Summary
Apresentado aqui é um protocolo para um modelo de loop hemodinâmico in vitro padronizado. Este modelo permite testar a hemocompatibilidade de tubos de perfusão ou stents vasculares de acordo com a norma ISO (Organização Internacional para Padronização) 10993-4.
Abstract
Neste estudo, a hemocompatibilidade de tubos com diâmetro interno de 5 mm feito de cloreto de polivinil (PVC) e revestido com diferentes conjugados bioativos foi comparada a tubos de PVC não revestidos, tubos de látex e um stent para aplicação intravascular que foi colocado dentro dos tubos de PVC. A avaliação da hemocompatibilidade foi feita utilizando-se um modelo de loop hemodinâmico in vitro que é recomendado pela norma ISO 10993-4. Os tubos foram cortados em segmentos de comprimento idêntico e fechados para formar laços evitando qualquer lacuna na emenda, depois preenchidos com sangue humano e girados em um banho de água a 37 °C por 3 horas. Depois disso, foi coletado sangue dentro dos tubos para análise de contagem total de células sanguíneas, hemolise (hemoglobina plasmática livre), sistema de complementação (sC5b-9), sistema de coagulação (fibrinopeptídeo A) e ativação leucócito (elastase polimorfonuclear, fator necrose tumoral e interleucina-6). A ativação de células hospedeiras foi determinada para ativação de plaquetas, status de integrin leucócito e agregados de plaquetas monocitos usando citometria de fluxo. O efeito do fechamento impreciso do loop foi examinado com microtomografia de raios-X e microscopia eletrônica de varredura, que mostrou formação de trombos na emenda. Os tubos de látex mostraram a ativação mais forte tanto do plasma quanto dos componentes celulares do sangue, indicando uma hemocompatibilidade ruim, seguido pelo grupo de stent e tubos de PVC não revestidos. Os tubos de PVC revestidos não apresentaram uma diminuição significativa no estado de ativação de plaquetas, mas apresentaram aumento na cascata de complemento e coagulação em comparação com tubos de PVC não revestidos. O modelo de loop em si não levou à ativação de células ou fatores solúveis, e o nível de hemólise era baixo. Portanto, o modelo de loop hemodinâmico in vitro apresentado evita a ativação excessiva de componentes sanguíneos por forças mecânicas e serve como método para investigar interações in vitro entre sangue doador e dispositivos médicos vasculares.
Introduction
O teste de hemocompatibilidade de dispositivos médicos é um passo crucial no desenvolvimento de novos dispositivos, como stents vasculares ou tubos de perfusão para oxigenação de membrana extracorpórea. Até hoje, os modelos animais são considerados como ferramentas padrão para finalizar o procedimento de teste dos dispositivos médicos antes de sua implementação em humanos. A partir de agora, é necessário encontrar modelos in vitro alternativos que ajudem ainda mais na minimização das investigações sobre animais. Neste estudo, temos explorado, portanto, um modelo de loop hemodinâmico in vitro em miniatura. O objetivo deste método apresentado é testar a compatibilidade sanguínea in vitro dos dispositivos médicos de acordo com a norma ISO 10993-4.
O padrão ISO 10993-4 descreve conjuntos padronizados de parâmetros clínicos a serem investigados na amostra de sangue1. Resumidamente, são trombose (agregação e contagem de plaquetas), coagulação (fibrinopeptídeo A, FPA), análise hematológica (contagem completa de células sanguíneas), índice de hemolise (hemoglobina plasmática livre) e sistema de complementação (complexo terminal de complemento, sC5b9). No entanto, marcadores adicionais, como elastase polimorfonuclear de neutrófilo (PMN), interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose tumoral - alfa (TNF) refletindo o estado de ativação dos leucócitos também podem ser contabilizados para as medições. Para determinar e quantificar as proteínas livres de células circulantes presentes no plasma de sangue, o ensaio imunosorbente ligado ao sanduíche (ELISA) representa um método convencional e mais confiável2,3. Da mesma forma, o fenotipo e o status de ativação das células hospedeiras (por exemplo, leucócitos) podem ser quantificados detectando a expressão da superfície celular das moléculas por citometria de fluxo (FACS) que fornece leituras baseadas em suspensão celular única, onde anticorpos específicos rotulados fluorescentes se ligam às moléculas de superfície celular alvo4. A microscopia eletrônica de varredura (SEM) também é recomendada para determinar a formação de trombos no material testado pelo padrão ISO 10993-41. Este método pode ser complementado com microtomografia de raios-X (μCT), para realizar análises estruturais do trombo, por exemplo, sua espessura, tamanho e localização em uma imagem renderizada 3D5.
A lógica por trás do uso desse modelo hemodinâmico in vitro é a triagem para os dispositivos médicos de melhor desempenho e compatíveis, entendendo a dinâmica fisiológica básica dos componentes sanguíneos, como plaquetas, que estão envolvidos na hemostase primária ou leucócitos e sua interação com diferentes tipos de dispositivos vasculares. Tais sistemas in vitro são altamente demandados, pois reduzem a necessidade de estudos em animais.
O modelo de loop aqui apresentado atende a essas exigências. Este modelo foi descrito pela primeira vez por A.B. Chandler em 1958 para a produção de trombo de sangue e é, portanto, também chamado chandler loop modelo6. Até agora, este modelo tem sido usado em uma série de experimentos e modificações para investigar a biocompatibilidade sanguínea dos dispositivos médicos7,8,9,10,11,12,13,14. Consiste em tubos de polímero, que são parcialmente preenchidos com sangue e moldados em laços re-closable. Estes laços giram em um banho de água controlado pela temperatura para simular condições de fluxo vascular com seus efeitos hemorheológicos. Métodos alternativos como modelos ou modelos acionados por bombas que usam válvulas mecânicas de esfera dentro das alças para induzir um fluxo sanguíneo dentro dos tubos de polímero já foram descritos15,16. No entanto, a vantagem geral do método aqui apresentado é que a força mecânica aplicada às células sanguíneas e proteínas é baixa, evitando a hemólise, e não há contato entre sangue e conectores, o que poderia possivelmente levar a turbulências de fluxo e ativação de componentes sanguíneos. Os principais fatores de ativação dentro do loop são o próprio material de teste e o ar que está preso dentro. Isso ajuda a minimizar as fontes de erro de medição e a fornecer uma alta reprodutibilidade, mesmo que a interface sangue-ar possa levar à desnaturação proteica17. Também é possível investigar variedades de materiais de tubulação e diâmetros de stent sem restrições de comprimento ou tamanho, permitindo assim o uso de tubos de diferentes comprimentos e diâmetro interno. Além disso, hemocompatibilidades hospedeiras sobre fechamento de loop impreciso e exposição à superfície do tubo não revestida também são possíveis de investigar. Outras aplicações médicas similares deste modelo de loop hemodinâmico in vitro é que ele também pode ser usado para estudar as interações entre imunoterapêuticas (drogas) e componentes sanguíneos durante o desenvolvimento pré-clínico ou triagem individual de segurança de drogas antes do primeiro teste clínico da fase I, ou para a geração de material thrombus que pode ser usado em experimentos adicionais18,19,20.
