Summary
Presentato qui è un protocollo per un modello standardizzato di loop emodinamico in vitro. Questo modello consente di testare l'emocompatibilità di tubi perfusione o stent vascolari per essere conforme allo standard ISO (International Organization for Standardization) 10993-4.
Abstract
In questo studio, l'emocompatibilità dei tubi con un diametro interno di 5 mm in cloruro di polivinile (PVC) e rivestiti con diversi coniugati bioattivi è stata confrontata con tubi in PVC non rivestiti, tubi di lattice e uno stent per l'applicazione intravascolare che è stato posto all'interno dei tubi in PVC. La valutazione dell'emocompatibilità è stata effettuata utilizzando un modello di loop emodinamico in vitro raccomandato dallo standard ISO 10993-4. I tubi sono stati tagliati in segmenti di lunghezza identica e chiusi per formare anelli evitando qualsiasi gap alla giunzione, quindi riempiti di sangue umano e ruotati in un bagno d'acqua a 37 °C per 3 ore. Successivamente, il sangue all'interno dei tubi è stato raccolto per l'analisi del numero di cellule del sangue intero, dell'emolisi (emoglobina plasmatica libera), del sistema di complemento (sC5b-9), del sistema di coagulazione (fibrinopeptide A) e dell'attivazione dei leucociti (elastasi polimorfonucleare, fattore di necrosi tumorale e interleuchina-6). L'attivazione delle cellule ospiti è stata determinata per l'attivazione piastrinica, lo stato di integrina leucocitaria e gli aggregati piastrinico monociti utilizzando la citometria del flusso. L'effetto della chiusura imprecisa del loop è stato esaminato con la microscopia a raggi X e la microscopia elettronica a scansione, che ha mostrato la formazione di trombo alla giunzione. I tubi in lattice hanno mostrato la più forte attivazione sia del plasma che dei componenti cellulari del sangue, indicando una scarsa emocompatibilità, seguiti dal gruppo stent e dai tubi in PVC non rivestiti. I tubi in PVC rivestito non hanno mostrato una significativa diminuzione dello stato di attivazione delle piastrine, ma hanno mostrato un aumento della cascata di complemento e coagulazione rispetto ai tubi in PVC non rivestiti. Il modello ad anello stesso non ha portato all'attivazione di cellule o fattori solubili, e il livello di emolisi era basso. Pertanto, il modello di loop emodinamico presentato in vitro evita l'eccessiva attivazione dei componenti del sangue da parte di forze meccaniche e funge da metodo per indagare le interazioni in vitro tra sangue donatore e dispositivi medici vascolari.
Introduction
Il test di emocompatibilità dei dispositivi medici è un passo cruciale nello sviluppo di nuovi dispositivi come stent vascolari o tubi perfusione per l'ossigenazione extracorporea della membrana. Fino ad oggi, i modelli animali sono considerati strumenti standard per finalizzare la procedura per testare i dispositivi medici prima della sua implementazione nell'uomo. D'ora in poi, è necessario trovare modelli alternativi in vitro che aiutino ulteriormente a ridurre al minimo le indagini sugli animali. In questo studio, quindi, abbiamo esplorato un modello di loop emodinamico in vitro in miniatura. L'obiettivo di questo metodo presentato è quello di testare la compatibilità del sangue in vitro dei dispositivi medici in conformità con lo standard ISO 10993-4.
Lo standard ISO 10993-4 descrive serie standardizzate di parametri clinici da esaminare sul campione di sangue1. In breve, si tratta di trombosi (aggregazione piastrinica e conteggio), coagulazione (fibrinopeptide A, FPA), analisi ematologica (numero di globuli interi), indice di emolisi (emoglobina plasmatica libera) e sistema di complemento (complesso di complementi terminali, sC5b9). Tuttavia, ulteriori marcatori, come l'elastasi polimorfonucleare neutrofila (PMN), l'interleuchina 6 (IL-6) e il fattore di necrosi tumorale - alfa (TNF) che riflette lo stato di attivazione dei leucociti possono anche essere contabilizzati per le misurazioni. Per determinare e quantificare le proteine libere dalle cellule circolanti presenti nel plasma sanguigno, il saggio immunoassorbente enzimatico sandwich (ELISA) rappresenta un metodo convenzionale e piùaffidabile 2,3. Allo stesso modo, il fenotipo e lo stato di attivazione delle cellule ospiti (ad esempio, i leucociti) possono essere quantificati rilevando l'espressione della superficie cellulare delle molecole mediante citometria a flusso (FACS) che fornisce letture basate su sospensione a singola cellula, in cui anticorpi specifici etichettati fluorescenti si legano alle molecole di superficie cellulare mirate4. La microscopia elettronica a scansione (SEM) è anche raccomandata per determinare la formazione di trombo sul materiale testato dallo standard ISO 10993-41. Questo metodo può essere integrato con la microtomografia a raggi X (μCT), per eseguire analisi strutturali del trombo, ad esempio, il suo spessore, dimensioni e localizzazione in un'immagine renderizzata in 3D5.
La logica alla base dell'utilizzo di questo modello emodinamico in vitro è quella di migliorare le prestazioni e i dispositivi medici compatibili comprendendo le dinamiche fisiologiche di base dei componenti del sangue come le piastrine, che sono coinvolti nell'emostasi primaria o nei leucociti e la loro interazione con diversi tipi di dispositivi vascolari. Tali sistemi in vitro sono molto richiesti in quanto riducono la necessità di studi sugli animali.
Il modello di loop presentato qui soddisfa queste esigenze. Questo modello è stato descritto per la prima volta da A.B. Chandler nel 1958 per la produzione di trombi di sangue ed è, quindi, chiamato anche Chandler Loop modello6. Fino ad ora, questo modello è stato utilizzato in una serie di esperimenti e modifiche per indagare la biocompatibilità sanguigna dei dispositivimedici 7,8,9,10,11,12,13,14. È costituito da tubi polimerici, che sono in parte riempiti di sangue e modellati in anelli richiudibili. Questi anelli ruotano in un bagno d'acqua a temperatura controllata per simulare le condizioni del flusso vascolare con i suoi effetti emoreologici. Metodi alternativi come modelli azionati da pompa o modelli che utilizzano valvole a sfera meccaniche all'interno dei loop per indurre un flusso sanguigno all'interno dei tubi polimerici sono giàstati descritti 15,16. Tuttavia, il vantaggio generale del metodo qui presentato è che la forza meccanica applicata alle cellule del sangue e alle proteine è bassa, evitando l'emolisi, e non c'è contatto tra sangue e connettori, che potrebbe portare a turbolenze del flusso e attivazione dei componenti del sangue. I principali fattori di attivazione all'interno del ciclo sono il materiale di prova stesso e l'aria che è intrappolata all'interno. Ciò aiuta a ridurre al minimo le fonti di errore di misurazione e a fornire un'elevata riproducibilità, anche se l'interfaccia sangue-aria può portare alla denaturazioneproteica 17. È anche possibile studiare varietà di materiali di tubi e diametri di stent senza restrizioni di lunghezza o dimensioni, consentendo così l'uso di tubi di diversa lunghezza e diametro interno. Inoltre, sono possibili anche emocompartibilità dell'ospite sulla chiusura imprecisa del loop e sull'esposizione alla superficie del tubo non rivestito. Altre applicazioni mediche simili di questo modello di loop emodinamico in vitro è che potrebbe anche essere utilizzato per studiare le interazioni tra immunoterapia (farmaci) e componenti del sangue durante lo sviluppo preclinico o lo screening individuale della sicurezza dei farmaci prima dello studio clinico di fase I del primo nell'uomo, o per la generazione di materiale trombo che può essere utilizzato inulteriori esperimenti 18,19,20.
