
| BD LSR Fortessa II cell analyzer | Becton Dickinson | 647465 | |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | Becton Dickinson | 369714 | |
| BD Vacutainer one-use holder | Becton Dickinson | 364815 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
| Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
| Beaker glass ROTILABO short 50 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X688.1 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
| Centrifuge ROTINA 420 | 420 R | Hettich Zentrifugen | 4701 | 4706 | |
| Centrifuge tubes, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| CHC Super modified, 5mm PVC tubing | Corline Sweden | 1807-148 | Referred to as hepPVC tube |
| Circular Precision Cutter | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 007-20 | |
| Closing Unit (complete with tension bands) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 008-20 | |
| Electric tape Scotch Super 33+ | VWR | MMMA331933 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 | BioLegend | 430504 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a | BioLegend | 430204 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000012 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000020 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000047 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue | Eppendorf AG | 3123000063 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000055 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet | Eppendorf AG | 3123000071 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom | Corning BV | 352052 | |
| Fetal bovine serum Gold Plus | Bio-Sell | FBS.GP.0500 | |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 367116 | |
| Fluency plus stent 13.5 x 60 mm | Angiomed GmbH & Co | FVM14060 | |
| Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
| Gibco PBS Tablets | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Gloves Vasco Nitril white L | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208437 | |
| Gloves Vasco Nitril white M | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208429 | |
| Glutaraldehyde 25% aequous solution | Sigma Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, 25.000 IE in 5 ml | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN 3862340 | |
| Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit | Hölzel Diagnostika | abx253234 | |
| Kodan tincture forte colourless | Schülke & Mayr GmbH | 104012 | |
| Latex tube, ID 5 mm | Laborhandel24 GmbH | 305 0507 | |
| Loop Stand | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 009-20 | |
| Medimex venous tourniquet classic | ROESER Medical GmbH | 310005 | |
| Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex | Tecan | TEC006418I | |
| Microplate shaker PMS-1000i | VWR | 444-0041 | |
| Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm | VWR | NALG8703-0508 | Referred to as PVC tube |
| NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
| Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
| Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| PE anti-human CD16Antibody | BioLegend | 302008 | |
| PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody | BioLegend | 304906 | |
| Pipette controller, pipetus | VWR | 612-1874 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5186480 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 9409410 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.870 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000µl blue | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.919 | |
| PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
| Probe stand ROTILABO combi | CARL ROTH | K082.1 | |
| Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 011-20 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
| Reagent reservoirs | VWR | 613-1184 | |
| Rotation Unit | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 010-20 | |
| Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409320 | |
| Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409331 | |
| sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
| Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG | Philips | n.a. | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X715.1 | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X714.1 | |
| Semi-micro cuvette 1.6 ml | Sarstedt | 67.746 | |
| Serological pipette 10.0 ml | Corning BV | 4488 | |
| Serological pipette, 25.0 ml | Corning BV | 4489 | |
| Serological pipette, 5.0 ml | Corning BV | 4487 | |
| Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm | VWR | BURK8803-0812 | |
| Sprout mini centrifuge | Biozym | 552034 | |
| Stop Solution for TMB Substrate | BioLegend | 77316 | |
| Swabs, sterile | Fuhrmann GmbH | 32055 | |
| Syringe, 10 ml | Becton Dickinson | 300296 | |
| Temperature controlled water basin | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 020-20 | |
| tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | 10000730 | |
| TMB Substrate Set | BioLegend | 421101 | |
| Trillium PVC tube, 5 mm ID | Medtronic | 161100107100103 | Referred to as polyPVC tube |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0250 | |
| UV-Vis Spektrometer Lambda 2 | Perkin Elmer | 33539 | |
| Vornado Mini Vortexer | Biozym | 55BV101-B-E | |
| XN-3000 workstation blood analyzer | Sysmex Europe | n.a. | |
| μ-CT Phoenix Nanotom S | GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany | n.a. |
References
- International Organisation for Standardisation. DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood. International Organisation for Standardisation. , (2017).
- Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum. Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).
- Maiolini, R., et al. A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor. Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).
- Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
- Betke, U., et al. Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study. Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus. Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).
- Fink, H., et al. An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).
- Lenz-Habijan, T., et al. Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model. Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).
- Olsen, A. L., Long, M. Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
- Feyerabend, F., et al. Blood compatibility of magnesium and its alloys. Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).
- Lukas, K., et al. Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane. Materials. 10 (4), Basel, Switzerland. 355 (2017).
- Paul, A., et al. Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).
- Link, A., et al. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. Journal of Visualized Experiments. (157), e60610 (2020).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. 2012, 673163 (2012).
- Maa, Y. F., Hsu, C. C. Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface. Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).
- Fletcher, E. A. K., et al. Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics. International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue. Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).
- Gong, J., et al. Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model. Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).
- Tevaearai, H. T., et al. Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility. The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).
- Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils. Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).
- Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries. Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).
- Gardner, R. A. An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).
- Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis. Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).
- Böswirth, L. Technische Strömungslehre. 8 edn. , Springer Vieweg. (2010).
- Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers. Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).
- Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis. Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).
- Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space. Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).
- Foley, M. E., McNicol, G. P. An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage. The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).
- Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study. The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).
- Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood. Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).
- Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface. Micromachines. 11 (1), Basel. 18 (2019).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