Este estudo descreve um protocolo detalhado para testar as hemocompatibilidades de tubos de perfusão e/ou stents. Aqui, a comparação entre tubos de PVC não revestidos e revestidos (hepPVC: revestimento de heparina, poliPVC: revestimento com polímero bioativo). A ativação reduzida das plaquetas, mas uma maior ativação do sistema de coagulação (FPA) foi encontrada para ambos os tubos revestidos em comparação com os tubos não revestidos. Os tubos de hepPVC utilizados aqui são modificados com heparina covalentemente ligada para torná-los tromboressistentes21 e já foram empregados em um modelo de loop para otimizar e caracterizar diferentes parâmetros22. Os tubos de polipvc utilizados neste estudo são tubos comercialmente disponíveis usados em ambientes clínicos de perfusão sanguínea extracorpórea e são revestidos com um polímero de heparina para reduzir sua trombogenicidade23. Às vezes, em aplicações clínicas até mesmo tubos de PVC não revestidos são usados. Por isso, incluímos tubos de látex como um grupo de controle positivo que mostrou ativação excessiva de plaquetas, sistema de coagulação e fatores solúveis como IL-6, TNF e PMN elastase. A formação de trombos foi notada quando o fechamento de loop impreciso foi simulado. Isso levou à ativação do sistema de coagulação e complementação, bem como leucócitos e plaquetas em comparação com as condições da linha de base. Além disso, o contato sanguíneo com o material de stent aqui usado (stent nitinol metálico nu, coberto com politetrafluoroetileno expandido impregnado de carbono) levou a uma maior ativação de plaquetas e leucócitos em termos de elastase PMN. No geral, o modelo apresentado não induziu hemólise em nenhum dos dispositivos vasculares testados, pois eram comparáveis às condições básicas ou estáticas, exceto os tubos de látex, onde a hemolise de glóbulos vermelhos (RBC) era óbvia. Além disso, esses tubos de perfusão podem ser examinados por imagem ou por histologia. Embora as avaliações histológicas possam ser viáveis, focamos principalmente na ELISA e na citometria de fluxo para realizar esses experimentos e, assim, possibilitando a viabilidade da realização de experimentos baseados no modelo aqui apresentado para muitos laboratórios. Assim, este método representa um método viável para testar a biocompatibilidade sanguínea dos dispositivos médicos vasculares de acordo com as recomendações da norma ISO 10993-4. Além disso, este método pode ser utilizado sempre que uma interação entre sangue e materiais deve ser testada em condições de fluxo, imitando as condições in vivo.
Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da faculdade de medicina do Hospital Universitário Magdeburg (aplicação número 88/18) e os sujeitos forneceram consentimento por escrito informado antes do procedimento de coleta de sangue.
1. Preparação do estoque de heparina e amostragem de sangue
- Calcule a quantidade de sangue necessária para todos os experimentos.
NOTA: Quase, 5 mL de sangue heparinizado são necessários para cada dispositivo vascular em duplicatas (loops). Da mesma forma, 5 mL de sangue são necessários para cada condição de base e estática que é mantida de lado à temperatura ambiente. - Prepare uma solução de estoque de heparina na concentração de 100 UI/mL diluindo a heparina não fratizada (por exemplo, Rotexmedia) em água desionizada. Use 150 μL desta solução para a heparinização de 10 mL de sangue fresco.
- Calcule a quantidade de sangue, bem como plasma que são necessários para a contagem total de células sanguíneas, ensaios ELISA e FACS.
NOTA: As medidas representadas neste estudo são obtidas a partir de duas alças em paralelo (uma como duplicada) com um volume sanguíneo total de 10 mL. - Com base na quantidade necessária de sangue, encha 10 mL de seringas com 150 μL de solução de estoque de heparina para evitar a coagulação sanguínea com uma concentração final de heparina de 1,5 UI/mL de sangue.
- Tirar sangue usando uma borboleta (tamanho: 21 G). Encha as seringas muito suavemente para evitar hemólise ou ativação celular devido ao vácuo excessivo.
NOTA: A permissão do comitê de ética local deve ser obtida antes do início dos experimentos. Obter consentimento informado de cada doador de sangue humano. Certifique-se de que o doador de sangue é saudável e não toma nenhum medicamento, especialmente nenhum antiplaquelho ou anti-inflamatório não esteroide por pelo menos 10 dias antes dos experimentos. Note-se que o mesmo doador é preferido ao comparar diferentes tipos de dispositivos vasculares pela primeira vez como apresentado neste manuscrito. Para avaliar melhor as diferenças entre indivíduos, o protocolo pode ser repetido com diferentes doadores. - Coletar sangue em um copo de vidro, evitar agitação excessiva.
2. Montagem in vitro de loop hemodinâmico
- Encha o banho de água até que o nível da água chegue até o centro da unidade de rotação. Atee a temperatura da água para 37 °C.
- Montagem de loop para testar diferentes materiais de tubulação (polyPVC, hepPVC, PVC e látex)
- Corte dois pedaços de 50 cm de comprimento de cada material do tubo (diâmetro interno 5 mm) com o cortador de tubo. Certifique-se de que a superfície de corte é plana, pois isso é particularmente importante para o fechamento perfeito para os laços com diâmetros pequenos para que o sangue flua sem qualquer distorção na borda de montagem.
NOTA: Este protocolo inteiro utiliza os tubos com diâmetro interno de 5 mm. - Para facilitar o manuseio e evitar o atraso no processamento pós-amostra após a rotação, execute apenas quatro loops (2 materiais em duplicatas) em paralelo.
- Para gerar uma forma de loop, conecte as terminações abertas dos tubos em um pequeno pedaço de tubo de silício que encaixe o diâmetro externo do tubo investigativo.