Questo studio descrive un protocollo dettagliato per testare le emocompatibilità dei tubi perfusione e/o degli stent. Qui, il confronto tra tubi in PVC non rivestiti e rivestiti (epPVC: rivestimento di eparina, poliPVC: rivestimento con polimero bioattivo). L'attivazione delle piastrine è stata abbassata, ma è stata riscontrata una maggiore attivazione del sistema di coagulazione (FPA) per entrambi i tubi rivestiti rispetto ai tubi non rivestiti. I tubi hepPVC qui utilizzati vengono modificati con eparina legata covalentemente per renderli tromboresitanti21 e sono già stati utilizzati in un modello ad anello per ottimizzare e caratterizzare diversi parametri22. I tubi poliPVC utilizzati in questo studio sono tubi disponibili in commercio utilizzati in contesti clinici di perfusione ematica extracorporea e sono rivestiti con un polimero eparina per ridurne la trombogenicità23. A volte, nelle applicazioni cliniche vengono utilizzati anche tubi in PVC non rivestiti. Pertanto, abbiamo incluso i tubi in lattice come gruppo di controllo positivo che ha mostrato un'eccessiva attivazione di piastrine, sistema di coagulazione e fattori solubili come IL-6, TNF e PMN elastasi. La formazione di trombo è stata notata quando è stata simulata una chiusura imprecisa del loop. Ciò ha portato all'attivazione del sistema di coagulazione e complemento, nonché di leucociti e piastrine rispetto alle condizioni di base. Inoltre, il contatto sanguigno con il materiale stent qui usato (stent nitinolo di metallo nudo, coperto con politetrafluoroetilene espanso impregnato di carbonio) ha portato a una maggiore attivazione piastrinica e leucocitaria in termini di elastasi PMN. Nel complesso, il modello presentato non ha indotto l'emolisi in nessuno dei dispositivi vascolari testati in quanto erano paragonabili alle condizioni basali o statiche, ad eccezione dei tubi di lattice, dove l'emolisi dei globuli rossi (RBC) era ovvia. Inoltre, questi tubi perfusione possono essere esaminati mediante imaging o istologia. Sebbene le valutazioni istologiche possano essere fattibili, ci siamo concentrati principalmente sull'ELISA e sulla citometria del flusso per eseguire questi esperimenti e quindi consentire la fattibilità di condurre esperimenti sulla base del modello qui presentato per molti laboratori. Pertanto, questo metodo rappresenta un metodo fattibile per testare la biocompatibilità ematica dei dispositivi medici vascolari in conformità con le raccomandazioni dello standard ISO 10993-4. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato ogni volta che un'interazione tra sangue e materiali deve essere testata in condizioni di flusso, imitando le condizioni in vivo.
Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della facoltà di medicina dell'Ospedale Universitario di Magdeburgo (numero di domanda 88/18) e le materie hanno fornito il consenso informato scritto prima della procedura di prelievo del sangue.
1. Preparazione del patrimonio eparina e prelievo del sangue
- Calcola la quantità di sangue necessaria per l'intero esperimento.
NOTA: Quasi, 5 mL di sangue eparinato sono necessari per ogni dispositivo vascolare in duplicati (anelli). Allo stesso modo, sono necessari 5 mL di sangue per ogni condizione basale e statica che viene tenuta da parte a temperatura ambiente. - Preparare una soluzione di cedimento di eparina alla concentrazione di 100 UI/mL diluire l'eparina non fratturata (ad esempio Rotexmedia) in acqua deionizzata. Utilizzare 150 μL di questa soluzione per l'eparinazione di 10 mL di sangue fresco.
- Calcola la quantità di sangue e plasma necessaria per il conteggio delle cellule del sangue intero, i test ELISA e FACS.
NOTA: Le misurazioni rappresentate in questo studio sono ottenute da due anelli che corrono in parallelo (uno come duplicato) con un volume totale di sangue di 10 mL. - In base alla quantità richiesta di sangue, riempire le siringhe da 10 ml con 150 μL di soluzione di stock di eparina per prevenire la coagulazione del sangue con una concentrazione finale di eparina di 1,5 UI/ml di sangue.
- Ereere sangue usando una farfalla (dimensione: 21 G). Riempire le siringhe molto delicatamente per evitare l'emolisi o l'attivazione cellulare a causa di un vuoto eccessivo.
NOTA: L'autorizzazione del comitato etico locale deve essere ottenuta prima dell'inizio degli esperimenti. Ottenere il consenso informato di ogni donatore di sangue umano. Assicurarsi che il donatore di sangue sia sano e non prenda alcun farmaco, in particolare nessun agente antipiastrine o farmaci antinfiammatori non steroidei per almeno 10 giorni prima degli esperimenti. Si noti che lo stesso donatore è preferito quando si confrontano diversi tipi di dispositivi vascolari per la prima volta come presentato in questo manoscritto. Per valutare ulteriormente le differenze inter-individuali, il protocollo può essere ripetuto con diversi donatori. - Raccogliere il sangue in un bicchiere, evitare un'eccessiva agitazione.
2. Assemblaggio di loop emodinamici in vitro
- Riempire il bagno d'acqua fino a quando il livello dell'acqua raggiunge il centro dell'unità di rotazione. Impostare la temperatura dell'acqua a 37 °C.
- Assemblaggio loop per testare diversi materiali di tubi (poliPVC, hepPVC, PVC e lattice)
- Tagliare due pezzi lunghi 50 cm di ogni materiale del tubo (diametro interno 5 mm) con la fresa a tubo. Assicurarsi che la superficie di taglio sia piatta, in quanto ciò è particolarmente importante per una chiusura perfetta per gli anelli con piccoli diametri in modo che il sangue fluisca senza alcuna distorsione sul bordo del raccordo.