- Use as faixas de tensão de policarbonato para garantir o fechamento adequado das alças. Quando usado pela primeira vez, ajuste o comprimento das bandas para encaixar o diâmetro externo da alça, cortando a faixa de tensão com uma tesoura nos comprimentos necessários e fixá-la com uma chave de torque de 3 mm.
- Aperte cuidadosamente o parafuso de travamento do conector da banda de tensão sob inspeção das terminações do tubo. Ajuste a força de fechamento para que não fique uma lacuna entre as terminações do tubo. Se o parafuso de bloqueio estiver totalmente apertado e a tensão da faixa de policarbonato parecer muito baixa para fechar a lacuna entre as terminações do tubo, abra o bloqueio do sistema e corte alguns mm da faixa de tensão. Repita isso, até que o fechamento preciso do loop seja alcançado(Figura 1A).
- Se o material de tubulação for muito macio e tende a escorregar dentro das faixas de tensão, fixe o laço com fita elétrica na faixa de tensão(Figura 1B,C).
- Prepare um loop adicional de PVC para controle de temperatura com as mesmas dimensões dos loops de teste.
- Fixar as voltas no berço de loop da unidade de rotação fora do banho de água. Posteriormente, conecte o suporte de laço à unidade de rotação dentro do banho de água(Figura 1E).
- Desmonte a faixa de tensão em parte dos loops e desligue uma extremidade de cada tubo para abrir o laço.
- Preencha suavemente cada laço com 5 mL de sangue com uma pipeta sorológica de 5 mL. Misture o sangue suavemente duas vezes no copo de vidro, estonteantemente para cima e para baixo antes de carregar nas alças.
- Pegue o termômetro descartável e coloque-o dentro do laço de controle de temperatura. Se o termômetro for muito grande, corte-o com uma tesoura para caber tubos menores. Encha o laço com 5 mL de água deionizada à temperatura ambiente.
- Feche os loops e certifique-se se os laços, as faixas de tensão e o rack estão devidamente encaixados.
- Defina a velocidade de rotação para 30 rodadas por minuto (rpm) e gire por 3h.
- Corte dois pedaços de 50 cm de comprimento de cada material do tubo (diâmetro interno 5 mm) com o cortador de tubo. Certifique-se de que a superfície de corte é plana, pois isso é particularmente importante para o fechamento perfeito para os laços com diâmetros pequenos para que o sangue flua sem qualquer distorção na borda de montagem.
- Montagem de loop para testar o impacto do fechamento de loop inadequado (gap)
- Prepare quatro loops (polyPVC) conforme descrito em 2.2.
- Feche dois dos loops corretamente com as faixas de tensão e evite qualquer lacuna entre as terminações do tubo.
- Para os outros dois loops conecte as terminações abertas no tubo maior, como descrito em 2.2.3, mas deixe uma lacuna de 1-2 mm entre as terminações de loop. Não use as faixas de tensão para estes loops(Figura 1D).
- Prepare um loop de controle de temperatura conforme descrito em 2.2.7 e 2.2.11.
- Encha todos os laços com sangue como descrito em 2.2.10.
- Defina a velocidade de rotação para 30 rpm e gire por 3h.
- Montagem de loop para testes de stent
- Prepare quatro loops como descrito em 2.2 e a seguir.
NOTA: Para avaliar a biocompatibilidade sanguínea dos stents, o material de tubulação em si deve ser testado como biocompatível para evitar a mascaramento da ativação celular. Se não houver dados, o material do tubo em si pode ser testado conforme descrito em 2.2. Além disso, a faixa de diâmetro dentro do stent pode ser aplicada (veja as instruções do fabricante) e deve se encaixar no diâmetro interno do material do tubo. - Abra dois loops e tire o tubo do sistema de banda de tensão.
- Insira o stent no meio do tubo de acordo com as instruções do fabricante.
- Use os outros dois loops sem stent como controle. Encha todos os laços com sangue como descrito em 2.2.10.
- Defina a velocidade de rotação a 30 rpm e gire por 3h.
- Prepare quatro loops como descrito em 2.2 e a seguir.
- Controle de temperatura
- A qualquer momento durante a duração e quando a rotação é interrompida, a temperatura do sangue dentro das alças é indicada pelo termômetro dentro do circuito de controle de temperatura. Para ler a temperatura, pare a rotação e leia imediatamente a temperatura indicada pelo termômetro.
3. Processamento de amostras de sangue
- Após a rotação, deixe os loops ficarem no rack por 2 minutos em uma posição ascendente para deixar o sangue acumular na parte inferior das alças, evitando qualquer derramamento durante a abertura dos loops.
- Inspecione o sangue deixado para condições estáticas: Se este sangue for coagulado, suspeita-se de uma heparinização inadequada. Neste caso, repita o experimento de preferência também com outro doador de sangue.
- Tire cuidadosamente os laços do rack. Abra os conectores e deixe o sangue fluir em um copo de vidro de 10 mL.
- Acumule o sangue dos tubos que são executados em duplicatas.
- Extrair sangue fresco para análise de linha de base do mesmo doador descrito em 1,5 e 1,6.
- Coleta de sangue citrato de sódio
- Para a coleta de sangue citrato de sódio, encha quatro tubos de 1,5 mL, cada um com uma solução de citrato de sódio de 111 μL coletada a partir de tubos de citrato de sódio, para gerar uma concentração final de 3,2% de citrato de sódio.
- Encha cada tubo com 1 mL de sangue dos béquers de vidro, conforme descrito em 1,6 e 3,3.
- Mantenha o sangue em temperatura ambiente e use este sangue para análises FACS, conforme descrito em 12.
NOTA: Para alterar o comprimento dos loops para diferentes configurações experimentais, planeje corretamente as alíquotas com base na quantidade de medições a serem feitas. Pode ser necessário estabelecer todas as medidas necessárias com sangue fresco antes dos experimentos reais para garantir que o volume de sangue nos laços seja suficiente para todas as medidas.
- Coleta de amostras de sangue e plasma de ácido e plasma de etilenodiaminetetraactic (EDTA).
- De cada béquer de vidro com sangue (ver 1,6 e 3,3) transfira 4,5 ml de sangue em um tubo EDTA de 5 ml. Encha dois tubos EDTA de cada béquer de vidro de 10 ml com sangue.
- Misture suavemente o sangue e mantenha-o no gelo.
- Transfira 2 mL de sangue para um tubo de centrifugação de bloqueio de 2 mL e use este sangue para contagem de células sanguíneas e medição de hemoglobina livre, conforme descrito em 5. E 6.
- Centrifugar o sangue restante a 3.500 x g por 20 min.
- Colete cuidadosamente o plasma no supernatante em alíquotas de 500 μL e congele imediatamente a -80 °C.
4. Digitalizar imagens de microscopia eletrônica e μCT
- Após o processamento da amostra de sangue, enxágue as alças esvaziadas preparadas como descrito em 2,3 com 10 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) cada.
- Corte cuidadosamente uma amostra de 1 cm de comprimento de cada extremidade de cada tubo com um bisturi.
- Incubar a amostra durante a noite a 4 °C em uma solução de glutaraldeído de 2%.
ATENÇÃO: A inalação de vapores de aldeído pode causar sintomas nasais, como um entupiço persistente do nariz escorrendo e irritação das vias aéreas, e o contato com a pele causa dermatite. Aldeídos devem ser manuseados em um capuz de fumaça enquanto usam luvas, um vestido de proteção e óculos de segurança. - Enxágüe a amostra (3 vezes) com PBS.
- Prepare uma solução de 1% de tetroxida de ósmio (OsO4) em água deionizada e incubar a amostra por 15 minutos à temperatura ambiente.
ATENÇÃO: O OsO4 é um agente oxidante forte, pode ser reduzido pela exposição à luz. Para evitar a redução durante a preparação, armazene o OsO4 em uma garrafa de vidro marrom. OsO4 é extremamente volátil, seus vapores são tóxicos para os olhos, nariz e garganta. Sempre trabalhe sob um capô de fumaça e use luvas e protegendo roupas, garantindo que nenhuma parte do corpo seja exposta ao OsO4. Entre em contato com as diretrizes da sua instituição sobre o manuseio e armazenamento de resíduos. Em geral, o OsO4 é armazenado por vários meses, mas precisa de garrafas de vidro especiais com forro Teflon e um dessecador, pois o OsO4 pode descolorir superfícies internas e conteúdos da geladeira na presença de fumaça vazando. - Pegue amostras, transfira-as em novos tubos de centrífugas de 15 mL e enxágue amostras 3 vezes com PBS.
- Prepare uma série de etanol com concentrações variadas (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
- Desidratar amostras no etanol: incubar por 20 min cada em 25%, 50%, 75% e 90% e 30 min em 100%.
- Pegue amostras de 100% de etanol e deixe o ar seco durante a noite à temperatura ambiente.
- Examine amostras no microscópio eletrônico de varredura a uma tensão de aceleração de 5 kV e com o scanner de raios-X μCT.
5. Contagem de células sanguíneas
- Tome 2 mL do sangue EDTA obtido como descrito em 3.7.3
- Insira o tubo no analisador automatizado de hematologia e siga as instruções do fabricante.
6. Medição de hemoglobina livre (fHb) no plasma
- Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5. Guarde gelo depois do descongelamento.
NOTA: Descongele sempre amostras de plasma congelado em um banho de água a 37 °C e transfira imediatamente para o gelo, contendo um pouco de água, para baixar a temperatura. Isso é importante para evitar a ativação de componentes sanguíneos durante o descongelamento. - Use o reagente fHb e siga as instruções do fabricante. Evite contaminação após a abertura e proteja o reagente da luz direta (sol, luz UV).
- Use um esquema de pipetação (veja as instruções do fabricante) com diluição de 1:5.
- Adicione 1000 μL do reagente de hemoglobina em um semi-micro cuvette de 1,6 mL. Use este cuvette para determinar o valor em branco.
- Adicione 1000 μL do reagente de hemoglobina e 250 μL da amostra de plasma em outro semi-micro cuvette.
- Misture o conteúdo em ambas as cuvetas lavando bem a pipeta, enchendo repetidamente com mistura de reação e incubando pelo menos 3 minutos à temperatura ambiente.
- Determine a extinção (E) da amostra contra reagente fHb como reagente em branco. Calcule a concentração de fHb (mmol/l) da amostra: E540-E680 x 0,452.
7. Medição da FPA
- Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5 e armazene no gelo após o descongelamento.
- Use o kit FPA Elisa e siga as instruções do fabricante.
8. Medição do sC5b9
- Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5 e armazene no gelo após o descongelamento.
- Use o kit ELISA sC5b-9 e siga as instruções do fabricante.
9. Medição do PMN
- Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5 e armazene no gelo após o descongelamento.
- Use o kit PMN-Elastase ELISA e siga as instruções do fabricante.
10. Medição de TNF
- As microplacões devem ser revestidas um dia antes de executar o ELISA. Para o revestimento, adicione 100 μL de solução de anticorpos de captura a todos os poços, placa de vedação e incubar durante a noite a 2 °C-8 °C.
- Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5. Guarde gelo depois do descongelamento.
- Use o kit TNF ELISA e siga as instruções do fabricante.
11. Medição do IL-6
- Microplacos devem ser revestidos com anticorpos de captura um dia antes do experimento. Para revestimento, adicione 100 μL de solução de anticorpos de captura a todos os poços da microplacão fornecidos com o conjunto, placa de vedação e incubar durante a noite a 4 °C
- Descongele uma amostra de plasma de cada condição obtida como descrito em 3.7.5. e armazenar no gelo depois de descongelar.
- Use o kit IL-6 ELISA e siga as instruções do fabricante..
12. Análises FACS
- Prepare 500 mL de tampão FACS adicionando 10 mL de soro de bezerro fetal e 2 mL de solução EDTA (0,5 M) a 488 mL de 1x PBS. O buffer FACS pode ser armazenado por 4 semanas a 4°C.
- Utilize 100 μL do sangue citrato de sódio (ver 3.6.3) para cada procedimento de coloração (agregados de plaquetas monócitos (MPA), ativação de plaquetas (PA), integrins leucócitos (LI)).
- Pipeta 100 μL de sangue de cada amostra em um tubo FACS de 5 mL. De cada amostra, prepare 3 tubos para coloração de anticorpos e etiqueta com painel MPA (agregados de plaquetas monocitos), painel PA (agregados de plaquetas) e painel LI (leucocitte integrin).
- Misture o resto das 4 amostras em um tubo FACS de 5 mL. Use esta mistura para controles não manchados e fluorescência menos um (FMO).
- Prepare 6 tubos FACS por tubos de 100 μL do sangue de amostra mista em cada tubo. Rotule 3 tubos como não manchados e 3 tubos como FMO-CD41, FMO-CD62P e FMO-CD162.