NOTA: L'intero protocollo utilizza i tubi con un diametro interno di 5 mm. - Per facilitare la movimentazione ed evitare ritardi di elaborazione post-campionamento dopo la rotazione, eseguire solo quattro anelli (2 materiali in duplicati) in parallelo.
- Per generare una forma ad anello, collegare le terminazioni aperte dei tubi in un breve pezzo di tubo di silicio che si adatta al diametro esterno del tubo investigativo.
- Utilizzare le bande di tensione in policarbonato per garantire una corretta chiusura dei loop. Quando viene utilizzato per la prima volta, regolare la lunghezza delle bande per adattarsi al diametro esterno dell'anello tagliando la fascia di tensione con le forbici nelle lunghezze richieste e fissarla con una chiave di coppia di 3 mm.
- Stringere con cura la vite di bloccaggio del connettore della banda di tensione sotto ispezione delle terminazioni del tubo. Regolare la forza di chiusura in modo che non rimanga spazio tra le terminazioni del tubo. Se la vite di bloccaggio è totalmente stretta e la tensione della banda in policarbonato sembra troppo bassa per colmare lo spazio tra le terminazioni del tubo, aprire il bloccaggio del sistema e tagliare alcuni mm della banda di tensione. Ripetere questa situazione, fino a ottenere una chiusura accurata del ciclo (Figura 1A).
- Se il materiale del tubo è molto morbido e tende a scivolare all'interno delle bande di tensione, fissare l'anello con nastro elettrico alla banda di tensione(Figura 1B,C).
- Preparare un ciclo aggiuntivo di PVC per il controllo della temperatura con le stesse dimensioni dei cicli di prova.
- Fissare gli anelli nella culla ad anello dell'unità di rotazione all'esterno del bagno d'acqua. Successivamente, attaccare la culla ad anello all'unità di rotazione all'interno del bagno d'acqua( Figura 1E).
- Smontare la banda di tensione in parte dai loop e scollegare un'estremità di ogni tubo per aprire il loop.
- Riempire delicatamente ogni anello con 5 mL di sangue con una pipetta sierologica da 5 mL. Mescolare delicatamente il sangue due volte nel becher di vetro tubazioni lentamente su e giù prima di caricarlo nei loop.
- Prendi il termometro monouso e posizionalo all'interno del ciclo di controllo della temperatura. Se il termometro è troppo grande, tagliarlo con le forbici per adattarsi a tubi più piccoli. Riempire l'anello con 5 mL di acqua deionizzata a temperatura ambiente.
- Chiudere i loop e assicurarsi che i loop, le bande di tensione e il rack siano correttamente montati.
- Impostare la velocità di rotazione su 30 colpi al minuto (giri/min) e ruotare per 3 ore.
- Tagliare due pezzi lunghi 50 cm di ogni materiale del tubo (diametro interno 5 mm) con la fresa a tubo. Assicurarsi che la superficie di taglio sia piatta, in quanto ciò è particolarmente importante per una chiusura perfetta per gli anelli con piccoli diametri in modo che il sangue fluisca senza alcuna distorsione sul bordo del raccordo.
- Assemblaggio loop per testare l'impatto della chiusura impropria del loop (gap)
- Preparare quattro anelli (polyPVC) come descritto al punto 2.2.
- Chiudere correttamente due anelli con le bande di tensione ed evitare qualsiasi spazio tra le terminazioni del tubo.
- Per gli altri due anelli collegare le terminazioni aperte nel tubo più grande come descritto al punto 2.2.3, ma lasciare uno spazio di 1-2 mm tra le terminazioni del loop. Non utilizzare le bande di tensione per questi cicli (Figura 1D).
- Preparare un ciclo di controllo della temperatura come descritto nei punti 2.2.7 e 2.2.11.
- Riempire tutti i cicli di sangue come descritto al 2.2.10.
- Impostare la velocità di rotazione su 30 giri/min e ruotare per 3 ore.
- Assemblaggio loop per test stent
- Preparare quattro cicli come descritto nella 2.2 e seguenti.
NOTA: Per valutare la biocompatibilità ematica degli stent, il materiale del tubo stesso deve essere testato per essere biocompatibile al fine di prevenire il mascheramento dell'attivazione cellulare. Se non esistono dati, il materiale del tubo stesso può essere testato come descritto al 2.2. Inoltre, l'intervallo di diametro all'interno dello stent può essere applicato (vedi istruzioni del produttore) e deve adattarsi al diametro interno del materiale del tubo. - Aprire due anelli e togliere il tubo dal sistema di bande di tensione.
- Inserire lo stent al centro del tubo secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare gli altri due cicli senza stent come controllo. Riempire tutti i cicli di sangue come descritto al 2.2.10.
- Impostare la velocità di rotazione su 30 giri/min e ruotare per 3 ore.
- Preparare quattro cicli come descritto nella 2.2 e seguenti.
- Controllo della temperatura
- In qualsiasi momento durante la durata e quando la rotazione viene interrotta, la temperatura del sangue all'interno dei loop è indicata dal termometro all'interno del ciclo di controllo della temperatura. Per leggere la temperatura, interrompere la rotazione e leggere immediatamente la temperatura indicata dal termometro.
3. Elaborazione del campione di sangue
- Dopo la rotazione, lasciare riposare i loop nel rack per 2 minuti in posizione verso l'alto per lasciare che il sangue si accumuli nella parte inferiore dei loop, evitando qualsiasi fuoriuscita mentre si aprono i loop.
- Ispezionare il sangue lasciato per le condizioni statiche: se questo sangue è coagulato, alla fine si sospetta un'eparinazione impropria. In questo caso, ripetere l'esperimento preferibilmente anche con un altro donatore di sangue.
- Togliere con cura i loop dal rack. Aprire i connettori e lasciare fluire il sangue in un bicchiere da 10 mL.
- Mettere in comune il sangue dai tubi che vengono eseguiti in duplicati.
- Eleva sangue fresco per l'analisi di base dallo stesso donatore descritto nei punti 1.5 e 1.6.
- Raccolta di sangue di citrato di sodio
- Per la raccolta del sangue di citrato di sodio, riempire quattro tubi da 1,5 ml, ciascuno con soluzione di citrato di sodio da 111 μL raccolta da tubi di citrato di sodio, per generare una concentrazione finale del 3,2% di citrato di sodio.
- Riempire ogni tubo con 1 ml di sangue dai becher di vetro come descritto ai punti 1.6 e 3.3.