- Adicione 100 μL de solução de paraformaldeído de 4% e incubar por 15 minutos no escuro à temperatura ambiente.
ATENÇÃO: Paraformaldeído é tóxico para pele e olhos. Pode causar irritação pulmonar grave quando inalado e pode levar a danos pulmonares após exposição prolongada. Além disso, é classificada como cancerígena e toxina reprodutiva. Use sempre luvas e óculos de segurança e trabalhe sob o capô da fumaça. - Adicione 1 mL de tampão de lavagem a cada tubo e centrífuga a 287 x g por 5 min. Descarte o supernatante e repita a etapa de lavagem duas vezes.
- Para a lise de glóbulos vermelhos (RBC), adicione 1 mL de tampão de lise RBC tampão de 1x (diluir 10x tampão de lise RBC em água desionizada), misture lentamente tubos para cima e para baixo e incubar por 5 minutos no RT no escuro.
- Prepare contas de compensação para manchas simples. A 1 mL de tampão FACS adicione 4 gotas de cada contas positivas e negativas. Vórtice completo e adicione 100 μL de solução de contas a um tubo FACS de 5 mL.
- Prepare 4 tubos com contas e rótulo como CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC e CD62P-PE. Adicione 1 mL de tampão FACS a cada tubo e centrífuga a 287 x g por 5 min. Descarte o supernaspe e mantenha no gelo.
- Após a lise RBC, adicione 1 mL de tampão FACS a cada tubo e lave conforme descrito em 12,7. Descarte o supernaspeso.
- Prepare coquetéis de anticorpos:
- Painel MPA: Adicione 4 μL de CD45-APC, 4 μL de CD14-FITC e 4 μL de CD41-BV421 a 388 μL de buffer FACS.
- Painel PA: Adicione 1,6 μL de CD41-BV421 e 12 μL de CD62P-PE a 386,4 μL de buffer FACS.
- Painel LI: Adicione 4 μL de CD45-APC e 8 μL de CD162-BV421 a 388 μL de buffer FACS. Mantenha-se no gelo.
- Preparem as manchas únicas: Adicione 0,5 μL a 499,5 μL de tampão FACS cada um para CD14-FITC, CD41-BV421 e CD45-APC. Para CD62P-PE adicione 0,3 μL a 499,7 μL de buffer FACS. Mantenha-se no gelo.
- Preparar controles FMO: (i) painel MPA (FMO-CD41): Adicionar 1 anticorpo CD14-FITC μL e 1 μL de anticorpo CD45-APC a 98 μL FACS buffer. (ii) Painel PA (FMO-CD62P): Adicionar 0,4 μL de CD41-BV421 a 99,6 μL de buffer FACS. (iii) Painel LI (FMO-CD162): Adicionar 1 μL de CD45-APC a 99 μL de buffer FACS. Mantenha os controles FMO no gelo.
- Coquetéis de anticorpos vortex e adicione 100 μL de cada coquetel de anticorpos preparados em 12,12 para cada um dos respectivos tubos rotulados (painel MPA, PA e LI) conforme descrito em 12,3 e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Mantenha-se no RT no escuro.
- Diluições de anticorpos de cor da única mancha de vórtice e adicionar 100 μL das diluições de anticorpos de uma única mancha, conforme preparado em 12.13. a cada um dos respectivos tubos rotulados com contas como descrito em 12,7 e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Mantenha-se no RT no escuro.
- Coquetéis de anticorpos Vortex FMO e adicione 100 μL de cada coquetel de anticorpos FMO-1, conforme preparado em 12.14. para cada um dos respectivos tubos rotulados (controles FMO) conforme descrito em 12,5. e misture suavemente por pipetting para cima e para baixo. Mantenha-se no RT no escuro.
- Incubar todos os tubos com manchas de anticorpos por 30 minutos no RT no escuro.
- Pegue os três tubos para controle não manchado (ver 12,4) e pelotas resuspendes em 250 μL de tampão FACS. Mantenha-se no gelo.
- Após o tempo de incubação, lave todos os tubos, exceto controles não manchados uma vez com tampão FACS, conforme descrito em 12,7. Resuspend pelota em 250 μL de buffer FACS e adquirir dados sobre o citômetro de fluxo.
- Use células não manchadas para configurações negativas e contas de mouse de compensação para configurações positivas no software FACS. Além disso, use FMO para controlar a estratégia de gating, onde FMO-CD41 é usado no painel MPA, FMO-CD62P é usado no painel PA e FMO-CD162 é usado no painel LI.
- Adquira quase 0,5 x 106 - 0,25 x 106 eventos por tubo para FACS. Salve dados e analise com um software de análise (versão 9.9.6).
Representative Results
Todos os dados apresentados, exceto as parcelas FACS, foram analisados com um software estatístico. As parcelas FACS foram analisadas por meio do software de citometria de fluxo.
A análise da contagem completa de células sanguíneas não mostrou diferenças significativas em relação aos eritrócitos entre todas as condições testadas(Figura 2). Mas, plaquetas e leucócitos foram drasticamente reduzidas no grupo de látex, indicando uma biocompatibilidade muito ruim de látex. Isso é ainda sublinhado pelo aumento dos níveis de hemoglobina livre no grupo látex, indicando o fato de que, com exceção do grupo de látex, nenhum dos outros dispositivos vasculares ou condições levou a uma hemolise extensa(Figura 2). Além disso, os tubos de PVC revestidos, o policpvc e o hepPVC, bem como o stent testado não levaram à trombose por meio de perda de plaquetas e leucócitos, enquanto o látex apresentou a maior perda de plaquetas e leucócitos, seguido por tubos de PVC não revestidos que apresentaram tendência reduzida.
Enquanto todos os dispositivos vasculares testados levaram ao aumento da ativação do sistema de coagulação (FPA) e componente complementar (sC5b-9), os loops de hepPVC apresentaram uma tendência para a diminuição dos níveis de FPA e sC5b-9 quando comparados especificamente aos loops de policpvc(Figura 3). Curiosamente, os loops de PVC e Gap não revestidos apresentaram níveis mais baixos de FPA em comparação com o poliPVC, embora não atingindo o nível de significância estatística. No entanto, os loops de látex apresentaram níveis significativamente maiores de FPA quando comparados às condições de base e estáticas.
De acordo com toda a contagem de células sanguíneas, os loops de látex apresentaram os mais altos níveis de TNF, IL-6 e PMN elastase(Figura 4),atingindo o nível de significância estatística quando comparados com o resto dos grupos em termos de TNF e IL-6(Figura 4A,B),enquanto as condições estáticas e de linha de base em termos de elastase PMN(Figura 4C). Estes resultados indicam a potente ativação de leucócitos por látex. Os níveis de linha de base dos marcadores de ativação sempre foram comparáveis às condições estáticas, indicando uma heparinização adequada do sangue.
Curiosamente, mostrou-se que as contagens de plaquetas e leucócitos para loops induzidos por lacunas foram apenas ligeiramente reduzidas com ativação moderada do sistema coagulatório (FPA) e leucócitos (PMN elastase), embora o fechamento de loop inadequado com turbulências de fluxo resultantes e contato sanguíneo à superfície de corte não revestida e áspera levou a coágulos macroscopicamente visíveis na emenda(Figura 1F). Os coágulos e sua distribuição sobre toda a superfície da emenda ficaram evidentes com imagens μCT e SEM, enquanto nenhum coágulo foi encontrado quando os loops foram fechados com o dispositivo de fechamento externo não deixando nenhuma lacuna entre as terminações do loop(Figura 5).
A análise citométrica de fluxo das células sanguíneas hospedeiras que foram manchadas com marcadores específicos de plaquetas, CD41 e marcador de ativação de plaquetas CD62P, são mostradas na Figura 6A,B. Aqui, os tubos de látex apresentaram intensidade de fluorescência mediana extremamente alta (MFI) para CD62P em plaquetas sanguíneas, seguidos por stent, enquanto os tubos de polipVC revestidos de heparina apresentaram ativação mínima de plaquetas que retratam propriedade anti-trombogênica de tubos de polipVC. Além disso, os leucócitos foram classificados com base na granularidade baseada em CD45 e SSC (dispersão lateral) em (i) granuócitos; (ii) monócitos e (iii) linfócitos(Figura 7),e a expressão de CD162+ integrin foi detectada em cada subpopulação de leucócitos que são conhecidos por interagir com o CD62P nas plaquetas24. Notou-se que as expressões integrinas foram drasticamente reduzidas em granulócitos e linfócitos em loops de látex. Este resultado foi em linha com os níveis reduzidos de frequências totais de leucócitos nas alças de látex(Figura 2). Em geral, os níveis de integrin foram mais elevados entre os monócitos quando comparados aos granulócitos e linfócitos, indicando a probabilidade de interação monocito com plaquetas ativadas. Nesse sentido, os agregados de plaquetas monócitos também foram avaliados pela coloração das células sanguíneas com CD14 (como marcador monócito) e CD41 (como marcador de plaqueta) e, em última instância, para identificar células duplas positivas, ou seja, CD14+CD41+MPA (Figura 8). Aqui, notamos que o grupo de stent apresentou os mais altos níveis de expressão CD41 no MPA, seguido pelo grupo de látex, indicando uma tendência aumentada para formar MPA, apesar da frequência reduzida de monócito (<1 %) nos loops de látex.
Figura 1: Visão geral do modelo de loop hemodinâmico in vitro e suas modificações. (A) Loop para o experimento de lacuna com sistema externo de fechamento de loop, não deixando nenhuma lacuna na emenda. (B) Laço feito de tubo de PVC revestido de polipVC e stent dentro (seta). (C) Loop feito de tubo de látex. (D) Loop para o experimento de lacuna sem o sistema de fechamento de loop externo deixando uma lacuna entre as terminações do tubo (seta). (E) Laços colocados no berço de laço dentro do banho de água e cheios de sangue. (F) Trombo resultando em uma lacuna na emenda (seta) após a rotação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados para contagem de células sanguíneas e hemoglobina plasmática. (A) Eritrócitos contam. (B) Contagem de plaquetas. (F) Leucócitos contam. (D) Hemoglobina de plasma livre. Os resultados indicam a baixa biocompatibilidade do látex, levando a hemólise excessiva. Os dados são apresentados como valor médio; as barras de erro indicam SEM. n=1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados para ativação do sistema de coagulação e complementação. (A) Ativação do sistema de coagulação, medida por níveis de Fibrinopeptide A (FPA) (B) Complementar a ativação do sistema, medida por níveis de sC5b-9. Enquanto os tubos de látex evocavam níveis elevados significativos da FPA, a ativação complementar foi forte para todos os materiais testados. Os dados são apresentados como valor médio, as barras de erro indicam SEM. *p<0,05, n=1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Marcadores de ativação de leucócitos. (A) Fator de necrose tumoral alfa (TNF). (B) Interleucina 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Os resultados indicam aumento da ativação de leucócitos devido aos níveis elevados dos marcadores analisados, seguidos por laços de stent, que só levaram a níveis aumentados para PMN Elastase, mas não TNF ou IL-6. Os dados são apresentados como valor médio, as barras de erro indicam SEM. *p<0.5; **p<0,01, n=1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagem da emenda dos laços. (A) μ tomografia computadorizada (μCT) de loops com fechamento inadequado (lacuna). As áreas vermelhas indicam material trombo. (B) Renderização do lado luminal do tubo. A seleção retangular indica a área para a microscopia eletrônica de varredura (SEM) (C). (D) μCT de loops com dispositivo de fechamento de loop externo e nenhuma lacuna na emenda, e (E) renderização e visão da superfície luminal. Nenhum material de trombo foi encontrado. (F) IMAGEM SEM da seleção retangular em (E). Nenhum material de trombo foi encontrado na superfície de corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Parcela FACS para ativação de plaquetas (CD62P). (A) Gráfico FACS representativo (condição básica) mostrando o sangue CD41+ plaquetas. (B) Gráfico mostrando o estado de ativação plaquetária refletido pela intensidade média de fluorescência (FI) dos diferentes tipos de dispositivos vasculares em comparação com as condições estáticas de TR e linha de base. As barras de dados apresentam dados de medições únicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Trama FACS para leucócito integrin (CD162). (A) Gráfico representativo FACS (condição básica) mostrando o sangue CD45+ leucócitos e subgrupos(B) Gráfico mostrando a intensidade de fluorescência média leucócitos (MFI) dos diferentes tipos de dispositivos vasculares em comparação com as condições estáticas e de linha de base. As barras de dados apresentam dados de medições únicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Gráfico FACS para agregados de monócitos plaquetas (CD41/CD14). (A) Gráfico representativo FACS (condição básica) mostrando a gating para monócitos sanguíneos (CD45+/CD14+), plaquetas (CD41+) e agregados de plaquetas monocitos (CD41+/CD14+) (B) Gráfico mostrando o CD41+ intensidade média de fluorescência (MFI) nos agregados de plaquetas monócitos para os diversos dispositivos vasculares em comparação com as condições estáticas e de linha de base. As barras de dados apresentam dados de medições únicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este estudo mostrou que o modelo de loop hemodinâmico in vitro apresentado oferece um método confiável para testar a compatibilidade sanguínea in vitro de dispositivos médicos de acordo com o padrão ISO 10993-4.