- Conservare il sangue a temperatura ambiente e utilizzare questo sangue per le analisi FACS come descritto al punto 12.
NOTA: Per modificare la lunghezza dei loop per diverse configurazioni sperimentali, pianificare correttamente le aliquote in base alla quantità di misurazioni da effettuare. Può essere necessario stabilire tutte le misurazioni richieste con sangue fresco prima dei veri esperimenti per garantire che il volume di sangue nei loop sia sufficiente per tutte le misurazioni.
- Raccolta di campioni di acido etilendiamminatetraacetico (EDTA) nel sangue e nel plasma.
- Da ogni bicchiere di vetro con sangue (vedi 1.6 e 3.3) trasferire 4,5 ml di sangue in un tubo EDTA da 5 ml. Riempire con sangue due tubi EDTA da ogni bicchiere da 10 ml.
- Mescolare delicatamente il sangue e tenerlo sul ghiaccio.
- Trasferire 2 ml di sangue in un tubo di centrifugazione bloccante da 2 ml e utilizzare questo sangue per il conteggio delle cellule del sangue e la misurazione libera dell'emoglobina come descritto al punto 5. E 6.
- Centrifugare il sangue rimanente a 3.500 x g per 20 minuti.
- Raccogliere con cura il plasma nel supernatante in aliquote da 500 μL e congelare immediatamente a -80 °C.
4. Microscopia elettronica a scansione e immagini μCT
- Dopo l'elaborazione del campione di sangue, sciacquare gli anelli svuotati preparati come descritto al punto 2.3 con 10 mL di soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) ciascuno.
- Tagliare con cura un campione lungo 1 cm da ogni estremità di ogni tubo con un bisturi.
- Incubare il campione durante la notte a 4 °C in una soluzione di glutaraldeide al 2%.
ATTENZIONE: L'inalazione di vapori di aldeide può causare sintomi nasali come un naso che cola o soffocamento persistente e irritazione delle vie aeree e il contatto con la pelle causa dermatite. Le aldeidi devono essere maneggiate in un cappuccio aspirante mentre indossano guanti, un abito protettivo e occhiali di sicurezza. - Risciacquare il campione (3 volte) con PBS.
- Preparare una soluzione all'1% di tetrossido di osmio (OsO4)in acqua deionizzata e incubare il campione per 15 minuti a temperatura ambiente.
ATTENZIONE: OsO4 è un forte agente ossidante, può essere ridotto dall'esposizione alla luce. Per evitare la riduzione durante la preparazione, conservare OsO4 in una bottiglia di vetro marrone. OsO4 è estremamente volatile, i suoi fumi sono tossici per occhi, naso e gola. Lavorare sempre sotto un cappuccio dei fumi e utilizzare guanti e proteggere gli indumenti, assicurando che nessuna parte del corpo sia esposta a OsO4. Contattare le linee guida dell'istituto in materia di gestione dello smaltimento e dello stoccaggio dei rifiuti. In generale, OsO4 è conservabile per diversi mesi, ma ha bisogno di speciali bottiglie di vetro con rivestimento in Teflon e un essiccatore, perché OsO4 può scolorire le superfici interne e il contenuto del frigorifero in presenza di fumi che perdono. - Prelevare campioni, trasferirli in nuovi tubi di centrifuga da 15 ml e risciacquare i campioni 3 volte con PBS.
- Preparare una serie di etanolo con concentrazioni variabili (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
- Campioni disidratati in etanolo: incubare per 20 minuti ciascuno nel 25%, 50%, 75% e 90% e 30 min nel 100%.
- Prelevare campioni dal 100% di etanolo e lasciarlo asciugare all'aria durante la notte a temperatura ambiente.
- Esaminare i campioni nel microscopio elettronico a scansione ad una tensione di accelerazione di 5 kV e con lo scanner μCT a raggi X.
5. Numero di cellule del sangue
- Assumere 2 mL del sangue EDTA ottenuto come descritto al 3.7.3
- Inserire il tubo nell'analizzatore di ematologia automatizzato e seguire le istruzioni del produttore.
6. Misurazione dell'emoglobina libera (fHb) nel plasma
- Scongelare un campione di plasma per ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5. Conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
NOTA: Scongelare sempre campioni di plasma congelato in un bagno d'acqua a 37 °C e trasferirli immediatamente sul ghiaccio, contenente un po 'd'acqua, per abbassare la temperatura. Questo è importante per evitare l'attivazione dei componenti del sangue durante lo scongelamento. - Utilizzare il reagente fHb e seguire le istruzioni del produttore. Evitare la contaminazione dopo l'apertura e proteggere il reagente dalla luce diretta (sole, luce UV).
- Utilizzare uno schema di pipettazione (vedere le istruzioni del produttore) con diluizione 1:5.
- Aggiungere 1000 μL del reagente dell'emoglobina in una cuvetta semi-micro da 1,6 mL. Utilizzare questa cuvetta per determinare il valore vuoto.
- Aggiungere 1000 μL del reagente dell'emoglobina e 250 μL del campione di plasma in un'altra cuvetta semi-micro.
- Mescolare il contenuto in entrambe le cuvette lavando accuratamente la pipetta riempiendo ripetutamente con miscela di reazione e incubare almeno 3 minuti a temperatura ambiente.
- Determinare l'estinzione (E) del campione rispetto al reagente fHb come reagente vuoto. Calcolare la concentrazione di fHb (mmol/l) del campione: E540-E680 x 0,452.
7. Misurazione dell'FPA
- Scongelare un campione di plasma per ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5 e conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
- Utilizzare il kit FPA Elisa e seguire le istruzioni del produttore.
8. Misurazione di sC5b9
- Scongelare un campione di plasma per ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5 e conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
- Utilizzare il kit ELISA sC5b-9 e seguire le istruzioni del produttore.
9. Misurazione della PMN
- Scongelare un campione di plasma per ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5 e conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
- Utilizzare il kit PMN-Elastase ELISA e seguire le istruzioni del produttore.
10. Misurazione del TNF
- Le micropiatte devono essere rivestite un giorno prima di eseguire l'ELISA. Per il rivestimento, aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale di cattura a tutti i pozzi, sigillare la piastra e incubare durante la notte a 2 °C-8 °C.
- Scongelare un campione di plasma per ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5. Conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
- Utilizzare il kit TNF ELISA e seguire le istruzioni del produttore.
11. Misurazione dell'IL-6
- Le micropiatte devono essere rivestite con anticorpi di cattura un giorno prima dell'esperimento. Per il rivestimento, aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale di cattura a tutti i pozzi della micropiastra fornita con il set, la piastra di tenuta e incubare durante la notte a 4 °C
- Scongelare un campione di plasma da ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5. e conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
- Utilizzare il kit IL-6 ELISA e seguire le istruzioni del produttore..
12. Analisi FACS
- Preparare 500 mL di tampone FACS aggiungendo 10 mL di siero fetale di vitello e 2 mL di soluzione EDTA (0,5 M) a 488 mL di 1x PBS. Il tampone FACS può essere conservato per 4 settimane a 4°C.
- Utilizzare 100 μL del sangue di citrato di sodio (vedere 3.6.3) per ogni procedura di colorazione (aggregati piastrine monociti (MPA), attivazione piastrinica (PA), integrine leucocite (LI)).
- Pipetta 100 μL di sangue da ogni campione in un tubo FACS da 5 ml. Da ogni campione, preparare 3 tubi per la colorazione degli anticorpi ed etichettare con pannello MPA (aggregati piastrini monociti), pannello PA (aggregati piastrine) e pannello LI (integrina leucocitaria).
- Mescolare il resto dei 4 campioni in un tubo FACS da 5 ml. Utilizzare questa combinazione per controlli non macchiati e fluorescenza meno uno (FMO).
- Preparare 6 tubi FACS pipettando 100 μL del sangue campione misto in ogni tubo. Etichettare 3 tubi come non macchiati e 3 tubi come FMO-CD41, FMO-CD62P e FMO-CD162.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di paraformaldeide al 4% e incubare per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica per la pelle e gli occhi. Può causare gravi irritazioni polmonari quando inalato e può portare a danni polmonari dopo un'esposizione prolungata. Inoltre, è classificato come cancerogeno e tossina riproduttiva. Indossare sempre guanti e occhiali di sicurezza e lavorare sotto il cofano dei fumi. - Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio a ciascun tubo e centrifugare a 287 x g per 5 min. Scartare il supernatante e ripetere il passaggio di lavaggio due volte.
- Per la lisi dei globuli rossi (RBC), aggiungere 1 mL di tampone 1x tampone RBC lysis buffer (diluire 10x RBC lysis buffer in acqua deionizzata), mescolare pipettando lentamente su e giù e incubare per 5 minuti a RT al buio.
- Preparare perline di compensazione per singole macchie. A 1 mL di tampone FACS aggiungere 4 gocce di ogni perline positiva e negativa. Vortice approfondito e aggiungere 100 μL di soluzione di perline a un tubo FACS da 5 ml.
- Preparare 4 tubi con perline ed etichetta come CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC e CD62P-PE. Aggiungere 1 ml di tampone FACS a ciascun tubo e centrifugare a 287 x g per 5 min. Scartare il supernatante e tenere sul ghiaccio.
- Dopo la lisi RBC, aggiungere 1 ml di tampone FACS a ciascun tubo e lavare come descritto al punto 12.7. Scartare il supernatante.
- Preparare cocktail anticorpali:
- Pannello MPA: Aggiungere 4 μL di CD45-APC, 4 μL di CD14-FITC e 4 μL di CD41-BV421 a 388 μL di buffer FACS.
- Pannello PA: Aggiungere 1,6 μL di CD41-BV421 e 12 μL di CD62P-PE a 386,4 μL di buffer FACS.
- Pannello LI: Aggiungere 4 μL di CD45-APC e 8 μL di CD162-BV421 a 388 μL di buffer FACS. Tieniti sul ghiaccio.
- Preparare singole macchie: aggiungere da 0,5 μL a 499,5 μL di tampone FACS ciascuno per CD14-FITC, CD41-BV421 e CD45-APC. Per CD62P-PE aggiungere 0,3 μL a 499,7 μL di tampone FACS. Tieniti sul ghiaccio.
- Preparare i controlli FMO: (i) pannello MPA (FMO-CD41): Aggiungere 1 μL CD14-FITC anticorpo e 1 μL di anticorpo CD45-APC a 98 μL tampone FACS. (ii) Pannello PA (FMO-CD62P): aggiungere 0,4 μL di CD41-BV421 a 99,6 μL di tampone FACS. (iii) Pannello LI (FMO-CD162): aggiungere 1 μL di CD45-APC a 99 μL di tampone FACS. Mantenere i controlli FMO sul ghiaccio.
- Cocktail di anticorpi vortici e aggiungere 100 μL di ogni cocktail anticorpale preparato in 12.12 a ciascuno dei rispettivi tubi etichettati (pannello MPA, PA e LI) come descritto al punto 12.3 e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Tieni RT al buio.
- Diluizioni di anticorpi a macchia singola vortice e aggiungere 100 μL delle diluizioni dei singoli anticorpi di macchia come preparato in 12.13. a ciascuno dei rispettivi tubi etichettati con perline come descritto al punto 12.7 e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Tieni RT al buio.
- Vortex FMO cocktail anticorpali e aggiungere 100 μL di ogni cocktail anticorpale FMO-1 come preparato in 12.14. a ciascuno dei rispettivi tubi etichettati (controlli FMO) come descritto al punto 12.5. e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Tieniti a RT al buio.
- Incubare tutti i tubi con colorazione anticorpale per 30 minuti a RT al buio.
- Prendere i tre tubi per il controllo non macchiato (vedi 12.4) e resuspend pellet in 250 μL di tampone FACS. Tieniti sul ghiaccio.
- Dopo il tempo di incubazione, lavare tutti i tubi tranne i controlli non contaminati una volta con tampone FACS come descritto al punto 12.7. Resuspend pellet in 250 μL di tampone FACS e acquisire dati sul citometro di flusso.
- Utilizzare celle non macchiate per impostazioni negative e compensare le perline del mouse per le impostazioni positive nel software FACS. Inoltre, utilizzare FMO per controllare la strategia di gating, dove FMO-CD41 viene utilizzato nel pannello MPA, FMO-CD62P viene utilizzato nel pannello PA e FMO-CD162 viene utilizzato nel pannello LI.
- Acquisire quasi 0,5 x 106 - 0,25 x 106 eventi per tubo per FACS. Salvare i dati e analizzare con un software di analisi (versione 9.9.6).
Representative Results
Tutti i dati presentati, ad eccezione dei grafici FACS, sono stati analizzati con un software di statistica. I grafici FACS sono stati analizzati utilizzando il software di citometria a flusso.