As etapas críticas do protocolo incluem o extração de sangue e o preenchimento dos tubos com sangue, onde o vácuo excessivo ou agitação devem ser evitados para evitar que os componentes sanguíneos sejam ativados pelo procedimento de manuseio. Além disso, é muito importante congelar imediatamente as amostras de plasma e mantê-las no gelo após o descongelamento, pois a ativação do sistema de complementação e coagulação pode ser adulterada mantendo as amostras em temperatura ambiente por mais tempo.
Uma vez que este modelo tem méritos e deméritos quando comparados a outros modelos in vitro, vários fatores devem ser levados em conta ao projetar os experimentos.
Primeiro, os loops podem ser variados em comprimento e diâmetro para caber várias configurações experimentais. Caso a configuração inclua tubos contrastantes de diâmetros internos variados, deve-se ter em mente que as diferenças de diâmetro resultarão em diferentes forças de corte, afetando assim a coagulação e a cascata complementar7. Em segundo lugar, a velocidade de rotação foi definida para 30 rpm neste experimento. Isso resultará em um fluxo sanguíneo de aproximadamente 25 cm/s, o que é comparável à velocidade de fluxo sanguíneo nos enxertos de bypass da artéria coronária humana25. A taxa de tensão, gerada pela rotação dos loops, é o principal parâmetro que iniciará cascatas bioquímicas de componentes sanguíneos, incluindo células e proteínas livres de células. Mas como o sangue é um fluido não newtoniano, a taxa de tensão também será influenciada pela curvatura do tubo, respectivamente o comprimento dos tubos que estão fechados para loops10. Sempre que a velocidade de rotação ou o tamanho do loop é alterado, é importante considerar que a correlação entre a taxa de tensão e a velocidade de rotação não é linear. A correlação entre a velocidade de rotação e a taxa de tensão não é suficientemente examinada até hoje e estudos adicionais são necessários para investigar esses parâmetros específicos10,26,27. No entanto, com base em um modelo para a camada de limite laminar, o diâmetro dado do tubo de 5 mm e a velocidade de rotação de 25 cm/s, uma estimativa aproximada do estresse da tesoura da parede (W SSS) indicaria valores entre 2,20-22,00 pascal para uma distância de 1,00-0,01 mm à parede do tubo quando a densidade sanguínea é estimada em 1060 kg*m-3 e a viscosidade cinética é definida para 0,0025 pascal*s28,29. Curiosamente, também uma análise computacional mais detalhada da dinâmica do fluxo na curvatura das artérias coronárias humanas mostrou valores WSS variando de 11,33 a 16,77 pascal em parâmetros aproximadamente comparáveis para a velocidade, densidade e viscosidade do sangue30.
Além dessa limitação, o modelo de loop apresentado é um sistema sem pressão, que não imita as relações intravasculares de pressão arterial do sistema vascular humano.
A próxima limitação importante é que o sangue está em contato com o ar dentro dos laços, o que traz interferências adicionais. Tal contato sangue-ar é impactado por dois parâmetros, que inclui a permeabilidade gasosa dos tubos e a retenção de ar dentro dos laços enquanto os enche com sangue. Cada material do tubo possui uma certa permeabilidade de gás que pode levar a mudanças significativas nas concentrações de gás dentro dos tubos. Embora alguns autores adquiram que o efeito resultante da permeabilidade do gás na ativação de componentes sanguíneos permanece incerto31, sabe-se que a função dos coaguladores sanguíneos é altamente sensível a uma mudança de pH, que pode ser causada pela difusão de CO2 32,33,34. Aqui, testamos a biocompatibilidade dos tubos de perfusão sanguínea sob condições de ar interior, comparáveis aos cenários clínicos de perfusão sanguínea extracorpórea. Para melhorias futuras do modelo apresentado, a incubação de todo o modelo em uma incubadora de CO2 e a realização da validação do pH sanguíneo antes e depois da incubação podem ser úteis para padronizar ainda mais esse modelo.
Além disso, a interface sangue-ar dentro dos laços pode levar à ativação de proteínas plasmáticas e frações celulares do sangue35,36. Os dispositivos acionados pela bomba de rolo sem ar dentro dos tubos podem evitar a questão da interface sangue-ar, mas certamente induzem danos às células sanguíneas com níveis elevados significativos de hemoglobina em comparação com o modelo de loop aqui apresentado, e a hemoglobina no plasma pode interferir com a sensibilidade de analitos testados em ELISA16. Neste estudo, mostramos que o efeito hemolítico do modelo de loop em si permanece mínimo ao usar materiais biocompatíveis, como tubos de PVC revestidos de heparina. Assim, o modelo é, por um lado, não causar danos celulares excessivos em comparação com modelos acionados pela bomba, mas, por outro lado, induzir proteínas plasmáticas devido ao contato com o ar no sangue. Note-se que van Oeveren et al. desenvolveram um modelo de loop baseado em válvula de esfera evitando o ar dentro dos loops16. Esta alternativa promissora ao modelo de loop aqui apresentado pode superar o problema da interface sangue-ar, no entanto, em comparação com o modelo apresentado aqui, a adesão plaqueta ainda é maior para o modelo de loop baseado em válvula de esfera.
Em relação ao controle estático, nota-se que o vidro em si tem se mostrado um potente ativador do sistema coagulatório37. No entanto, na configuração apresentada, a incubação em um copo de vidro (controle estático) não levou à ativação excessiva da célula hospedeira ou ativação do sistema coagulatório em comparação com os níveis de linha de base logo após o desenho do sangue. Em conclusão, pode ser útil usar, por exemplo, tubos de polipropileno, se o controle estático mostrar altos níveis de ativação.