L'analisi del numero di globuli interi non ha mostrato differenze significative per quanto riguarda gli etrociti tra tutte le condizioni testate (Figura 2). Ma piastrine e leucociti sono stati drasticamente ridotti nel gruppo del lattice, indicando una biocompatibilità molto scarsa del lattice. Ciò è ulteriormente sottolineato dall'aumento dei livelli di emoglobina libera nel gruppo del lattice, il che indica il fatto che, ad eccezione del gruppo del lattice, nessuno degli altri dispositivi o condizioni vascolari ha portato a un'emolisi estesa (Figura 2). Inoltre, i tubi rivestiti in PVC, il poliPVC e l'hepPVC, così come lo stent testato, non hanno portato alla trombosi per mezzo della perdita di piastrine e leucociti, mentre il lattice ha mostrato la più alta perdita di piastrine e leucociti, seguita da tubi in PVC non rivestiti che hanno mostrato una tendenza ridotta.
Mentre tutti i dispositivi vascolari testati hanno portato a una maggiore attivazione del sistema di coagulazione (FPA) e del componente del complemento (sC5b-9), i loop hepPVC hanno mostrato una tendenza alla diminuzione dei livelli di FPA e sC5b-9 rispetto specificamente ai loop poliPVC(Figura 3). È interessante notare che i loop IN PVC e Gap non rivestiti mostravano livelli più bassi di FPA rispetto al poliPVC, anche se non raggiungevano il livello di significatività statistica. Tuttavia, i loop in lattice hanno mostrato livelli significativamente aumentati di FPA rispetto alle condizioni di base e statiche.
In conformità con il numero di globuli interi, gli anelli di lattice presentavano i livelli più elevati diTNF, IL-6 e PMN elastasi (Figura 4), raggiungendo il livello di significatività statistica rispetto al resto dei gruppi in termini di TNF e IL-6 (Figura 4A,B), mentre alle condizioni statiche e di base in termini di PMN elastasi (Figura 4C). Questi risultati indicano la potente attivazione dei leucociti da parte del lattice. I livelli di base dei marcatori di attivazione erano sempre paragonabili alle condizioni statiche, indicando una corretta eparinizzazione del sangue.
È interessante notare che il numero di piastrine e leucociti per i loop indotti dal gap è stato solo leggermente ridotto con un'attivazione moderata del sistema coagulatorio (FPA) e dei leucociti (Elastasi PMN), anche se una chiusura impropria del loop con conseguenti turbolenze del flusso e il contatto sanguigno con la superficie di taglio grezza non patinato ha portato a coaguli macroscopicamente visibili alla giunzione(Figura 1F). I coaguli e la sua distribuzione su tutta la superficie delle giunzione erano evidenti con immagini μCT e SEM, mentre non è stato trovato coagulo quando i loop sono stati chiusi con il dispositivo di chiusura esterno senza lasciare spazio tra le terminazioni del loop (Figura 5).
L'analisi citometrica del flusso delle cellule del sangue ospiti che sono state macchiate con marcatori specifici piastrinica, CD41 e marcatore di attivazione piastrinica CD62P, sono mostrate nella figura 6A,B. Qui, i tubi in lattice mostravano un'intensità di fluorescenza mediana estremamente elevata (IFM) per CD62P sulle piastrine del sangue, seguiti da stent, mentre i tubi in poliPVC rivestiti di eparina mostravano un'attivazione minima di piastrine raffiguranti proprietà anti-trombogeniche dei tubi poliPVC. Inoltre, i leucociti sono stati classificati in base alla granularità basata su CD45 e SSC (side scatter) in (i) granulociti; ii monociti e iii linfociti (figura 7) e l'espressione di CD162+ integrina è stata rilevata su ciascuna sottopopolazione di leucociti noti per interagire con il CD62P sulle piastrine24. È stato notato che le espressioni di integrina sono state drasticamente ridotte su granulociti e linfociti negli anelli di lattice. Questo risultato è stato in linea con i livelli abbassati delle frequenze totali dei leucociti negli anelli di lattice (Figura 2). In generale, i livelli di integrina erano più alti tra i monociti rispetto ai granulociti e ai linfociti, indicando la probabilità per l'interazione dei monociti con piastrine attivate. A questo proposito, gli aggregati piastrini monociti sono stati valutati anche macchiando le cellule del sangue con CD14 (come marcatore monocita) e CD41 (come marcatore piastrinica) e, in ultima analisi, identificando doppie cellule positive, ad esempio CD14+CD41+MPA (Figura 8). Qui, abbiamo notato che il gruppo stent mostrava i più alti livelli di espressione CD41 sull'MPA, seguito dal gruppo del lattice, indicando una maggiore tendenza a formare MPA, nonostante la ridotta frequenza del monocita (<1 %) nei loop in lattice.
Figura 1: Panoramica del modello ad anello emodinamico in vitro e delle sue modifiche. (A) Ciclo per l'esperimento gap con sistema di chiusura del loop esterno, senza lasciare spazio alla giunzione. (B) Anello in tubo in PVC rivestito in poliPVC e stent all'interno (freccia). (C) Anello in tubo di lattice. (D) Ciclo per l'esperimento gap senza che il sistema di chiusura del loop esterno lasci uno spazio tra le terminazioni del tubo (freccia). (E) Anelli posti nella culla ad anello all'interno del bagno d'acqua e riempiti di sangue. (F) Trombo risultante in uno spazio alla giunzione (freccia) dopo la rotazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati per la conta delle cellule del sangue e l'emoglobina plasmatica. (A) Contano gli erytrociti. (B) Le piastrine contano. (F) Contano i leucociti. (D)Emoglobina al plasma libera. I risultati indicano la scarsa biocompatibilità del lattice, portando a un'eccessiva emolisi. I dati sono presentati come valore medio; le barre di errore indicano SEM. n=1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati per l'attivazione del sistema di coagulazione e complemento. (A) Attivazione del sistema di coagulazione, misurata in base ai livelli di fibrinopeptide A (FPA) (B) Attivazione del sistema di complemento, misurata in base ai livelli di sC5b-9. Mentre i tubi in lattice evocavano livelli elevati significativi dell'FPA, l'attivazione del complemento era forte per tutti i materiali testati. I dati vengono presentati come valore medio, le barre di errore indicano SEM. *p<0.05, n=1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Marcatori di attivazione dei leucociti. (A) Fattore di necrosi tumorale alfa (TNF). (B) Interleuchina 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. I risultati indicano una maggiore attivazione dei leucociti a causa degli elevati livelli dei marcatori analizzati, seguita da cicli stent, che hanno portato solo ad un aumento dei livelli per la PMN Elastase ma non per il TNF o l'IL-6. I dati vengono presentati come valore medio, le barre di errore indicano SEM. *p<0.5; **p<0,01, n=1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Imaging delle giunzione dei loop. (A) μ tomografia computerizzata (μCT) di loop con chiusura impropria (gap). Le aree rosse indicano materiale trombo. (B) Rendering del lato luminare del tubo. La selezione rettangolare indica l'area per la microscopia elettronica a scansione (SEM) (C). (D) μCT di loop con dispositivo di chiusura ad anello esterno e nessun gap alla giunzione, e (E) rendering e vista della superficie luminare. Non è stato trovato materiale trombo. (F) Immagine SEM della selezione rettangolare in (E). Nessun materiale trombo è stato trovato sulla superficie di taglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Grafico FACS per l'attivazione piastrinica (CD62P). (A) Posto rappresentante FACS (condizione di base) che mostra il SANGUE CD41+ piastrine. (B) Grafico che mostra lo stato di attivazione piastrinica riflesso dall'intensità media di fluorescenza (IFM) dei diversi tipi di dispositivi vascolari rispetto alla RT statica e alle condizioni di base. Le barre dei dati presentano i dati di singole misurazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Grafico FACS per l'integrina leucocitarie (CD162). (A) Grafico rappresentativo FACS (condizione di base) che mostra il sangue CD45+ leucociti e sottogruppi (B) Grafico che mostra il leucocita CD162+ intensità media di fluorescenza (IFM) dei diversi tipi di dispositivi vascolari rispetto alle condizioni statiche e di base. Le barre dei dati presentano i dati di singole misurazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Grafico FACS per aggregati di monociti piastrinica (CD41/CD14). (A) Grafico rappresentante FACS (condizione di base) che mostra la gating per monociti del sangue (CD45+/CD14+), piastrine (CD41+) e aggregati piastrinica monociti (CD41+/CD14+) ( B )Graficoche mostra l'intensità di fluorescenza media (IFM) cd41+ media sugli aggregati piastrine monociti per i vari dispositivi vascolari rispetto alle condizioni statiche e di base. Le barre dei dati presentano i dati di singole misurazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo studio ha dimostrato che il modello di loop emodinamico presentato in vitro offre un metodo affidabile per testare la compatibilità del sangue in vitro dei dispositivi medici in conformità con lo standard ISO 10993-4.
Le fasi critiche del protocollo includono il prelievo di sangue e il riempimento dei tubi con sangue, dove si dovrebbe evitare un vuoto eccessivo o agitazione per impedire l'attivazione dei componenti del sangue mediante la procedura di manipolazione. Inoltre, è molto importante congelare immediatamente i campioni di plasma e tenerli sul ghiaccio dopo lo scongelamento, poiché l'attivazione del complemento e del sistema di coagulazione può essere manolata mantenendo i campioni a temperatura ambiente per un tempo più lungo.
Poiché questo modello ha sia meriti che demeriti rispetto ad altri modelli in vitro, è necessario prendere in considerazione diversi fattori durante la progettazione degli esperimenti.
In primo luogo, i loop possono essere variati in lunghezza e diametro per adattarsi a varie configurazioni sperimentali. Nel caso in cui la configurazione includa tubi a contrasto di diversi diametri interni, va tenuto presente che le differenze di diametro si tradurranno in diverse forze di taglio, influenzando così la coagulazione e completando la cascata7. In secondo luogo, la velocità di rotazione è stata impostata a 30 giri/min in questo esperimento. Ciò si tradurrà in un flusso sanguigno di circa 25 cm / s, che è paragonabile alla velocità del flusso sanguigno negli innesti di bypass coronaricaumana 25. Il tasso di deformazione, generato dalla rotazione dei loop, è il parametro principale che avvierà cascate biochimiche di componenti del sangue, comprese le cellule e le proteine senza cellule. Ma poiché il sangue è un fluido non newtoniano, la velocità di deformazione sarà influenzata anche dalla curvatura del tubo, rispettivamente dalla lunghezza dei tubi chiusi agli anelli10. Ogni volta che la velocità di rotazione o la dimensione del loop viene modificata, è importante considerare che la correlazione tra velocità di deformazione e velocità di rotazione non è lineare. La correlazione tra velocità di rotazione e velocità di deformazione non è sufficientemente esaminata fino ad oggi e sono necessari ulteriori studi per studiare questi particolariparametri 10,26,27. Tuttavia, sulla base di un modello per lo strato limite laminare, il diametro del tubo dato di 5 mm e la velocità di rotazione di 25 cm/s, una stima approssimativa della sollecitazione di taglio a parete (WSS) indicherebbe valori compresi tra 2,20 e 22,00 pascal per una distanza di 1,00-0,01 mm dalla parete del tubo quando la densità sanguigna è stimata in 1060 kg*m-3 e la viscosità cinetica è impostata su 0,0025 pascal*s28,29. È interessante notare che anche un'analisi computazionale più dettagliata della dinamica del flusso nella curvatura delle arterie coronarie umane ha mostrato valori WSS che vanno da 11,33 a 16,77 pascal a parametri approssimativamente comparabili per la velocità, la densità e la viscosità del sangue30.
Oltre a questa limitazione, il modello ad anello presentato è un sistema senza pressione, che non imita i rapporti di pressione sanguigna intravascolare del sistema vascolare umano.
La prossima importante limitazione è che il sangue è a contatto con l'aria all'interno dei loop, il che porta ulteriori interferenze. Tale contatto sangue-aria è influenzato da due parametri, che includono la permeabilità del gas dei tubi e il contenimento dell'aria all'interno dei loop mentre li riempie di sangue. Ogni materiale del tubo possiede una certa permeabilità al gas che può portare a cambiamenti significativi nelle concentrazioni di gas all'interno dei tubi. Mentre alcuni autori affermano che l'effetto risultante della permeabilità al gas sull'attivazione dei componenti del sangue rimane poco chiaro31, è noto che la funzione dei coagulatori del sangue è altamente sensibile a uno spostamento del pH, che può essere causato dalla diffusione di CO2 32,33,34. Qui, abbiamo testato la biocompatibilità dei tubi perfusione del sangue in condizioni di aria interna, paragonabile agli scenari clinici di perfusione ematica extracorporea. Per i futuri miglioramenti del modello presentato, l'incubazione dell'intero modello in un incubatore di CO2 e l'esecuzione della convalida del pH nel sangue prima e dopo l'incubazione potrebbero essere utili per standardizzare ulteriormente questo modello.