Independentemente de ser um modelo baseado em loop ou de bomba, esses modelos in vitro não possuem completamente as interações biológicas autênticas que são principalmente contribuídas por um endotélio intacto, que é uma superfície ideal de contato sanguíneo. A lógica por trás dessa questão é mais evidente quando um dispositivo médico como um stent está sendo testado, o que pode dar diferentes resultados, em termos de ativação e proteínas plasmáticas, durante sua interação com componentes sanguíneos na presença de endotélio. Isso declara ser uma grande desvantagem de todos os sistemas in vitro discutidos imitando o sistema circulatório. Assim, para superar essa questão, novos sistemas microfluidos que estão completamente cobertos com endotélio estão ganhando imenso interesse, mas, no entanto, em comparação com o modelo de loop apresentado aqui, eles ainda estão limitados a acomodar volumes sanguíneos menores e taxas mínimas de fluxo38,39
Assim, concluímos que o modelo Chandler Loop continua sendo um modelo robusto para a realização de testes padronizados sobre a biocompatibilidade sanguínea de dispositivos médicos vasculares no campo da pesquisa cardiovascular.
Disclosures
O funder [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Alemanha] forneceu um apoio financeiro na forma de consumíveis e taxas de publicação para o autor deste manuscrito [Max Wacker]. Os financiadores não apresentaram qualquer papel adicional na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou elaboração do manuscrito.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Sra. Elena Denks por sua assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
| BD LSR Fortessa II cell analyzer | Becton Dickinson | 647465 | |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | Becton Dickinson | 369714 | |
| BD Vacutainer one-use holder | Becton Dickinson | 364815 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
| Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
| Beaker glass ROTILABO short 50 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X688.1 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
| Centrifuge ROTINA 420 | 420 R | Hettich Zentrifugen | 4701 | 4706 | |
| Centrifuge tubes, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| CHC Super modified, 5mm PVC tubing | Corline Sweden | 1807-148 | Referred to as hepPVC tube |
| Circular Precision Cutter | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 007-20 | |
| Closing Unit (complete with tension bands) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 008-20 | |
| Electric tape Scotch Super 33+ | VWR | MMMA331933 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 | BioLegend | 430504 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a | BioLegend | 430204 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000012 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000020 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000047 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue | Eppendorf AG | 3123000063 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000055 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet | Eppendorf AG | 3123000071 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom | Corning BV | 352052 | |
| Fetal bovine serum Gold Plus | Bio-Sell | FBS.GP.0500 | |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 367116 | |
| Fluency plus stent 13.5 x 60 mm | Angiomed GmbH & Co | FVM14060 | |
| Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
| Gibco PBS Tablets | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Gloves Vasco Nitril white L | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208437 | |
| Gloves Vasco Nitril white M | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208429 | |
| Glutaraldehyde 25% aequous solution | Sigma Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, 25.000 IE in 5 ml | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN 3862340 | |
| Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit | Hölzel Diagnostika | abx253234 | |
| Kodan tincture forte colourless | Schülke & Mayr GmbH | 104012 | |
| Latex tube, ID 5 mm | Laborhandel24 GmbH | 305 0507 | |
| Loop Stand | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 009-20 | |
| Medimex venous tourniquet classic | ROESER Medical GmbH | 310005 | |
| Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex | Tecan | TEC006418I | |
| Microplate shaker PMS-1000i | VWR | 444-0041 | |
| Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm | VWR | NALG8703-0508 | Referred to as PVC tube |
| NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
| Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
| Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| PE anti-human CD16Antibody | BioLegend | 302008 | |
| PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody | BioLegend | 304906 | |
| Pipette controller, pipetus | VWR | 612-1874 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5186480 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 9409410 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.870 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000µl blue | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.919 | |
| PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
| Probe stand ROTILABO combi | CARL ROTH | K082.1 | |
| Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 011-20 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
| Reagent reservoirs | VWR | 613-1184 | |
| Rotation Unit | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 010-20 | |
| Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409320 | |
| Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409331 | |
| sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
| Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG | Philips | n.a. | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X715.1 | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X714.1 | |
| Semi-micro cuvette 1.6 ml | Sarstedt | 67.746 | |
| Serological pipette 10.0 ml | Corning BV | 4488 | |
| Serological pipette, 25.0 ml | Corning BV | 4489 | |
| Serological pipette, 5.0 ml | Corning BV | 4487 | |
| Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm | VWR | BURK8803-0812 | |
| Sprout mini centrifuge | Biozym | 552034 | |
| Stop Solution for TMB Substrate | BioLegend | 77316 | |
| Swabs, sterile | Fuhrmann GmbH | 32055 | |
| Syringe, 10 ml | Becton Dickinson | 300296 | |
| Temperature controlled water basin | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 020-20 | |
| tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | 10000730 | |
| TMB Substrate Set | BioLegend | 421101 | |
| Trillium PVC tube, 5 mm ID | Medtronic | 161100107100103 | Referred to as polyPVC tube |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0250 | |
| UV-Vis Spektrometer Lambda 2 | Perkin Elmer | 33539 | |
| Vornado Mini Vortexer | Biozym | 55BV101-B-E | |
| XN-3000 workstation blood analyzer | Sysmex Europe | n.a. | |
| μ-CT Phoenix Nanotom S | GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany | n.a. |
References
- International Organisation for Standardisation. DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood. International Organisation for Standardisation. , (2017).
- Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum. Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).
- Maiolini, R., et al. A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor. Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).
- Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
- Betke, U., et al. Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study. Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus. Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).
- Fink, H., et al. An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).
- Lenz-Habijan, T., et al. Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model. Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).
- Olsen, A. L., Long, M. Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
- Feyerabend, F., et al. Blood compatibility of magnesium and its alloys. Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).
- Lukas, K., et al. Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane. Materials. 10 (4), Basel, Switzerland. 355 (2017).
- Paul, A., et al. Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).
- Link, A., et al. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. Journal of Visualized Experiments. (157), e60610 (2020).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. 2012, 673163 (2012).
- Maa, Y. F., Hsu, C. C. Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface. Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).
- Fletcher, E. A. K., et al. Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics. International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue. Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).
- Gong, J., et al. Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model. Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).
- Tevaearai, H. T., et al. Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility. The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).
- Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils. Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).
- Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries. Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).
- Gardner, R. A. An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).
- Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis. Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).
- Böswirth, L. Technische Strömungslehre. 8 edn. , Springer Vieweg. (2010).
- Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers. Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).
- Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis. Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).
- Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space. Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).
- Foley, M. E., McNicol, G. P. An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage. The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).
- Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study. The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).
- Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood. Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).
- Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface. Micromachines. 11 (1), Basel. 18 (2019).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