Inoltre, l'interfaccia sangue-aria all'interno dei loop può portare all'attivazione di proteine plasmatiche e frazionicellulari del sangue 35,36. I dispositivi azionati da pompa a rulli senza aria all'interno dei tubi possono evitare il problema dell'interfaccia sangue-aria, ma certamente inducono danni alle cellule del sangue con livelli elevati significativi di emoglobina rispetto al modello ad anello qui presentato, e l'emoglobina nel plasma può interferire con la sensibilità degli analiti testati in ELISA16. In questo studio abbiamo dimostrato che l'effetto emolitico del modello ad anello stesso rimane minimo durante l'utilizzo di materiali biocompatibili come tubi in PVC rivestiti di eparina. Pertanto, il modello non sta causando, da un lato, danni cellulari eccessivi rispetto ai modelli azionati dalla pompa, ma dall'altro induce proteine plasmatiche a causa del contatto con l'aria nel sangue. Da notare che van Oeveren et al. Questa promettente alternativa al modello di loop qui presentato può superare il problema dell'interfaccia sangue-aria, tuttavia, rispetto al modello qui presentato, l'adesione piastrinica è ancora più alta per il modello ad anello basato sulla valvola a sfera.
Per quanto riguarda il controllo statico, è da notare che il vetro stesso si è dimostrato un potente attivatore del sistema coagulatorio37. Tuttavia, nella configurazione presentata, l'incubazione in un bicchiere di vetro (controllo statico) non ha portato a un'eccessiva attivazione delle cellule ospiti o all'attivazione del sistema coagulatorio rispetto ai livelli di base direttamente dopo il prelievo del sangue. In conclusione, potrebbe essere utile utilizzare ad esempio tubi in polipropilene, se il controllo statico mostra alti livelli di attivazione.
Indipendentemente dal fatto che si tratti di un modello basato su loop o di una pompa, questi modelli in vitro mancano completamente delle autentiche interazioni biologiche che sono principalmente fornite da un endotelio intatto, che è una superficie di contatto con il sangue ideale. La logica alla base di questo problema è più evidente quando si sta testando un dispositivo medico come uno stent, che potrebbe impartire risultati diversi, in termini di attivazione e proteine plasmatiche, durante la sua interazione con i componenti del sangue in presenza di endotelio. Ciò si dichiara uno dei principali inconvenienti di tutti i sistemi in vitro discussi che imitano il sistema circolatorio. Quindi, per superare questo problema, i nuovi sistemi microfluidici completamente coperti di endotelio stanno guadagnando immenso interesse, ma tuttavia rispetto al modello ad anello qui presentato, sono ancora limitati ad accogliere volumi di sangue più piccoli e portate minime38,39
Pertanto, concludiamo che il modello Chandler Loop rimane quello di essere un modello robusto per condurre test standardizzati sulla biocompatibilità del sangue dei dispositivi medici vascolari nel campo della ricerca cardiovascolare.
Disclosures
Il finanziatore [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Germania] fornì un sostegno finanziario sotto forma di materiali di consumo e tasse di pubblicazione all'autore di questo manoscritto [Max Wacker]. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo aggiuntivo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o preparare il manoscritto.
Acknowledgments
Gli autori sono grati alla signora Elena Denks per la sua assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
| BD LSR Fortessa II cell analyzer | Becton Dickinson | 647465 | |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | Becton Dickinson | 369714 | |
| BD Vacutainer one-use holder | Becton Dickinson | 364815 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
| Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
| Beaker glass ROTILABO short 50 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X688.1 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
| Centrifuge ROTINA 420 | 420 R | Hettich Zentrifugen | 4701 | 4706 | |
| Centrifuge tubes, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| CHC Super modified, 5mm PVC tubing | Corline Sweden | 1807-148 | Referred to as hepPVC tube |
| Circular Precision Cutter | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 007-20 | |
| Closing Unit (complete with tension bands) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 008-20 | |
| Electric tape Scotch Super 33+ | VWR | MMMA331933 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 | BioLegend | 430504 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a | BioLegend | 430204 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000012 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000020 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000047 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue | Eppendorf AG | 3123000063 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000055 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet | Eppendorf AG | 3123000071 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom | Corning BV | 352052 | |
| Fetal bovine serum Gold Plus | Bio-Sell | FBS.GP.0500 | |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 367116 | |
| Fluency plus stent 13.5 x 60 mm | Angiomed GmbH & Co | FVM14060 | |
| Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
| Gibco PBS Tablets | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Gloves Vasco Nitril white L | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208437 | |
| Gloves Vasco Nitril white M | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208429 | |
| Glutaraldehyde 25% aequous solution | Sigma Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, 25.000 IE in 5 ml | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN 3862340 | |
| Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit | Hölzel Diagnostika | abx253234 | |
| Kodan tincture forte colourless | Schülke & Mayr GmbH | 104012 | |
| Latex tube, ID 5 mm | Laborhandel24 GmbH | 305 0507 | |
| Loop Stand | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 009-20 | |
| Medimex venous tourniquet classic | ROESER Medical GmbH | 310005 | |
| Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex | Tecan | TEC006418I | |
| Microplate shaker PMS-1000i | VWR | 444-0041 | |
| Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm | VWR | NALG8703-0508 | Referred to as PVC tube |
| NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
| Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
| Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| PE anti-human CD16Antibody | BioLegend | 302008 | |
| PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody | BioLegend | 304906 | |
| Pipette controller, pipetus | VWR | 612-1874 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5186480 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 9409410 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.870 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000µl blue | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.919 | |
| PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
| Probe stand ROTILABO combi | CARL ROTH | K082.1 | |
| Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 011-20 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
| Reagent reservoirs | VWR | 613-1184 | |
| Rotation Unit | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 010-20 | |
| Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409320 | |
| Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409331 | |
| sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
| Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG | Philips | n.a. | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X715.1 | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X714.1 | |
| Semi-micro cuvette 1.6 ml | Sarstedt | 67.746 | |
| Serological pipette 10.0 ml | Corning BV | 4488 | |
| Serological pipette, 25.0 ml | Corning BV | 4489 | |
| Serological pipette, 5.0 ml | Corning BV | 4487 | |
| Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm | VWR | BURK8803-0812 | |
| Sprout mini centrifuge | Biozym | 552034 | |
| Stop Solution for TMB Substrate | BioLegend | 77316 | |
| Swabs, sterile | Fuhrmann GmbH | 32055 | |
| Syringe, 10 ml | Becton Dickinson | 300296 | |
| Temperature controlled water basin | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 020-20 | |
| tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | 10000730 | |
| TMB Substrate Set | BioLegend | 421101 | |
| Trillium PVC tube, 5 mm ID | Medtronic | 161100107100103 | Referred to as polyPVC tube |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0250 | |
| UV-Vis Spektrometer Lambda 2 | Perkin Elmer | 33539 | |
| Vornado Mini Vortexer | Biozym | 55BV101-B-E | |
| XN-3000 workstation blood analyzer | Sysmex Europe | n.a. | |
| μ-CT Phoenix Nanotom S | GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany | n.a. |
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